修饰的Fc-区以增强抗体及其抗原结合片段的功能性亲和力的制作方法

修饰的fc-区以增强抗体及其抗原结合片段的功能性亲和力
技术领域
1.发明涉及鉴定小鼠igg3抗体(mab)内负责分子间协同性的关键残基，并将其转移到igg1抗体中以增强其功能性亲和力和直接细胞杀伤。


背景技术：

2.小鼠(m)igg3对细菌感染具有高度保护作用，是形成非共价低聚物的migg中唯一的同型，强烈影响其生物活性(abdelmoula等人，1989)，并增加对多价抗原的功能性亲和力。grey等人(grey、hirst和cohn，1971)最初确定了migg3低聚化的趋势，他们表明与多价抗原的结合促进了migg3分子间的相互作用，导致与抗原的功能性亲和力增加(greenspan、monafo和davie，1987；greenspan和cooper，1993)，这一特征被称为“分子间协同性”(greenspan和cooper，1993；greenspan、dacek和cooper，1989；greenspan和cooper，1992)。确定该现象取决于fc，因为igg3 f(ab’)2片段未与抗原协同结合(greenspan、monafo和davie，1987)。migg3同型与对重复抗原的分子间协同性倾向有关，由此通过亲合力介导的增强结合来挽救低单价亲和力(greenspan和cooper，1993、1992)。相邻migg3 fc-区之间的非共价相互作用被认为是通过延长靶占用率和降低离解率来巩固这种增强的功能性亲和力(cooper等人，1991；greenspan、dacek和cooper，1989))。
3.由于与转化过程相关的改变，肿瘤糖基体是一种丰富且未被充分探索的用于mab开发的癌症特异性靶源(pinho和reis，2015)。聚糖结构存在于蛋白质和糖脂主链二者上，且由于糖转移酶的表达改变，在癌症中可以大量过度表达。聚糖已被证明是癌细胞生存、增殖、扩散和免疫逃避的关键辅助分子；交联这些抗原可导致直接细胞死亡，而不需要免疫效应细胞或补体(dalziel等人，2014；rodriguez、schetters和van kooyk，2018；rabu等人，2012)。事实上，发明人已经制备了许多在癌症治疗方面具有潜在应用潜力的聚糖靶向mab，因为它们相对于健康组织结合具有强大的肿瘤差异性、高功能性亲和力以及治愈转移性结直肠癌小鼠的能力(chua等人，2015；durrant等人，2006；noble等人，2013)，许多其他mab在临床开发中作为被动或主动免疫治疗，或重新格式化用于嵌合抗原受体(car)t细胞(burris等人，2010；labrada等人，2018；hege等人，2017)，而达妥昔单抗β(dinutuximab beta；一种抗-gd2 mab)目前用于神经母细胞瘤的治疗(ladenstein等人，2018)。
4.发明人先前描述了一组具有lewis
a/c/x
、lewisy以及唾液酸基-di-lewisa反应性的癌聚糖靶向mab(wo2017/033020a1；wo2015/063500a1；chua等人，2015；noble等人，2013)。有趣的是，如果聚糖结合mab属于migg3同型，它们独立于补体或免疫效应细胞的存在而对表达高密度靶的癌细胞表现出直接的细胞毒性作用，具有启动适应性抗肿瘤免疫反应和长期肿瘤控制的潜力。这表明由migg3同型实现的分子间协同作用是直接细胞杀伤的原因。其他抗聚糖mab也观察到这种直接细胞毒性，通常涉及mab诱导的同型细胞粘附、细胞骨架重排、随后的细胞肿胀、膜损伤和最终的细胞死亡(loo等人，2007；faraj等人，2017；roque-navarro等人，2008；chua等人，2015；welt等人，1987)。在大多数情况下，细胞死亡是一种非经典的凋亡形式，可能涉及活性氧(ros)的产生，最类似于肿瘤坏死(zheng等人，2017；
hernandez等人，2011)。重要的是，与免疫原性或炎性细胞死亡(icd)类似，炎症介质的损伤相关分子模式(damp)的同时释放有可能将天然免疫细胞招募到肿瘤部位，这可以进一步增加mab介导的效应子功能(galluzzi等人，2017)。因此，这些抗聚糖mab可以成为在其他免疫抑制环境中重新动员免疫系统全部潜能的重要工具。
5.对于人类抗体疗法，不负责靶向特异性的区域通常被其人类等效物替换，以生成具有临床用途的人性化抗体版本。当我们将小鼠mab与igg1(例如人igg1，higg1)嵌合时，它们失去了直接细胞杀伤，并降低了功能性亲和力，因为在人igg中不存在分子间协同性。以前曾提出，小鼠igg3抗体一旦与其目标结合，可能会以其他抗体亚类不会采取的方式结合在一起，以稳定结合并增强抗体的临床效力。
6.us2011/0123440描述了改变的抗体fc-区及其用途。改变的fc-区具有一个或多个氨基酸取代。该专利要求保护在许多位置的任何取代，但确切的实例都是我们的发明的不同取代，我们的发明举例说明这些取代不负责直接细胞杀伤。
7.us2008/0089892描述了多肽fc-区变体和包含这些fc-区变体的组合物，这变体在位置251、256、268、280、332、378和440处具有氨基酸取代以改进adcc。与本专利中概述的修改的唯一相似之处是位置378，但发明人用丝氨酸取代，而不是天冬氨酸，并且我们本发明显示adcc降低。
8.us2010/0184959描述了提供具有2个或更多个氨基酸取代的fc多肽变体和更改的fc配体(例如fcγr或c1q)和/或效应子功能(例如adcc)识别的方法。相比之下，本发明的取代只与增加细胞杀伤有关。目前公开的26和23种氨基酸基序确实包括v305a、q342r和r344q取代，而15种氨基酸基序仅包含q342r。
9.us2010/015133描述了通过调节多肽关联产生多肽的方法。他们要求保护在356/439、357/370和399/409位置的抗体的ch3恒定区，将成对氨基酸的电荷从负电荷改变为正电荷，或相反。相比之下，本专利描述了将氨基酸356从天冬氨酸(d)改为谷氨酸(e)(不改变电荷)，将氨基酸357从谷氨酸(e)改为谷氨酰胺(q)(将负电荷改为中性)，以及将氨基酸370从赖氨酸(k)改为苏氨酸(将负电荷改为中性)。
10.wo2018/146317描述了具有fc-区和抗原结合区的多肽和抗体，其中fc-区具有fc-fc增强突变和c1q结合增强突变，提供具有增加的cdc活性和/或激动活性的多肽或抗体。fc区据说包含(a)选自由e430、e345或s440y或s440w取代组成的组的位置处的取代，和(b)在一个或多个选自由：g236、s239、s267、h268、s324、k326、i332、e333和p396组成的组的位置处的取代，其中这些位置对应于人igg1。多肽包含至少一个来自由：e430g、e345k、e430s、e430f、e430t、e345q、e345r、e345y、s440y和s440w组成的组的取代。本发明不包括这些取代中的任何一种。
11.wo2018/083126描述了包含变体fc-区的多肽和抗体。当一种或多种多肽、抗体或多种抗体与细胞表面上的靶、抗原或多种抗原结合时，fc-区提供稳定的fc：fc相互作用，同时还具有降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)，并且可能由于fc-区中的一个或多个氨基酸修饰还降低了其他效应子功能的激活。fc区据说包含(i)e430、e345或s440处的第一突变，前提是s440中的突变为s440y或s440w；和(ii)k322或p329处的第二突变。第一突变选自由：e430g、e345k、e430s、e430f、e430t、e345q、e345r、e345y、s440w和s440y组成的组。本发明不包括这些取代中的任何一种。
12.wo2014/108198公开了多肽，例如包含具有一个或多个氨基酸修饰的变体fc-区的抗体，其导致补体依赖性细胞毒性(cdc)增加。本发明不包括这些取代中的任何一种。
13.wo2013/004842描述了包含变体fc结构域的多肽和相关抗体，该变体fc结构域用于在一种或多种多肽、抗体或多种抗体与细胞表面上的靶结合时稳定fc：fc相互作用，以改进效应子功能，例如cdc反应。本发明不包括这些取代中的任何一种。


技术实现要素：

14.本发明提供与其亲本多肽、抗体、变体及其抗原结合片段相比具有增强的功能性亲和力的多肽、抗体、变体及其抗原结合片段。本发明还提供与其亲本多肽、抗体、变体及其抗原结合片段相比具有增强的细胞杀伤的多肽、抗体、变体及其抗原结合片段。在不受理论限制的情况下，据认为这种修饰的多肽、抗体、变体及其抗原结合片段能够在两种抗体的fc-区之间进行更稳定的结合相互作用，从而提供增加的抗体-抗原结合的功能性亲和力。此外，发明人公开了migg3 ch2和ch3结构域内的一个不连续区域，其赋予该同型对结合重复聚糖抗原的增加的功能性亲和力，以及对高结合癌细胞系的直接细胞毒性。将所涉及的残基转移到igg1亚型中，产生改进的“i”igg1，增加了体外和体内抗肿瘤活性。
15.通过使嵌合型mab与抗人ig抗血清交联或改变一个关键氨基酸残基，我们证明了直接细胞杀伤与功能性亲和力直接相关。此外，我们通过在嵌合构建体中引入分子间协同性，总结了本发明的新型小鼠mab的功能性亲和力。没有人绘制出migg3协同性的图谱，而igg1和migg3之间不同的关键氨基酸之前也未被描述过。因此，发明人不仅推动了我们系列抗糖脂mab的开发，而且开发了一种可用于改进任何mab治疗指数的技术。
16.将migg3单抗嵌合到人igg1骨架上与直接细胞毒性的显著降低相一致，导致发明人假设这是分子间协同性降低的结果。因此，发明人希望识别migg3内负责分子间协同性的关键残基，并将其转移到igg1中，以总结观察到的migg3直接细胞毒性活性，从而产生具有优异临床效用的嵌合型igg1。
17.发明人利用我们的组套或先前生成的聚糖靶向mab，通过转移选定的migg3恒定区残基，创建了具有增加的功能性亲和力和直接细胞毒性活性的igg1抗聚糖mab。通过创建包含migg3 ch1、ch2或ch3结构域的杂交igg1构建体来确定migg3贡献区域。通过基于以下的筛选来确定候选残基：当引入igg1(获得功能)中时基于增加的直接细胞毒性和功能性亲和力，和/或在migg3中被相应的igg1残基取代(丧失功能)时基于降低的直接细胞毒性和功能性亲和力。初步分析确定，migg3 chl对直接细胞毒性能力的贡献可忽略不计，因为将migg3 ch1引入igg1并没有导致细胞毒性的显著增加。相反，将人igg1(higg1)ch1引入migg3同样不会在杀伤活性上发生显著降低。接下来，在功能获得法中，在igg1中分别引入migg3 ch2和ch3结构域。含有小鼠ch3的igg1表现出显著的细胞毒性增加。将小鼠ch2引入igg1导致杀伤活性的小幅度增加，但不显著。作为对这两个结构域贡献的确认，遵循相反的策略，籍此评估由于将igg1 ch2或ch3结构域引入migg3所致的细胞毒性活性的丧失。这种情况导致含有igg1 ch3的migg3的细胞毒性显著降低，证实了先前的获得功能结果。重要的是，该策略还确定了小鼠ch2的一个小贡献，因为含有人ch2的migg3表现出细胞毒性活性的显著降低。
18.根据本发明的一个方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含免疫球蛋白fc-区的一个或多个残基和结合区，其中将fc-区的一个或多个残基修饰为来自小鼠
igg3抗体的相应残基并且其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段具有增强的功能性亲和力。
19.在本发明的一些方面中，提供一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的功能性亲和力增强至少约10％。
20.在本发明的一些方面中，与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的功能性亲和力增强了至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
21.在本发明的一些方面中，与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段增强了直接细胞杀伤。
22.在本发明的一些方面中，与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤增强至少约10％。
23.在本发明的一些方面中，与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤增强至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
24.根据本发明的第一方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中ch2和/或ch3结构域的一个或多个残基替换为来自小鼠igg3 ch2和/或ch3结构域的相应残基。
25.根据本发明的第二方面，提供一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中ch2和/或ch3结构域替换为小鼠igg3 ch2和/或ch3结构域。
26.通过转移包含残基286-306和339-378(包含ch2和ch3元素，总共26个migg3残基)的不连续切面，经亚结构域分析进一步剥离组合ch2-ch3区域，显示migg3对igg1的直接细胞毒性完全恢复。26个残基是n286t、k288w、k290q、e294a、y300f、v305a、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。由于直接相互作用和构象残基的联合作用，这些残基是通过分子间协同性来增加功能性亲和力所必需的，构象残基有可能创造允许框架(permissive framework)。电荷分布模式的作用，尤其是在ch2中，也不能排除，因为它已被证明能增强migg3与带负电的多价抗原的结合，并且与igg1不同(klaus和bereta 2018；hovenden等人，2013)。我们的方法中涉及的一些残基位于许多天然结合搭档(如蛋白a、蛋白g、类风湿因子和新生儿fcrn)的较大的共有结合位点内(delano等人，2000)。然而，我们的残基都不直接参与fcrn结合(oganesyan等人2014)。
27.根据本发明的第三方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其对fc-区的以下残基中的一个或多个进行修饰：n286、k288、k290、e294、y300、v305、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
28.根据本发明的第四方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其具有对fc-区的以下修饰中的一个或多个：n286t、k288w、k290q、e294a、y300f、v305a、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、
g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
29.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在选自位置n286、k288、k290、e294、y300、v305、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个残基上的修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在所有26个残基上的修饰。
30.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含选自n286t、k288w、k290q、e294a、y300f、v305a、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a和a378s的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含所有26个修饰。
31.文献中描述了大量的fc工程策略，主要是通过改变fcγr或c1q结合来影响mab效应子功能(adcc和cdc)，以及经由fcrn连接来影响mab半衰期(wang、mathieu和brezski 2018；carter，2006)。这些都没有描述构成本专利一部分的氨基酸变化。另外，在许多人mab同型中，晶体堆积通过fc：fc相互作用诱导mab低聚化(saphire等人，2001年)，形成了最近描述的用于改进补体激活的六聚体mab平台的基础(wo2014/006217a9；wo2018/083126a1；wo2018/146317a1，ugurlar等人，2018；de jong等人，2016；diebolder等人，2014)。有效的六聚体排列和c1q结合取决于个体突变(e345k或e430g)，这与构成本专利基础的氨基酸变化不同。事实上，ii型cd20 mab 11b8通过这些诱发强cdc能力的突变来诱导程序性细胞死亡(即直接细胞毒性)的能力并未增强，这表明该位置与直接细胞杀伤无关。
32.大多数经批准的治疗性mab是人源化或全人igg抗体，因为小鼠或嵌合抗体携有增加患者抗小鼠抗体(hama)不良反应的风险(schroff等人，1985；azinovic等人，2006；miotti等人，1999；d
′
arcy和mannik 2001)。在igg1中仅引入26个migg3不太可能诱导hama反应。然而，它们可能产生mhcii结合表位，这些表位有可能在某些患者中驱动hama反应。免疫表位数据库(iedb)对2含有6个残基的杂交88igg1进行分析，发现包含几个潜在的高评分表位的簇(簇1，残基294-315)。将簇1中位置294、300和305的三个mig3恢复为igg1残基，维持了功能型亲和力和直接细胞毒性。重要的是，对该23个aa的基序(n286、k288、k290、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378)的修饰在修饰成相应的小鼠igg3残基时为(n286t、k288w、k290q、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s)，诱导了直接细胞毒性、细胞聚集、孔隙形成和最终的细胞溶解。孔隙形成和最终的细胞溶解与坏死性凋亡具有相似的细胞解体特征，但不能与坏死或继发性坏死区分开来(vanden berghe等人，2010)。由于激活的应力途径构成或诱导的释放的damp的最终结果取决于细胞环境以及潜在的信号级联，但总体而言，有可能创造这样的炎症环境：通过交叉呈现释放的肿瘤抗原，该炎症环境可以进一步增强免疫效应子功能和/或激发适应性免疫反应(yatim、cullen和albert 2017；galluzzi等人，2017)。
33.根据本发明的第五方面，提供一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其对fc-区的以下残基中的一个或多个进行修饰：n286、k288、k290、a339、q342、p343、r344、e345、
l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
34.根据本发明的第六方面，提供一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其具有对fc-区的以下修饰中的一个或多个：n286t、k288w、k290q、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
35.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在选自位置n286、k288、k290、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个残基上的修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在所有23个残基上的修饰。
36.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含选自n286t、k288w、k290q、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含所有23个修饰。
37.对图9a和9b中的88抗体举例说明了该组23个修饰。
38.通过将选定的23个migg3残基引入唾液酸基-di-lewisa靶向129mab，证明了进一步的验证，唾液酸基-di-lewisa靶向129mab具有更有利的正常组织分布，同时靶向广泛的肿瘤组织，尤其是70％以上的胰腺肿瘤和30％以上的胃和结直肠肿瘤，以及超过20％的卵巢癌和非小细胞肺癌肿瘤。有趣的是，杂交瘤产生的亲代129mab是缺乏直接细胞毒性能力的migg1。因此，与129igg1相比，通过较慢的解离速率产生功能性亲和力显著提高的i129g1 mab，与对于colo205的纳摩尔直接细胞杀伤能力相一致，这表明我们的方法可能具有更广泛的适用性，并且与依赖亲合力效应的免疫调节mab相关(wang、mathieu和brezski，2018)。i129g1发挥的直接细胞杀伤以与i88g1相似的方式表现，mab诱导细胞聚集，随后形成孔隙，最终细胞溶解。将23个migg3残基引入i129g1 mab对效应子功能有混合效应：虽然adcc显著降低，但维持纳摩尔ec
50
，i129g1的cdc活性显著增加。这反映了i88g1获得的结果，尽管i129g1的adcc降低更强，这表明糖类靶点的性质也影响adcc的效力：而88mab靶向糖蛋白和糖脂，129mab仅靶向糖蛋白。值得注意的是，i129g1显示出有效的肿瘤控制，i129g1显示出显著的肿瘤体积减少，明显优于129igg1，后者没有显示出显著的肿瘤减少。这表明129igg1的联合效应子功能在该模型中无法控制肿瘤生长，进一步强调了具有直接细胞毒性能力的价值。
39.为了评估23个选定mg3残基中每一个残基的单独贡献，执行了基于i88g1的单回复体策略(实施例4)。i88g1中的23个mg3残基中的每一个都单独回复为hg1残基，并对产生的构建体进行直接细胞杀伤分析，这证实了上述23个残基可以进一步减少为15个残基，而不会显著丧失直接细胞杀伤能力。值得注意的是，i88g1中的六个migg3残基可以回复为igg1残基，而不会显著丧失直接细胞杀伤。使用129mab进一步证明了这一点，其中15个migg3残基的引入维持了对colo205的纳摩尔直接细胞杀伤。
40.免疫原性可能是成功治疗的主要障碍。抗药物抗体可能中和治疗功能，影响药代动力学，并可能导致严重的不良反应。导致免疫原性风险的t细胞表位可以使用在电脑上的
工具进行相对准确的评估。识别t细胞表位的免疫信息学算法可用于评估和分析免疫治疗是否会导致不想要的免疫原性。为了评估我们的杂交sd286-306 339-378构建体(由26个migg3残基的存在产生)的潜在免疫原性，我们在电脑上对sd286-306 339-378序列进行了mhcii结合表位筛选(免疫表位数据库，iedb)。ii类限制性t辅助细胞与体液免疫反应更相关，预测的结合簇已被证明是t细胞反应的有力指标(jawa等人，2013)。鉴定出两个mhcii结合簇(包含几个高评分结合表位)：簇1(残基294-315)和簇2(残基365-393)(图5/图20)。将簇1内三个小鼠残基294(a到e)、300(f到y)和305(a到v)恢复为人残基，产生了个体可耐受的人序列片段。类似地，339378区域内的两个残基351(i到l)和371(n到g)的逆转移除了两个mhcii结合核心。
41.电脑上识别的一个免疫原性簇的逆转产生先导候选，改进的“i”88g1，其具有强大的细胞杀伤、孔隙形成能力和良好的免疫效应子功能。
42.为了证明引入所选残基的效果并不局限于抗聚糖抗体，对靶向生长因子受体her2的曲妥珠单抗(以等品牌出售)进行了相关残基的转移。由此产生的itrastuzumab改进了与中度her2表达细胞系的稳态细胞结合，与pi摄取增加一致。此外，与野生型相比，它通过较慢的解离速率改进了亲和力。
43.根据本发明的第七方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其对fc-区的以下残基中的一个或多个进行修饰：n286、k288、k290、q342、p343、e345、l351、t359、n361、q362、g371、p374、s375、d376、a378。
44.根据本发明的第八方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其具有对fc-区的以下修饰中的一个或多个：n286t、k288w、k290q、q342r、p343a、e345t、l351i、t359s、n361k、q362k、g371n、p374s、s375e、d376a、a378s。
45.对图9c和9d中的抗体129和88举例说明了该组15个修饰。
46.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在选自位置n286、k288、k290、q342、p343、e345、l351、t359、n361、q362、g371、p374、s375、d376、a378的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个残基上的修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在所有15个残基上的修饰。
47.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含选自n286t、k288w、k290q、q342r、p343a、e345t、l351i、t359s、n361k、q362k、g371n、p374s、s375e、d376a、a378s的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含所有15个修饰。
48.根据本发明的第九方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其对fc-区的以下残基中的一个或多个进行修饰：q342、p343、e345、n361、q362、p374、d376。
49.根据本发明的第十方面，提供修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其具有对fc-区的以下修饰中的一个或多个：q342r、p343a、e345t、n361k、q362k、p374s、d376a。
50.对图9f中的抗体88举例说明了该组7个修饰。
51.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在选自位置q342、p343、e345、n361、q362、p374、d376的1、2、3、4、5、6或7个残基上的修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含在所有7个残基上的修饰。
52.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含选自q342r、
p343a、e345t、n361k、q362k、p374s、d376a的1、2、3、4、5、6或7个修饰。在本发明的优选方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含所有7个修饰。
53.在本发明的一个方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含图15中公开的一个或多个序列。在本发明的一个方面中，提供了包含如图15所公开的重链和轻链序列的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段。
54.在本发明的一个方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含图16中公开的一个或多个序列。在本发明的一个方面中，提供了一种包含如图16所公开的重链和轻链序列的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段。
55.在本发明的一个方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含图17中公开的一个或多个序列。在本发明的一个方面中，提供了一种包含如图17所公开的重链和轻链序列的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段。
56.在本发明的一个方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含图19中公开的一个或多个序列。在本发明的一个方面中，提供了一种包含如图19所公开的重链和轻链序列的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段。
57.在本发明的一些方面中，“相应的igg1抗体或其抗原结合片段”是指未经修饰(即野生型)的抗体或其抗原结合片段，其包含天然残基，且没有改变为相应的小鼠igg3残基。在本发明的一些方面中，相应的igg1抗体或其抗原结合片段结合与修饰的igg1抗体或其抗原结合片段相同的一个或多个靶点(例如相同的表位)。在本发明的一些方面中，修饰的和相应的未修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含相同cdr序列(即，vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2、vlcdr3)中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个。在本发明的一些方面中，修饰的和相应的未修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含相同的结合区序列。在本发明的一些方面中，修饰的和相应的未修饰的igg1抗体或其抗原结合片段包含相同的可变区序列(例如，相同的可变重链序列和/或相同的可变轻链序列)。
58.在本发明的一些方面中，“结合区”是指抗体或其抗原结合片段中负责与靶抗原结合的部分。例如，它可以包括重链和轻链中每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域。在本发明的一些方面中，结合区可指互补决定区(cdr)序列(即，vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2、vlcdr3)。
59.igg1抗体或其抗原结合片段的结构通常为抗体重链或轻链序列或其大部分。免疫球蛋白结构域的结构和位置可参考http：//www.imgt.org/来确定。
60.在整个说明书中，残基编号是指用于对抗体序列进行编号的标准化imgt系统，如lefranc mp、giudicelli v、ginestoux c、jabado-michaloud j、folch g、bellahcene f等人，imgt，the international immunogenetics information system，nucleic acids research，2009：37：d1006-12中公开的。技术人员已知其他合适的编号系统。其他合适的编号系统可用于识别修饰的igg1抗体与其抗原结合片段或其抗原结合片段之间的相应残基。允许识别相应残基的任何编号系统都适用于本发明。本文中使用的编号系统不限制本发明的范围，而仅用于识别可修饰的相关残基。术语“相应残基”意指在所比较的两个或更多个抗体或其抗原结合片段中在结构上或功能上处于等效位置的残基。在一些情况下，相应残基可通过序列比对来识别。在一些情况下，相应残基可通过结构比对来识别。
61.在本发明的一些方面中，包含免疫球蛋白fc-区的一个或多个残基的igg1抗体或
其抗原结合片段包含fc-区的至少10个氨基酸残基、fc-区的至少20个氨基酸、fc-区的至少30个氨基酸、fc-区的至少40个氨基酸、fc-区的至少50个氨基酸、fc-区的至少75个氨基酸、fc-区的至少100个氨基酸、fc-区的至少200个氨基酸、fc-区的至少300个氨基酸、fc-区的至少400个氨基酸或fc-区的至少500个氨基酸。优选地，igg1抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白的整个fc-区。
62.在本发明的一些方面中，fc-区的一个或多个残基选自ch2和/或ch3结构域。在一些方面中，一个或多个残基选自ch2结构域。在一些方面中，一个或多个残基选自ch3结构域。
63.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段和相应野生型igg1抗体或其抗原结合片段的功能性亲和力可通过表面等离子体共振(例如，biacore 3000/t200，ge healthcare)来确定，例如，通过将浓度增加(0.3nmol/l至200nmol/l)的igg1抗体或其抗原结合片段注入包含适当配体的cm5芯片，并使用适当软件(例如biaevaluation 4.1)将数据拟合至适当的结合模型。可对修饰的igg1抗体或其抗原结合片段进行使用相同条件的相应试验。在本发明的一些方面中，当表面等离子体共振数据表明修饰的igg1抗体或其抗原结合片段与配体涂覆的cm5芯片结合更紧密时，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段显示出与相应野生型igg1抗体或其抗原结合片段更大的功能性亲和力。配体包括聚糖-hsa和抗聚糖抗体的对照结合物。
64.涂覆有抗his抗体的biacore cm5芯片包含与金表面共价连接的羧甲基葡聚糖。分子通过胺、硫醇、醛或羧基与传感器表面共价连接。可以研究涉及小有机分子(例如候选药物)到大分子组装体或整个病毒的相互作用。高结合能力提供高响应，有利于捕获分析和涉及小分子的相互作用。高表面稳定性可提供准确度和精密度，并允许在同一表面上重复分析。本领域技术人员已知其他合适的芯片，并且可以通过本领域已知的标准技术来调整表面等离子体共振协议。
65.在本发明的一些方面中，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段和相应野生型igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤可通过碘丙啶(pi)的摄取来确定，例如，将igg1抗体或其抗原结合片段与colo205或hct-15细胞(5x 104)在37℃孵育2小时，然后添加1μg pi 30分钟，使细胞重新悬浮在pbs中，在流式细胞仪(例如beckman coulter fc 500或macsquant 10)上处理细胞，并使用适当的软件(例如winmdi 2.9或flowjo v10)分析结果。可对修饰的igg1抗体或其抗原结合片段进行使用相同条件的相应试验。在本发明的一些方面中，当细胞与修饰的igg1抗体或其抗原结合片段孵育时pi摄取量较大时，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段比相应的野生型igg1抗体或其抗原结合片段提供更大的直接细胞杀伤。
66.相对于野生型igg1抗体或其抗原结合片段(不包含fc-区中的修饰的残基)的相应功能性质测量修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的改进的功能性质。由于改进的功能性质是一种相对量度，因此用于确定所要求保护的igg1抗体或其抗原结合片段的功能性亲和力和/或直接细胞杀伤或任何其他功能性质的准确方法不影响该功能性质的相对变化。本领域技术人员已知测量抗体及其抗原结合片段的功能性质的许多合适方法。测量这些功能性质的任何合适方法可用于测量所要求保护的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段或其抗原结合片段的功能性质，前提是为了公平比较，将相同方法应用于相应的野生型igg1抗体或
其抗原结合片段。
67.通过建立分子间协同性结合，产生具有增强的功能性亲和力和直接细胞毒性的改进的癌聚糖靶向mab，可能导致更好的临床应用。这种方法也可能对其他靶向重复抗原或高密度抗原的mab有价值。此外，将许多多糖靶向migg3mab观察到的不寻常的促炎细胞杀伤模式恢复到igg1框架中，有可能与其他免疫疗法结合使用。
68.本发明的修饰的igg1抗体可用于人或动物对象肿瘤的诊断和治疗方法。当用于诊断时，本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可使用可检测标签(例如放射性标签，例如i或tc)进行标记，这种标签可使用抗体成像领域已知的常规化学附着于本发明的修饰的igg1抗体。标签还包括酶标签，如辣根过氧化物酶。标签还包括化学部分如生物素，其可通过与特定同源可检测部分(例如，标记的亲合素)结合来检测。尽管本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段本身已被证明在杀伤癌细胞方面有效，但它们还可以用功能标签进行标记。功能标签包括设计为针对癌症部位以导致其破坏的物质。这些功能标签包括毒素如蓖麻毒素和酶如细菌羧肽酶或硝基还原酶，它们能够将前药转化为活性药物。另外，修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可附着或以其他方式与化疗剂或细胞毒性剂缔合，例如美登素(dm1和dm4)、奈德类、澳瑞他汀类、卡奇霉素、倍癌霉素、阿霉素90 131或放射性标记物，例如y或i。此外，本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可单独施用或与其他治疗同时或相继地组合施用，取决于待治疗的状况。因此，本发明进一步提供这样的产品：含有本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段和活性剂作为组合制剂，用于在治疗肿瘤时同时、单独或相继使用。活性剂可包括化疗剂或细胞毒性剂，包括5-氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素c、奥沙利铂和三苯氧胺，其可与本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段协同发挥作用。其他活性剂可包括适当剂量的止痛药，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片剂，例如吗啡，或止吐药。
69.虽然不希望受到理论的约束，本发明修饰的igg1抗体及其抗原结合片段与活性剂协同增强肿瘤杀伤的能力可能不是由于免疫效应子机制，而是可能是修饰的igg1抗体及其抗原结合片段与细胞表面受体结合的直接结果。本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段通常将以药物组合物的形式施用，其可包含除经修饰的igg1抗体及其抗原结合片段之外的至少一种组分。
70.除活性成分外，药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应无毒，且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质取决于施用途径，施用途径可以是口服，也可以是注射，例如静脉注射。优选地，施用途径是静脉注射。
71.尽管也使用通过导管或其他医用软管的输送，但预计注射将是组合物的治疗性施用的主要途径。一些合适的施用途径包括静脉、皮下、腹腔和肌肉施用。液体制剂可在从粉末制剂重构后使用。
72.对于静脉注射或在疼痛部位注射，活性成分将呈肠外可接受的水溶液的形式，该水溶液不含热原，并具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员能够很好地使用等渗溶媒，例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。
73.用于经口施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包含固体
载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液，或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。制剂为液体时，其可为例如含有ph为6.8-7.6的非磷酸盐缓冲液的生理盐溶液，或冻干粉末。
74.组合物也可通过微球、脂质体、其他微粒递送系统或放置在包括血液在内的某些组织中的缓释制剂来施用。缓释载体的合适实例包括共享物品形式的半渗透性聚合物基质，例如栓剂或微胶囊。可植入或微囊缓释基质包括聚乳酸(美国专利号3,773,919；ep-a-0058481)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸酯的共聚物[43]、聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)。含有多肽的脂质体通过众所周知的方法制备：(eppstein等人，1985；hwang、luk和beaumier，1980)；ep-a-0052522；ep-a-0036676；ep-a-0088046；ep-a-0143949；ep-a-0142541；jp-a-83-11808；us专利号4,485,045和4,544,545。通常，脂质体为小(约200埃至800埃)单层型，其中脂质含量大于约30摩尔％胆固醇，为多肽泄漏的最佳速率调整所选比例。组合物可以以局部方式施用于肿瘤部位或其它所需部位，或者可以以靶向肿瘤或其它细胞的方式递送。
[0075]
组合物优选以“治疗有效量”施用给个体，该量足以显示对个体的益处。实际施用量、施用速率和时间取决于待治疗的性质和严重程度。治疗处方，如剂量决定等，由全科医生和其他医生负责，通常考虑待治疗的疾病、个体患者的状况、递送部位、施用方法和医生已知的其他因素。本发明的组合物特别与现有肿瘤(尤其是癌症)的治疗以及在初始治疗或手术后预防此类状况的复发相关。上述技术和方案的例子可以在《雷明顿药学科学》第16版，奥斯陆，a(ed)1980中找到。
[0076]
最佳剂量可由医生基于许多参数确定，包括例如，年龄、性别、体重、治疗情况的严重程度、施用的活性成分和施用途径。一般来说，允许受体饱和的多肽和抗体的血清浓度是可取的。浓度超过约lnm通常就足够了。例如，剂量为100mg/m2的抗体提供约20nm的血清浓度，持续约八天。作为粗略的指南，抗体的剂量每周可给予10mg/m2至300mg/m2的量。应以更频繁的间隔使用同等剂量的抗体片段，以保持血清水平超过允许聚糖饱和的浓度。
[0077]
组合物的剂量将取决于修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的性质，例如其结合活性和体内血浆半衰期、制剂中多肽的浓度、施用途径、给药部位和速率，所涉及的患者的临床耐受性、折磨患者的病理状况等，这是在医生的技能范围内。例如，每名患者每次施用3000g抗体的剂量是优选的，尽管剂量可能在每剂约10μg至6mg的范围内。在一系列连续接种期间使用不同剂量；医师可以进行初始接种，然后使用相对较小剂量的抗体进行增强。
[0078]
本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可全部或部分通过化学合成产生。修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可根据完善的标准液体或优选固相肽合成方法轻易制备，其一般描述可广泛获得(例如，参见j.m.stewart和j.d.young，(1984)[46]，m.bodanzsky和a.bodanzsky，(1984))；或者它们可以在溶液中通过液相方法或通过固相、液相和溶液化学的任何组合制备，例如，首先完成各自的肽部分，然后，如果需要和适当，在移除存在的任何保护基后，通过各自的碳酸或磺酸或其反应性衍生物的反应引入残基x。
[0079]
生产根据本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的另一方便方法是通过在表达系统中使用核酸来表达编码它们的核酸。本发明还提供编码本发明修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的分离核酸。核酸包括dna和rna。技术人员将能够确定对这种核酸的取代、
删除和/或添加仍将提供本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段。
[0080]
本发明还提供包含至少一种如上所述的核酸的质粒、载体、转录本或表达盒形式的构建体。本发明还提供一种重组宿主细胞，其包含如上所述的一种或多种构建体。如前所述，编码本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的核酸形成本发明的一个方面，生产修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的方法也形成本发明的一个方面，该方法包括通过编码修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的核酸进行表达。通过在适当条件下培养含有该核酸的重组宿主细胞，可以方便地实现表达。在通过表达进行生产后，修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可使用任何合适的技术来分离和/或纯化，然后适当使用。在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、hela细胞、幼仓鼠肾细胞、nso小鼠黑色素瘤细胞和许多其他细胞。常见的、优选的细菌宿主是大肠杆菌。在原核细胞(如大肠杆菌)中表达抗体和抗体片段在本领域中已得到充分证实。有关评论，请参见例如(pluckthun，1991)。本领域技术人员也可在培养的真核细胞中进行表达，作为生产修饰的igg1抗体及其抗原结合片段的选择，最近的评论参见，例如(reff 1993；trill、shatzman和ganguly，1995)。
[0081]
可以选择或构建合适的载体，该载体包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他序列(视情况而定)。载体可以是质粒、病毒，如“噬菌体”或噬菌粒(视情况而定)。对于其他详细信息，参见，例如(sambrook、fritsch和maniatis，1989)。许多用于操纵核酸的已知技术和协议，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将dna引入细胞和基因表达以及蛋白质分析的技术和协议详细描述在ausubel等人，1992(ausubel等人，1992)中。
[0082]
因此，本发明的另一方面提供含有如本文所公开的核酸的宿主细胞。另一方面提供了包括将这种核酸引入宿主细胞的方法。引入可采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、deae-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如痘苗病毒，或对于昆虫细胞，则为杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。引入后可引起或允许核酸表达，例如，通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。在一个实施方式中，本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，整合可通过包含促进与基因组重组的序列来促进。本发明还提供一种方法，其包括在表达系统中使用如上所述的构建体，以表达上述的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段。
[0083]
片段结晶区(fc区)是抗体的尾部区域，与称为fc受体的细胞表面受体和补体系统的某些蛋白质相互作用。这种性质允许抗体激活免疫系统。在igg抗体同型中，fc区由两个相同的蛋白质片段组成，它们来自抗体两条重链的第二和第三恒定结构域。igg的fc区包含高度保守的n-糖基化位点。
[0084]
igg的fc(片段，可结晶)由一组成对的抗体hc结构域组成，每个结构域都具有与ch3融合的ch2，形成约50kda的结构。名称“片段，可结晶”(fc)来源于这样一个事实：在用木瓜蛋白酶切割血清来源的骨髓瘤igg组分后，唯一可以结晶的片段是成对的ch2-ch3片段。
[0085]
在fc内，两个ch3结构域彼此紧密结合，而两个ch2结构域彼此之间没有直接的蛋白质-蛋白质接触。寡糖与两个ch2结构域内的天冬酰胺-297(n297)结合，填充两个ch2之间
的部分空间。在一些晶体结构中，观察到两条碳水化合物链之间直接或通过桥接水分子形成氢键。虽然抗体似乎是高度分段的分子，但已经证明fc的结构可以影响fab与靶抗原的结合，类似地，fab中可变链的含量可以影响fc与各种受体的结合。最近的圆二色性研究证实了igg的fab臂和fc之间显著的结构耦合。因此，igg分子是一种高度复杂的分子，其中不同的结构域显著相互作用，即使在很长的距离内也是如此。
[0086]
虽然双价/多价抗体包含与表位相互作用的结合结构域，但合成的双价/多价配体包含与靶位点相互作用的药效团。术语“功能性亲和力”也可用于表示表观亲和力的双价/多价相关增加。该术语与“亲合力”同义。
[0087]
亲合力是指单个非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度，例如蛋白质受体与其配体之间的亲和力，也可称为“功能性亲和力”。因此，亲合力不同于描述单个相互作用的强度的内在亲和力。然而，由于单个结合事件增加了发生其他相互作用的可能性(即，增加结合位点附近每个结合伙伴的局部浓度)，因此亲合力不应被认为仅仅是构成要素亲和力的总和，而是参与生物分子相互作用的所有亲和力的综合效应。区分“内在亲和力”和“功能性亲和力”的效用来自于每个术语所涉及的不同重点。前者在抗体结合位点和配体互补区之间的结构关系受到仔细检查或特定相互作用的动力学机制处于研究时最有用。另一方面，如在本发明中，当正在检查亲和力增强的定量测量时，后者特别重要。
[0088]“功能性亲和力”和“内在亲和力”二者均指形式上相同的可逆过程，如下所示：
[0089]
复合物(单价)
[0090]
复合物(多价)
[0091]
其中f1为单价抗体片段，l1为单价配体，abn为多价抗体，lm为具有m个基团的多价配体。在每种情况下，两个动力学单元可逆地结合形成一个单元，原则上，每个过程都可用缔合常数来表征。由于缔合常数是热力学亲和力的量度，因此两个过程都可指定亲和力的定量值。
[0092]
抗体和抗原结合分子的片段
[0093]
本发明的抗原结合分子可以是抗体片段，具体是抗体的抗原结合片段。抗原结合片段包括一个或多个抗原结合区。已经证明，整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由vl、vh、cl和ch1结构域组成的fab片段；(ii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iii)由单个抗体的vl和vh结构域组成的fv片段；(iv)由vh结构域组成的dab片段(ward、e.s等人，nature 341：544-546(1989))；(v)分离的cdr区；(vi)f(ab
′
)2片段，包含两个连接的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接(bird等人，science 242：423-426(1988)；huston等人，pnas usa 85：5879-5883(1988))；(viii)双特异性单链fv二聚体(pct/us92/09965)和(ix)“双体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(wo94/13804；p.hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa 90：6444-6448(1993))。通常，片段为fab、f(ab’)2或fv片段或scfv分子。
[0094]
双体是多肽的多聚体，每种多肽包含第一结构域(包含免疫球蛋白轻链的结合区)和第二结构域(包含免疫球蛋白重链的结合区)，两个结构域连接(例如通过肽接头)，但不能相互缔合以形成抗原结合位点：抗原结合位点由多聚体中一种多肽的第一结构域与多聚体中另一种多肽的第二结构域缔合而形成(wo94/13804)。
[0095]
在使用双特异性抗体的情况下，这些抗体可以是传统的双特异性抗体，可以通过多种方式制造(hollinger&winter，current opinion biotechnol，4：446-449(1993))，例如，化学制备或从杂交瘤制备，或可能是下述任何双特异性抗体片段。优选使用scfv二聚体或双体而不是全抗体。双体和scfv可以构建为没有fc区，只使用可变结构域，这可能会减少抗特异型反应的影响。双特异性抗体的其他形式包括traunecker等人，embo journal 10：3655-3659(1991)中描述的单链“janusins”。
[0096]
双特异性抗体是一种能同时结合两个靶分子(如两个抗原或两个表位)的抗体。双特异性抗体也可称为双结合抗体。双特异性抗体形式的实例包括但不限于；(mab)2、fcab、f(mab’)2、四重杂交瘤、scfv(单链可变片段)、bsdb(双特异性双体)、scbsdb(单链双特异性双体)、bite(双特异性t细胞衔接子)、串联抗体、串联scfv-fc、fab-scfv-fc、fab-scfv、微型抗体、zybodies、dnl-f(ab)3(对接锁定三价fab(dock and lock trivalent fab))、bssdab(双特异性单结构域抗体)和杵-臼结构。
[0097]
相对于双特异性全抗体，双特异性双体也可能是有用的，因为它们可以很容易地在大肠杆菌中构建和表达。使用噬菌体展示(wo94/13804)可以从文库中容易地选择具有适当结合特异性的双体(和许多其他多肽，如抗体片段)。如果双体的一个臂保持恒定，例如，具有针对抗原x的特异性，则可以在另一个臂发生变化并选择具有适当特异性的抗体的情况下制备文库。
[0098]
在本发明的一些方面中，可能需要产生对相同或不同分子的至少两个不同表位具有结合特异性的多特异性(例如双特异性)抗靶抗体。示例性双特异性抗体可结合靶分子的两个不同表位。作为选择，靶特异性抗体臂可与结合细胞表面分子(例如t细胞受体分子(例如cd3))的臂结合。本发明的示例性双特异性抗体可结合来自t细胞受体分子(例如cd3)的抗原和任何其他靶。
[0099]
本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可以是抗体或抗体片段fab、(fab
′
)2、scfv、fv、dab、fd或双体。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是单克隆抗体(mab)。本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段可以是人源化、嵌合或饰面抗体，或者可以是任何物种的非人抗体。在优选的实施方式中，本发明的修饰的igg1抗体及其抗原结合片段是人的或人源化的。
[0100]
小鼠或嵌合抗体携带了增加患者发生抗小鼠抗体(hama)不良反应的风险(schroff等人，1985；azinovic等人，2006；miotti等人，1999；d
′
arcy和mannik，2001)。因此，大多数经批准的治疗性mab是人源化或全人igg抗体。
[0101]
变体
[0102]
本发明还扩展到本文公开的任何肽序列的变体。如本文所用，术语“变体”涉及具有相似氨基酸序列和/或保留相同功能的蛋白质。例如，术语“变体”包括蛋白质或多肽，其包括一个或多个氨基酸添加、删除、取代等。本发明变体的实例是包括如下定义且用一个或多个其他氨基酸取代一个或多个氨基酸的肽的蛋白质。可进行氨基酸取代以例如减少或消除氨基酸序列中的不稳定性(1iability)。作为选择，如果需要，可进行氨基酸取代以改进抗原亲和力或使抗体人源化或去免疫化。本文提供指定抗体的亲和力成熟变体、人源化变体和去免疫变体，以及包含氨基酸取代的变体，以减少或消除抗体序列中的任何不稳定性。
[0103]
如上所述，在一些实施方式中，任何取代只能发生在框架区中。在这些实施方式
中，保留原始cdr序列，但在一个或多个框架区中可能发生变异。
[0104]
具有一个或多个氨基酸取代的变体抗原结合分子可保留衍生变体抗原结合分子的抗原结合分子的功能活性(例如ec50、ic50、ic90、kd、功能性亲和力和/或直接细胞杀伤)。本发明的变异体抗原结合分子可以按照与衍生出该变异体抗原结合分子的抗原结合分子所述相同的方式使用和配制。
[0105]
取代
[0106]
技术人员知道各种氨基酸具有相似的性质。一种物质的一种或多种此类氨基酸通常可以被一种或多种其他此类氨基酸取代，而不会消除该物质所需的活性。
[0107]
因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可以相互取代(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的取代中，优选使用甘氨酸和丙氨酸相互取代(因为它们具有相对较短的侧链)，并且缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸相互取代(因为它们具有较大的疏水性脂肪族侧链)。通常可以相互取代的其他氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸盐和谷氨酸盐(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
[0108]
这种性质的取代通常被称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。
[0109]
使用三个字母和一个字母代码，自然产生的氨基酸可称为：甘氨酸(g或gly)、丙氨酸(a或ala)、缬氨酸(v或val)、亮氨酸(l或leu)、异亮氨酸(i或ile)、脯氨酸(p或pro)、苯丙氨酸(f或phe)、酪氨酸(y或tyr)、色氨酸(w或trp)、赖氨酸(k或lys)、精氨酸(r或arg)、组氨酸(h或his)、天冬氨酸(d或asp)、谷氨酸(e或glu)、天冬酰胺(n或asn)、谷氨酰胺(q或gln)、半胱氨酸(c或cys)、蛋氨酸(m或met)、丝氨酸(s或ser)和苏氨酸(t或thr)。残基可能是天冬氨酸或天冬酰胺，则可使用符号asx或b。残基可能是谷氨酸或谷氨酰胺，则可以使用符号glx或z。除非上下文另有规定，否则天冬氨酸包括天冬氨酸盐，谷氨酸包括谷氨酸盐。
[0110]
也可相对于下文所述融合蛋白的氨基酸序列完成氨基酸删除或插入。因此，例如，可以删除对多肽活性没有实质性影响或至少没有消除这种活性的氨基酸。这种删除可能是有利的，因为多肽的总长度和分子量可以减少，而同时仍然保持活性。这可以使特定目的所需的多肽的量减少，例如，可以减少剂量水平。
[0111]
在一些实施方式中，以下氨基酸可以相互交换以进行保守的氨基酸取代：
[0112]
[0113]
因此，提及“保守”氨基酸取代是指抗体序列(例如cdr中或vh或vl序列中)中的一个或多个氨基酸被上述同一类别的另一个氨基酸取代的氨基酸取代。在cdr区域中可优选保守氨基酸取代以最大程度减小对抗体功能的不利影响。然而，保守氨基酸取代也可能发生在框架区内。
[0114]
可以使用任何合适的技术，例如通过定点诱变或固态合成，来完成与下面给出的序列相关的氨基酸改变。
[0115]
应当理解，本发明范围内的氨基酸取代或插入可以使用天然存在或非天然存在的氨基酸来进行，尽管天然存在的氨基酸可能是优选的。无论是否使用天然或合成氨基酸，优选只存在l-氨基酸。
[0116]
制造不稳定性(manufacturing liability)
[0117]
由于化学修饰和翻译后修饰(ptm)，治疗性蛋白质如抗体本质上是异质和复杂的。修饰可能由许多因素引起，如宿主细胞系统、制造中使用的工艺或储存或制造期间的条件。修饰可能与分子本身的化学稳定性或聚集电位以及这对抗体固有物理稳定性的影响有关。给定抗体序列中的氨基酸基序或残基可能在制造或存储过程中发生自发修饰被称为不稳定性。因此，可对抗体序列进行突变以解决不稳定性从而降低抗体对修饰和降解的易感性。
[0118]
由于抗体序列中的不稳定性而导致的此类修饰可包括糖基化、脱酰胺、氧化以及c-和n-末端的变化。此类修饰可能在制造过程中出现。某些残基和结构或序列基序更容易发生某些修饰。此类对修饰的不稳定性的实例包括asn n-连接糖基化、ser/thr o-连接糖基化、asn脱酰胺、asp异构化/片段化、lys糖化、met/trp氧化、游离硫醇基团、焦谷氨酸盐、c-末端lys。
[0119]
技术人员知道，计算工具可用于预测和识别可能导致修饰的结构和序列的不稳定性。为了尽量减少修饰的发生，可以对制造过程进行更改。蛋白质工程也被视为降低风险。例如，这些不稳定性的选择性突变有助于识别和降低危及抗体稳定性的修饰风险。
[0120]
天冬氨酸残基(asp)可能会发生自发修饰。含有asp的基序，如asp-gly序列可自发异构化以形成异天冬氨酸。异天冬氨酸盐的形成可能削弱或完全消除抗体的结合。如果asp残基出现在抗体的cdr中，这一点更为重要。
[0121]
因此，天冬氨酸残基(asp)可以被任何天然存在的氨基酸取代，以减少这种对修饰的不稳定性。可选地，天冬氨酸残基(asp)可被丙氨酸(ala)、谷氨酰胺(gln)或谷氨酸(glu)取代，以减少这种对修饰的不稳定性。还可以研究生产/配制的优化，以减少异构化。作为选择，asp-gly基序可以通过用另一种天然存在的氨基酸取代甘氨酸残基来修饰以抑制去酰胺化，而不是通过取代asp残基。
[0122]
蛋氨酸残基(met)可能会发生自发修饰。cdr中蛋氨酸(met)的存在，尤其是暴露于溶剂中时，如果蛋氨酸被氧化并干扰结合，可能会产生问题。因此，蛋氨酸残基可以被任何其他天然氨基酸取代，以减少这种修饰的不稳定性。蛋氨酸残基优选用ala或leu取代。还可以研究生产/配制的优化，以减少氧化。
[0123]
本发明每个方面的优选特征经必要修改后针对其他方面的每个方面。本文所述的现有技术文件在法律允许的最大范围内并入。
附图说明
[0124]
以下通过实施例给出但并不旨在将本发明仅限于所述特定实施方式的详细描述可以结合附图最好地理解。
[0125]
图1.88igg1与88migg3和亲代杂交瘤mab相比，维持癌细胞结合但显著降低直接细胞毒性。a.通过88igg1、88migg3和fg88(杂交瘤mab)进行可比的hct15和colo205细胞结合分析；b.与亲代88migg3和fg88相比，88igg1显著降低了对hct15的直接细胞毒性(pi摄取)；与亲代88migg3和fg88相比，88igg1显著降低了对colo205(c)和hct15(d)的增殖抑制。通过多重比较的dunnett修正由双因素方差分析推导出显著性。
[0126]
图2.migg3 ch3和少量ch2有助于直接细胞毒性和改进功能性亲和力。恒定结构域变换表明ch1对直接细胞毒性没有显著贡献(pi摄取，hct15，图2a；对colo205的增殖抑制，图2b)。相反，ch3(1m3和3h3)对直接细胞毒性有显著贡献，mch2轻微贡献仅在功能丧失方法(3h2)中是明显的(pi摄取，hct15，图2c；增殖抑制，colo205，图2d)。1m3显著增加功能性亲和力，降低解离速率；3h2显著降低功能性亲和力，增加解离速率，3h3更明显，确认主要ch3贡献和次要ch2贡献(图2e、2f)。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性)或单因素方差(功能性亲和力、解离速率)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0127]
图3.包含ch2：ch3连接的sd286397是migg3直接细胞毒性和改进的功能性亲和力的基础。ch2ch3的亚结构域划分确定了两个没有贡献的区域：sd232-294和sd390-447，以及两个显著有助于直接细胞毒性和功能性亲和力的区域：sd286-345(ch2)和sd339-397(ch3)。与88igg1相比，两种构建体和组合(sd286-397)均显著增加hct15(图3a)和colo205(图3b)的pi摄取。与88igg1相比，两种构建体和组合均显著增加colo205(图3c)和hct15(图3d)的增殖抑制。显著增加功能性亲和力(spr)，这主要是由于上述两种构建体(分别为图3e和图3f)降低了解离速率所致。与88igg1相比，sd339-397显著降低cdc活性(hct15)(图3g)；上述构建体维持adcc活性(colo205)(图3h)。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性)或单因素方差(功能性亲和力、解离速率、效应子功能)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0128]
图4.由286-306组合339-378组成的不连续区域赋予直接细胞毒性和增强的功能性亲和力，同时维持免疫效应子功能。与88igg1相比，sd339-378显著增加hct15的pi摄取(图4a)和增殖抑制(图4b)。与sd286-345相比，sd307-345显著降低pi摄取，表明sd286-306的贡献(图4c)。与88igg1相比，sd286-306 339-378组合显著增加对hct15(图4d)和colo205(图4e)的增殖抑制，以及colo205(图4f)的pi摄取。与88igg1相比，sd286-306 339-378显著增加功能性亲和力(spr)(图4g)。与88igg1相比，sd286-306 339-378维持对hct15(图4h)的cdc活性和对colo205(图4i)的adcc活性。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性)或单因素方差(功能性亲和力和效应子功能)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0129]
图5.包含几个高评分结合表位的mhcii结合簇。簇1由残基294-315组成，簇2由残基365-393组成。
[0130]
图6.具有直接的细胞毒性和增强的功能性亲和力，同时维持免疫效应子功能的i88g1，显示出孔隙形成能力。与88igg1相比，i88g1显著增加对hct15(图6a)和colo205(图6b)的增殖抑制。与88igg1相比，i88g1显著增加功能性亲和力(spr)(图6c)。与88igg1相比，
i88g1轻微但显著减小对colo205(图6d)的adcc，且与88igg1相比，i88g1显著增加对hct15(图6e)的cdc活性。i88g1对hct15细胞脱落、聚集和孔隙形成能力的证据(图6f)。
[0131]
图7.具有直接的性细胞毒性和增强的功能亲和力，同时维持免疫效应子功能的i129g1显示孔隙形成能力和体内肿瘤控制。与129igg1相比，i129g1显著增加对col0205(图7a)的增殖抑制(图7a)和pi摄取(图7b)。与129igg1相比，i129g1显著增加功能性亲和力(spr)(图7c)。i129g1维持对colo205的一些adcc活性，但与h129igg1相比显著降低(图7d)。与129igg1相比，i129g1对colo205的cdc活性显著增加(图7e)。i129g1对colo205的细胞脱落、聚集和孔隙形成能力的证据(图7f)。在colo205异种移植模型(balb/c小鼠)中，i129g1与溶媒对照相比且与129igg1相比体内肿瘤控制显著(图7g)。在小鼠研究过程中，对平均体重无显著影响(图7h)。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性和体内肿瘤控制)或单因素方差(功能性亲和力和效应子功能)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0132]
图8.与27igg1相比，i27g1显示出显著改进的直接细胞毒性和功能性亲和力，同时维持免疫效应子功能。与27igg1相比，i27g1显著增加了对mcf7(图8a)和ags(图8b)的增殖抑制。与27igg1相比，i27g1显著增加了功能性亲和力(spr)(图8c)。i27g1对mcf7维持相同的adcc(图8d)和cdc活性(图8e)。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性)或单因素方差(功能性亲和力)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0133]
图9.单回复体分析显示维持细胞直接杀伤需要最少15个残基。23个单i88g1回复体对colo205(图9a)和hct15(图9b)的直接细胞毒性。与colo205(七个残基)相比，正常化细胞杀伤(相对于i88g1)表明需要数量更多的mg3残基来维持对hct15(15个残基)的直接细胞毒性。分别与含有23个mg3残基的亲代构建体i88g1和i129g1相比，具有15个mg3残基的改进的构建体(i88g1v2，图9c和9e，以及i129g1v2，图9d)对colo205和hct15维持相同的直接细胞毒性。
[0134]
图10.fg27.10和fg27.18与st16、huvec和pbmc的结合。对于st16和huvec，本试验的阴性对照为nso上清液，或对于pbmc，为单独的细胞，阳性对照为识别hla的抗唾液酸基-di-lewis
a mab、505/4或w6/32。
[0135]
图11.fg27.10和fg27.18与结直肠(c170)、卵巢(ovcar-3、ovcar-4、ovca433、oaw28、oaw42)和胃细胞系(st16、mkn45、ags)的糖脂提取物的结合。从一系列癌细胞系中提取的糖脂被镀在elisa板上。然后将细胞和糖脂与fg2710或fg2718上清液孵育。用抗igg-hrp/tmb检测与糖脂的结合。
[0136]
图12a.由小鼠igg3 mab fg27.10介导的st16细胞的pi摄取即使在4℃也诱导强大的pi摄取，但igg1变体fg27.18则不能。图12b：由fg27.10和fg27.18介导的一组肿瘤细胞系(ags、colo201、c170、c170hm2、mcf7、ovca4、lovo、mkn45、791t和skov3)对pi的摄取。图12c：c170细胞上由fg27.10、fg27.18、ch27 igg2、ch27 igg1介导的c170细胞对pi的摄取。
[0137]
图13.fg27.10、fg27.18、ch27igg1和人源化变体hlewac与一组细胞系的结合：图13a，hct15；图13b，ags；图13c，ovcar3；图13d，h322和图13e，mcf7，以及fg27.10(图13f)和fg27.18(图13g)的spr分析。
[0138]
图14.与27igg1相比，i27g1显示出显著改进的直接细胞毒性和功能性亲和力，同时维持免疫效应子功能。与27igg1相比，i27g1显著增加对mcf7(小图i)和ags(小图ii)的增殖抑制。与27igg1相比，i27g1显著增加功能性亲和力(spr)(小图iii)。i27g1对mcf7维持相
同的adcc(小图iv)和cdc活性(小图v)。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性)或单因素方差(功能性亲和力)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0139]
图15.抗体88的dna和蛋白质抗体序列，包括“改进”版本1-3。
[0140]
图16.抗体129的dna和蛋白质抗体序列，包括“改进”版本1-3。
[0141]
图17.抗体27的dna和蛋白质抗体序列，包括“改进”版本1。
[0142]
图18.与野生型曲妥珠单抗(wt)相比，i曲妥珠单抗(itv1和itv2)以配体密度依赖性方式表现出改进的功能性亲和力(biacore t200分析，图18a)。曲妥珠单抗构建体对一系列高结合(skbr3、bt474)和中低结合细胞系(mda-mb231和skov3)的细胞结合概述(图18b)。与野生型曲妥珠单抗相比，显著改进对mda-mb231的直接细胞毒性(itv2)(图18c)。与野生型曲妥珠单抗相比，itv1和itv2(最高浓度)增强bt474细胞对pi的摄取(反射膜损伤)(图18d)。与野生型曲妥珠单抗相比，直接标记的itv2改进固相her2结合(图18e)。通过多重比较的dunnett修正，由双因素方差(直接细胞毒性)，推导出与各亲代构建体的显著性。
[0143]
图19.蛋白质抗体曲妥珠单抗抗体序列，包括“改进”版本1和2。
[0144]
图20.iedb筛选mhc ii类结合表位。顶部，包含sd286-306 339-378的higg1和migg3序列的序列比对(clustalw)。组合的亚结构域286-306和339-378在框中；iedb分析确定的簇1和簇2由箭头表示。下方，中栏为iedb分析表，包括mhcii结合表位、dr等位基因和评分。右栏列出了可解决免疫原性问题的残基变化(migg3-＞higg1，下划线)。di，去免疫构建体。
具体实施方式
[0145]
在描述本发明的实施方式时，术语并不旨在限于如此选择的特定术语，并且应理解，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等价物。
[0146]
术语“免疫球蛋白”或ig是指一类结构相关糖蛋白，该糖蛋白由两对多肽链组成，即一对低分子量轻(l)链和一对重(h)链，所有四条链可能通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已得到很好表征。例如，参见基础免疫学第7章(paul，w.编辑，第二版，raven press，n.y.(1989))。
[0147]
方法
[0148]
材料、细胞和抗体
[0149]
所有癌细胞系：colo205、hct15(c170、c170hm2)、ags、colo201、st16、mcf7、ovcar3、h322、ovca4、lovo、mkn45、791t、bt474、mda-mb231、skbr3、skov3和791t，以及小鼠骨髓瘤ns0细胞系均购自atcc(美国弗吉尼亚)。所有细胞系均使用短串联重复序列分析进行鉴定。人血清白蛋白(hsa)-apd-唾液酸基-lewisa和has-apd-lewisa来自isosepab(瑞典)。erb2 his来源于abcam和stratech。细胞系保持在rpmi培养基1640(sigma)或补充有10％胎牛血清、l-谷氨酰胺(2mm)和碳酸氢钠缓冲液的dmem高糖中。如前所述，产生亲代小鼠fg88和fg129mab(chua等，2015)。
[0150]
修饰的mab构建体的克隆
[0151]
为创建我们的杂交瘤产生的mab(fg88.2和fg129)的嵌合igg1变体，使用限制酶bamhi/bsiwi(轻链位点)或hindiii/afei(重链位点)将编码相应mab的重链和轻链可变区引入pdcorig载体(metheringham等人，2009)。由eurofins mwg(德国杜塞尔多夫)设计并订
购合成重链恒定区，包括完整的migg3恒定区以及互换的migg3-igg1结构域和单残基变化。通常，这涉及1054bp盒，从连接至xbai位点3
′
的jh/ch连接处的afei限制位点延伸到ch终止密码子。合成基因在专有的eurofins载体中提供。在maxiprep(质粒maxi试剂盒，qiagen)之后，用afei和xbai(均来自neb)消化15μg质粒dna，并纯化插入物凝胶(qiaquick凝胶提取试剂盒，qiagen)。该插入物通过连接(t4 dna连接酶，neb，遵循制造商的建议)引入afei/xbai消化的载体porighib(metheringham等人，2009)。序列确认和maxiprep后，用afei和avrii(均来自neb)消化15μg质粒dna，并纯化插入物凝胶。然后通过连接将该插入物引入afei/avrii消化的载体pdcorig中。
[0152]
hek293转染和mab纯化
[0153]
在使用expifectamine
tm 293转染试剂盒(gibco，lifetechnologies)瞬时转染expi293f
tm
细胞后获得mab构建体。简而言之，用100μg dna转染悬浮液(100ml，2
×
106/ml)中的hek293细胞，并在转染后第7天收集调整培养基。调整的转染上清液通过0.22μm瓶顶过滤器(merck millipore)过滤，并添加叠氮化钠至最终浓度为0.2％(w/v)。使用aktafplc(ge healthcare)在蛋白g柱(hitrap proteing hp，ge healthcare)上纯化抗体。柱子使用pbs/tris缓冲液(pbs与50mm tris/hcl，ph 7.0)洗涤，然后使用快速(2ml)梯度将抗体洗脱至100mm甘氨酸，ph12(补充有0.05％v/v吐温20)中，收集2ml组分。将含有mab的部分合并并中和(使用1m hcl)并测定浓度。然后分析所有瞬时表达的mab构建体相较于亲代mab的细胞结合，使用流式细胞术作为正确折叠mab构建体的读数(数据未显示)。
[0154]
间接免疫荧光和流式细胞术
[0155]
癌细胞(1
×
105)在4℃与初级mab(33.3nmol/l或滴定)孵育1小时，如前所述(chua等人，2015)，然后在4℃与抗小鼠/抗人-fitc标记的二抗孵育1小时，并固定在0.4％的甲醛中。染色样本在macsquant10流式细胞仪上进行分析，并使用flowjo v10进行分析。
[0156]
功能性亲和力测定
[0157]
通过表面等离子体共振(spr，biacore 3000，ge healthcare)测定88和129mab与lewisa或唾液酸基-lewis
a-apd-has结合的动力学参数。通过cm5芯片注入浓度增加(0.3nmol/l至200nmol/l)的mab，并使用biaevaluation 4.1将数据拟合到异质配体结合模型。芯片包含四个池，其中两个为hsa涂覆(在线参考池)，另外两个由低量(30至80个响应单元(ru))和高量(360ru至390ru)的各自的聚糖-apd-has涂覆。
[0158]
通过spr(biacore t200，cytiva，formerly ge healthcare)测定曲妥珠单抗抗体与曲妥珠单抗工程抗体变体结合其配体her2的动力学参数。注射浓度增加(90.0nm至0.37nm)的抗体穿过涂覆有抗-his抗体的cm5芯片，并捕获his-标记的her2。
[0159]
体外细胞毒性
[0160]
进行pi摄取和增殖抑制以分析mab的直接细胞毒性作用。colo205、hct-15或bt474细胞(5
×
104)与mab在37℃孵育2小时，然后添加1μg pi，持续30分钟。将细胞重新悬浮在pbs中，在beckman计数仪fc-500或macsquant 10流式细胞仪上运行，并分别使用winmdi 2.9或flowjo v10软件进行分析。
[0161]
通过使用水溶性四氮唑盐wst-8(cck8试剂盒，sigma-aldrich)测量细胞氢化酶的活性(与活细胞的数量成正比)来评估构建体的增殖抑制。简而言之，在整夜镀覆癌细胞(1000-2000细胞/90u1/孔)后，在10μl/孔的最终体积中添加不同浓度的构建体，板在37℃，
(5％co2)孵育72至96小时。然后添加wst-8试剂(10μl/孔)，在进一步孵育3小时后，450nm读板(tecan infinite f50)，并计算抑制百分比。ec
50
值通过graphpad prism v 8.0(graphpad inc，la jolla，ca)使用非线性回归(曲线拟合)确定。
[0162]
扫描电子显微镜
[0163]
hct-15或colo205细胞(1
×
105)在无菌盖玻片上生长24小时，然后在37℃添加mab(0.2μmol/l)18小时。对照包括单独培养基和0.5％(v/v)过氧化氢(h2o2)(sigma)。细胞用预先加热的0.1m二甲胂酸钠缓冲液ph 7.4(sdb)洗涤，并用12.5％(v/v)戊二醛固定24小时。固定的细胞用sdb洗涤两次，然后用1％(v/v)四氧化锇(ph7.4)固定45分钟。最后用h2o洗涤后，在增加乙醇浓度的情况下使细胞脱水，并暴露于临界点干燥，然后用金溅射，之后进行sem分析(jsm-840sem，jeol)。
[0164]
体内模型
[0165]
根据ncri、lasa和felas指南，该研究由crownbio uk在uk home office licence下进行。在年龄匹配的雌性balb/c裸鼠(charles river，英国)中通过将0.1ml无血清rpmi：matrigel(1∶1)中的5
×
106个活细胞注入每只小鼠的左胁，来建立colo 205人结直肠腺癌模型的皮下肿瘤。在研究的第6天基于平均肿瘤体积(约103mm3±
13mm3)将小鼠(n＝10)随机分配到治疗组，并每两周通过静脉注射(i.v.)给药mab(0.1mg)或溶媒(pbs，100u1)，直至第5周。每周评估三次体重和肿瘤体积，并使用双因素方差检验和bonferroni后检验(相互作用因数；graphpad prismv 7.4(graphpad inc，la jolla，ca))对肿瘤体积的减少进行统计分析。
[0166]
实施例
[0167]
现在将进一步参考以下实施例和附图描述本发明。
[0168]
实施例1.在缺乏补体和免疫效应细胞的情况下，m88g3表现出嗜多糖结合和直接细胞毒性(在嵌合到88igg1后二者均减少)。
[0169]
先前已经证明杂交瘤产生的migg3 mab fg88.2在缺乏补体或效应细胞的情况下，对高结合癌细胞系，如colo205和hct15，发挥直接的细胞毒性作用(chua等人，2015)。这种直接的细胞毒性涉及通过溶瘤机制的mab诱导的细胞聚集、增殖抑制以及不规则孔隙形成。我们随后创建了嵌合的hek293表达的igg1 mab，88igg1，用于临床开发。与杂交瘤产生的fg88.2以及hek293表达的88migg3相比，88igg1维持相同的hct15和colo205癌细胞结合水平(图1a)。后一种mab的产生是为了排除表达系统相关效应，如差异fc糖基化，这是由于使用小鼠杂交瘤细胞和hek293细胞所致。令人惊讶的是，与88migg3相比，通过两个功能试验(pi摄取和增殖抑制)，88igg1显示出对colo205和hct15显著降低的直接细胞毒性(图1b-d)。与杂交瘤产生的fg88.2相比，88migg3也显示出适度的直接细胞毒性降低，表明两种表达设置(小鼠杂交瘤与hek293细胞)导致的fc区的差异糖基化可能有助于这种效应。这表明直接细胞杀伤与不同同型的动力学结合有关。因此，使用spr在lewisa-apd-has涂覆的-芯片上分析了我们的同型切换mab的动力学结合(表1)。fg88.2在高密度流动池上显示avid lewis
a-apd-hsa结合，具有快速的表观结合速率(k
on
约10
4 1/smol/l)和非常缓慢的解离速率(k
off
约10-6 1/s)。与fg88.2相比，hek293产生的88migg3显示出表观更快的结合速率(k
on
约
×
10
5 1/smol/l)和稍快的解离速率(k
off
约10-4 1/s)，这可以解释与fg88.2相比细胞毒性略微降低。相比之下，88igg1以表观快速的结合速率(k
on
约1051/smol/l)结合其靶，但与
migg3同型相比，表现出快得多的离解阶段(表观koff约10-2 1/smol/l)，这可能是其与癌细胞结合时细胞毒活性降低的原因。三种mab在低密度流动池上的mab结合行为在很大程度上具有可比性，三种mab的平衡离解常数(kd)均大约为10-8
mol/l。
[0170]
实施例2.migg3恒定区的结构域分析表明，migg3 ch3结构域具有主要贡献，略微涉及ch2。
[0171]
总的来说，结果表明fg88和88migg3表现出的高lewisa-apd-hsa功能性亲和力主要由其缓慢的离解驱动，这可能是由于这种同型的分子间协同性所致，这种高亲和力有助于它们对高结合癌细胞系的直接细胞毒性作用。因此，我们通过将选定的migg3恒定区残基转移到88igg1中着手设计一种具有直接细胞毒性活性的igg1癌聚糖靶向mab。首先，通过创建包含migg3 ch1、ch2或ch3结构域的杂交88igg1构建体，确定migg3贡献区。初步分析确定，migg3 ch1对88migg3的直接细胞毒性能力的贡献微乎其微，因为将migg3 ch1引入88igg1(1m1)并不会导致细胞毒性的显著增加(图2a和2b)。相反，将igg1ch1引入88migg3(3h1)中，同样不会导致杀伤活性显著降低(图2a和2b)。接下来，采用功能增益法，在88igg1中分别引入migg3 ch2和ch3结构域。与88igg1相比，含有小鼠ch3的88igg1(1m3)显示出hct15的pi摄取显著增益，以及colo205细胞的增殖抑制显著增加(图2c和2d)。将小鼠ch2引入到88igg1(1m2)中导致两种试验中的杀伤活性都有少量但不显著的增加(图2c和2d)。作为对这两个结构域贡献的确认，遵循相反的策略，籍此通过将igg1 ch2或ch3结构域引入88migg3，评估细胞毒性活性的丧失。这种情况导致含有igg1 ch3的88mg3(3h3)的细胞毒性显著降低，证实了先前的功能增益结果。重要的是，该策略还确定了小鼠ch2的小贡献，因为含有人ch2的88migg3(3h2)显示出细胞毒性活性的显著降低(图2c和2d)。接下来，分析杂交构建体的动力学结合行为。在两种情况下，杂交构建体1m3显示出适度但显著增加的功能性亲和力(kd降低)，而含有人ch3的3h3显示出功能性亲和力显著降低(kd增加，图2e)，反映了直接细胞毒性。构建体3h2中的人ch2也导致功能性亲和力适度但显著的下降。在所有情况下，功能性亲和力的变化主要由mab的解离速率的变化驱动，1m3的解离速率与88igg1和3h3相比显著降低，以及3h2与88migg3相比显示出出解离速率显著增加(图2f)。与88igg1相比，构建体1m2中的小鼠ch2不会导致功能性亲和力增加或解离速率降低，这是该构建体的细胞毒性不显著的原因(图2c和d)。综上所述，结果表明小鼠ch3对细胞毒性和动力学结合有更显著的贡献，而小鼠ch2的贡献较小，仅在功能丧失的背景下观察到。
[0172]
实施例3.aa 286-397的ch2-ch3区内的不连续序列对于杀伤活性和增加功能性亲和力至关重要。
[0173]
由于小鼠ch3赋予的细胞毒性作用不完全，并且为了进一步缩小其他有贡献的残基，我们设计了88个杂交mab构建体，其中ch2和ch3结构域进一步细分为连接区域包含10个残基重叠的两个亚结构域(sd)：ch2：sd232-294和sd286-345以及ch3：sd339-397和sd390-447。对于colo205，sd339-397和sd286-345二者均提供了类似的显著增加的细胞毒性，在较低浓度下最为明显，而sd232-294和sd390-447单独或组合(未显示)对细胞毒性而言是可有可无的(图3a和3c)。然而，对于hct15，sd339-397内残基的显著贡献大于sd286-345的(图3b和3d)，这表明糖抗原密度和组成的细微差异可调节mab结合和随后的细胞毒性活性。引人注目的是，含有组合的migg3 sd286-345和sd339-397(sd286-397)的88igg1在两种细胞系和两种测试中几乎恢复了88migg3的所有细胞毒性(图3a-3d)，避免了对额外的亚结构域的
需求。与88igg1相比，亚结构域构建体的功能性亲和力分析显示sd286-397以及sd339-397的功能性亲和力有显著改进，两者目前都与88migg3功能性亲和力相匹配，sd286-345的改进更为适度(图3e)。功能性亲和力的改进主要是由于sd286-397以及sd339-397的表观解离速率显著降低(约10-6 1/s)，sd286-345的解离速率显示出更适度的改进(约10-3 1/s)(图3f)。这些结果进一步增加了细胞毒性观察的权重，并表明创建具有较低靶解离速率的mab支持直接细胞毒性。
[0174]
尽管含有27个migg3残基的sd339-397重现了88migg3高达90％的理想属性，尤其是缓慢解离和增强的细胞毒性，但与88igg1相比，其显示出显著降低的cdc活性(图3g)，因此需要使用sd286-397进行进一步开发。相反，与88igg1相比，sd339-397的adcc活性并未降低(图3h)。尽管sd286-397完全重现了88migg3的细胞毒性，但它仍然含有41个migg3残基。因此，对sd286-345和sd339-397的其他细分进行了细胞毒性活性和功能性亲和力分析。该分析突出了分别在sd339-397和sd286-345中的两个对直接细胞毒性有贡献的区域。首先，含有20个migg3-特异性残基的sd339-378在引入88igg1中后，在两次测试中，细胞毒性显著恢复到migg3细胞毒性的约80％至90％内(图4a和4b)。与88igg1相比，该区域也注入了功能性亲和力的显著增加，但这种改进不如sd339-397的情况明显(图4g)。在同一组构建体中，我们通过功能丧失方法确定了另一个感兴趣的区域。与sd286-345相比，sd307-345的细胞毒性显著降低，这意味着残基286-306的进一步贡献(图4c)。总的来说，结果表明含有残基286-306和339-378组合(总共26个migg3特异性残基)的构建体可能完全重现88migg3的直接细胞毒性和功能亲和力。为了验证这一假设，评估了sd286-306 339-378的细胞毒性活性和功能性亲和力。与88igg1相比，sd286-306 339-378对两种细胞系均表现出显著改进的直接细胞毒性，目前与88migg3细胞毒性相匹配(图4d-4f)。sd286-306 339-378的spr分析显示，与88igg1相比功能性亲和力显著提高，kd为(0.3
×
10-9
nmol/l)，并与88migg3相似(图4g)。重要的是，sd286-306 339-378构建体的cdc活性和adcc活性均与88igg1没有显著差异(图4h和4i)。改进的功能性亲和力与直接细胞毒性以及维持的免疫效应子功能的结合表明，我们的sd286-306 339-378杂交igg1模拟了88migg3的理想属性。
[0175]
实施例4.在电脑上识别的一个免疫原性簇的逆转产生先导候选，改进的“i”88g1，其具有强大的细胞杀伤、孔隙形成能力和良好的免疫效应子功能。
[0176]
为评估我们的杂交sd286-306 339-378构建体(由存在的26个migg3残基产生)的潜在免疫原性，我们对mhcii结合表位的sd286-306 339-378序列进行了在电脑上的筛选(免疫表位数据库，iedb)。ii类限制性t辅助细胞与体液免疫反应更相关，预测的结合簇已被证明是t细胞反应的有力指标(jawa等人，2013)。鉴定出两个mhcii结合簇(包含几个高评分结合表位)：簇1(残基294-315)和簇2(残基365-393)(图5/图20)。在簇1内，将三个小鼠残基294(a到e)、300(f到y)和305(a到v)回复为人残基，产生了个体将可耐受的人序列片段。类似地，在339-378区域内，两个残基351(i到l)和371(n到g)的回复去除了两个mhcii结合核心。因此，我们基于上述在电脑上的筛选创建了另外两个基于sd286-306 339-378的构建体：簇1(di1)和簇2(di2)，分别包含三个和两个人回复残基，并测定了它们的细胞毒性。与88igg1相比，di1和di2维持了显著改进的细胞毒性，但与88migg3相比，di2表现出较小但持续的活性降低(图6a和6b)。另外，在88di1的情况下，直接细胞毒性与有利的功能性亲和力曲线一致，表观解离速率为(约10-4 1/s)，kd为0.5
×
10-9
nmol/l，与88migg3没有显著差异
(图6c，表2)。相比之下，与88migg3相比，di2显示出显著降低的功能性亲和力(图6c)。基于这些发现，我们关注含有23个migg3残基的88di1，现在重命名为改进的“i”(改良的)88g1，以进一步分析其免疫效应子功能。88igg1对于colo205显示出强大的adcc活性，具有亚纳摩尔ec
50
(图6d)，与fg88的强大免疫效应子功能一致(chua等人，2015)。类似地，i88g1显示出强大的adcc，具有亚纳摩尔ec
50
(0.35nmol/l)，尽管与88igg1(ec
50
为0.13nmol/l)相比稍微降低。与88igg1相比，i88g1的cdc活性得到适度改进(图6e，表2)。
[0177]
早期对杂交瘤产生的亲代fg88mab的研究已经证明了其孔隙形成能力，这被推测是其细胞毒性的基础(chua等人，2015)。因此，我们开始使用sem来分析i88g1在hct15上的孔隙形成能力。hct15与i88g1或88migg3(而非88igg1)孵育导致单层破坏、细胞变圆和聚集。在高倍镜下，明显有不规则孔隙形成(图6f)，反映了杂交瘤产生的fg88mab观察到的原始数据(chua等人，2015)。
[0178]
总的来说，结果表明将选定区域从migg3恒定区转移到88igg1主链中，产生了具有直接细胞杀伤能力、增加的功能性亲和力以及强大免疫效应子功能的杂交mab。
[0179]
实施例5.将“ig1”序列转移到可替换的非杀伤性聚糖结合mab(129igg1)中产生具有改进的体外和体内抗肿瘤活性的癌症靶向mab。
[0180]
我们最近描述了具有癌症免疫治疗发展潜力的识别唾液酸基-di-lewisa(sialyl-di-lewisa)的mab(129mab)的产生。与上述88mab相比，129mab具有更为有利的肿瘤与正常人体组织分布，主要原因是其正常组织反应性非常有限。杂交瘤产生的fg129(一种小鼠igg1mab)和嵌合的129igg1均未表现出直接的细胞毒性。这使我们检验了如下假设，即，将23个上述选定的migg3恒定区残基引入ch129的fc区将产生具有直接细胞毒性和改进的功能性亲和力的“i”129g1，从而显示出优越的临床效用。
[0181]
我们评估了i129g1对colo205的直接细胞毒性能力，colo205在之前证明是129mab的高结合癌细胞系。i129g1显示出显著改进(与129igg1相比)的剂量依赖性增殖抑制(图7a)，ec
50
为45.6nmol/l，以及显著改进但更适度的pi摄取(图7b)。接下来，我们使用唾液酸基lewis
a-apd-has涂覆的芯片和spr分析了i129g1的功能性亲和力。与129igg1相比，i129g1 mab显示出显著改进的功能性亲和力(图7c，表2)，这主要是由于解离速率改进了近两个对数(129igg1和i129g1分别为2.6
×
10-4
s-1
和5.5
×
10-6
s-1
)。129igg1先前对colo205发挥了强大的adcc效应子功能，因此评估了i129g1对colo205的adcc和cdc活性。与129igg1相比，i129g1的adcc活性显著降低，但细胞裂解保持在纳摩尔范围内(i129g和129igg1的ec
50
分别为2.4
×
nmol/l和1.7
×
nmol/l)(图7d，表2)。然而，与亲代129igg1相比，i129g1的cdc活性显著增加，i129g1和129igg1的ec
50
分别为8.2
×
nmol/l和75
×
mol/l(图7e，表2)。i129g1的直接细胞毒性和改进的功能性亲和力使我们分析了其对于colo205的孔隙形成能力。colo205与i129g1的孵育导致了具有不均匀表面的大细胞团的形成，以及不规则孔状结构的出现(图7f)。在相同浓度下与129igg1孵育也会导致一定程度的细胞聚集，但观察到更小更少的团块，没有孔隙形成的证据。
[0182]
i129g1的直接细胞毒性和改进的功能性亲和力引导我们分析与亲代129igg1相比，i129g1在colo205异种移植模型中的体内抗肿瘤活性。与溶媒对照相比，i129g1 mab导致肿瘤体积显著减少(双因素方差分析，p＜0.0001)，与129igg1相比该结果仍然显著，从而证实了体外结果(图7g)。未观察到对平均体重的影响(图7h)。
[0183]
通过引入选定数量的migg3恒定区残基，产生的具有直接细胞毒性、改进的功能性亲和力和优越的体内抗肿瘤活性的mab为将我们的策略应用于其他具有临床效用的癌症靶向mab铺平了道路。
[0184]
实施例6.将“ig1”序列转移到可替换的lewisy聚糖结合mab(27igg1)中产生具有改进的体外直接细胞杀伤能力的癌症靶向mab。
[0185]
我们还创建了单特异性结合lewisy的mab，27mab，其具有广泛的肿瘤组织分布和良好的正常人体组织结合。该migg3 mab对于表达lewisy的ags和mcf7细胞系显示直接细胞杀伤，而嵌合27igg1则没有(图8a和8b)。我们将我们选择的23个mg3残基引入27igg1中，从而产生i27g1并分析其直接细胞杀伤作用。与27igg1相比，i27g1对于mcf7和ags二者均显示出显著改进的直接细胞杀伤，相当于27mg3 mab(图8a和8b)。另外，与27igg1相比，i27g1表现出显著改进的功能性lewisy亲和力(图8c)。重要的是，在mcf7上，i27g1的效应子功能，adcc和cdc二者均与27igg1相当(图8d和8e)。
[0186]
总的来说，结果表明将选定区域从migg3恒定区转移到27igg1主链中，产生了具有直接细胞杀伤能力、增加的功能性亲和力以及强大的免疫效应子功能的杂交mab。
[0187]
实施例7.对23个“ig1”序列的进一步微调表明，15或7个残基对于以细胞类型依赖性方式维持直接细胞杀伤至关重要。
[0188]
为了评估23个选定的mg3残基中每一个残基的单独贡献，执行了基于i88g1的单回复体策略(实施例4)。将i88g1中的23个mg3残基中的每一个单独回复为hg1残基，并使用细胞增殖试验(cck-8，sigma 96992)分析产生的构建体对col0205以及hct15的直接细胞杀伤作用，并与亲代i88g1进行比较。在同一实验中，固定浓度的杀伤百分比针对相同浓度的i88g1的相应杀伤百分比进行归一化，以便在多个实验中关联细胞杀伤。大多数i88g1回复体结构保留了对colo205细胞的良好直接细胞杀伤(图9a)。残基342、343、345、361、362、374和376(总共七个)的平均标准化杀伤小于1，并且被认为对高结合colo205细胞系的直接细胞杀伤是所必需的。相反，如果这七个残基单独回复，那么这个最小构建体不表达/折叠，因此该构建体并未获得。中等结合hct15的直接细胞杀伤被证明对回复为hg1残基更为敏感，仅八个回复残基(339、344、354、356、357、358、370、373)就将细胞杀伤维持在i88g1的一个标准偏差内，因此需要保留15个mg3残基：n286t、k288w、k290q、q342r、p343a、e345t、l351i、t359s、n361k、q362k、g371n、p374s、s375e、d376a、a378s(图9b)。后一种构建体针对88和129mab二者创建，分别为i88g1v2和i129g1v2，并分析其对于colo205和hct15的细胞杀伤。i88g1v2以及i129g1v2对colo205的直接细胞杀伤分别与i88g1和i129g1观察到的相当(图9c和9d)。i88g1v2对hct15的直接细胞杀伤同样与i88g1观察到的相匹配(图9e)。
[0189]
总的来说，结果表明15个mg3残基：n286t、k288w、k290q、q342r、p343a、e345t、l351i、t359s、n361k、q362k、g371n、p374s、s375e、d376a、a378s，足以对高结合以及中等结合的癌细胞系诱导直接细胞杀伤。
[0190]
表1.亲代88个mab的动力学结合参数概述
[0191][0192]a代表最少3次分析
[0193]b给出了高密度表面结合的结果
[0194]
表2.改进的构建体的功能特征概述
[0195][0196]a由对colo205的增殖抑制推断
[0197]
n/a：不合适，nd：未测定
[0198]
实施例8.fg27mab的产生和初始表征：fg27通过胃肿瘤细胞糖脂免疫而提高
[0199]
分析抗体对免疫接种的反应：最初通过脂质酶联免疫吸附试验(elisa)监测抗体滴度。随后使用st16全部及质膜脂质提取物进行薄层色谱(tlc)分析，使用st16肿瘤细胞进行流式细胞术分析(facs)，并且使用st16全细胞提取物全部及质膜脂质提取物进行westernblot。与出血前血清对照相比，被认为具有最佳反应的小鼠在融合前静脉注射(i.v.)st16质膜脂质提取物以增强。
[0200]
通过直接免疫荧光和facs分析，分析fg27杂交瘤上清液与一组肿瘤细胞系的结合。与阳性对照抗-hla mab，w6/32(ebioscience，ca，usa)和阴性对照相比，fg27.10和fg27.18二者均结合st16，但不结合人脐静脉内皮细胞(huvec)或外周血单核细胞pbmc(图10)。fg27.10和fg27.18均被克隆。fg27.10为igg3κ，fg27.18为igg1κ亚类。为确保两种mab均与糖脂结合，从一系列细胞系中提取糖脂，在elisa板上干燥，然后与fg27.10和fg27.18孵育。发现c170、st16和ags衍生糖脂与两种mab结合，但未发现与整个细胞缺乏结合的细胞系(mkn-45、oaw28、ovcar-3、ovcar-4和oaw42；图11)。
[0201]
实施例9.亲代fg27 mab的直接细胞杀伤
[0202]
许多抗聚糖mab已被证明在抗原阳性细胞系中诱导直接细胞死亡，而不需要效应
细胞或补体。这有可能提高其体内疗效，因为肿瘤可发展避免免疫介导的细胞死亡的机制。这种能力主要与migg3同型的聚糖结合mab有关，因此在嵌合体化或人源化后该特性丧失。
[0203]
为确定fg27.10和fg27.18是否具有导致直接细胞死亡的能力，st16细胞与fg27.10、fg27.18和抗唾液酸基lewisa mab sc104一起在室温孵育2小时，然后通过pi摄取测量细胞死亡，pi是一种仅被死亡细胞摄取的dna插入剂(图12a)。有趣的是，尽管具有相同的可变区，但只有fg27.10能够诱导直接细胞死亡，fg27.18未观察到pi摄取。图12b显示了两种mab对一系列抗原阳性(ags、colo201、c170、c170hm、mcf-7、ovcar4)细胞系的直接细胞杀伤，显示了可变的杀伤量。两种mab均未显示对抗原阴性细胞系(lovo、mkn45、791t、skov3)的杀伤。
[0204]
图12c显示了一系列mab下，结直肠细胞系c170的pi摄取。fg27.10和阳性对照抗体sc101显示出可滴定的强杀伤。fg27.18表现出不可滴定的弱杀伤。修饰的igg1嵌合物显示可滴定的适度杀伤，而igg2变体则没有。
[0205]
实施例10.fg27结合研究
[0206]
人源化(人源化27)和嵌合mab(ch27)对于癌细胞系的滴定显示出类似的细胞结合模式(图13a-e)。平衡亲和力常数总体上处于相同的数量级，但与亲代小鼠抗体相比略高(图13f-13g)，而人源化27和ch27的最大结合能力与小鼠mab的最大结合能力相比更大。这一结果表明人源化过程取得了成功。
[0207]
实施例11.人源化fg27 mab的直接细胞杀伤
[0208]
为了增强人igg1 27嵌合物(27igg1)的直接细胞杀伤，我们将选定的migg3恒定区残基转移到igg1 fc结构域，从而产生结合lewisy聚糖的改进的“i27g1”mab，其具有改进的体外直接细胞杀伤能力。
[0209]
图14显示了改进的i27g1的直接细胞杀伤、功能性亲和力以及效应子功能。migg3 27抗体对表达lewisy的mcf7(图14的i)和ags细胞系(图14的ii)具有直接细胞杀伤能力，而嵌合27igg1则没有。与27igg1相比，我们的i27g1(含有选定的migg3恒定区残基)对mcf7(图14的i)和ags(图14的ii)二者均显示出显著改进的直接细胞杀伤，相当于27mg3 mab。另外，与27igg1相比，i27g1表现出显著改进的功能性lewisy亲和力(图14的iii)。重要的是，i27g1对mcf7的效应子功能，adcc和cdc均与27igg1相当(图14的iv和14的v)。总的来说，结果表明将选定区域从migg3恒定区转移到27igg1主链中，产生了具有直接细胞杀伤、增加的功能性亲和力以及强大的免疫效应子功能的杂交mab。
[0210]
实施例12.将“ig1”序列转移到蛋白结合mab(曲妥珠单抗)中，产生具有改进的功能性亲和力的癌症靶向的mab。
[0211]
为了评估改变靶向癌症相关蛋白的抗体的氨基酸残基是否导致功能性亲和力增加，改变了“ig1”残基(23，
′
v1
′
和15，
′
v2
′
)，并通过spr分析确定了产生的“改进的”抗体变体的亲和力。为了确定功能性亲和力，三种曲妥珠单抗抗体构建体在her2涂覆芯片上以三种不同的配体密度进行滴定。进行了多循环动力学分析(浓度范围为90nm至0.37m)，该分析表明，与wt相比，itv1和itv2对于低密度(20ru)和高密度(200ru)表面二者的功能性亲和力都有所增加(图18a)。这种改进在高密度表面上更为明显，主要是由于解离速率的降低所致(itv1为8.5
×
10-8 1/s，itv2为7.4
×
10-8 1/s，而wt为6.0
×
10-7 1/s)。hek293表达的野生型曲妥珠单抗(wt)和“改进”变体(itv1和itv2)与表达her2的细胞系skbr3和bt474高度结
合，与mda-mb231和skov3为中低度结合(图18b)。为了评估itv1和itv2更强烈的结合是否会导致不同的细胞毒性，探索了对mda-mb231的增殖抑制和bt474的pi摄取。与wt相比，itv2显示出对mda-mb231显著改进的增殖抑制(图18c)，与wt相比，itv1和itv2二者均显示bt474细胞的改进的pi摄取，在最高试验浓度下最为显著(图18d)。直接将hrpo标记的mab滴定到her2涂覆的elisa板上，发现itv2的结合力比wt有所改进。总的来说，结果表明“ig1”工程化曲妥珠单抗构建体改进了功能性亲和力，这表明我们的方法除了聚糖靶外，还可以使蛋白靶向mab受益。然而，我们的工程方法的最终结果取决于mab复杂的亲合力与靶密度之间的相互作用。
[0212]
实施方式
[0213]
下面描述本发明的某些实施方式。以下实施方式的各种特征可与其他实施方式的特征组合，例如，诸如序列基序的结构特征可与所要求保护的抗体或其抗原结合片段的功能特征组合。
[0214]
1.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含免疫球蛋白fc-区的一个或多个残基和结合区，其中将fc-区的一个或多个残基修饰为来自小鼠igg3抗体的相应残基并且其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段具有增强的功能性亲和力。
[0215]
2.根据实施方式1的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的功能性亲和力增强至少约10％。
[0216]
3.根据实施方式1或实施方式2的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的功能性亲和力增强了至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0217]
4.根据实施方式1至3中任一项的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段增强了直接细胞杀伤。
[0218]
5.根据实施方式4的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤增强至少约10％。
[0219]
6.根据实施方式1或实施方式2的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中与包含野生型fc-区残基的相应igg1抗体或其抗原结合片段相比，修饰的igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤增强至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0220]
7.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个残基选自：q342、p343、e345、n361、q362、p374、d376。
[0221]
8.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个修饰的残基选自：q342r、p343a、e345t、n361k、q362k、p374s、d376a。
[0222]
9.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个残基选自：n286、k288、k290、q342、p343、e345、l351、t359、n361、q362、g371、p374、
s375、d376、a378。
[0223]
10.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个修饰的残基选自：n286t、k288w、k290q、q342r、p343a、e345t、l351i、t359s、n361k、q362k、g371n、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0224]
11.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个残基选自：n286、k288、k290、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
[0225]
12.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个修饰的残基选自：n286t、k288w、k290q、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0226]
13.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个残基选自：n286、k288、k290、e294、y300、v305、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
[0227]
14.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中fc-区的一个或多个修饰的残基选自：n286t、k288w、k290q、e294a、y300f、v305a、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0228]
15.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0229]
16.根据任何前述实施方式的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中igg1抗体或其抗原结合片段是单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
[0230]
17.根据实施方式16的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中igg1抗体或其抗原结合片段是包含具有第一重链和第一抗原结合区、第二重链和第二抗原结合区的fc-区的双特异性抗体。
[0231]
18.根据实施方式16或17的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其中igg1抗体或其抗原结合片段是与cd3抗原结合的双特异性抗体。
[0232]
19.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含基序raxtxxxxxxxxxxxxxxxkkxxxxxxxxxxxsxa，其中x是任何氨基酸。
[0233]
20.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含基序txwxqxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxraxtxxxxxixxxxxxxsxkkxxxxxxxxnxxseaxs，其中x是任何氨基酸。
[0234]
21.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含基序txwxqxxxxxxxxxxxxxxaxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxpxxraqtxxxxxixxpxeqmsxkkxxxxxxxtxxfseaxs，其中x是任何氨基酸。
[0235]
22.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含基序txwxqxxxaxxxxxfxxxxaxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxpxxraqtxxxxxixxpxeqmsxkkxxxxxxxtnxfseaxs，其中x是任何氨基酸。
[0236]
23.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下列表的任何一种或
多种基序：
[0237]
(i)txwxq
[0238]
(ii)raxtxxxxxi
[0239]
(iii)sxkkxxxxxxxxnxxseaxs
[0240]
(iv)nxxseaxs
[0241]
其中x是任何氨基酸。
[0242]
24.一种增加igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤能力的方法，该igg1抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白fc-区的一个或多个残基和结合区，其中所述方法包括用来自小鼠igg3 ch2和/或ch3结构域的一个或多个相应残基取代所述fc-区的ch2和/或ch3结构域的一个或多个残基。
[0243]
25.根据实施方式24的增加igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤能力的方法，其中所述方法包括修饰选自以下的fc-区的一个或多个残基：q342、p343、e345、n361、q362、p374、d376。
[0244]
26.根据实施方式25的方法，其中一个或多个修饰的残基选自：q342r、p343a、e345t、n361k、q362k、p374s、d376a。
[0245]
27.根据实施方式24的增加igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤能力的方法，其中所述方法包括修饰选自以下的fc-区的一个或多个残基：n286、k288、k290、q342、p343、e345、l351、t359、n361、q362、g371、p374、s375、d376、a378。
[0246]
28.根据实施方式27的方法，其中一个或多个修饰的残基选自：n286t、k288w、k290q、q342r、p343a、e345t、l351i、t359s、n361k、q362k、g371n、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0247]
29.根据实施方式24的增加igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤能力的方法，其中所述方法包括修饰选自以下的fc-区的一个或多个残基：n286、k288、k290、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
[0248]
30.根据实施方式29的方法，其中一个或多个修饰的残基选自：n286t、k288w、k290q、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0249]
31.根据实施方式24的增加igg1抗体或其抗原结合片段的直接细胞杀伤能力的方法，其中所述方法包括修饰选自以下的fc-区的一个或多个残基：n286、k288、k290、e294、y300、v305、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
[0250]
32.根据实施方式31的方法，其中一个或多个修饰的残基选自：n286t、k288w、k290q、e294a、y300f、v305a、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0251]
33.一种药物组合物，其包含根据实施方式1至23中任一项的修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
[0252]
34.根据实施方式33的药物组合物，其还包含至少一种其他治疗剂。
[0253]
35.根据实施方式33或34的药物组合物，其包含根据实施方式1至23中任一项的修
区的一个或多个残基修饰：n286、k288、k290、e294、y300、v305、a339、q342、p343、r344、e345、l351、s354、d356、e357、l358、t359、n361、q362、k370、g371、y373、p374、s375、d376、a378。
[0271]
53.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含对fc-区的选自以下的一个或多个修饰：n286t、k288w、k290q、e294a、y300f、v305a、a339p、q342r、p343a、r344q、e345t、l351i、s354p、d356e、e357q、l358m、t359s、n361k、q362k、k370t、g371n、y373f、p374s、s375e、d376a、a378s。
[0272]
54.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含图19中公开的一个或多个序列。
[0273]
55.一种修饰的igg1抗体或其抗原结合片段，其包含如图19中公开的重链和轻链序列。
[0274]
参考文献
[0275]
abdelmoula，m.，f.spertini，t.shibata，y.gyotoku，s.luzuy，p.h.lambert，and s.izui.1989.
′
igg3 is the major source of cryoglobulins in mice
′
，j immunoi，143：526-32
[0276]
ausubel，f.m.，r.brent，r.e.kingston，d.d.moore，j.g.seidman，j.a.smith，and k.struhl.1992.short protocols in molecular biology：a compendium of methods from current protocols in molecular biology(brooklyn，ny：green pub.associates：new york，ny：wiley)
[0277]
azinovic，i.，g.l.denardo，k.r.lambom，g.mirick，d.goldstein，b.m.bradt，and s.j.denardo.2006.
′
survival benefit associated with human anti-mouse antibody(hama)in patients with b-cell malignancies
′
，cancer immunol immunother.55：1451-8
[0278]
burris，h.a.，3rd，l.s.rosen，c.m.rocha-lima，j.marshall，s.jones，r.b.cohen，l.a.kunkel，d.loo，j.baughman，s.j.stewart，and n.lewis.2010.
′
phase 1 experience with an anti-glycotope monoclonal antibody，rav12，in recurrent adenocarcinoma
′
，clin cancer res，16：1673-81
[0279]
carter，p.j.2006.
′
potent antibody therapeutics by design
′
，nat rev immunol，6：343-57
[0280]
chua，j.x.，m.vankemmelbeke，r.s.mcintosh，p.a.clarke，r.moss，t.parsons，i.spendlove，a.m.zaitoun，s.madhusudan，and l.g.durrant.2015.
′
monoclonal antibodies targeting leclex-related glycans with potent antitumor activity
′
，clin cancer res，21：2963-74
[0281]
cooper，l.j.，j.c.schimenti，d.d.glass，and n.s.greenspan.1991.
′
h chain c domains influence the strength of binding of igg for streptococcal group a carbohydrate
′
，j immunol，146：2659-63
[0282]d′
arcy，c.a.，and m.mannik.2001.
′
serum sickness secondary to treatment with the murine-human chimeric antibody idec-c2b8(rituximab)
′
，arthritis rheum，44：1717-8
ther，6：856-65
[0305]
metheringham，r.l.，v.a.pudney，b.gunn，m.towey，i.spendlove，and l.g.duirant.2009.
′
antibodies designed as effective cancer vaccines
′
，mabs，1：71-85
[0306]
miotti，s.，d.r.negri，o.valota，m.calabrese，r.l.bolhuis，j.w.gratama，m.i.colnaghi，and s.canevari.1999.
′
level of anti-mouse-antibody response induced by bi-specific monoclonal antibody oc/tr in ovarian-carcinoma patients is associated with longer survival
′
，int j cancer，84：62-8
[0307]
noble，p.，i.spendlove，s.harding，t.parsons，and l.g.durtant.2013.
′
therapeutic targeting of lewis(y)and lewis(b)with a hovel monoclonal antibody 692/29
′
，plos one，8：e54892
[0308]
oganesyan，v.，m.m.damschroder，k.e.cook，q.li，c.gao，h.wu，and w.f.dall
′
acqua.2014.
′
structural insights into neonatal fc receptor-based recycling mechanisms
′
，j biol chem，289：7812-24
[0309]
pinho，s.s.，and c.a.reis.2015.
′
glycosylation in cancer：mechanisms and clinicalimplications
′
，nat rev cancer，15：540-55.
[0310]
pluckthun，a.1991.
′
antibody engineering：advances from the use of escherichia coli expression systems
′
，biotechnology(ny)，9：545-51
[0311]
rabu，c.，r.mcintosh，z.jurasova，and l.durrant.2012.
′
glycans as targets for therapeutic antitumor antibodies
′
，future oncol.8：943-60
[0312]
reff,m.e.1993.
′
high-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells
′
，curr opin biotechnol，4：573-6
[0313]
rodriguez，e.，s.t.t.schetters，and y.van kooyk.2018.
′
the tumour glycol-code as a novel immune checkpoint for immunotherapy
′
，nat rev immunol，18：204-11
[0314]
roque-navarro，l.，k.chakrabandhu，j.de leon，s.rodriguez，c.toledo，a.carr,c.m.de acosta，a.o.hueber，and r.perez.2008.
′
anti-ganglioside antibody-induced tumor cell death by loss of membrane integrity
′
，mol cabcer ther，7：2033-41
[0315]
sambrook，j.，e.f.fritsch，and t.maniatis.1989.molecular cloning：a laboratory manual(cold spring harbor，n.y.：cold spring harbor laboratory,1989.)
[0316]
saphire，e.o.，p.w.parren，r.pantophlet，m.b.zwick，g.m.morris，p.m.rudd，r.a.dwek，r.l.stanfield，d.r.burton，and i.a.wilson.2001.
′
crystal structure of a neutralizing human igg against hiv-1：a template for vaccine design
′
，science，293：1155-9
[0317]
schroff,r.w.，k.a.foon，s.m.beatty,r.k.oldham，and a.c.morgan，jr.1985.
′
human anti-murine immunoglobulin responses in patiems receiving monoclonal antibody therapy
′
，cancer res，45：879-85
[0318]
trill，j.j.，a.r.shatzman，and s.ganguly.1995.
′
production of monoclonal antibodies in cos and chocells
′
，curr opin biotechnol，6：553-60
[0319]
ugurlar,d.，s.c.howes，b.j.de kreuk，r.i.koning，r.n.de jong，f.j.beurskens，j.schuurman，a.j.koster，t.h.sharp，pwhi parren，and p.gros.2018.
′
structures of c1-igg1 provide insights into how danger pattern recognition activates complement
′
，science，359：794-97
[0320]
vanden berghe，t.，n.vanlangenakker，e.parthoens，w.deckers，m.devos，n.festjens，c.j.guerin，u.t.brunk，w.declercq，and p.vandenabeele.2010.
′
necroptosis，necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features
′
，cell death differ，17：922-30
[0321]
wang，x.，m.mathieu，and r.j.brezski.2018.
′
igg fc engineering to modulate antibody effector functions
′
，protein cell，9：63-73
[0322]
welt，s.，e.a.carswell，c.w.vogel，h.f.oettgen，and l.j.o1d.1987.
′
immune and nonimmune effector functions of igg3 mouse monoclonal antibody r24 detecting the disialoganglioside gd3 on the surface of melanoma cells
′
，clin immunol immunopathol.45：214-29
[0323]
yatim，n.，s.cullen，and m.l.albert.2017.
′
dying cells actively regulate adaptive immune responses
′
，nat rev immunol，17：262-75
[0324]
zheng，j.y.，h.l.tan，p.t.matsudaira，and a.choo.2017.
′
excess reactive oxygen species production mediates monoclonal antibody-induced human embryonic stem cell death via oncosis
′
，cell death differ，24：546-58