大豆属调节元件及其用途的制作方法

大豆属调节元件及其用途
1.相关申请
2.本技术要求于2019年11月25日提交的临时申请62/939,762的优先权，并通过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
3.本发明涉及调节元件，例如启动子和终止子，其可用于植物如大豆中的表达盒。
4.序列表
5.本技术附有2020年11月16日创建的命名为82000_st25.txt的序列表，其大小为大约54kb。本序列表通过引用以其全文并入本文。本序列表随同此申请经由efs-web提交，并且符合37c.f.r.
§
1.824(a)(2)-(6)和(b)。


背景技术：

6.转基因植物是理想性状，如昆虫抗性和除草剂耐受性的重要来源。为了产生此类性状，通常将一个或多个核酸引入含有表达盒的植物中，这些表达盒表达一种或多种性状的一种或多种编码序列。此类表达盒通常含有启动子和终止子序列以控制每个编码序列的表达。对于某些性状，如昆虫抗性和除草剂耐受性，可能需要使用具有中到高组成型表达的启动子和终止子。此类启动子和终止子的选择仍然有限。仍然需要额外的启动子和终止子序列以驱动基因表达，以实现稳健的蛋白质生产，理想情况是在所有或大多数大豆组织中。


技术实现要素：

7.本文提供了获得自或衍生自大豆属物种，例如银毛大豆(glycine argyrea)、灰色大豆(glycine canescens)、澎湖大豆(glycine clandestine)、大豆(glycine max)和短绒野大豆(glycine tomentella)的调节元件，如启动子和终止子。此类调节元件可用于构建用于表达目的编码序列，如表达植物中目的性状的编码序列的表达盒。如本文所述，测试了几种启动子和终止子序列，并且其显示与对照启动子或终止子相比在叶、根、种子荚和/或胚中具有提高的表达水平。因此，本披露的一些方面涉及此类调节元件和其在表达盒、载体和转基因植物及植物细胞中的用途。
8.在一些实施例中，本披露提供了表达盒，其包含与seq id no:1-5、8-29或31中的一个或多个具有至少90％同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可操作地连接至异源核苷酸序列。在一些实施例中，本披露提供了表达盒，其包含含有seq id no:1-5、8-29或31中的一个或多个或其生物活性片段的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可操作地连接至异源核苷酸序列。在一些实施例中，本披露提供了表达盒，其包含与seq id no:1-5中的一个或多个具有至少90％同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的第一核苷酸序列和与seq id no:8-29中的一个或多个具有至少90％同一性(例如，至少91％、
至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的第二核苷酸序列，其中该第一和/或第二核苷酸序列可操作地连接至异源核苷酸序列。
9.在一些实施例中，该异源核苷酸序列是编码目的rna或蛋白质的目的核酸。在一些实施例中，该目的rna或蛋白质能赋予植物所希望的特征，如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力。在一些实施例中，该异源核苷酸序列编码选择性标记。在一些实施例中，该表达盒进一步包含选择性标记。
10.在一些实施例中，本披露提供了包含上述实施例中任一项所述的表达盒的载体。在一些实施例中，该载体是质粒、病毒或土壤杆菌(agrobacterium)。
11.在一些实施例中，本披露提供了植物细胞，其包含上述实施例中任一项所述的表达盒或载体。在一些实施例中，该植物细胞是双子叶植物细胞。在一些实施例中，该植物细胞是大豆细胞。在一些实施例中，本披露提供了包含该植物细胞的转基因植物。在一些实施例中，该植物是双子叶植物。在一些实施例中，该植物是大豆植物。在一些实施例中，本披露提供了来自转基因植物的种子。
12.在一些实施例中，本披露提供了一种方法，该方法包括将上述实施例中任一项所述的表达盒或载体引入植物或植物细胞中。在一些实施例中，该方法进一步包括将该植物或植物细胞置于由表达盒或载体表达目的rna或蛋白质和/或选择性标记的条件下。在一些实施例中，该方法进一步包括将该植物与第二植物杂交或自交该植物以产生子代植物。
13.在一些实施例中，本披露提供了通过上述实施例中任一项所述的方法产生的转基因植物，或其植物部分。在一些实施例中，该植物是双子叶植物。在一些实施例中，该植物是大豆植物。
附图说明
14.图1是显示t1大豆幼苗叶中bx9表达的图。hom＝纯合，het＝杂合。24244＝prgaubi599400；24245＝prgcubipi339656；24246＝prgtubipi505267；24247＝prgaef1api599400；24249＝prgasamspi599400，阴性对照；24276＝prgmsams，阳性对照。标记a010a、a021a、a027a等分别代表不同的事件。
15.图2是显示在生殖阶段的t1大豆成熟叶中bx9表达的图。hom＝纯合，het＝杂合。24244＝prgaubi599400；24245＝prgcubipi339656；24246＝prgtubipi505267；24247＝prgaef1api599400；24249＝prgasamspi599400，阴性对照；24276＝prgmsams，阳性对照。标记a027a、a021a、a023a等分别代表不同的事件。
16.图3是显示在生殖阶段的t1大豆根中bx9表达的图。hom＝纯合，het＝杂合。24244＝prgaubi599400；24245＝prgcubipi339656；24246＝prgtubipi505267；24247＝prgaef1api599400；24249＝prgasamspi599400，阴性对照；24276＝prgmsams，阳性对照。标记a027a、a021a、a023a等分别代表不同的事件。
17.图4是显示t1大豆种子荚中bx9表达的图。hom＝纯合，het＝杂合。24244＝prgaubi599400；24245＝prgcubipi339656；24246＝prgtubipi505267；24247＝prgaef1api599400；24249＝prgasamspi599400，阴性对照；24276＝prgmsams，阳性对照。标
记a027a、a021a、a023a等分别代表不同的事件。
18.图5是显示t1大豆纯合胚中bx9表达的图。24244＝prgaubi599400；24245＝prgcubipi339656；24246＝prgtubipi505267；24247＝prgaef1api599400；24249＝prgasamspi599400，阴性对照；24276＝prgmsams，阳性对照。标记a027a、a021a、a023a等分别代表不同的事件。
19.图6是显示t1大豆幼苗叶中bx9表达的图。hom＝纯合，het＝杂合。标记a010a、a005a、a016a等分别代表不同的事件。
20.图7是显示在生殖阶段的t1大豆纯合成熟叶中bx9表达的图。标记a010a、a005a、a016a等分别代表不同的事件。
21.图8是显示在生殖阶段的t1大豆纯合根中bx9表达的图。标记a010a、a005a、a016a等分别代表不同的事件。
22.图9是显示t1大豆纯合种子荚中bx9表达的图。标记a010a、a005a、a016a等分别代表不同的事件。
23.图10是显示t1大豆纯合胚中bx9表达的图。标记a010a、a005a、a016a等分别代表不同的事件。
24.对序列表中的序列的简述
25.seq id no:1是启动子prgaubipi599400。
26.seq id no:2是启动子prgcubipi339656。
27.seq id no:3是启动子prgtubipi505267。
28.seq id no:4是启动子prgaef1api599400。
29.seq id no:5是启动子prgmef1aglyma17g186600。
30.seq id no:6是启动子prgasams599400。
31.seq id no:7是启动子prgmsams。
32.seq id no:8是终止子tgmef1a17g18600。
33.seq id no:9是终止子tgtubipi505267。
34.seq id no:10是终止子tgaef1api599400。
35.seq id no:11是终止子tgmmip02g255000。
36.seq id no:12是终止子tgtmippi505267。
37.seq id no:13是终止子tgimippi546970。
38.seq id no:14是终止子tgcubipi339656。
39.seq id no:15是终止子tgtef1api441001。
40.seq id no:16是终止子tgaubipi599400。
41.seq id no:17是终止子tgcubipi595799。
42.seq id no:18是终止子tgcsamspi339656。
43.seq id no:19是终止子tgmrbpglyma11g117300。
44.seq id no:20是终止子tgmmipglyma19g186100。
45.seq id no:21是终止子tgasamspi599400。
46.seq id no:22是终止子tgamippi505151。
47.seq id no:23是终止子tgtef-02pi441001。
48.seq id no:24是终止子tgaef-02pi599400。
49.seq id no:25是终止子tgaadf3pi599400。
50.seq id no:26是终止子tgcef-02pi483193。
51.seq id no:27是终止子tgmpoxglyma07g260300。
52.seq id no:28是终止子tgtsamspi505267。
53.seq id no:29是终止子tgarbppi599400。
54.seq id no:30是终止子tmt51186。
55.seq id no:31是启动子prgaubipi599400-02。
56.定义
57.尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
58.除非下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在此采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的技术人员而言很清楚的那些技术的变化或等效技术的替换。
59.本文引用的所有的专利、专利公布、非专利公布对于引用中提及的有关句子或段落的传授内容通过引用以其全文并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
60.如本文所用，术语“一个(a)”或“一种(an)”或“该/所述(the)”可以是指一个或多于一个，除非上下文清楚地并明确地另外指明。例如，“一种”内源性核酸可以指一种内源性核酸或多种内源性核酸。
61.术语“约”在本文中用于表示大约、大致、约或在......左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指
±
1℃，优选
±
0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。
62.在本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意思是如此合并的元件中的“任一者或两者”，即在一些情况下结合出现或在其他情况下分离出现的元件。应以相同的方式解释以“和/或”列出的多个元件，即如此合并的元件中的“一个或多个元件”。无论关联或不关联特定识别的那些元件，都可以任选地提出与通过“和/或”条款具体识别的元件不同的其他元件。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言(如“包含”)结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施例中能够仅指代a(任选地包括不同于b的元件)；而在另一实施例中，能够仅指代b(任选地包括不同于a的元件)；而在又另一实施例中，指代a和b两者(任选地包括其他元件)；等。在本说明书和权利要求书中使用的“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。
63.如本文所用，“生物活性片段”是指参考序列的片段，该片段具有基本上等于(例如，至少90％等于)或大于参考序列的活性的活性。例如，参考启动子的生物活性片段将是能以与参考启动子相比基本上相等或更高的水平驱动编码序列表达的片段。
[0064]“编码序列”是转录成rna(如mrna、rrna、trna、snrna、正义rna或反义rna)的核酸序列。在一些实施例中，该rna随后在生物体内被翻译以产生蛋白质。
[0065]
如本文所用，术语“优良”和/或“优良品系”是指基本上纯合并且是针对所希望的
农艺表现的育种和选择而产生的任何系。
[0066]“增强子”是一种核苷酸序列，其可以刺激启动子的活性，并且可以是该启动子或插入的异源元件的一个固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。一级序列可以存在于双链dna分子中的任一个链上，并且甚至当放置在启动子的上游或下游时能够发挥功能。
[0067]
当参考多核苷酸(如植物的基因、orf或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由rna聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为rna(例如，mrna、rrna、trna或snrna)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白)通过mrna的“翻译”转化为蛋白的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。例如，在反义构建体或dsrna构建体的情况下，各自地表达可仅指该反义rna或仅指dsrna的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mrna)或功能性rna的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白的产生。
[0068]
如本文所用，“表达盒”意指能指导特定多核苷酸或多核苷酸在适当宿主细胞中表达的核酸分子，其包含可操作地连接至一种或多种目的多核苷酸(其可操作地连接至终止信号上)的启动子。表达盒还典型地包含需要一种或多种目的多核苷酸的适当的翻译的多核苷酸。该表达盒还可以包含在目的多核苷酸的直接表达中不是必需的但是由于用于从表达载体去除该表达盒的方便限制位点而存在的多核苷酸。包含一个或多个目的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地表达盒相对于宿主来说是异源的，即表达盒的特定多核苷酸在宿主细胞中不是天然存在的，并且必须已经通过本领域已知的转化方法引入至宿主细胞或宿主细胞的祖先中。该表达盒中的一个或多个多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物(如植物)的情况下，启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。
[0069]
如本文所用，术语“基因组编辑剂”是指能够诱导细胞基因组中的缺失、插入、插入缺失(indel)或其他修饰的试剂，例如，通过在基因组中产生单链或双链断裂。基因组编辑剂的实例包括crispr/cas试剂(例如，cas蛋白和指导rna)、转录激活因子样效应子核酸酶(talens)、dna指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶和锌指核酸酶。cas蛋白包括cas9、cpf1(也称为cas12a)、c2c1、c2c2和c2c3及其功能变体。实例cas9和cpf1蛋白包括化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)cas9(spcas9)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)cas9(stcas9)、巴氏链球菌(streptococcus pasteurianus)(spacas9)、空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)cas9(cjcas9)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(sacas9)、新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)cas9(fncas9)、灰色奈瑟球菌(neisseria cinerea)cas9(nccas9)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitis)cas9(nmcas9)、新凶手弗朗西斯菌cpf1(fncpfl)、氨基酸球菌属物种(acidaminococcus sp.)cpf1(ascpfl)、或毛螺菌科细菌(lachnospiraceae bacterium)nd2006 cpf1(lbcpfl)。cas蛋白的“变体”是指野生型cas蛋白的蛋白或多肽衍生物，例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短、融合蛋白或其组合的蛋白。在某些实施例中，cas变体是基本上保留野生型cas蛋白的核酸酶活性或具有比其更好的核酸酶活性的功能性变体。指导rna实例包括单指导rna和双指导rna。
[0070]“异源”核酸序列是天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列，包括天然存在的核酸序列的非天然存在的多拷贝。核酸序列还可以异源于与其相关的其他核酸序列，例如在核酸构建体中，如例如，表达载体。作为一个非限制性实例，启动子可以与一种或多种调节元件和/或编码序列组合存在于核酸构建体中，所述调节元件和/或编码序列不与那个特定启动子相关地天然存在，即它们与该启动子是异源的。
[0071]“分离的”核酸分子或核苷酸序列或“分离的”多肽是借助于人的手脱离其天然环境存在的和/或当与其在其天然环境中的功能相比时具有不同的、修饰的、调节的和/或改变的功能的并且因此不是天然的产物的核酸分子、核苷酸序列或多肽。分离的核酸分子或分离的多肽能以纯化形式存在或可以存在于非天然环境(例如像重组宿主细胞)中。因此，例如，相对于多核苷酸而言，术语分离的意指将该多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出。如果将一种多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体、染色体位置、和/或细胞中，则该多核苷酸也是被分离的。本发明的重组核酸分子和核苷酸序列可以被认为是如上文所定义的“分离的”。
[0072]
因此，“分离的核酸分子”或“分离的核苷酸序列”是核酸分子或核苷酸序列，该核酸分子或核苷酸序列不与在其衍生而来的生物体的天然存在的基因组中的与其邻近的核苷酸序列(位于5'端的序列或位于3’端的序列)相邻。因此，在一个实施例中，分离的核酸包括一些或全部的5'非编码(例如，启动子)序列，这些序列与编码序列的翻译起始位点或转录起始位点直接邻接。因此，该术语包括，例如，重组核酸，该重组核酸并入载体、并入自我复制的质粒或病毒、或并入原核生物或真核生物的基因组dna，或者它作为独立于其他序列的单独分子(例如，cdna或通过pcr或限制性内切核酸酶处理而得到的基因组dna片段)而存在。它也包括作为编码额外多肽或肽序列的杂合核酸分子的部分的重组核酸。“分离的核酸分子”或“分离的核苷酸序列”还可以包括以下核苷酸序列，该核苷酸序列源自并插入相同的天然原始细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在该核酸分子的天然状态中发现的那些不同的调节序列的控制下。
[0073]
术语“分离的”可以进一步指核酸分子、核苷酸序列、多肽、肽或片段，其实质上不含细胞材料、病毒材料、和/或培养基(例如，当通过重组dna技术产生时)、或化学前体或其他化学品(例如，当进行化学合成时)。另外，“分离的片段”是不作为片段天然存在并且不会在天然状态下如此存在的核酸分子、核苷酸序列或多肽的片段。“分离的”不必须意味着该制备是工业纯的(同质的)，但是它是足够纯的以提供处于一种可以用于预期目的形式的多肽或核酸。
[0074]
在本发明的代表性实施例中，“分离的”核酸分子、核苷酸序列和/或多肽具有是至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％纯(w/w)或更纯。在其他实施例中，“分离”的核酸、核苷酸序列和/或多肽表示与起始材料相比，实现所述核酸的至少约5倍、10倍，25倍、100倍、1000倍、10,000倍、100,000-倍或更大富集(w/w)。
[0075]
在植物细胞、植物和/或植物部分的上下文中，术语“引入”(introducing或introduce)意指核酸分子与植物、植物部分和/或植物细胞以这样一种方式接触，即该核酸分子进入植物细胞和/或植物和/或植物部分的细胞的内部。在引入多于一种核酸分子的情
况下，这些核酸分子可以被装配成单个聚核苷酸或核酸构建体的一部分，或装配成分开的聚核苷酸或核酸构建体，并且可以位于相同或不同的核酸构建体上。因此，可以在单个的转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入到植物细胞中。因此，本文使用的术语“转化”是指将异源核酸引入细胞。细胞的转化可以是稳定或瞬时的。因此，本发明的转基因植物细胞、植物和/或植物部分可以被稳定转化或瞬时转化。
[0076]
术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”在本文中可互换使用，并且在本文中用于指在最佳比对两个序列时，与测试(“主题”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸序列或氨基酸中相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员已知的并且可以使用已知方法进行，例如使用已知软件或计算机程序，如对蛋白质使用默认矩阵文件eblosum62，对dna使用ednafull(默认空位罚分)的emboss-6.6.0水工具中实施的史密斯和沃特曼算法。emboss-6.6.0可获得自例如以下bio-soft和open-bio，如以下网站：en.bio-soft.net/format/emboss.html或emboss.open-bio.org/html/adm/ch01s01.html。
[0077]
术语“核酸”或“多核苷酸”在本文可互换使用，并且是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的dna聚合物或聚脱氧核糖核苷酸或rna聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含生物rna或dna不典型的碱基的寡核苷酸，如2'-o-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另有说明，否则除任何明确指示的多核苷酸之外，本发明的特定核酸或多核苷酸任选地还包含或编码互补多核苷酸。核酸可以存在于载体中，如细胞、病毒或质粒中。
[0078]“可操作地连接”是指在单一核酸片段上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸的表达时(即，编码多核苷酸在启动子的转录控制下)，启动子与编码多核苷酸可操作地连接。正义方向或反义方向的编码多核苷酸能够与调节多核苷酸可操作地连接。
[0079]
术语“植物”是指任何植物，特别是农艺上有用的植物(例如种子植物)，并且“植物细胞”是该植物的结构单元和生理单元(包含细胞壁)，还可以指原生质体。该植物细胞可以是处于分离的单细胞或经培养的细胞的形式、或作为高等组织化的单位(如例如，植物组织、或分化成植物发育的任一阶段存在的结构的植物器官)的一部分。植物可以是单子叶植物或双子叶植物物种。
[0080]“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或培养细胞的形式，或作为高等组织化单位(如例如，植物组织、植物器官或整株植物)的一部分。
[0081]
如本文所用，术语“植物部分”包括但不限于：胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、芽、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、果壳、茎杆、根、根尖、花药、包括在植物和/或植物部分中完整的植物细胞、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。如本文所用，“芽”是指包括叶和茎的地上部分。此外，如本文所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，包括细胞壁并且也可以指原生质体。本发明的植物细胞可以处于分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织或
植物器官)的一部分。
[0082]
如本文所用，“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养中的任何植物组织。此术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。此术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
[0083]
如本文所用，术语“启动子”是指通常位于编码序列翻译起始位点上游(5')的多核苷酸，其通过提供对正确转录所需的rna聚合酶和其他因子的识别来控制编码序列的表达。例如，启动子可以含有包含被rna聚合酶识别的基础启动子元件的区域、含有编码序列的5'非翻译区(utr)的区域和任选地内含子。在一些实施例中，启动子包含已知或预测的编码序列的翻译起始位点上游(5')的约2kb区域或由其组成。
[0084]“调节元件”和“调节序列”在本文中可互换使用并且是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或翻译。调控序列包括增强子、启动子、翻译增强子序列、内含子、终止子和多聚腺苷酸化信号序列。它们包括自然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的序列。调节序列可以决定表达水平、表达的空间模式和时间模式，并且对于启动子的子集，决定在诱导性条件下的表达(由外部因子，例如光、温度、化学品和激素来调节)。调节序列可以是dna序列6-100个碱基对的短区域，这些短区域限定了反式作用因子如转录因子的结合位点。调节序列还可以是增强子，即dna序列的更长区域，这些更长区域可以在距核心启动子区域一个距离(有时距核心区域几千多个碱基)处发挥作用。调节序列活性可以受反式作用因子影响，这些反式作用因子包括一般的转录机构、转录因子和染色质装配因子。
[0085]
如本文所用，“终止子”负责超出编码序列的翻译终止位点的转录终止和正确的mrna多聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与目的可操作地连接的dna序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、目的dna序列、该宿主植物、或其任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括camv 35s终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子以及豌豆rbcs e9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用基因的天然转录终止子。例如，终止子可以含有包含编码序列的3'非翻译区(utr)和任选地额外的3'非转录序列的区域。在一些实施例中，终止子包含已知或预测的编码序列的翻译终止位点下游(3')的约1kb区域或由其组成。
[0086]“选择性标记”或“选择性标记基因”是指一种基因，该基因在一种植物细胞中的表达给予该细胞一种选择优势。“正向选择”是指转化的细胞，该转化的细胞获得其以前不能使用或不能有效使用的底物代谢能力，典型地通过转化并表达正向选择性标记基因。这种转化的细胞由此从大量未转化组织中生长出来。正向选择可以是来自植物生长调节剂的无活性形式的许多类型，然后通过转移的酶转化为活性形式来转化碳水化合物来源，这些碳水化合物来源不被非转化细胞(例如甘露糖)有效利用，其然后在转化后可得到酶，例如磷酸甘露糖异构酶，使其能够被代谢。与转化的细胞相比，不转化的细胞生长缓慢或根本不生长。与非转化细胞生长能力相比，其他类型的选择可能是由于用选择性标记基因的细胞转化，该选择性标记基因获得在阴性选择试剂(如抗生素或除草剂)存在下生长的能力。转化
细胞所具有的选择优势还可以是由于在所谓“阴性选择”中失去以前具有的基因。在这种情况下，所添加的化合物只对未失去亲本细胞(通常是转基因)中存在的特异性基因(阴性选择性标记基因)的细胞具有毒性。
[0087]
选择性标记的实例包括但不限于，提供对以下抗生素抗性或耐受性的基因，如卡那霉素(dekeyser等人1989,plant phys[植物生理学]90:217-23)、壮观霉素(svab和maliga 1993,plant mol biol[植物分子生物学]14:197-205)、链霉素(maliga等人1988,mol gen genet[分子基因遗传]214:456-459)、潮霉素b(waldron等人1985,plant mol biol[植物分子生物学]5:103-108)、博来霉素(hille等人1986,plant mol biol[植物分子生物学]7:171-176)、磺胺(guerineau等人1990,plant mol biol[植物分子生物学]15:127-136)、链丝菌素(jelenska等人2000,plant cell rep[植物细胞报告]19:298-303)、或氯霉素(de block等人1984,embo j[欧洲分子生物学学会杂志]3:1681-1689)。其他选择性标记包括提供对除草剂抗性或耐受性的基因，如赋予对包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类和嘧啶基硫代苯甲酸酯的除草剂的抗性的乙酰乳酸合酶(als)的s4和/或hra突变；5-烯醇-吡咯-莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)基因，包括但不限于描述在美国专利号4,940,935、5,188,642、5,633,435、6,566,587、7,674,598中的那些(连同所有相关的应用)，和草甘膦n-乙酰转移酶(gat)，其赋予对草甘膦的抗性(castle等人2004,science[科学]304:1151-1154，和美国专利申请公开号20070004912、20050246798、和20050060767)；bar，其赋予对草铵膦的抗性(参见例如美国专利号5,561,236)；芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxy alkanoate dioxygenase)或aad-1、aad-12、或aad-13，其赋予对2,4-d的抗性；基因(如假单胞菌hppd)，其赋予对hppd抗性；原卟啉原氧化酶(sprotophorphyrinogen oxidase)(ppo)突变体和变体，其赋予对过氧化除草剂的抗性，这些除草剂包括氟磺胺草醚、氟羧草醚钠、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵、氟噻甲草酯、嘧啶肟草醚、丙炔氟草胺、氟亚胺草酯、唑酮草酯、甲磺草胺；以及赋予对麦草畏的抗性的基因，如麦草畏单加氧酶(herman等人2005,j biol chem[生物化学杂志]280:24759-24767和美国专利号7,812,224，以及相关的申请和专利)。选择性标记的其他实例可以在sundar和sakthivel(2008,j plant physiology[植物生理学杂志]165:1698-1716)中发现，将该文献通过引用并入本文。
[0088]
其他选择系统包括使用药物、代谢物类似物、代谢中间体和酶用于转基因植物的正向选择或有条件的正向选择。实例包括但不限于编码其中甘露糖是选择剂的磷酸甘露糖异构酶(pmi)的基因，或编码其中d-木糖是选择剂的木糖异构酶的基因(haldrup等人1998,plant mol biol[植物分子生物学]37:287-96)。最后，其他选择系统可以使用无激素培养基作为选择剂。一个非限制性实例玉米同源盒基因kn1，其异位表达导致转化效率3倍增加(luo等人2006,plant cell rep[植物细胞报告]25:403-409)。各种选择性标记和编码他们的基因的实例披露在miki和mchugh(j biotechnol[生物技术杂志],2004,107:193-232；通过引用并入)中。
[0089]
在本披露的一些实施例，选择性标记可以是植物来源的。可以是植物衍生的选择性标记的实例包括但不限于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)。酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)催化植物中芳香族氨基酸生物合成常见的莽草酸通路中的重要步骤。除草剂草甘膦抑制epsps，因此杀死植物。可以通过引入修饰的epsps转基因产生转基因草甘膦耐受植物，该植物不由草甘膦影响(例如美国专利6,040,497；通过引用结合)。在草
甘膦的存在下可以被用作选择性标记的修饰的植物epsps的其他实例包括稻epsps的p106l突变(zhou等人2006,plant physiol[植物生理学]140:184-195)和在蟋蟀草epsps中的p106s突变(baerson等人2002,plant physiol[植物生理学]129:1265-1275)。不是植物来源的并可以被赋予草甘膦耐受性的epsps的其他来源包括但不限于来自鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)的epsps p101s突变(comai等人1985,nature[自然]317:741-744)以及来自土壤杆菌属菌株的cp4的cp4 epsps的突变的版本(funke等人2006,pnas[美国国家科学院院刊]103:13010-13015)。尽管植物epsps基因是细胞核，但是成熟酶位于叶绿体(mousdale和coggins 1985,planta[植物]163:241-249)。epsps合成为包含转运肽的前蛋白，随后该前体随后转运至叶绿体基质中并进行蛋白质水解以产生成熟酶(della-cioppa等人1986,pnas[美国国家科学院院刊]83:6873-6877)。因此，为了产生对草甘膦具有耐受性的转基因植物，可以引入正确地易位至叶绿体的epsps的适当的突变形式。然后此类转基因植物具有天然的、基因组的epsps基因，连同突变的epsps转基因。然后草甘膦可以被用作在转化和再生过程中的选择剂，由此仅用突变的epsps转基因成功地转化的那些植物或植物组织存活。
[0090]
如本文所用，术语“转化”是指将核酸转移到宿主细胞中，优选导致遗传稳定的整合，包括整合到染色体和可遗传的染色体外事件。在一些特定的实施例中，引入植物、植物部分和/或植物细胞中是经由细菌介导的转化，粒子轰击转化(也称为基因枪粒子转化)，磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，脂质体介导的转化，纳米粒子介导的转化，聚合物介导的转化，病毒介导的核酸递送，晶须介导的核酸递送，微量注射，超声波处理法，浸润法，聚乙二醇介导的转化，原生质体转化或导致向植物、植物部分和/或其细胞引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或其组合进行的。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括miki等人(“procedures for introducing foreign dna into plants[将外源dna引入植物中的程序]”在plant molecular biology and biotechnology[植物分子生物学和生物技术]的方法中)，glick,b.r.和thompson,j.e.编辑(crc press,inc.,boca raton[博卡拉顿crc出版社],1993,第67-88页)和rakowoczy-trojanowska(2002,cell.mol.biol.lett.[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。
[0091]
用于转化植物的程序在本领域中是熟知且常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括经由以下方式转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由来自土壤杆菌属的细菌)，病毒介导的核酸递送，碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送，脂质体介导的核酸递送，微注射，微粒轰击，磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，纳米粒子介导的转化，超声处理，渗入，peg介导的核酸吸收，以及使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学、化学、物理(机械)和/或生物学机制，包括其任何组合。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括miki等人(“procedures for introducing foreign dna into plants[将外源dna引入植物中的程序]”在plant molecular biology and biotechnology[植物分子生物学和生物技术]的方法中)，glick,b.r.和thompson,j.e.编辑(crc press,inc.,boca raton[博卡拉顿crc出版社],1993,第67-88页)和rakowoczy-trojanowska(cell.mol.biol.lett.[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。
[0092]
土壤杆菌介导的转化是用于转化植物的常用方法，因为它的高转化效率以及因为它与许多不同物种的广泛实用性。土壤杆菌介导的转化典型地涉及将携带目的外源dna的
二元载体转移至适当的土壤杆菌菌株，这可能取决于由宿主土壤杆菌菌株在共同存在的ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补体(uknes等人1993,plant cell[植物细胞]5:159-169)。将该重组二元载体转移至土壤杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌，一种辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶土壤杆菌菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移至土壤杆菌中(和willmitzer,1988,nucleic acids res.[核酸研究]16:9877)。
[0093]
通过重组土壤杆菌进行的植物转化通常涉及土壤杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的方法。典型地在携带位于这些二元质粒t-dna边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。
[0094]
另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物学活性的粒子。参见例如，美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有目的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕以使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性粒子(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有一个或多个试图被引入的核酸)推进到植物组织中。
[0095]
因此，在本发明的特定实施例中，植物细胞可以通过本领域内已知的任何方法并且如本文描述进行转化并且可以使用多种已知技术中的任一种来从这些经转化的细胞再生出完整的植物。在以下文献中描述了从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体进行的植物再生：例如，evans等人(handbook of plant cell cultures[植物细胞培养物手册],第1卷,macmilan publishing co.[麦克米兰出版公司],纽约(1983))；以及vasil i.r.(编辑)(cell culture and somatic cell genetics of plants[植物的细胞培养和体细胞遗传学],acad.press[美国学术出版社],奥兰多市,第i卷(1984)和第ii卷(1986))。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在本文提供的本发明的方法中。
[0096]“转基因植物”是具有含有异源dna序列的一个或多个植物细胞的植物。
[0097]
如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并且可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸的转录。“载体”被定义为除了其他之外还包括：在双链或单链的线型或环型中的任何质粒、黏粒、噬菌体或土壤杆菌二元载体，它们可能是或可能不是可自我传送的或可活动的，并且它们可以通过整合到该细胞的基因组中或存在于染色体外来转化一种原核或真核生物的宿主(例如，具有一个复制起点的自主的复制质粒)。特别包括的是穿梭载体，穿梭载体一词意指一种dna运载体，该dna运载体自然地或经设计能够在两个不同的宿主生物体中复制，这些宿主生物体可以选自：放线菌以及相关的物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。
具体实施方式
[0098]
本披露的一些方面涉及用于植物如大豆中异源序列的表达的调节元件，如启动子和终止子。
[0099]
在一些方面，本披露提供了与seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个具有
至少90％同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的核苷酸序列。在一些实施例中，该核苷酸序列包含seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个。在一些实施例中，该核苷酸序列包含seq id no:1-30，如1-5中的一个和seq id no:8-29中的一个。在一些实施例中，本披露提供了核苷酸序列，其包含seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的片段，例如生物活性片段(例如，seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个连续核苷酸的片段)。在一些实施例中，本披露提供了核苷酸序列，其包含seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的片段，例如生物活性片段(例如，seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个连续核苷酸的片段)。
[0100]
在一些方面，本披露提供了表达盒。在一些实施例中，该表达盒包含与seq id no:1-30，例如1-5或8-29中的一个或多个具有至少90％同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可操作地连接至异源核苷酸序列。在一些实施例中，该表达盒包含含有seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的核苷酸序列。在一些实施例中，该表达盒包含含有seq id no:1-30，如1-5中的一个和8-29中的一个的核苷酸序列。在一些实施例中，该表达盒包含核苷酸序列，其包含seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的片段，例如生物活性片段(例如，seq id no:1-30，如1-5或8-29中的一个或多个的至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个连续核苷酸的片段)。在一些实施例中，该表达盒进一步包含选择性标记。
[0101]
在一些实施例中，该异源序列是编码目的rna或蛋白质的目的核酸。在一些实施例中，该目的rna或蛋白质能赋予植物所希望的特征，如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力。在一些实施例中，该目的rna或蛋白质包含基因组编辑剂，例如crispr/cas剂(如cas蛋白和/或指导rna)、talen、dna指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在一些实施例中，该异源核苷酸序列编码选择性标记。
[0102]
在一些实施例中，该表达盒包含在载体，如质粒、病毒或土壤杆菌中。在一些实施例中，该表达盒包含在植物细胞内。在一些实施例中，该植物细胞是双子叶植物细胞。在一些实施例中，该植物细胞是大豆细胞。在一些实施例中，该大豆细胞是优良的大豆细胞。
[0103]
在一些实施例中，该表达盒包含在转基因植物中。在一些实施例中，该植物是双子叶植物。在一些实施例中，该植物是大豆植物。在一些实施例中，该大豆植物是优良的大豆植物。
[0104]
在一些实施例中，本披露提供了来自转基因植物的种子，例如，包含该表达盒的种子。
[0105]
在一些实施例中，本披露提供了由转基因植物或其部分产生的商品，例如，包含该表达盒的商品。在一些实施例中，该商品选自由以下组成的组：完整或加工过的种子、面粉、蛋白质分离物、浓缩物、液体、糖浆、糊状物、酱汁或其他食物或产品。
[0106]
本披露的其他方面涉及一种方法，例如转化方法，其包括将如本文所述的表达盒或载体引入植物或植物细胞中。在一些实施例中，该引入包括土壤杆菌介导的转化。在一些实施例中，该引入包括粒子轰击。在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括将植物或植物细胞置于由表达盒或载体表达目的rna或蛋白质和/或选择性标记的条件下。在一些实施例中，这些条件是植物或植物细胞的适当生长或维持条件。在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括将植物与第二植物杂交以产生子代植物。在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括自交该植物以产生子代植物。在一些实施例中，该植物或植物细胞是双子叶植物或植物细胞。在一些实施例中，该植物或植物细胞是大豆植物或植物细胞。在一些实施例中，该植物或植物细胞是优良的大豆植物或植物细胞。在一些实施例中，该第二植物是优良的大豆植物。
[0107]
在下文中，将通过以下实例详细描述本发明。然而，以下实例是对本发明的说明，本发明的范围不受以下实例限制。
[0108]
实例
[0109]
实例1：新颖启动子序列的鉴定和表征
[0110]
方法
[0111]
使用来自野生大豆属物种(银毛大豆、灰色大豆、澎湖大豆和短绒野大豆)的参考基因组，并基于对来自大豆的某些基因：泛素(ubi)、s-腺苷甲硫氨酸(sam)、肌动蛋白解聚因子(adf3)和翻译延伸因子ef-1α(ef1a)的直系同源物的鉴定获得候选启动子序列。使用rnaseq数据鉴定了额外的候选启动子序列，以鉴定大豆中表达在12-18log2归一化数据之间的基因，并将来自这些基因的推定启动子序列添加为候选。候选启动子序列是预测或已知翻译起始位点上游的2kb区域。候选启动子序列预计含有基础启动子元件，以及5'utr和可能的内含子(取决于预测或已知编码序列的结构)。
[0112]
为每种候选启动子设计载体，每种载体含有大豆密码子优化的bx9、玉米udp-葡糖基转移酶、苯并噁嗪9(玉米bx9的说明参见国际公开号wo 2018213022)，作为报告基因和终止子序列tmt51186(seq id no:30)。为了克隆方便，在启动子序列中进行了突变以去除任何ncoi和saci位点。5'utr中的atg也发生了突变。
[0113]
首先通过瞬时转化筛选载体。将所有载体与含有基线阳性对照启动子(prgmsams，seq id no:7)的载体的平均表达水平进行比较。使用14天龄的大豆植物进行瞬时转化。使用钢丝刷损坏第一组三叶的远轴面。然后将植物叶浸入土壤杆菌溶液中，该溶液含有测试构建体以及内部对照构建体(比率为1:1)。将每个土壤杆菌调整为600nm处od＝1.0。将浸没的植物置于真空室中并施加真空3-5分钟。将浸润的植物放置在带有透明塑料盖的托盘中以保持湿度。浸润后4天，在96孔块中对浸润的叶进行取样用于elisa测定。elisa使用了两种针对bx9蛋白产生的多克隆抗体。在4c下，将高结合聚苯乙烯板(nunc maxisorp#430341)用25mm硼酸盐，75mm nacl，ph 8.5中的10ug/ml山羊抗bx9包被过夜。用磷酸盐缓冲盐水 0.05％吐温-20(pbst)洗涤板五次。在elisa稀释剂(pbst 1％牛血清白蛋白)中制备标准品(160、80、40、20、10、5、2.5和0ng/ml的纯化bx9蛋白)。将100微升的每个适当稀释的样品或标准品添加到板中，在环境温度下以200rpm震荡孵育1小时，并洗涤五次。然后将在elisa稀释剂中稀释至1ug/ml的兔抗bx9(100ul/孔)添加到板中，在环境温度下以200rpm震荡孵育1小时，并如前所述洗涤。在elisa稀释剂中将共轭至碱性磷酸酶的驴抗-兔(杰克逊免疫研究
实验室(jackson immunoresearch)，西格罗夫(west grove)，宾夕法尼亚州)以1ug/ml添加至该板(100ul/孔)中，在环境温度下以200rpm震荡孵育，并洗涤。添加底物磷酸对硝基苯酯(surmodics公司，伊登普雷利(eden prairie)，明尼苏达州)，并允许在室温下显色15-30分钟。使用酶标仪(biotek powerwave xs2，威努斯基(winooski)，佛蒙特州)在405nm下测量吸光度。标准曲线使用四参数曲线拟合来绘制浓度比对吸光度。为将提取效率归一化，将分析物(bx9)浓度除以总可溶性蛋白(tsp)浓度。使用piercetm bca(二辛可宁酸)蛋白测定法(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))测量tsp。
[0114]
基于生成的数据，选择含有prgasams599400(参见表1)的载体作为阴性对照以进行额外的研究。
[0115]
然后选择载体的子集并将其稳定转化到大豆植物中，并在t0和t1事件中进行验证，并与阳性对照和阴性对照进行比较。用氯气对大豆(soybean)(大豆(glycine max)，品种06kg212440)种子进行过夜灭菌。将灭菌的种子浸入发芽培养基(soygerm)中，种脐朝下。将种子在黑暗中在22℃-24℃下孵育约16小时。如国际公开号wo 2004000006中所述，使用浸渗的种子制备外植体。通过将分离的未成熟种子外植体与感染培养基(soyinf：1/2x ms盐、1x b5维生素、2g/l蔗糖、1g/l葡萄糖、4g/l mes[2-(n-吗啉代)乙磺酸]、2mg/l玉米素核苷和200μm乙酰丁香酮，ph 5.4)中的细菌悬浮液混合，来将制备的外植体立即用含有各自的二元载体的无害chry5d3根癌土壤杆菌菌株感染。将混合物在室温下孵育至少30分钟或至过夜。感染后，将外植体从土壤杆菌悬浮液中取出并置于共培养培养基，如soyccm 2zt(1/2x ms盐、1x b5维生素、2g/l蔗糖、1g/l葡萄糖、4g/l mes、2mg/l玉米素核苷和200μm乙酰丁香酮，ph 5.4，含6g/l纯化琼脂)中，优选地近轴(平面)侧朝上。将共培养板在23℃下在黑暗中孵育3至5天。
[0116]
共培养后，将外植体的细长下胚轴修剪到刚好在子叶节下。将外植体转移到没有选择剂的恢复培养基，如soyr0(3.1g/l b5盐、1x b5维生素、0.8x ms铁、3％蔗糖、1g/l mes、2mg/l bap、0.1g/l天冬酰胺、50mg/l特美汀、200mg l-1头孢噻肟和50mg/l万古霉素、7g/l琼脂，ph 5.7)(具有适当抗生素以抑制土壤杆菌生长)中。将子叶节末端插入培养基中。将具有外植体的板在24摄氏度下、在16小时光照/8小时黑暗的方案和》80μe/m2/s下孵育约7-10天。
[0117]
恢复期后，将外植体以及子叶转移到再生培养基，如soyr1(3.1g/l b5盐、1x b5维生素、0.8x ms铁、3％蔗糖、1g/l mes、2mg/l bap、0.1g/l天冬酰胺，7g/l纯化琼脂，ph 5.7，以及适当的选择剂，例如als除草剂或草甘膦)中约2-3周。在再生/选择培养基(如soyr1)中约2-3周后，将发育的多个芽簇转移到伸长培养基soye1(1x ms基础盐、1x b5维生素、0.8x ms铁、3％蔗糖、0.6g/l mes、50mg/l天冬酰胺、100mg/l谷氨酸、0.1mg/l iaa、0.5mg/l ga3、1mg/l玉米素核苷、50mg/l替卡西林、75mg/l头孢噻肟，ph 5.7，用0.7％琼脂固化，以及适当的选择剂，例如als除草剂或草甘膦)以伸长芽。每2-4周对新鲜伸长培养基soye1进行继代培养，直到伸长的芽(》3cm)长到足以转移到土壤中，以在装满水以保持土壤湿润的无孔二级托盘内的托盘中直接生根。约2周后移除塑料圆顶，并对叶进行取样以进行taqman分析，以鉴定目的基因呈阳性的植物。
[0118]
结果
[0119]
在瞬时转化测定中测试了含有31种不同候选启动子的31种载体。在这31种中，发
现5种具有与已知具有高组成型表达的阳性对照启动子相当或更好的表达水平(参见表1)。选择具有相对于测定中的对照的较差表达的启动子prgasams599400作为稳定转化测定中的阴性对照。
[0120]
表1.启动子瞬时转化表达测定结果
[0121][0122]
然后，在稳定转化测定中测定表1中显示具有与阳性对照相比更好活性的四种候选启动子。
[0123]
在瞬时和t0事件两者中，与阳性对照相比，四种候选启动子均显示在幼苗叶中驱动更高的bx9表达(参见表2，t0数据来自单拷贝事件)。
[0124]
表2.报告子在幼苗叶中的表达
[0125][0126]
表2(续)
[0127][0128]
表2(续)
[0129][0130][0131]
与阳性对照相比，四种候选启动子还显示在t1幼苗叶中驱动更高的bx9表达(参见图1)。与阳性对照相比，四种候选启动子还显示在生殖阶段的t1成熟叶和t1根中驱动更高的bx9表达(参见图2和3)。与阳性对照相比，四种候选启动子还显示在t1种子荚中驱动更高或相当的bx9表达(参见图4)。与阳性对照相比，四种候选启动子中的三种还显示在t1胚中驱动更高或相当的bx9表达(参见图5)。修饰启动子prgaubipi599400以产生prgaubipi599400-02，其以可接受的水平驱动ccp4epspsctp2-01的表达。显示不同阶段启动子之间比较的额外数据示于下表3中。
[0132]
表3.构建体水平的启动子比较
[0133][0134]
表3(续)
[0135]
[0136][0137]
总之，这些数据显示四种选择的候选启动子在多种组织中高表达，并预期可用作组成型启动子，以用于在大豆中的表达构建体中使用。实例2：新颖终止子序列的鉴定和表征
[0138]
方法
[0139]
候选终止子序列源自实例1中测试的基因并测试终止子活性。候选终止子序列是预测或已知翻译终止位点下游的1kb区域。候选终止子序列预计含有3'utr和可能地额外的3'非转录序列(取决于预测或已知编码序列的结构)。
[0140]
为每种候选终止子设计载体，每种载体含有bx9作为报告基因和启动子序列prgmsams(seq id no:7)。首先使用实例1中描述的方法通过瞬时转化筛选载体。将所有载体与含有基线阳性对照终止子(tmt51186，seq id no:30)的载体的平均表达水平进行比较。如实例1中所述，通过elisa测量表达水平。
[0141]
然后选择载体的子集并将其稳定转化到大豆植物中，并在t0和t1事件中进行验证，并与阳性对照和阴性对照进行比较。转化和分析方法与实例1中描述的那些相同。
[0142]
结果
[0143]
在瞬时转化测定中测试了含有29种不同候选终止子的29种载体。在这29种中，发现22种具有与已知支持高组成型表达的阳性对照终止子相当或更好的表达水平(参见表4)。
[0144]
表4.终止子瞬时转化表达测定结果
[0145][0146]
然后，在稳定转化测定中测定在表4中显示具有与阳性对照相比更好活性的六种候选终止子。
[0147]
在瞬时和t0事件两者中，与阳性对照相比，六种候选终止子均显示在幼苗叶中驱动更高的bx9表达(参见表5，t0数据来自单拷贝事件)。
[0148]
表5.报告子在幼苗叶中的表达
[0149][0150]
与阳性对照相比，六种候选终止子还显示在t1幼苗叶中驱动更高或相当的bx9表达(参见图6)。与阳性对照相比，六种候选终止子还显示在生殖阶段的t1成熟叶和t1根中驱动更高或相当的bx9表达(参见图7和8)。与阳性对照相比，六种候选终止子还显示在t1种子荚中驱动更高或相当的bx9表达(参见图9)。与阳性对照相比，六种候选终止子中的五种还显示在t1胚中驱动更高或相当的bx9表达(参见图10)。显示不同阶段启动子之间比较的额外数据示于下表6中。
[0151]
表6.构建体水平的终止子比较
[0152][0153]
表6(续)
[0154][0155]
注释：平均值为纯合t1植物中的bx9表达(ng bx9/mg总可溶性蛋白)
[0156]
总之，这些数据显示六种选择的候选终止子支持在多种组织中高表达，并预期可用于大豆中的表达构建体中。