一种用于野外的便携式ARGs检测系统及检测方法与流程

一种用于野外的便携式args检测系统及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种用于野外的便携式args检测系统及检测方法。


背景技术：

2.环境中抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)的来源主要是环境中细菌等微生物的内在抗性基因及人类活动或抗生素使用导致微生物获得的外源性基因。抗生素在医疗保健行业以及养殖业中的滥用，导致抗生素抗性基因快速出现和扩散。抗生素抗性基因作为一种新型的环境污染物，由于其固有的生物学特性，例如可在不同细菌间转移和传播甚至是自我扩增，可表现出独特的环境行为，其在环境中的持久性残留，传播和扩散比抗生素本身的危害还要大，args的研究和治理在环境科学研究和生态修复领域也日益受到关注。
3.常见的args的环境样本包括水样、土壤、沉积物和粪便样本等，这类样本为了保持采集时的原始状态，在样本提取检测之前均需要低温保存和运输，但时间太久依然会与原始状态有出入。对于野外科研工作者而言，常常需要在外工作数月之久，样本不仅保存运输成本高，转移到实验室得到的结果也往往与预期有很大的出入。目前检测用的方案涉及到的设备比较多，且部分设备体积和重量很大而且属于精密仪器，运输途中会对设备造成一定的伤害，目前市场上并没有针对于以上问题行之有效的解决办法。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于野外的便携式args检测系统及检测方法，解决了上述背景技术中所存在的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于野外的便携式args检测系统，包括后表面开口且中空长方体结构的箱体、样本研磨系统、核酸提取系统、核酸定量系统和16孔荧光定量pcr系统，所述箱体的内后部转动连接有连接板，所述连接板的前表面从上到下依次通过螺丝固定有所述样本研磨系统、所述核酸提取系统、所述核酸定量系统和荧光定量pcr系统，所述箱体的前表面上下对称设有第一绑带，两个所述第一绑带的右后端均固定有第二绑带，所述第一绑带的后表面右侧固定有魔术子贴，所述第二绑带的前表面左侧固定有魔术母贴，所述魔术子贴和所述魔术母贴相粘接，位于上方的所述第一绑带和所述第二绑带的顶部均固定有肩带，两个所述第一绑带的外侧壁均固定有柔性条，所述柔性条为中空结构，且所述柔性条的前表面开设有移动槽，两个所述柔性条的内部均滑动连接有活动块，所述活动块处于所述柔性条外侧的一端与所述箱体的前表面固定连接，所述柔性条的内部右后侧固定有弹性带，所述弹性带的一端与所述活动块的外侧壁固定连接，位于上方的所述柔性带的前表面设有旋钮，所述旋钮的后表面中心处固定有转轴，上方的
所述柔性带的内部右前部固定有棘环，所述转轴贯穿所述棘环，且后端固定有卷线轮，所述转轴的外侧壁位于所述棘环的内部通过扭簧转动连接有棘爪，所述棘爪与所述棘环相卡合，所述卷线轮的后表面中心处转动连接有弹簧，所述弹簧的后端与所述柔性条的内表面固定连接，所述卷线轮的外侧壁收卷有牵引线，所述牵引线的一端与所述卷线轮的外侧壁固定连接，另一端与所述活动块的外侧壁固定连接。
8.优选的，所述移动槽与所述柔性条的内部空间的截面共同组成t型结构，所述活动块的截面也为t型结构。
9.优选的，所述连接板的两侧底部均固定有旋转阻尼器，且所述连接板通过两个所述旋转阻尼器与所述箱体转动连接。
10.优选的，所述箱体的后表面顶部中心处转动连接有挡块，所述挡块的前表面与所述连接板的后表面相贴合。
11.优选的，所述第一绑带和所述第二绑带均为松紧带材质。
12.一种用于野外的便携式args检测方法，包括以下步骤：
13.s1、按照实验设计采集环境样本，具体可包括水样、沉积物、土壤、粪便样本等；
14.s2、采集水样，采取单位体积过滤的方式收集水样中的微生物，滤膜孔径选取0.22μm-0.4μm，然后将滤膜剪碎进行核酸提取；采集沉积物、土壤或粪便样本选取0.5g左右样本进行核酸提取；
15.s3、将2ml干净的离心管中加入核酸提取试剂盒配套的研磨玻璃珠，然后将需要提取的样本转入离心管中，然后安装在样本研磨仪上进行研磨5min；
16.s4、将研磨后的样本静置20min，取上清液至核酸提取系统进行自动化提取；
17.s5、通过核酸定量系统进行提取核酸的浓度测定；
18.s6、根据args引物列表选取14对、7对或者4对引物进行检测，其中选取14对引物可一次性进行单次技术重复，选择7对引物可一次性进行2次重复，选择4对引物可一次性进行3次技术重复；
19.14基因单重复荧光定量pcr布局：
[0020][0021]
7基因2重复荧光定量pcr布局：
[0022][0023]
4基因3重复荧光定量pcr布局：
[0024][0025]
s7、荧光定量pcr体系配置，可选择探针法或者染料法；
[0026]
常用染料法体系：
[0027][0028]
常用探针法体系：
[0029][0030]
s8、将配制好的体系上荧光定量pcr系统；
[0031]
s9、数据分析。
[0032]
优选的，所述步骤s9具体为：
[0033]
(1)、16s阳性扩增且曲线平滑完成，阴性不扩增或ct值大于34，则证明本次实验成功，数据有效；
[0034]
(2)、样本ct值小于31即认定为样本对应基因有检出，大于31认定为检不出；
[0035]
(3)、对于重复实验，ct值偏差小于1.5时，取平均值，大于1.5时需增加重复实验。
[0036]
(三)有益效果
[0037]
本发明提供了一种用于野外的便携式args检测系统及检测方法，具备以下有益效果：
[0038]
(1)、本发明中所用的的小型样本研磨系统、小型核酸提取系统、核酸定量系统和16孔荧光定量pcr系统均属于小型设备，运输方便，校准简单，并且样本研磨系统、核酸提取系统、核酸定量系统和荧光定量pcr系统均被固置在箱体中，并且箱体可通过绑带和肩带背负在人员的身体上，在使用的时候，转动旋钮，从而可以将箱体运动到操作人员胸前，然后将连接板打开，此时样本研磨系统、核酸提取系统、核酸定量系统和荧光定量pcr系统处于品平行于地面的连接板上，此时操作人员进行操作即可，使操作更加的方便快捷；并且在使用完毕后，关闭连接板，按压旋钮，此时箱体会在连接带的作用下，自动的回到操作人员的背部，方便操作人员背负携带。
[0039]
(2)、本发明中的样本研磨系统、核酸提取系统、核酸定量系统和荧光定量pcr系统四种组合产品技术成熟稳定，可集成化也可单独使用，非常适用于野外科研工作者，对于野外科研工作者而言，常常需要在外工作数月之久，样本不仅保存运输成本高，转移到实验室
得到的结果也往往与预期有很大的出入，本发明实时实地的处理样本和检测样本避免了在样本提取检测之前需要低温保存和运输的麻烦，保持了样本采集时的原始状态，防止因采集样本到后续处理和检测的时间太久影响样本原始状态而导致的结果与真实情况有出入的偏差，并以环境微生物抗生素抗性基因(args)检测这一时间和环境敏感的应用为方向描述本方法。
附图说明
[0040]
图1为本发明的结构示意图；
[0041]
图2为本发明中箱体的侧剖结构示意图；
[0042]
图3为本发明中第一绑带和第二绑带的俯视结构示意图；
[0043]
图4为本发明中柔性条的俯剖局部结构示意图；
[0044]
图5为本发明中棘环与棘爪的啮合示意图。
[0045]
图中：1、箱体；2、移动槽；3、柔性条；4、肩带；5、旋钮；6、第二绑带；7、第一绑带；8、旋转阻尼器；9、16孔荧光定量pcr系统；10、核酸定量系统；11、小型核酸提取系统；12、小型样本研磨系统；13、连接板；14、魔术母贴；15、魔术子贴；16、弹性带；17、滑动块；18、牵引线；19、弹簧；20、卷线轮；21、棘环；22、转轴；23、棘爪；24、挡块。
具体实施方式
[0046]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0047]
如图1-5所示，本发明提供一种技术方案：一种用于野外的便携式args检测系统，包括后表面开口且中空长方体结构的箱体1、样本研磨系统12、核酸提取系统11、核酸定量系统10和16孔荧光定量pcr系统9，箱体1的内后部转动连接有连接板13，连接板13的两侧底部均固定有旋转阻尼器8，且连接板13通过两个旋转阻尼器8与箱体1转动连接，连接板13打开使用的时候，在旋转阻尼器8的作用下，连接板13会平缓的向下转动，最终与地面平行，方便操作人员操作使用，箱体1的后表面顶部中心处转动连接有挡块24，挡块24的前表面与连接板13的后表面相贴合，当将连接板13向上转动闭合后，转动挡块24，在挡块24的作用下，可以将连接板13阻挡住，避免在不使用的时候，连接板13向下转动打开，连接板13的前表面从上到下依次通过螺丝固定有样本研磨系统12、核酸提取系统11、核酸定量系统10和荧光定量pcr系统9，箱体1的前表面上下对称设有第一绑带7，两个第一绑带7的右后端均固定有第二绑带7，第一绑带7和第二绑带6均为松紧带材质，可以适应不同体型的操作人员，第一绑带7的后表面右侧固定有魔术子贴15，第二绑带6的前表面左侧固定有魔术母贴14，魔术子贴15和魔术母贴14相粘接，位于上方的第一绑带7和第二绑带6的顶部均固定有肩带4，两个第一绑带7的外侧壁均固定有柔性条3，柔性条3为中空结构，且柔性条3的前表面开设有移动槽2，两个柔性条3的内部均滑动连接有活动块17，移动槽2与柔性条3的内部空间的截面共同组成t型结构，活动块17的截面也为t型结构，避免活动块17从柔性条3中脱离，从而导致箱体1从操作人员的背部发生掉落的情况，活动块17处于柔性条3外侧的一端与箱体1
的前表面固定连接，柔性条3的内部右后侧固定有弹性带16，弹性带16的一端与活动块17的外侧壁固定连接，位于上方的柔性带3的前表面设有旋钮5，旋钮5的后表面中心处固定有转轴22，上方的柔性带3的内部右前部固定有棘环21，转轴22贯穿棘环21，且后端固定有卷线轮20，转轴22的外侧壁位于棘环21的内部通过扭簧转动连接有棘爪23，棘爪23与棘环21相卡合，卷线轮20的后表面中心处转动连接有弹簧19，弹簧19的后端与柔性条3的内表面固定连接，卷线轮20的外侧壁收卷有牵引线18，牵引线18的一端与卷线轮20的外侧壁固定连接，另一端与活动块17的外侧壁固定连接。
[0048]
样本研磨系统12为6通道的便携式样本研磨仪。
[0049]
核酸提取系统11为8通道的便携式磁珠法全自动核酸提取仪。
[0050]
核酸定量系统10为基于荧光原理的单通道便携式核酸定量仪。
[0051]
16孔荧光定量pcr系统9为16通道的便携式荧光定量pcr仪。
[0052]
一种用于野外的便携式args检测方法，包括以下步骤：
[0053]
s1、按照实验设计采集环境样本，具体可包括水样、沉积物、土壤、粪便样本等；
[0054]
s2、采集水样，采取单位体积过滤的方式收集水样中的微生物，滤膜孔径选取0.22μm-0.4μm，然后将滤膜剪碎进行核酸提取；采集沉积物、土壤或粪便样本选取0.5g左右样本进行核酸提取；
[0055]
s3、将2ml干净的离心管中加入核酸提取试剂盒配套的研磨玻璃珠，然后将需要提取的样本转入离心管中，然后安装在样本研磨仪上进行研磨5min；
[0056]
s4、将研磨后的样本静置20min，取上清液至核酸提取系统进行自动化提取；
[0057]
s5、通过核酸定量系统进行提取核酸的浓度测定；
[0058]
s6、根据args引物列表选取14对、7对或者4对引物进行检测，其中选取14对引物可一次性进行单次技术重复，选择7对引物可一次性进行2次重复，选择4对引物可一次性进行3次技术重复；
[0059]
s7、荧光定量pcr体系配置，可选择探针法或者染料法；
[0060]
s8、将配制好的体系上荧光定量pcr系统；
[0061]
s9、数据分析。
[0062]
(1)、16s阳性扩增且曲线平滑完成，阴性不扩增或ct值大于34，则证明本次实验成功，数据有效；
[0063]
(2)、样本ct值小于31即认定为样本对应基因有检出，大于31认定为检不出；
[0064]
(3)、对于重复实验，ct值偏差小于1.5时，取平均值，大于1.5时需增加重复实验。
[0065]
实验例：
[0066]
本次研究的对象是大山深处养牛场牛粪的抗生素抗性基因的污染情况，主要选取7种四环素类抗生素抗性基因引物对，7种args分别是tet(32)、tet(34)、tet(36)-02、tetd-02、tetg-01、tetm-02、tetpb-02，以及内参基因16s rrna。
[0067]
样本采集，单个点采集0.5g新鲜粪便样本，取干净的2ml离心管，转移mp商用土壤粪便提取试剂盒配套的研磨珠5颗到上述干净的2ml离心管中，往2ml离心管中加入1ml微生物裂解试剂。然后固定在样本研磨仪上进行研磨5分钟。将研磨后的样本静置20分钟，将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入250μl蛋白去除液，温和颠倒混匀10次，静置20min，取500μl上清液上核酸提取系统。
[0068]
取出未开封的48孔深孔板，48孔深孔板为8行6列的深孔板，依次在第一列至第六列的最上一行放入如下试剂：
[0069][0070]
核酸提取系统提取工作结束后，将核酸提取系统的样本取出，通过核酸定量系统进行浓度测定，测得浓度为235ng/ul，浓度测定结束后，开始上荧光定量pcr系统检测。
[0071]
荧光定量pcr体系：
[0072]
体系成分体积2
×
sybr green i master12.5μlprimer(f r)(10μm each)2μltemple1μl20mg/ml牛血清蛋白(bsa)0.5μlddh2oadd to 25μl
[0073]
荧光定量pcr反应程序：
[0074][0075]
实验结果：
[0076][0077]
说明：通过相对拷贝数间接计算各基因的绝对拷贝数，首先对该样本的16s rrna基因进行绝对定量后，按比例换算，换算方式：
[0078]
目的基因绝对拷贝数＝16s rrna基因绝对拷贝数*2-δct
[0079]
δct＝ct(gene)-ct(16s)注：ct(gene)和ct(16s)必须能来源于同一样本
[0080]
数据分析结果：
[0081]
样本基因ct平均值结果判定牛粪16s rrna16.035阳性牛粪tet(32)35.185阳性(有扩增)牛粪tet(34)26.395阳性牛粪tet(36)-0228.22阳性牛粪tetd-0222.91阳性牛粪tetg-0121.645阳性牛粪tetm-0234.57阳性(有扩增)牛粪tetpb-0221.42阳性
[0082]
本养牛场通过实时检测牛粪发现7种四环素类args检出，说明该养牛场四环素存在滥用，后续存在四环素耐药风险。
[0083]
综上可得，本发明的工作流程：在使用的时候，操作人员可以通过肩带4、第一绑带7和第二绑带6件箱体1背负在背部，当运动到野外指定的地点的时候，此时，操作人员转动旋钮5，卷线轮20会转动收卷牵引线，从而会带动活动块17在柔性条3中运动，从而可以将箱体1运动到操作人员的胸前，在此过程中，弹性带16会被拉伸，并蓄能，此时在棘环21和棘爪23的作用下，在弹性带16的作用下，活动块17和箱体1不会在操作人员不转动旋钮5的时候，再次运动到操作人员背部；然后操作人员转动挡块24，此时连接板13在重力的作用下，会向下平缓转动，最终转动到与地面平行，然后操作人员取样，通过样本研磨系统12、核酸提取系统11、核酸定量系统10和荧光定量pcr系统9对样本进行操作即可，当操作人员操作完毕后，将样本研磨系统12、核酸提取系统11、核酸定量系统10和荧光定量pcr系统9清理干净后，然后向上转动连接板13，并转动挡块24，使挡块24阻挡住连接板13，然后按压旋钮5，此时棘爪23和棘环21相互脱离，在弹性带16的作用下，活动块17和箱体1会运动到操作人员背部，然后操作人员松开旋钮5，在弹簧19的作用下，旋钮5恢复原位，棘环21和棘爪23再次卡合，此时操作人员背负转移即可，当需要再次对样本进行检测的时候，重复上述操作即可。
[0084]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0085]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。