一种功能性乳清多肽及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物活性肽深加工的技术领域，特别涉及一种功能性乳清多肽及其制备方法。


背景技术：

2.乳清蛋白不但是人体所需的优质蛋白来源，而且乳清蛋白及其内源性肽具有多种生物学功能。如王磊在“乳清蛋白及其活性多肽的生物学功能研究进展”一文中指出，乳清蛋白中含有具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化等生物活性的潜在肽段。关于乳清蛋白制备功能性多肽的报道较多的是抗氧化肽，如ferreira等国外学者用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制备了血管紧张素转换酶(ace)抑制肽。
3.也有实验表明，乳清蛋白及其内源性肽具有的降血糖尤其是降餐后血糖的功效，如吴尚仪等在“乳清蛋白及其生物活性肽调节血糖功能研究进展”一文中指出，乳清蛋白证实具有延缓2型糖尿病的功效，但是乳清蛋白调节血糖的效果较弱。
4.目前的研究认为，乳清蛋白及其活性肽调节血糖机理包括：改善胰岛素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶活性、促进肠促胰素分泌等。如徐庆等在“乳清蛋白水解法及其多肽对kkay小鼠血糖的影响”的研究中，用碱性蛋白酶水解乳清蛋白,分离得到分子量在900-1900da的活性多肽,但水解度仅为 14.8％，该混合多肽能降低kkay糖尿病小鼠的空腹血糖，改善糖耐量。赵红星在“降血糖活性肽制备及抑制α-葡萄糖苷酶活性肽纯化与鉴定”一文中报道:用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分别酶解乳清蛋白，得到的乳清多肽水解液的α-葡萄糖苷酶抑制率都不高，其中碱性蛋白酶相对其他两种蛋白酶的多肽水解液最高,最高抑制率为37.8％，水解度约40％。
5.总之，现有乳清多肽的研究主要考查了水解度，没有涉及使多肽得率和葡萄糖苷酶抑制率同时提高到较高水平的问题。


技术实现要素：

6.为解决上述背景技术中提到的问题，本发明提供一种功能性乳清多肽的制备方法，先将乳清蛋白粉与水混合制得的乳清蛋白溶液，然后采用酸溶液调节ph至2.5～3.5并均质得到乳清蛋白浆液；此处均质前调酸可使蛋白质凝聚沉淀，然后通过高压均质可以把凝块打碎细化，有利于加蛋白酶后水解，若均质后再调酸仍会使蛋白质凝聚结块，但不利于蛋白酶水解。
7.所述乳清蛋白浆液先采用酸性蛋白酶水解并离心得到上清液a和沉淀物 b；
8.再采用中性蛋白酶对所述沉淀物b的水溶液进行水解并离心得到上清液 c，将所述上清液a和上清液c混合后，采用膜分离得到分子量＜3000da的多肽滤液，经浓缩即得所述功能性乳清多肽。
9.在一实施例中，所述功能性乳清多肽还可以通过喷雾干燥制成功能性乳清多肽粉。
10.在一实施例中，所述乳清蛋白粉的蛋白质量含量大于等于80％。
11.在一实施例中，所述乳清蛋白粉与水按质量比1:15～25混合，优选地，其混合用水采用中硬度的水。
12.优选地，所述乳清蛋白溶液在均质前先加热至65～75℃后，再用高压均质机在12～18mpa压强下对乳清蛋白浆液均质一次，均质前加热可以加速乳清蛋白中多肽水解，提高多肽得率。
13.在一实施例中，所述酸性蛋白酶的酶解条件为在43～58℃保温水解60～ 110min，灭酶条件为煮沸灭酶1～3min，优选采用黑曲霉酸性蛋白酶3.350(来源aspergillus.niger 3.350)，并按乳清蛋白粉质量添加3000～6000u/g。
14.在一实施例中，所述中性蛋白酶的酶解条件为在ph为7.0～7.5，42～55℃下水解70～150min；灭酶条件为煮沸灭酶5～10min，优选采用枯草杆菌中性蛋白酶(来源bacillus subtilis)，并按乳清蛋白粉质量添加4000～7000u/g。
15.在一实施例中，所述分子量为＜3000da的多肽滤液浓缩至多肽含量为10％以上低温保存。
16.在一实施例中，所述膜分离的方法为先经孔径0.22～0.45μm的微滤膜微滤，再经过截留分子量3000da的超滤器超滤。
17.具体地，一种功能性乳清多肽的制备方法，包括以下制备步骤：
18.s100、制备乳清蛋白浆液：将蛋白质含量为80％以上的浓缩乳清蛋白粉与水以1:15～25的质量比混合溶解得到乳清蛋白溶液，然后采用酸溶将乳清蛋白溶液调到ph至2.5～3.5；加热到65～75℃后用高压均质机在12～18mpa 压强下对乳清蛋白浆液均质一次，得到乳清蛋白浆液；
19.s200、第一次酶解：在乳清蛋白浆液中按乳清蛋白粉质量加入黑曲霉酸性蛋白酶(来源aspergillus.niger 3.350)3000～6000u/g，在43～58℃保温水解60～110min；然后煮沸灭酶1～3min，灭酶液离心分离得到上清液a和沉淀物b两部分；
20.s300、第二次酶解：在沉淀物b加入乳清蛋白粉质量8～12倍的中等硬度水和4000～7000u/g的枯草杆菌中性蛋白酶(来源bacillus subtilis)，采用碱液调ph到7.0～7.5，在42～55℃水解70～150min；水解结束后煮沸灭酶5～10min，然后离心取得上清液c。
21.s400、膜分离与浓缩:上清液c与上清液a混合，先经孔径0.22～0.45 μm的微滤膜微滤，再经过截留分子量3000da的超滤器超滤，得到的多肽滤液经浓缩即得所述功能性乳清多肽。
22.本发明还提供一种功能性乳清多肽，采用如上任意所述的功能性乳清多肽的制备方法制得。
23.基于上述，与现有技术相比，本发明提供的一种功能性乳清多肽的制备方法具备如下有益效果：
24.1、乳清蛋白通过酸性蛋白酶第一次水解后，分离出的残渣用中性蛋白酶再进行第二次水解，两次水解物均具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，两次水解的多肽合并后，活性肽得率提高到60％以上，多肽含量在15mg/ml时的a-葡萄糖苷酶抑制率在60％左右，在30mg/ml时的a-葡萄糖苷酶抑制率达到78％。
25.2、膜分离过程中只用3000da的超滤膜超滤一次，不经过纳滤处理，即可获得有较
高的多肽得率和a-葡萄糖苷酶抑制率的多肽，降低了能耗成本，应用性优势显著提高。
26.本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书中所指出的结构和/或组分来实现和获得。
附图说明
27.图1为实施例4中多肽浓度与α-葡萄糖苷酶的抑制率的曲线图。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。
30.本发明提供如下实施例
31.实施例1
32.s100、制备乳清蛋白浆液：将100克浓缩乳清蛋白粉加入1600克水混合溶解，然后用苹果酸溶液将乳清蛋白溶液调节ph至2.8；加热到70℃后用高压均质机在18mpa压强下对乳清蛋白浆液均质一次，得到乳清蛋白浆液；
33.s200、第一次酶解：在乳清蛋白浆液中加入35万u的黑曲霉酸性蛋白酶 3.350，在43℃保温水解110min；水解后，煮沸灭酶3min，灭酶液用离心机离心分离得到上清液a和沉淀物b两部分；
34.s300、第二次酶解：向沉淀物b加入1000克的水、40万u的枯草杆菌中性蛋白酶，ca(oh)2溶液调ph至7.5，在48℃二次水解120min，定时加碱液保持ph稳定；水解结束后煮沸灭酶5min，然后离心取得上清液c；
35.s400、膜分离:上清液c与上清液a混合，先经孔径0.45μm的微滤膜微滤，微滤液检测过多肽得率后，分别用截留分子量为10000da、5000da、 3000da和1000da的超滤膜及300da的纳滤膜分离，得到6个分子量mw组分 (5000～10000da、3000～5000da、1000～3000da、mw＜1000da、300～3000da 和mw＜3000da)。将6段多肽分离液调整到多肽含量15mg/ml后，分别测定各样品的α-葡萄糖苷酶活抑制率和肽段占比，测试结果如表1所示：
36.其中,α-葡萄糖苷酶的抑制率的测定方法参考论文《桑叶不同提取部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性体外研究”(作者唐明敏等)》；
37.多肽得率q的计算:q＝(s*t*100％)/w；式中,s为水解液(离心或超滤)中多肽的含量g/ml。t为水解液的体积ml。w为水解原料液中的粗蛋白含量g表1-各段多肽的含量分布和α-葡萄糖苷酶活的抑制率/％
38.多肽分离液样品5000-10000da3000-5000da1000-3000da＜1000da＜3000da300-3000daα-葡萄糖苷酶抑制率％-0.7850.7415.6361.1061.92多肽分布％4.3211.1571.3013.2384.5381.46
39.从测试结果可知，虽然有三段多肽的α-葡萄糖苷酶抑制率在50％以上，但是抑制活性较高的多肽段为mw＜3000da和300-3000da。不过，经过纳滤分离的300～3000da多肽段与未经纳滤的mw＜3000d多肽的抑制率相近，没有明显差距。而凝胶层析法分析多肽分布表明，mw＜3000da段的多肽比例最高，占总多肽的84.53％，意味着该段多肽得率最高，而且可以省去的纳滤，性价比最高，因此选择这段多肽为目的多肽即本发明所要制备的功能性乳清多肽。
40.将上述经过超滤得到的分子量3000da以下的乳清多肽液进一步浓缩，喷雾干燥，得到功能性乳清多肽粉。经检测，本例的乳清多肽的多肽得率为 66.3％，将乳清多肽粉稀释到多肽浓度15mg/ml时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为60.58％，说明上述的功能性乳清多肽经浓缩和喷雾干燥制得功能性乳清多肽粉的过程中其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性基本保持不变。
41.实施例2
42.s100、制备乳清蛋白浆液：将两份50克浓缩乳清蛋白粉分别加入1200 克水中混合溶解，标记为d料液和f料液，用乳酸溶液将d料液和f料液调到ph至3.0；加热d料液和f料液到75℃；将d料液在15mpa压强下对高压均质一次，f料液不均质，75℃保温5min后自然冷却到室温，之后d料液和f料液的工艺操作均相同；
43.s200、第一次酶解：经前处理的d料液和f料液分别加入黑曲霉酸性蛋白酶22.5万u，在58℃保温水解60min；水解后煮沸灭酶1min，灭酶后，d 料液和f料液分别用离心机分离均得到上清液a和沉淀物b各两部分；
44.s300、第二次酶解：分别向d料液和f料液分离得到的沉淀物b中加入 500克的中硬度水、30万u的枯草杆菌中性蛋白酶，用naoh溶液调ph值到 7.0，在43℃水解150min；定时加碱液保持ph值稳定，水解结束后煮沸灭酶 8min，然后离心分离取得两份上清液c。
45.s400、膜分离与干燥将d料液和f料液的上清液c分别与各自的上清液 a混合，然后用孔径0.22μm的微滤膜微滤，滤液再用3000da的超滤膜超滤，分别对d、f两种超滤液检测多肽得率，然后通过浓缩和喷雾干燥，最终得到 d和f两种乳清多肽粉。
46.对本实施例制得的d和f两种乳清多肽粉进行检测，发现乳清多肽粉d 的相对蛋白的多肽得率为65.47％，乳清多肽粉f的多肽得率为56.33％；
47.将二者分别稀释到多肽浓度为6mg/ml，检测α-葡萄糖苷酶活的抑制率分别为36.5％和36.7％。经对比可知，乳清蛋白经过16mpa高压均质处理，有利于蛋白质二级和三级结构的打开，以便酶解，从而提高可多肽得率10％左右，但是否经过高压均质处理对多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性没有明显影响。
48.实施例3
49.s100、制备乳清蛋白浆液：将100克浓缩乳清蛋白粉加入2000克水混合溶解，然后用盐酸溶液将乳清蛋白溶液调到ph为3.3；加热到72℃后用高压均质机在13mpa压强下对乳清蛋白浆液均质一次，得到乳清蛋白浆液；
50.s200、第一次酶解：在乳清蛋白浆液中加入60万u的黑曲霉酸性蛋白酶，在48℃保
温水解100min；水解后，煮沸灭酶2min，灭酶料液离心分离得到上清液a和沉淀物b两部分。
51.s300、第二次酶解：向沉淀物b加入1000克的中硬度水、60万u的枯草杆菌中性蛋白酶，naoh溶液调ph至7.2，在52℃二次水解90min，定时补碱保持ph值稳定；水解结束后煮沸灭酶8min，然后离心取得上清液c
52.s400、膜分离、喷雾干燥：上清液c与上清液a混合，先经0.22μm的微滤膜微滤，再经过截留分子量3000da的超滤器超滤，得到的为多肽滤液经浓缩后喷雾干燥，得到功能性乳清多肽粉。
53.本发明还提供如下对比例
54.对比例1
55.除去实施例3中的中性蛋白酶水解环节，其余操作均与实施例3一致。
56.对比例2
57.100克浓缩乳清蛋白与2000克中硬度水混合溶解后，加热到72℃，在 13mpa压强下对浆液均质一次，然后直接加入60万u的枯草杆菌中性蛋白酶水解一次，(未经过黑曲霉酸性蛋白酶水解)其余操作与实施例3一致。
58.对比例3
59.采用解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶(来源bacillus amylpoliquefaciens) 代替实施例3中的枯草杆菌中性蛋白酶对沉淀物b进行水解，其余与实施例3 一致。
60.对比例4
61.采用蜂蜜曲霉中性蛋白酶(来源aspergillus melleus)代替实施例3中的枯草杆菌中性蛋白酶对沉淀物b进行水解，其余与实施例3一致。
62.对比例5
63.采用宇佐美曲霉酸性蛋白酶(来源aspergillus.usammi 3.758)代替实施例3中的黑曲霉酸性蛋白酶进行水解，其余与实施例3一致。
64.对比例6
65.采用米曲霉酸性蛋白酶(来源aspergillus oryzae)代替实施例3中的黑曲霉酸性蛋白酶进行水解，其余与实施例3一致。
66.检测实施例3和对比例1至6制备获取的功能性乳清多肽粉的多肽得率，以及配制成多肽质量浓度为20mg/ml后检测其α-葡萄糖苷酶活抑制率，结果如表2所示：
67.表2α-葡萄糖苷酶活抑制率(20mg/ml)和多肽得率统计表
[0068][0069]
从表2的测试结果可以看出：
[0070]
对比例1仅用黑曲霉酸性蛋白酶3.350水解乳清蛋白，多肽水解液的α
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葡萄糖苷酶抑制率和多肽得率只有实施例3的58％和52％；可见，仅用黑曲霉酸性蛋白酶水解的乳清多肽抑制活性和经济性都不好。
[0071]
对比例2仅用枯草杆菌中性蛋白酶水解乳清蛋白，结果多肽得率和α-葡萄糖苷酶活抑制率仅为实施例3的42％和17.1％；可见，枯草杆菌中性蛋白酶水解乳清蛋白虽能产生
一些有α-葡萄糖苷酶抑制作用的多肽，但是多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制活性依然很低。
[0072]
对比例3和对比例4分别用蜂蜜曲霉中性蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶替换枯草杆菌中性蛋白酶，所得的多肽水解液对α-葡萄糖苷酶抑制率均和对比例1相近，说明这两种蛋白酶均不能通过水解乳清蛋白残渣进一步产生抑制α-葡萄糖苷酶活的多肽；以及第一次酶解的残渣蛋白不是这两种中性蛋白酶的适宜底物。
[0073]
对比例5和对比例6分别将3.350酸性蛋白酶替换为537酸性蛋白酶和米曲霉酸性蛋白酶，虽然二者的水解多肽得率较高，但是α-葡萄糖苷酶抑制率很低，均与对比例2相近；说明这两种酸性蛋白酶得到的乳清蛋白水解肽未具备明显的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
[0074]
通过实施例3与其他对比例的分析可知，黑曲霉酸性蛋白酶水解得到的乳清多肽的α-葡萄糖苷酶抑制率达40％(20mg/ml)左右，而其他酸性蛋白酶不能产生这种活性多肽。而被黑曲霉酸性蛋白酶降解后的残渣蛋白是枯草杆菌中性蛋白酶进一步水解出α-葡萄糖苷酶抑制肽的适宜底物，而不是其他中性蛋白酶的适宜底物，所以用其他中性蛋白酶水解得不到较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
[0075]
以上对比说明，黑曲霉酸性蛋白酶一次水解 枯草杆菌中性蛋白酶二次水解沉淀是获得较高α-葡萄糖苷酶抑制率和较高多肽得率的最佳工艺。
[0076]
实施例4
[0077]
s100、制备乳清蛋白浆液：将500克浓缩乳清蛋白粉与10kg中硬度的水混合溶解为乳清蛋白溶液后，用乳酸溶液将乳清蛋白溶液调到ph至2.8；加热到75℃后用高压均质机在16mpa压强下对乳清蛋白浆液均质一次，得到乳清蛋白浆液。
[0078]
s200、第一次酶解：在乳清蛋白浆液中加入黑曲霉3.350酸性蛋白酶 200万u，在50℃保温水解80min后，煮沸灭酶2min，灭酶水解液离心分离得到上清液a和沉淀物b。
[0079]
s300、第二次酶解：向沉淀物b加入5kg中硬度水和枯草杆菌中性蛋白酶250万u，用naoh溶液调ph到7.5，沉淀浆料在45℃水解130min后，煮沸灭酶8min，然后离心取得上清液c。
[0080]
s400、膜分离和浓缩:上清液c与上清液a混合后，先经0.45μm的微滤膜微滤和3000da超滤，得到分子量小于3000da的多肽滤液，将多肽滤液浓缩到多肽浓度12％后，在1～4℃低温保存。
[0081]
通过计算该实施例的多肽得率(相对蛋白)为67.3％，同时将得到多肽浓缩液分别稀释到多肽含量5mg/ml至30mg/ml，测得各浓度下的抑制率，其结果如图1所示，多肽含量在5mg/ml至20mg/ml范围内与α-葡萄糖苷酶的抑制率呈线性量效关系，线性对应性好。
[0082]
本发明还采用该实施例制得的功能性乳清多肽浓缩液进行动物实验，观察对健康和高血糖实验小鼠餐后血糖的影响，具体试验过程如下：
[0083]
(1)正常小鼠餐后血糖试验
[0084]
选取24只前期检测葡萄糖耐量正常的雄性成年昆明种小鼠，随机分为 3组，每组8只，分别为空白组、乳清蛋白实验组和乳清多肽实验组：
[0085]
空白组灌胃2.0g/kg bw的蔗糖(蒸馏水溶解)；
[0086]
乳清蛋白实验组灌胃2.0g/kg bw的蔗糖和2.0g/kg bw的浓缩乳清蛋白 (蒸馏水溶解)；
[0087]
乳清多肽实验组灌胃2.0g/kg bw的蔗糖和0.3g/kg bw的乳清多肽(蒸馏水溶配)。
[0088]
各组小鼠禁食12h后灌胃计时，分别于0min和60min由眼静脉丛取血测定血糖值，结果如表3所示：
[0089]
表3乳清蛋白与多肽灌胃对健康小鼠糖耐量的影响(n＝8，x
±
s)
[0090][0091]
注：与本组0时相比，**p＜0.01；*p＜0.05；#与空白组60min后相比，p＜0.05。
[0092]
由表3可知，经灌胃蔗糖60min后，各组血糖值较0时均显著升高，但是乳清多肽组上升的幅度较小，本组差异为(p＜0.05)，表现出较好的控制餐后血糖作用。乳清多肽组小鼠的血糖值比空白组显著减少(p＜0.05)，说明乳清多肽有降血糖显著。结合前期试验，判断其降低餐后血糖可能是通过抑制α-葡萄糖苷酶活性实现的。乳清蛋白组餐后60min血糖虽有下降，但是与空白组相比无显著性差异(p＞0.05)，说明乳清蛋白对正常小鼠餐后血糖的影响不明显。
[0093]
(2)乳清多肽对模型糖尿病小鼠降血糖实验
[0094]
选择前期腹腔注射四氧嘧啶建模成功的、血糖值在16～30mmol/l的雄性昆明种小鼠作为糖尿病模型鼠。结合小鼠体重及血糖值编号并随机分为3组，每组10只，分别为模型组(灌蒸馏水1ml/kg bw)、乳清多肽组(灌0.3g/kgbw)和阿卡波糖对照组(灌10mg/kg bw)，另取正常小鼠10只，设为基础组 (灌蒸馏水1ml/kg bw)。每天灌胃一次，连续3周，饲养过程中小鼠自由采食基础饲料与饮水。实验结束后，禁食4小时，眼眶取血，血糖测定仪测定各组小鼠的血糖值，用spss软件分析。
[0095]
表4乳清多肽对糖尿病小鼠血糖的影响(n＝10，x
±
s)
[0096][0097]
注：与模型组相比，**p＜0.01；与阿卡波糖组比，##p＜0.01；#p＜0.05。
[0098]
由表4可见，阿卡波糖对照组和乳清多肽组经过三周的灌胃实验后，血糖值与模型组相比均显著下降p＜0.01，说明长期服用本例的乳清多肽具有显著降血糖作用。乳清多肽组的降血糖效果可能与多肽抑制α-葡萄糖苷酶活性有关，与药物阿卡波糖的降糖方式相近。虽然乳清多肽组降糖效果不如阿卡波糖，与阿卡波糖组存在显著差异(p＜0.05)，但该多肽属于蛋白类食品，不但可以降糖，还可以补充人体所需要的蛋白质和氨基酸。本实验也说明，本发明的乳清α-葡萄糖苷酶抑制肽可以抵抗肠胃蛋白酶的破坏，保持一定的活性，从而发挥降血糖功效，因此，可以开发为高血糖人群的功能食品。
[0099]
另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是，本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员应当理解，对于一个权利要求中没有
提到的内容不应当作为对于该权利要求的限制。
[0100]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。