一种判定烟草成分来源的方法与流程

1.本发明属于分子生物学研究领域，具体涉及一种判定烟草成分来源的方法。


背景技术：

2.烟丝很难从外观上进行鉴别检验，而以烟草特有的亚硝胺、烟碱等化学成分检测来对烟丝进行检验又有如下局限：其一，烟碱并非烟草所独有，在其它茄科植物中也很常见；其二，化学成分检测易被不法分子所采取的非法加料等手段所干扰。除此之外，上述法规要求检验人员不仅需要掌握相关的原料特性、化学成分分析方法、感官评吸技术，还具备烟叶生产和分级技能，致使检验人员的培训难度大；另外，烟丝本身的霉变和不法分子所采取的染色等手段，也加大了检验人员进行准确鉴定的难度。因此，依靠现有的检验方法对烟丝进行鉴别，容易引起误判、错判的发生。
3.申请公布号为cn104962648a的中国专利申请公开了一种应用fmyyssr-1分子标记技术鉴定烟草原料的方法，在以十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法，对各个样品的dna进行提取后，以本发明所设计的引物对其进行pcr扩增，经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置，视待测样品在相应位置有无扩增条带产生来判断该样品是否为烟草。
4.在烟草及烟草制品的鉴定过程中，不仅需要鉴定样品是否是烟草，还要判定烟草成分是否为外源添加。外源添加例如在非烟基质(茶叶、树叶等)上添加烟草成分(如烟草提取液)混合，以充当烟草制品。内源烟草指样品本身即为烟草。
5.烟草成分是否是外源添加的判定是必要环节也是难点。传统的外观和评吸鉴定方法很难判定烟草成分的来源，这对目前的烟草及烟草制品的鉴别检验工作造成了困扰。
6.而上述文献(cn104962648a)记载的技术方案只能判定样品中是否含有烟草成分，并不能进一步判定烟草成分为内源还是外源添加。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种判定烟草成分来源的方法，该方法能够鉴定烟草成分的来源。
8.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
9.一种判定烟草成分来源的方法，包括以下步骤：
10.(1)根据烟草特有的ssr-1标记设计引物；提取待测样品的dna，用所述引物对所述dna进行pcr扩增，得到第一扩增产物，对第一扩增产物进行电泳分析，确定是否存在烟草物种的特异性条带；如存在所述特异性条带，表明待测样品中含有烟草成分；
11.(2)对含有烟草成分的待测样品进行洗脱，提取洗脱后的待测样品的dna，用所述引物对洗脱后的待测样品dna进行pcr扩增，得到第二扩增产物，对第二扩增产物进行电泳分析，确定是否存在烟草物种的特异性条带；所述洗脱所用洗脱液为1.0～2.0mol/l的nacl溶液；
12.如存在所述特异性条带，表明烟草成分是内源的；如不存在，表明烟草成分是外源
的。
13.本发明的判定烟草成分来源的方法，提取样品的dna后，以本发明设计的引物对其进行pcr扩增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置；再用nacl溶液对样品进行洗脱，nacl溶液能够较好地洗脱除去待测样品中外源添加的烟草成分，同时不干扰内源烟草成分的鉴定，洗脱后再提取样品的dna进行pcr扩增，以是否出现烟草特异性条带来判定烟草成分为内源或外源添加。
14.dna是物种间相互区分的显著标志，因此通过判断烟草dna的来源可以判断烟草成分的来源。目前在烟草中已经开发和发表的ssr标记，作为筛选和过滤的基础。具体分析步骤如下：1、取拟南芥、本氏烟(国际上普遍采用的一种模式烟草种，与普通烟草亲缘关系较近)、栽培烟草、番茄和土豆作为参考序列，将候选标记进行比对；2、过滤掉能和拟南芥、番茄和土豆能比对上的ssr标记；3、选取能和本氏烟、栽培烟草均能比对上，且扩增序列单一的ssr标记；4、筛选的标记扫描美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information ncbi)数据库的所有物种基因序列信息，验证上述引物在烟草中的特异性。经过筛选，发现ssr-1标记能够对烟草样品进行鉴定。
15.进一步地，步骤(1)和步骤(2)中，进行所述pcr扩增的上游引物如seq id no：1所示，下游引物如seq id no：2所示。该引物在烟草中具有特异性，能够鉴别待测样品是否为烟草。以dna分子标记鉴定加洗脱的手段判定烟草成分来源，与传统的外观鉴定法、评吸鉴定方法相比，具有更加客观、更加准确、更加可靠的优势。
16.进一步地，采用所述nacl溶液对待测样品洗脱3～5次。
17.进一步地，每0.1g待测样品对应采用2ml的所述nacl溶液。
18.进一步地，所述提取待测样品的dna包括以下步骤：(a)将待测样品组织碾磨成细粉末，放入2ml离心管中；(b)向离心管中加入600～800μl、65℃的ctab提取缓冲液，混匀，每3～5min轻轻震荡5-7次，20min后12000r/min离心10～15min；(c)吸取400μl上清液，加入与上清液等体积的苯酚、氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心10～15min；(d)吸取上清液，加入与上清液等体积的氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心10～15min，重复2～3次，以蛋白层不出现为止；(e)取上清液，-20℃沉淀1～2h，4℃、12000r/min，离心10～15min；(f)弃去上清液，用50％～70％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥10～15min后，于-20℃或者-70℃下保存备用。所述提取洗脱后的待测样品的dna的步骤与上述洗脱前的步骤相同。
19.所述ctab提取缓冲液为2％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液。
20.进一步地，所述pcr扩增的反应体系包括20.8μl的h2o、3μl的10
×
pcr缓冲液、1μl的5
′‑
引物、1μl的3
′‑
引物、2μl的dntps、0.2μl的taq酶和2μl的模板。
21.进一步地，所述5
′‑
引物的浓度为20m。所述3
′‑
引物的浓度为20m。所述dntps的浓度为2.5mm。
22.进一步地，所述pcr扩增的反应程序为：94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸30s，重复35个循环。
23.进一步地，进行所述电泳分析所需的第一、第二扩增产物的体积为25μl。
24.进一步地，所述电泳分析为凝胶电泳分析。
附图说明
25.图1为本发明实验例中的电泳结果示意图，其中，箭头所指为特异性条带。
具体实施方式
26.以下结合实施例对本发明做进一步地说明。本发明实施例所用的pcr缓冲液采购自roche公司，货号为11699121001。
27.一、判定烟草成分来源的方法的实施例
28.实施例1
29.本实施例的判定烟草成分来源的方法，包括以下步骤：
30.1.对待测样品1进行dna提取：(1)将样品组织碾磨成细粉末，放入2ml离心管中；(2)加入600μl、65℃的ctab提取缓冲液，混匀，每3min轻轻震荡5次，20min后12000r/min离心10min；(3)小心吸取上清液400μl，加入与上清液等体积的苯酚、氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心10min；(4)小心吸取上清液，加入与上清液等体积的氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心10min，重复2次，以蛋白层不出现为止；(5)取上清液，-20℃沉淀1h，在4℃、12000r/min条件下离心10min；(6)弃去上清液，用50％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥10min后，于-20℃下保存备用；
31.2.用2ml浓度为1.0mol/l的nacl溶液洗脱待测样品1(0.1g)3次；
32.3.对洗脱后的待测样品1进行dna提取，提取步骤与步骤1相同；
33.4.对洗脱前后的待测样品1的dna分别进行pcr扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；pcr扩增反应体系如下所示：20.8μl的h2o，3μl的10
×
pcr缓冲液，1μl的5
′‑
引物(20m)，1μl的3
′‑
引物(20m)，2μl的dntps(2.5mm)，0.2μl的taq酶，2μl的模板；pcr扩增的上游引物为gcaagaagatctgaaagtgaaagag，下游引物为ccatactttcagtttggccc；pcr扩增反应体系总体积为30μl；pcr扩增反应程序为：94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸30s，重复35个循环；
34.5.分别取25μl的第一扩增产物、第二扩增产物进行凝胶电泳分析，观察发现待测样品1在洗脱前后的电泳结果均含有烟草特异性条带，说明待测样品1的烟草成分是内源的。
35.实施例2
36.本实施例的判定烟草成分来源的方法，包括以下步骤：
37.1.对待测样品2进行dna提取：(1)将样品组织碾磨成细粉末，放入2ml离心管中；(2)加入700μl、65℃的ctab提取缓冲液，混匀，每4min轻轻震荡6次，20min后12000r/min离心12min；(3)小心吸取上清液400μl，加入与上清液等体积的苯酚、氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心12min；(4)小心吸取上清液，加入与上清液等体积的氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心12min，重复3次，以蛋白层不出现为止；(5)取上清液，-20℃沉淀2h，在4℃、12000r/min条件下离心12min；(6)弃去上清液，用60％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥12min后，于-70℃下保存备用。
38.2.用2ml浓度为1.5mol/l的nacl溶液洗脱待测样品2(0.1g)4次；
39.3.对洗脱后的待测样品2进行dna提取，提取步骤与步骤1相同；
40.4.pcr扩增反应体系如下所示：20.8μl的h2o，3μl的10
×
pcr缓冲液，1μl的5
′‑
引物
(20m)，1μl的3
′‑
引物(20m)，2μl的dntps(2.5mm)，0.2μl的taq酶，2μl的模板；pcr扩增的上游引物为gcaagaagatctgaaagtgaaagag，下游引物为ccatactttcagtttggccc；pcr扩增反应体系总体积为30μl；pcr扩增反应程序为：94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸30s，重复35个循环；
41.5.分别取25μl的第一扩增产物、第二扩增产物进行凝胶电泳分析，观察发现洗脱前待测样品2的电泳结果有烟草特异性条带，洗脱后待测样品2的电泳结果没有烟草特异性条带，说明待测样品2的烟草成分是外源的。
42.实施例3
43.本实施例的判定烟草成分来源的方法，包括以下步骤：
44.1.对待测样品3进行dna提取：(1)将样品组织碾磨成细粉末，放入2ml离心管中；(2)加入800μl、65℃的ctab提取缓冲液，混匀，每5min轻轻震荡7次，20min后12000r/min离心15min；(3)小心吸取上清液400μl，加入与上清液等体积的苯酚、氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心15min；(4)小心吸取上清液，加入与上清液等体积的氯仿，混匀，在4℃、12000r/min条件下离心15min，重复3次，以蛋白层不出现为止；(5)取上清液，-20℃沉淀2h，4℃、12000r/min，离心15min；(6)弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥15min后，于-20℃下保存备用。
45.2.用2ml浓度为2.0mol/l的nacl溶液洗脱待测样品3(0.1g)5次；
46.3.对洗脱后的待测样品3进行dna提取，提取步骤与步骤1相同；
47.4.pcr扩增反应体系如下所示：20.8μl的h2o，3μl的10
×
pcr缓冲液，1μl的5
′‑
引物(20m)，1μl的3
′‑
引物(20m)，2μl的dntps(2.5mm)，0.2μl的taq酶，2μl的模板；pcr扩增的上游引物为gcaagaagatctgaaagtgaaagag，下游引物为ccatactttcagtttggccc；pcr扩增反应体系总体积为30μl；pcr扩增反应程序为：94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸30s，重复35个循环；
48.5.分别取25μl的第一扩增产物、第二扩增产物进行凝胶电泳分析，观察发现洗脱前待测样品3的电泳结果有烟草特异性条带，洗脱后待测样品3的电泳结果没有烟草特异性条带，说明待测样品3的烟草成分是外源的。
49.二、实验例
50.制备不同质量比(1:1、1:9、1:99)的烟草dna提取物和非烟基质(茶叶)混合物，经过自然风干后，用nacl溶液(浓度为2.0mol/l)对混合物进行洗脱，洗脱后进行实施例1中的步骤3、4、5，电泳结果如图1所示，图1中，m：marker；1：k326；2：红花大金元；3：烟草样品提取液；4：烟草样品提取液和非烟基质混合物(质量比1:1)；5：烟草样品提取液和非烟基质混合物(质量比1:9)；6：烟草样品提取液和非烟基质(质量比1:99)；7：nacl溶液；8：非烟基质；9：洗脱后烟草样品提取液和非烟基质混合物(质量比1:1)；10：洗脱后烟草样品提取液和非烟基质混合物(质量比1:9)；11：洗脱后烟草样品提取液和非烟基质混合物(质量比1:99)。
51.由图1的电泳结可知，洗脱后样品的烟草特异性条带不再显现，说明本发明设计的洗脱方法行之有效。