一种唾液腺恶性多形性腺瘤3D类器官及其培养方法和应用

一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官及其培养方法和应用
技术领域
1.本发明涉及类器官培养技术领域，涉及一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官及其培养方法和应用。


背景技术：

2.多形性腺瘤(pleomorphic adenoma，pa)是最常见的唾液腺良性肿瘤，占所有唾液腺良性肿瘤的73.8％[tian z；li l；wang l；hu y；li j；salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions:a 23-year retrospective study of 6982cases in an eastern chinese population,international journal of oral and maxillofacial surgery,2010,39(3):235-242.]。多形性腺瘤虽为良性，但具复发倾向，多次复发或长期存在的多形性腺瘤极易发生恶变，成为恶性多形性腺瘤(malignant pleomorphic adenoma，mpa)，也称恶性混合瘤(malignant mixed tumor)或癌在多形性腺瘤中(carcinoma in pleomorphic adenoma)。在我国恶性多形性腺瘤并不少见，本课题组统计显示的恶性多形性腺瘤发生率(占唾液腺所有恶性肿瘤的8.0％(第一篇))远高于who(3.6％)[ei-naggar ak；chan jkc；grandis jr；takashi t；slootweg pj；world health organization classification of head and neck tumors,iarc:lyon,2017,159-203.]的统计结果。多形性腺瘤恶变后，一旦恶性细胞突破包膜外大于1.5mm，即成为侵袭型恶性多形性腺瘤，患者预后陡然变差，生物学行为转为高度恶性，可发生区域淋巴结转移及肝、肺、骨等远处转移，5年生存率仅25％。目前关于恶性多形性腺瘤仍缺乏有效治疗手段，主要为手术切除，配合术后放、化疗，但疗效不佳。故寻找恶性多形性腺瘤预后评估、有效治疗靶点以提高患者生存率一直是该领域研究的重要课题。
[0003]
肿瘤临床前模型能再现肿瘤患者原有的基因组学信息，将基因组学信息与药物基因组学相结合，是进行临床前药物筛选、挖掘治疗新靶点、优选治疗策略的重要手段之一，凸显临床前模型作为基础研究成果与转化应用研究深度整合的桥梁作用。临床前模型主要包括细胞系、人源性组织异种移植模型(patient-derived xenograft，pdx)和类器官(organoids)等。
[0004]
类器官是由器官特异性的成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化、自我组合而成的3d细胞簇，能复现组织和器官的某些特性和功能。类器官技术可与其它生物技术进行有机整合，包括基因编辑、单细胞基因组学、实时成像、微流体技术，从而为了解疾病的发病机制和发展过程以及转化出新的诊断和治疗技术提供一个全新视角。多个领域研究人员模拟各种组织类型构建了多种类器官，如发育生物学、精准医学、疾病建模、再生医学、毒理学、药物开发。国家食品药品监督管理局药品审评中心(cde)最新发布的《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则(试行)》中明确指出类器官可作为非临床研究动物模型的替代性模型，可作为治疗药物有效性和安全性的评估模型。
[0005]
虽然多种人源组织3d类器官可在体外培养获得，但目前未见唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官培养方法的研究报道。由于中国人群中恶性多形性腺瘤的发生率显著高于who
的报道，且目前对恶性多形性腺瘤治疗手段缺乏、患者预后不佳，因此开发恶性多形性腺瘤及相关疾病的类器官模型迫在眉睫，此类模型建立将为恶性多形性腺瘤治疗靶点和药物筛选工作顺利开展奠定坚实基础。


技术实现要素：

[0006]
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明目的在于提供一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官及其培养方法和应用，用于解决现有技术中无培养唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官培养基及培养方法等问题，实现培养获得组织细胞形态、蛋白表达等与患者恶性多形性腺瘤真实肿瘤高度一致的3d类器官的目的。
[0007]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官及其培养方法和应用。
[0008]
本发明的目的之一是提供一种培养唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官的培养基，所述培养基包括：advanced dmem/f12，以及以advanced dmem/f12为基准的以下成分：0.5～2v％antibiotic-antimycotic、0.5～2v％glutamax、0.5～～2v％hepes缓冲液，50～～300ng/ml成纤维生长因子、50～300ng/ml egf、5～25μg/ml bfgf、300～800nmol/l tgf-βi型受体抑制剂、300～800ng/ml wnt3a重组蛋白、0.05～0.3μg/ml noggin重组蛋白、0.05～0.3μg/ml r-spondin-1重组蛋白、0.75～2.5mmol/l n-乙酰半胱氨酸、5～30mmol/l烟酰胺，0.5～5v％b27补充剂、0.2～5μmol/l地塞米松，0.2～5mg/ml primocin。
[0009]
所述培养基优选还包括n-2补充剂、fgf2、prostaglandin e2中的一种或几种。
[0010]
本发明的另一目的是提供如上所述的培养基在培养唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官中的应用。
[0011]
本发明的另一目的是提供一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官的培养方法，所述方法包括，将破碎后的唾液腺恶性多形性腺瘤细胞采用如上所述的培养基进行培养，获得所述的唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官。
[0012]
本发明中，所述唾液腺恶性多形性腺瘤肿瘤组织选自人。
[0013]
如上所述，本发明的一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官及其培养方法和应用，具有以下有益效果：
[0014]
本发明的唾液腺恶性多形性腺瘤类器官的培养基针对于唾液腺恶性多形性腺瘤来源细胞的生长特点，选用了多种细胞因子成份按照特定的比例进行复配，获得的培养基中，含有适宜含量的细胞因子、信号通路调控因子，使恶性多形性腺瘤细胞能够在较短的时间内形成与真实肿瘤组织形态和性质接近的3d类器官。
[0015]
本发明的培养基及培养方法可以完成唾液腺恶性多形性腺瘤组织的传代培养，并能保持3d类器官的形态和性质，达到大规模复制唾液腺恶性多形性腺瘤类器官的需求。
[0016]
通过本发明的培养基或方法获得的3d类器官能够模拟真实唾液腺恶性多形性腺瘤肿瘤细胞生存微环境，可以有效地维持细胞组织特异性，细胞组织形态和蛋白表达高度一致；可以用于筛选恶性多形性腺瘤的治疗药物、研究恶性多形性腺瘤发生发展机制、筛选恶性多形性腺瘤相关生物标志物等，不仅满足科学研究需要，而且在临床用药指导方面提供有益选择，如将患者肿瘤活检样本组织体外3d培养后为患者提供用药指导等。
附图说明
[0017]
图1为实施例1步骤(1.5)接种于培养板后照片。
[0018]
图2为实施例1恶性多形性腺瘤原代培养类器官培养第10天的镜下表现(放大倍数10
×
)。
[0019]
图3为实施例1恶性多形性腺瘤第2代类器官培养第6天不同视野下的镜下表现(放大倍数均为10
×
)。
[0020]
图4为实施例1恶性多形性腺瘤第3代类器官培养第6天不同视野下的镜下表现(放大倍数均为4
×
)。
[0021]
图5a为实施例1恶性多形性腺瘤第2代类器官培养第4天时he染色结果(he，400
×
)。
[0022]
图5b为实施例1患者肿瘤组织样本病理he染色结果(he，400
×
)。
[0023]
图6a为实施例1恶性多形性腺瘤第2代类器官培养第4天时ck7、ck19、sma蛋白表达和细胞增殖指标ki67免疫组织化学染色结果(免疫组化，400
×
)。
[0024]
图6b为实施例1患者肿瘤组织样本ck7、ck19、sma蛋白表达和细胞增殖指标ki67的免疫组织化学染色结果(免疫组化，400
×
)。
[0025]
图7为对比例4中采用培养基培养恶性多形性腺瘤原代类器官第7天的镜下表现(放大倍数10
×
)。
[0026]
图8为对比例4中采用培养基a培养恶性多形性腺瘤原代类器官第7天的镜下表现(放大倍数10
×
)。
具体实施方式
[0027]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的优点与功效。本发明还可通过其它不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0028]
本发明提供一种唾液腺恶性多形性腺瘤类器官的体外构建方法及应用，提取人腮腺恶性多形性腺瘤细胞，并诱导构建类器官，镜下观察其形态，通过he染色、免疫组化观察及验证恶性多形性腺瘤类器官组织细胞形态、蛋白表达状况，获得与患者肿瘤样本组织细胞形态、蛋白表达等高度一致的类器官。
[0029]
本发明提供了一种培养唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官的培养基，所述培养基包括：
[0030]
advanced dmem/f12，以及以advanced dmem/f12为基准的以下成分：0.5～2v％antibiotic-antimycotic、0.5～2v％glutamax、0.5～2v％hepes缓冲液，50～300ng/ml成纤维生长因子(fgf-10)、50～300ng/ml egf、5～25μg/ml bfgf、300～800nmol/l tgf-βi型受体抑制剂、300～800ng/ml wnt3a重组蛋白、0.05～0.3μg/ml noggin重组蛋白、0.05～0.3μg/ml r-spondin-1重组蛋白、0.75～2.5mmol/l n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine,nac)，5～30mmol/l烟酰胺(nicotinamide)，0.5～5v％b27补充剂，0.2～5μmol/l地塞米松，0.2～5mg/ml primocin。
[0031]
其中，v％是指某物质占advanced dmem/f12的体积百分比。例如0.5～2v％
antibiotic-antimycotic是指在100ml advanced dmem/f12中，antibiotic-antimycotic的体积为0.5～2ml。
[0032]
其中，antibiotic-antimycotic占advanced dmem/f12的体积百分数为0.5～2％，可以是0.5～1.0％、0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
[0033]
其中，glutamax占advanced dmem/f12的体积百分数为0.5～2％，可以是0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
[0034]
其中，hepes缓冲液占advanced dmem/f12的体积百分数为0.5～2％，可以是0.5～1.0％、0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
[0035]
其中，成纤维生长因子(fgf-10)在advanced dmem/f12中的浓度为50～300ng/ml，可以是50～100ng/ml、100～150ng/ml、150～200ng/ml、200～250ng/ml、250～300ng/ml，具体可以是50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300ng/ml。优选地，为60～240ng/ml；进一步优选地，为80～160ng/ml；进一步优选地，为80～120ng/ml；更进一步优选地，为100ng/ml。
[0036]
其中，egf在advanced dmem/f12中的浓度为50～300ng/ml，可以是50～100ng/ml、100～150ng/ml、150～200ng/ml、200～250ng/ml、250～300ng/ml，具体可以是50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300ng/ml。优选地，为60～240ng/ml；进一步优选地，为80～160ng/ml；进一步优选地，为80～120ng/ml；更进一步优选地，为100ng/ml。
[0037]
其中，bfgf在advanced dmem/f12中的浓度为5～25μg/ml，可以是5～10μg/ml、10～15μg/ml、15～20μg/ml、20～25μg/ml，具体可以是5、8、10、12、15、18、20、22、25μg/ml。优选地，为6～18μg/ml；进一步优选地，为8～12μg/ml；更进一步优选地，为10μg/ml。
[0038]
其中，tgf-βi型受体抑制剂(优选a83-01)在advanced dmem/f12中的浓度为300～800nmol/l，可以是300～350nmol/l、350～400nmol/l、450～500nmol/l、500～550nmol/l、550～600nmol/l、600～650nmol/l、650～700nmol/l、750～800nmol/l。优选地，为400～600nmol/l；进一步优选地，为450～550nmol/l；更进一步优选地，为500nmol/l。
[0039]
其中，wnt3a重组蛋白在advanced dmem/f12中的浓度为300～800ng/ml，300～350ng/ml、350～400ng/ml、450～500ng/ml、500～550ng/ml、550～600ng/ml、600～650ng/ml、650～700ng/ml、750～800ng/ml。优选地，为400～600ng/ml；进一步优选地，为450～550ng/ml；更进一步优选地，为500ng/ml。
[0040]
其中，noggin重组蛋白在advanced dmem/f12中的浓度为0.05～0.3μg/ml，可以是0.05～0.1μg/ml、0.1～0.15μg/ml、0.15～0.2μg/ml、0.2～0.25μg/ml、0.25～0.3μg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3μg/ml。优选地，为0.07～0.2μg/ml；进一步优选地，为0.08～0.15μg/m；更进一步优选地，为0.1μg/ml。
[0041]
其中，r-spondin-1重组蛋白在advanced dmem/f12中的浓度为0.05～0.3μg/ml，可以是0.05～0.1μg/ml、0.1～0.15μg/ml、0.15～0.2μg/ml、0.2～0.25μg/ml、0.25～0.3μg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3μg/ml。优选
地，为0.07～0.2μg/ml；进一步优选地，为0.08～0.15μg/m；更进一步优选地，为0.1μg/ml。
[0042]
其中，n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine,nac)在advanced dmem/f12中的浓度为0.75～2.5mmol/l，可以是0.75～1mmol/l、1～1.25mmol/l、1.25～1.5mmol/l、1.5～1.75mmol/l、1.75～2mmol/l、2～2.25mmol/l、2.25～2.5mmol/l，具体可以是0.75、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.5mmol/l。优选地，为0.9～1.8mmol/l；进一步优选地，为1～1.5mmol/l；更进一步优选地，为1.25mmol/l。
[0043]
其中，烟酰胺(nicotinamide)在advanced dmem/f12中的浓度为5～30mmol/l，可以是5～10mmol/l、10～15mmol/l、15～20mmol/l、20～25mmol/l、25～30mmol/l，具体可以是5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30mmol/l。优选地，为6～20mmol/l；进一步优选地，为8～16mmol/l；更进一步优选地，为10mmol/l。
[0044]
其中，b27补充剂在advanced dmem/f12中的浓度为0.5～5％，可以是0.5～1％、1～1.5％、1.5～2％、2.5～3％、3.5～4％、4.5～5％，具体可以是0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5％。优选地，为1～3.5％；进一步优选地，为1.5～2.5％；更进一步优选地，为2％。
[0045]
其中，地塞米松在advanced dmem/f12中的浓度为0.2～5μmol/l，可以是0.2～0.5μmol/l、0.5～1μmol/l、1～1.5μmol/l、1.5～2μmol/l、2.5～3μmol/l、3.5～4μmol/l、4.5～5μmol/l，具体可以是0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5μmol/l。优选地，为0.5～3.5μmol/l；进一步优选地，为0.8～2.5μmol/l；更进一步优选地，为1μmol/l。
[0046]
其中，primocin在advanced dmem/f12中的浓度为0.2～5mg/ml，可以是0.2～0.5mg/ml、0.5～1mg/ml、1～1.5mg/ml、1.5～2mg/ml、2.5～3mg/ml、3.5～4mg/ml、4.5～5mg/ml，具体可以是0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5mg/ml。优选地，为0.5～3.5mg/ml；进一步优选地，为0.8～2.5mg/ml；更进一步优选地，为1mg/ml。
[0047]
在一些优选实施方式中，所述培养基还包括n-2补充剂、fgf2、prostaglandin e2中的一种或几种。可以仅包含n-2补充剂，或者包含fgf2，或者包含prostaglandin e2，或者包含n-2补充剂和fgf2，或者包含n-2补充剂和prostaglandin e2，或者包含fgf2和prostaglandin e2，或者包含n-2补充剂、fgf2和prostaglandin e2。在一些优选实施例方式中，所述培养基包含n-2补充剂、fgf2和prostaglandin e2。
[0048]
当所述培养基中包含n-2补充剂时，其中，n-2补充剂占advanced dmem/f12的体积百分数为0.5～3％，可以是0.5～1.0％、1.0～1.5％、1.5～2％、2～2.5％、2.5～3％，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.8、3.0％。优选地，为0.6～1.6％；进一步优选地，为0.8～1.2％；更进一步优选地，为1％。
[0049]
当所述培养基中包含fgf2时，其中，fgf2占advanced dmem/f12的体积百分数为2～10ng/ml，可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10ng/ml。优选地，为3～8ng/ml；进一步优选地，为4～6ng/ml；更进一步优选地，为5ng/ml。
[0050]
当所述培养基中包含prostaglandin e2时，其中，prostaglandin e2占advanced dmem/f12的体积百分数为0.5～3μmol/l，可以是0.5～1.0μmol/l、1.0～1.5μmol/l、1.5～2μmol/l、2～2.5μmol/l、2.5～3μmol/l，具体可以是0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、
2.0、2.2、2.5、2.8、3.0μmol/l。优选地，为0.6～1.6μmol/l；进一步优选地，为0.8～1.2μmol/l；更进一步优选地，为1μmol/l。
[0051]
在一些更优选实施方式中，所述培养基包含：500ml advanced dmem/f12(gibco)，1v％的antibiotic-antimycotic(gibco)、1v％的glutamax(gibco)、1v％的hepes缓冲液(gibco)，成纤维生长因子(fgf-10)100ng/ml(mce)、egf 100ng/ml(mce)、bfgf 10μg/ml(mce)、a83-01 500nmol/l(mce)、wnt3a重组蛋白500ng/ml(mce)、noggin重组蛋白0.1μg/ml(mce)、r-spondin-1重组蛋白0.1μg/ml(mce)、n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine,nac)1.25mmol/l(mce)、烟酰胺(nicotinamide)10mmol/l(mce)、2v％b27补充剂(mce)、地塞米松1μmol/l、primocin 1mg/ml、1v％n-2补充剂(mce)、fgf2为5ng/ml(mce)、prostaglandin e2 1μmol/l(mce)；其中，所述培养基中，advanced dmem/f12外，其他组分的用量如百分含量或浓度均以advanced dmem/f12为基准进行说明；b27补充剂为50x b27补充剂；n-2补充剂为100x n-2补充剂。
[0052]
本发明还提供了如上所述的培养基在培养恶性多形性腺瘤3d类器官中的应用。本发明的培养基针对于恶性多形性腺瘤细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照特定的比例进行复配，获得的培养基中，含有适宜含量的细胞因子、信号通路调控因子，唾液腺恶性多形性腺瘤细胞能够在较短的时间内形成与真实肿瘤组织形态和特性接近的3d类器官。本发明的培养基成本低、可操作性强、重复性好，经过多次传代培养的类器官，依然能够保持类器官的细胞形态，蛋白表达接近于真实肿瘤组织。
[0053]
本发明还提供了一种唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官的培养方法，所述方法包括，将破碎后的唾液腺恶性多形性腺瘤细胞采用如上所述的培养基进行培养，获得所述的唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官。
[0054]
具体地，所述方法包括：
[0055]
(a)组织破碎
[0056]
将唾液腺恶性多形性腺瘤肿瘤组织进行破碎，获得组织碎片；
[0057]
(b)组织消化
[0058]
采用消化酶消化所述的组织碎片，获得消化后的悬液；
[0059]
所述消化酶包含ⅱ型胶原酶和dnase i；优选地，所述消化酶包含0.8～4mg/mlⅱ型胶原酶和0.05～0.3mg/ml dnase i；
[0060]
(c)过滤
[0061]
对消化后的悬液进行过滤，弃上清，重悬沉淀获得细胞悬液，接种并培养。
[0062]
步骤(b)所述消化酶中，ⅱ型胶原酶的浓度为0.8～4mg/ml；可以是0.8～1mg/ml、1～1.5mg/ml、1.5～2mg/ml、2～2.5mg/ml、2.5～3mg/ml、3～3.5mg/ml、3.5～4mg/ml，具体可以是0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4mg/ml。优选地，为0.8～3mg/ml；进一步优选地，为1.5～2.5mg/ml；更进一步优选地，为2mg/ml。
[0063]
步骤(b)所述消化酶中，dnase i的浓度为0.05～0.3mg/ml；可以是0.05～0.1mg/ml、0.1～0.15mg/ml、0.15～0.2mg/ml、0.2～0.25mg/ml、0.25～0.3mg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3mg/ml。优选地，为0.07～0.2mg/ml；进一步优选地，为0.08～0.15mg/ml；更进一步优选地，为0.1mg/ml。
[0064]
步骤(b)中，所述消化在摇床中进行，摇床转速为150～500rrpm；可以是150～
200rrpm、200～250rrpm、300～500rrpm、350～400rrpm、450～500rrpm；优选地，为180～400rpm；优选地，为200～260rpm；更优选地，为300rpm。
[0065]
步骤(c)中，所述过滤的步骤包括，将所述消化后的悬液依次通过90～120μm、60～80μm的过滤膜进行过滤；优选地，依次通过100μm、70μm的过滤膜进行过滤。
[0066]
步骤(c)中，获得所述细胞悬液后，将所述细胞悬液与基质胶混合，接种到如上所述的培养基进行培养。其中，所述混合的操作在0～10℃进行；可以是0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃。
[0067]
步骤(c)中，所述培养的温度为28～40℃；可以是28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃。优选地，为32～38℃；进一步优选地，为37℃。
[0068]
步骤(c)中，所述培养的温度为5～10d；可以是5、6、7、8、9、10d。优选地，为6～8d；进一步优选地，为6d。
[0069]
步骤(c)中，先将接种后的培养板倒置培养至基质胶形成圆顶状结构后，再正置在培养箱中进行培养。
[0070]
本发明通过上述方法能够培养获得所述唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官，即原代唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官，将所述原代唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官继续进行传代培养，获得传代唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官；所述传代的次数不做限制，如可以进行一次、二次、三次及以上传代，只要能实现培养具有目标性质的唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官即可，优选地，可进行一次、二次、三次传代。
[0071]
所述传代的步骤包括：
[0072]
将基质胶融化，离心弃上清，去除基质胶，加胰酶消化，获得含细胞或合适大小细胞团块的细胞悬液，然后进行传代培养，培养步骤和方法同原代唾液腺恶性多形性腺瘤3d类器官。
[0073]
在一些优选实施方式中，所述传代的步骤包括：弃原培养基，用预冷的pbs-1将基质胶融化，轻轻吹打下基质胶和类器官的混合物并转移至离心管中，离心弃上清后，加pbs-1第一次重悬并离心弃上清，以将基质胶去尽，加1～2ml胰酶(苏州新赛美生物科技有限公司)重悬沉淀消化球体3min，终止消化。离心弃上清，之后再用pbs-1第二次重悬沉淀。显微镜下计数板计数，根据计数结果加适量培养基重悬细胞沉淀；之后进行接种、培养，步骤同原代恶性多形性腺瘤类器官。在一些更优选实施方式中，前述pbs-1第一次重悬后，如有部分小球在悬液中，还有部分大球下沉，可以将含小球的上清先转移到另一个离心管，将含有大球的pbs-1悬液、离心弃上清，之后用胰酶消化后转移至含小球的离心管中进行离心；这样可以一定程度上保留部分原来的小球和单细胞，并且能把大球消化成小球或者单细胞，小球的存在可以一定程度上利于更快更易长出类器官。
[0074]
本发明中，pbs-1是指添加5v％青链霉素双抗的pbs。
[0075]
本发明的方法，能够获得组织细胞形态和蛋白表达与真实唾液腺恶性多形性腺瘤高度一致的类器官。培养过程中，最大程度保证活细胞的比例，可以缩短培养的时间。
[0076]
各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，结合独特的消化酶和消化方法以及接种培养方法，使得唾液腺恶性多形性腺瘤细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于真实唾液腺恶性多形性腺瘤肿瘤的综合特性。采用本发明的培养基培养获得的唾液腺恶性多形性腺瘤类器官，会聚集成团，类似于真实唾液
腺恶性多形性腺瘤肿瘤细胞形态及组织结构。
[0077]
本发明中，所述唾液腺恶性多形性腺瘤肿瘤组织选自人。
[0078]
本发明中，v％是指某物质的体积百分比。例如，以advanced dmem/f12为基准的0.5～2v％antibiotic-antimycotic，是指在100ml advanced dmem/f12中，antibiotic-antimycotic的体积为0.5～2ml。
[0079]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0080]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0081]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
[0082]
本实施例中，pbs是指磷酸盐缓冲液(品牌gibco)。
[0083]
pbs-1是指添加5v％青链霉素双抗的pbs。
[0084]
实施例1唾液腺恶性多形性腺瘤类器官培养
[0085]
标本来源为上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面头颈肿瘤科，一例62岁的男性恶性多形性腺瘤患者，原发灶位于腮腺。冷冻活检术前，征得患者本人及监护人同意，签署知情同意书，术后病理诊断为：腮腺恶性多形性腺瘤。
[0086]
(1)具体培养方法
[0087]
(1.1)组织保存
[0088]
将活检样本迅速装入含有组织保存液的离心管中，保存液的主要成分为dmem(上海源培生物科技股份有限公司)，向其中加入两性霉素b(在保存液中的浓度为500ng/ml)(苏州新赛美生物科技有限公司)和占保存液5v％的青霉素-链霉素双抗(gibco)。离心管装入冰盒中送至实验室。
[0089]
(1.2)组织破碎
[0090]
在生物安全柜内操作，将恶性多形性腺瘤组织转移至培养皿中，用含有5v％青霉素-链霉素双抗的pbs-1溶液浸泡组织约10分钟。转移至新的含上述组织洗涤液的培养皿中，去除包膜组织。将组织剪成约1mm^3大小的组织碎片。
[0091]
(1.3)组织消化
[0092]
将组织碎片转移到含有消化酶(2mg/mlⅱ型胶原酶(gibco)和0.1mg/ml dnase i(applichem))的50ml离心管中，在37℃摇床300rpm消化1.5h，获得较多细胞沉淀，并且无细胞粘连的情况。之后加有血清dmem培养基终止消化，上下吹打10～20次，以进一步促进组织破碎。
[0093]
(1.4)过滤
[0094]
将消化后的悬液依次用100μm、70μm滤网进行过滤，得到细胞悬液；200g离心3min弃上清，将细胞沉淀用pbs-1重悬沉淀之后，显微镜下计数板计数，根据计数结果加适量培养基重悬细胞沉淀。
[0095]
其中，所述培养基各成分配比：500ml advanced dmem/f12(gibco)，1v％的antibiotic-antimycotic(gibco)、1v％的glutamax(gibco)、1v％的hepes缓冲液(gibco)，成纤维生长因子(fgf-10)100ng/ml(mce)、egf 100ng/ml(mce)、bfgf 10μg/ml(mce)、a83-01 500nmol/l(mce)、wnt3a重组蛋白500ng/ml(mce)、noggin重组蛋白0.1μg/ml(mce)、r-spondin-1重组蛋白0.1μg/ml(mce)、n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine,nac)1.25mmol/l(mce)，烟酰胺(nicotinamide)10mmol/l(mce)，2v％b27补充剂(mce)、地塞米松(mce)1μmol/l、primocin(invivogen)1mg/ml、1v％n-2补充剂(mce)、fgf2为5ng/ml(mce)、prostaglandin e2 1μmol/l(mce)；其中，所述培养基中，除advanced dmem/f12外，其他组分的用量如百分含量或浓度均以advanced dmem/f12为基准进行说明；b27补充剂为50x b27补充剂；n-2补充剂为100x n-2补充剂。
[0096]
(1.5)接种
[0097]
选取适量细胞悬液与基质胶(低生长因子型matrigel，corning公司)混合，其中，每40μl基质胶混合物中约含10^4个细胞，接种于24孔细胞培养板(nest)中，每孔加入40μl基质胶混合物。接种后如图1所示。
[0098]
由于基质胶在0～10℃时处于液态，温度变高时凝固，故需要在冰上进行基质胶的相关操作，同时最好用预冷的枪头在最短时间内完成基质胶跟细胞悬液的混合以防止基质胶凝固。
[0099]
(1.6)原代恶性多形性腺瘤类器官培养
[0100]
将接种后的24孔板倒置放置于37℃培养箱(thermo fisher)中约45min，待胶体凝固，将24孔板正置，每孔加450ul如上步骤(4)中所述的培养基。放回37℃培养箱培养。之后每2～3天更换一次培养基。
[0101]
上述倒置操作更有利于基质胶形成圆顶状结构，并且贴壁牢固。期间倒置显微镜镜下观察类器官，一般在两周内，如果类器官不会再变大则进行传代。传代比例是24孔板中1：6(即一个孔中的原代恶性多形性腺瘤类器官传代至新的24孔板中的6个孔中)。
[0102]
(1.7)恶性多形性腺瘤类器官传代
[0103]
弃原培养基，用预冷的pbs-1将基质胶融化，轻轻吹打下基质胶和类器官的混合物并转移至离心管中，离心弃上清后，加pbs-1重悬并离心弃上清，以将基质胶去尽，加1～2ml胰酶(苏州新赛美生物科技有限公司)重悬沉淀消化球体3min，终止消化。离心弃上清，之后再用pbs-1重悬沉淀。镜下计数板计数，根据计数结果加适量培养基重悬细胞沉淀；之后进行接种、培养，步骤同原代恶性多形性腺瘤类器官。
[0104]
(2)恶性多形性腺瘤类器官形态观察
[0105]
在倒置显微镜镜下观察不同生长代数恶性多形性腺瘤类器官的形态并摄图。原代(p1)恶性多形性腺瘤类器官培养至第6天的形态如图2所示：类器官形状呈圆球状，边缘连续。传代后获得第2代(p2)恶性多形性腺瘤类器官，p2代培养至第6天时镜下表现见图3。再次传代，获得第3代(p3)恶性多形性腺瘤类器官，p3代培养至第6天时镜下表现见图4。图3、
图4显示：经传代培养后，p2、p3代恶性多形性腺瘤类器官的组织细胞形态与原代恶性多形性腺瘤类器官相似，保持不变。
[0106]
(3)恶性多形性腺瘤类器官细胞形态及蛋白表达鉴定
[0107]
将p2代恶性多形性腺瘤类器官培养至第4天，收获类器官后行he染色(图5a)，与患者肿瘤组织he染色进行细胞形态比对(图5b)(患者肿瘤样本切片资料调取自上海交通大学附属第九人民医院口腔病理科病理档案库)。比对结果显示p2代恶性多形性腺瘤类器官细胞形态与真实肿瘤样本相似。
[0108]
将培养至第4天的p2代恶性多形性腺瘤类器官进行蛋白表达(ck7、ck14、sma)和细胞增殖指数ki67表达的免疫组织化学染色(图6a)，染色结果与患者肿瘤组织的上述标记物免疫组织化学染色结果进行对比(图6b)(患者肿瘤样本免疫组化资料调取自上海交通大学附属第九人民医院口腔病理科组织样本库病理档案库)。比对结果显示p2代类器官蛋白表达和增殖指数表达水平与真实肿瘤样本相近。
[0109]
对比例1采用不同的消化酶
[0110]
操作步骤同实施例1，仅将步骤(1.3)中的消化酶成分替换为0.63mg/mlⅱ型胶原酶、0.5mg/ml透明质酸酶(gibco)、6.25mmol/l cacl2(gibco)。
[0111]
对比可知，实施例1中采用含ⅱ型胶原酶和dnase i的消化酶，消化后能获得较多细胞沉淀，活细胞数较多，并且不会出现细胞粘连的情况。本对比例消化后获得的细胞沉淀减少，且会出现细胞粘连的情况。可见，实施例1在ⅱ型胶原酶基础上，加入dnasei作为消化酶成分，可有效地裂解细胞死亡所释放出的dna，且对活细胞无影响。
[0112]
对比例2采用不同的消化方式
[0113]
操作步骤同实施例1，仅将步骤(1.3)中的37℃摇床300rpm消化1.5h，替换为37℃培养箱消化1.5h，其间每隔15～30min手动摇匀离心管的方式。
[0114]
对比结果可知，实施例1中采用摇床连续消化1.5h的方式，能保证酶与组织碎块较大接触面积、消化更充分、获得较多细胞沉淀、不出现细胞粘连之外，还能保证细胞沉淀中活细胞含量高，取得较好的消化效果。本对比例中，培养箱中消化1.5h后，消化不充分，仍存在很多组织碎块，无法得到理想的细胞沉淀；若在此基础上，采用延长时间等方法进行进一步消化时，虽能获得更多细胞沉淀，但活细胞含量会降低。
[0115]
对比例3不同的过滤方式
[0116]
操作步骤同实施例1，仅将步骤(1.4)中将消化后的悬液依次用100μm、70μm滤网(biosharp)进行过滤，替换为将消化后的悬液依次用100μm，70μm，40μm滤网进行过滤。
[0117]
对比结果可知，实施例1中采用的过滤方式，得到的细胞沉淀中含较多中等大小的细胞团块，在这些细胞团块基础上，更容易且更快地长成包含一个个细胞团块的类器官。本对比例中，采用的过滤方式，得到的细胞沉淀中含较多单细胞，在后续接种培养时，不易长成类器官。
[0118]
对比例4不同的培养基
[0119]
标本来源为上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面头颈肿瘤科，一例中年男性恶性多形性腺瘤患者，原发灶位于腮腺。冷冻活检术前，征得患者本人及监护人同意，签署知情同意书，术后病理诊断为：腮腺恶性多形性腺瘤。
[0120]
操作步骤同实施例1，采用实施例1步骤(1.4)中的培养基以及培养基a分别进行培
养及比对，其中培养基a相对于步骤实施例1步骤(1.4)中的培养基，但不含n-2补充剂、fgf2、prostaglandin e2这三种成分。
[0121]
采用培养基培养原代恶性多形性腺瘤类器官至第7天时，结果如图7所示。采用培养基a培养原代恶性多形性腺瘤类器官至第7天时，结果如图8所示。由图7、8可知，采用培养基的恶性多形性腺瘤类器官较采用培养基a者生长更快，相同培养时间段内类器官球体数量更多、体积更大。采用培养基a培养原代恶性多形性腺瘤类器官，需更长时间周期，通常约需2w才有一定数量类器官形成。
[0122]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。