一种金属-有机笼纳米复合载药体系及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种金属-有机笼纳米复合载药体系及其制备方法与应用。


背景技术：

2.癌症是一种占位性病变，具体指机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织细胞的异常增生而形成的局部肿块，它会不断地分裂，不受身体控制，最后形成癌症。目前，针对癌症的治疗包括手术切除、化疗、放疗、免疫治疗等方法。其中，化疗一般是采用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞。但是化疗除了对肿瘤细胞有抑制作用以外，对人体正常细胞不可避免地也会造成一定的损伤。
3.为了解决上述问题，现有技术常将化疗药物与载药体系结合，用载药体系包被药物，降低药物对正常体细胞的毒性，到达肿瘤细胞时，将药物释放，从而达到高效抗肿瘤的效果。如中国专利申请公开了一种包含光敏剂的金属有机框架，除了可以吸收x射线进行光动力治疗外，还可以在有机框架的腔体或通道中负载药物颗粒，对癌症进行治疗。但是这类有机框架结构不够稳定，容易被破坏，造成药物提前释放，无法达到高效抗癌的效果。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有有机框架化合物结构不稳定易被破坏的缺陷和不足，提供一种结构稳定、可与小分子药物稳定结合的金属-有机笼纳米复合载药体系。
5.本发明的目的是提供一种金属-有机笼化合物。
6.本发明另一目的是提供所述金属-有机笼纳米复合载药体系的制备方法。
7.本发明的另一目的是提供所述金属-有机笼纳米复合载药体系的应用。
8.本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤药物。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.一种金属-有机笼化合物，所述金属-有机笼状化合物的分子式为：ru4c
264h216n64
，简写为moc-68，以式(1)化合物为单体连接成四面体结构：
[0011][0012]
一种金属-有机笼纳米复合载药体系，包括所述金属-有机笼化合物和peg-nh2修饰的中空介孔的mno2。
[0013]
进一步地，所述金属-有机笼化合物与peg-nh2修饰的中空介孔的mno2的质量比为1：(1～2)。
[0014]
另外的，本发明还提供了所述金属-有机笼纳米复合载药体系的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
将所述金属-有机笼化合物moc-68溶于极性有机溶剂中，得溶液a，peg-nh2修饰的中空介孔的mno2分散于极性有机溶剂中，得混悬液b，将溶液a与混悬液b充分混合，固液分离，固体后处理，即得。
[0016]
优选地，所述充分混合为室温条件下搅拌12～48h。固液分离为离心。后处理为分别用乙醚和去离子水洗涤多次。
[0017]
优选地，所述极性有机溶剂选自乙腈、乙醚中的一种或两种。
[0018]
进一步地，所述peg-nh2修饰的中空介孔的mno2的制备方法包括以下步骤：
[0019]
s1、于水-氨水-乙醇体积比为1：(0.5～4)：(14～28)的混合溶液中加入原硅酸四乙酯，加热反应完全，后处理(分别用乙醇和去离子水洗涤两次)，得到sio
2 nps；将sio
2 nps超声条件下加入高锰酸钾溶液(1.2g～2.4g高锰酸钾溶解在40～80ml水中，浓度为0.01～0.03g/ml)中，搅拌均匀(室温搅拌过夜)，固液分离，后处理(水洗3次)，得sio2@mno
2 nps；将sio2@mno
2 nps分散在碱性水溶液中，搅拌均匀(加热至50～70℃搅拌过夜)，后处理(水洗多次)，得中空介孔的mno
2 nps；
[0020]
s2、将步骤s1所得中空介孔的mno
2 nps分散在水中(20～40mg mno
2 nps分散在10～20ml去离子水中，浓度1～2mg/ml)，超声条件下加入聚(烯丙胺
·
盐酸)(pah,mw≈15000)溶液(pah浓度5～10mg/ml)搅拌均匀(室温搅拌1～3h)，固液分离(离心后水洗多次)，固体分散至聚丙烯酸(paa,mw≈2000)溶液(paa浓度5～10mg/ml)中，搅拌均匀(室温搅拌1～3h)，固液分离(离心后水洗多次)，固体加入氨基聚乙二醇单甲醚(mpeg-nh2,mw≈5000)溶液(mpeg-nh2浓度5～10mg/ml)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液(edc浓度1～3mg/ml)，搅拌均匀(搅拌过夜)，后处理(离心后水洗多次)，即得。
[0021]
优选地，步骤s1中，所述加热反应的温度为50～70℃；所述加热反应的时间为1～
3h。
[0022]
优选地，步骤s1中，所述碱性水溶液为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠等的水溶液(浓度1～2m)。
[0023]
其中，所述金属-有机笼化合物的制备方法为：
[0024]
i、醛基有机配体l-cho的制备：将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮、醋酸铵置于冰乙酸中，加热并加入对苯二甲醛，反应完全，后处理，得式(2)化合物：
[0025][0026]
ii、ru-l-cho的制备：将三氯化钌、步骤i所得式(2)化合物置于乙二醇中，混合均匀后加热反应完全，冷却后加入水和饱和nabf4水溶液混合均匀，固液分离，所得固体用甲醇萃取，萃取液加入水和hbf4水溶液，加热反应完全，后处理，得式(3)化合物：
[0027][0028]
iii、金属-有机笼状化合物的制备：步骤ii所得式(3)化合物依次用甲醇、氯仿、水和三乙胺溶解，加入式(4)化合物避光反应完全，固液分离，液体中加入nabh4反应完全，固液分离，液体经后处理除杂，即得；
[0029][0030]
进一步地，步骤i中，所述加热的温度为70～100℃。
[0031]
更进一步地，步骤i中，所述反应的温度为100～110℃。
[0032]
优选地，步骤i中，所述反应的时间为2～3h。
[0033]
进一步地，步骤i中，所述1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮、对苯二甲醛与醋酸铵的摩尔比为0.5～1：1～3：5～10。
[0034]
更进一步地，步骤i中，所述后处理为：反应完全后冷却至室温，加入去离子水，用
氨水调节至中性，抽滤后将得到的固体产物用大量水洗涤得到粗产物；粗产物用甲醇重结晶，即得。
[0035]
进一步地，步骤ii中，所述混合均匀后加热反应的温度为180～190℃。优选地，反应时间为10～15min。
[0036]
更进一步地，步骤ii中，所述萃取液加入水和nabf4水溶液后的加热反应温度为40～50℃。优选地，反应时间为2～5h，以将在微波反应中生成的缩醛水解。
[0037]
进一步地，步骤ii中，所述加热反应的同时采用微波辅助反应。
[0038]
更进一步地，步骤ii中，所述三氯化钌、式(2)化合物的摩尔量比为0.25～0.3:0.8～0.9。
[0039]
进一步地，步骤ii中，所述hbf4水溶液的浓度为50～60wt％。
[0040]
更进一步地，步骤ii中，所述后处理为：加热反应结束后，用5～8m的氢氧化钠水溶液将反应液调节至中性，固液分离，将沉淀水洗多次后真空干燥，即得。
[0041]
进一步地，步骤iii中，所述反应均在常温条件下进行。优选地，避光反应48～72h；加入nabh4反应2～4h。
[0042]
更进一步地，步骤iii中，所述式(3)化合物、式(4)化合物、nabh4的摩尔量比为1：1.1～1.4：30～50。
[0043]
进一步地，步骤iii中，所述后处理除杂为：固液分离后除去固体，使用50wt％hbf4水溶液将溶液调节至中性，加入饱和nabf4水溶液，通过旋转蒸法去除大部分溶剂后加入水洗涤多次，用dmso将固体溶解后离心除去不溶物，倾倒入ph＝6.6的饱和nabf4溶液中，离心，将沉淀用蒸馏水洗两次，用乙腈将沉淀溶解后离心除去不溶物，旋蒸后得到橙色固体，真空干燥2～4h后用乙腈将橙色固体溶解加入乙醚，离心后将得到的固体用乙醚洗涤两次后在50～70℃下真空干燥3天，即得。
[0044]
更进一步地，调节ph所用酸为氟硼酸钠或六氟磷酸钾，所用碱为氢氧化钠或氨水。
[0045]
本发明提供的金属-有机笼纳米复合载药体系中，金属-有机笼纳米化合物通过使用动态可逆的亚胺键作为连接单元进行笼的组装，将得到的动态可逆的不稳定的亚胺键通过硼氢化钠原位进行还原，得到的是酸碱稳定的笼结构；并且其笼子具有内部疏水，外部亲水的特性，可通过疏水作用与疏水抗肿瘤小分子药形成稳定的主-客体包合物，减少疏水抗肿瘤小分子药对正常体细胞的损害作用，显著提高疏水抗肿瘤小分子药的生物利用度和抗癌效果。中空介孔的mno2在富含h2o2和h

的肿瘤微环境中可以降解为mn
2
和o2，mn
2
可作为磁共振造影剂使用，后者可显著改善肿瘤微环境的乏氧情况，增强抗肿瘤药物和免疫因子的抗肿瘤作用。
[0046]
因此，本发明还要求保护所述金属-有机笼纳米复合载药体系在制备抗肿瘤药物、光动力材料、核磁造影材料中的应用。
[0047]
进一步地，所述药物包括金属-有机笼纳米复合载药体系和疏水抗肿瘤小分子药。
[0048]
更进一步地，所述疏水抗肿瘤小分子药包括康普瑞汀、凡德他尼、美洛昔康、沙利度胺、苯丁酸氮芥、7-氨基-4甲基香豆素、大蒜新素等。
[0049]
现有数据已经证明，大蒜素的有机硫提取物——二烯丙基三硫醚(大蒜新素，dats)可以通过产生ros和破坏细胞超微结构来促进细胞凋亡，从而实现治疗癌症的目的。但是dats水溶性差，不稳定，易挥发，极大限制了其在治疗癌症中的作用，为了解决上述问
题，本发明一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括所述金属-有机笼纳米复合载药体系和大蒜新素。
[0050]
进一步地，所述金属-有机笼纳米复合载药体系和大蒜新素的摩尔比为1：(1～3)。
[0051]
更进一步地，一种抗肿瘤药物的制备方法包括以下步骤：
[0052]
将所述金属-有机笼纳米复合载药体系和大蒜新素在混合溶液(dmso:pbs＝1:2)中搅拌12～24h，离心后用pbs洗涤3次，即得。
[0053]
本发明具有以下有益效果：
[0054]
本发明提供了一种金属-有机笼纳米复合载药体系，该体系中的金属-有机笼纳米化合物的笼子结构稳定，并且具有内部疏水外部亲水的特性，可通过疏水作用与疏水抗肿瘤小分子药形成稳定的主-客体包合物，显著提高疏水抗肿瘤小分子药的生物利用度和抗癌效果。中空介孔的mno2在富含h2o2和h

的肿瘤微环境中可以降解为mn
2
和o2，mn
2
可作为磁共振造影剂使用，后者可显著改善肿瘤微环境的乏氧情况。
附图说明
[0055]
图1为实施例1所得lcho的核磁氢谱图。
[0056]
图2为实施例1所得ru(lcho)3(bf4)2的核磁共振氢谱图及1h-1
h cosy谱图。
[0057]
图3为实施例1所得moc-68的核磁共振氢谱图及1h-1
h cosy谱图。
[0058]
图4为实施例2中moc-68、dats和的核磁氢谱图。
[0059]
图5为实施例3中的1h-1
h noesy谱图。
[0060]
图6为实施例4中的1h dosy谱图。
[0061]
图7为实施例5中dats和moc-68的job曲线图。
[0062]
图8为实施例6中hill方程对moc-68和dats的核磁的非线性拟合图。
[0063]
图9为实施例7中mno
2 nps的tem图和dmmp nps的eds元素分布图；其中，图9a～图9c为tem图：图9a-sio
2 nps，图9b-sio2@mno
2 nps，图9c-mno2nps；图9d～图9g为eds元素分布图：图9d-moc-68@mno2@peg，图9e-mn，图9f-ru，图9g-图9d、9e和9f的叠加。
[0064]
图10为实施例8中不同浓度h2s溶液的紫外-可见光谱图(图10a)和标准曲线图(图10b)。
具体实施方式
[0065]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0066]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0067]
实施例1：钌(ii)基金属-有机笼状化合物moc-68的制备
[0068]
所述钌(ii)基金属-有机笼状化合物moc-68的制备包括以下步骤：
[0069]
1、醛基有机配体lcho的合成：
[0070]
将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮(210mg,1mmol)与醋酸铵(770mg,10mmol)加入到100ml圆底烧瓶中，加入50ml冰乙酸后加热至90℃，将对苯二甲醛(268mg,2mmol)分批加入烧瓶中，继续升温至110℃并保持2h。反应结束后冷却至室温，向反应液中加入50ml去离子
dmso将固体溶解后离心除去不溶物，倾倒入20ml ph＝6.6的饱和nabf4溶液中，离心，将沉淀用蒸馏水洗两次，用4ml乙腈将沉淀溶解后离心除去不溶物，旋蒸后得到橙色固体，真空干燥2h后用4ml乙腈将橙色固体溶解加入50ml乙醚，离心后将得到的固体用乙醚洗涤两次后在70℃下真空干燥3天。得到橙色粉末，即为moc-68。(80mg,65％)。
[0079]1h nmr(400mhz,含有25mm naoh的meod:cdcl3＝1:1(v/v)混合溶液)δ10.00(d,j＝8.3hz,1h),9.06
–
8.99(m,1h),8.86(d,j＝8.1hz,2h),8.29(d,j＝5.0hz,1h),7.52(d,j＝4.0hz,1h),7.44(dd,j＝8.3,5.3hz,1h),7.33(d,j＝8.3hz,2h),6.18(dd,j＝8.1,5.3hz,1h),3.77
–
3.65(m,3h),3.04(d,j＝11.0hz,1h),2.96(d,j＝12.5hz,1h),2.74(d,j＝10.4hz,2h),2.45(d,j＝11.7hz,2h).具体参见图3。
[0080][0081]
实施例2moc-68和dats的主-客体作用研究
[0082]
将moc-68、dats和摩尔浓度1:1的moc-68 dats(0.5mm)分别溶解在dmso-d6:d2o＝1:2的混合溶剂中，得到的溶液用核磁进行表征，得到moc-68、dats和的核磁氢谱图(具体参见图4)。
[0083]
由图4可以看出，和单独的moc-68相比，混合物的核磁氢谱中出现了客体dats的位移信号峰，说明二者具有主-客体作用，可以结合在一起。
[0084]
实施例3：moc-68与dats的空间相互作用研究
[0085]
将摩尔浓度1:1的moc-68和dats(1.0mm)溶解在dmso-d6:d2o＝1:2的混合溶剂中，得到的溶液用核磁进行表征，得到的1h-1
hnoesy谱图(具体参见图5)。
[0086]
由图5可以看出，客体分子dats的c质子主要和笼子钌配体朝向笼子外部的质子d,f,f’，g,h,h’有相关信号，说明客体分子dats可能是在moc-68笼子外部与笼子形成主-客体作用。
[0087]
实施例4：moc-68与dats的扩散系数研究
[0088]
将摩尔浓度1:1的moc-68和dats(1.0mm)溶解在dmso-d6:d2o＝1:2的混合溶剂中，得到的溶液用核磁进行表征，得到的1h dosy谱图(具体参见图6)。
[0089]
由图6可以看出，低场区的moc-68笼子的信号的扩散系数的对数值相同，客体分子dats的扩散系数对数值相同，且与moc-68笼子的扩散系数的对数值相近，这一现象说明dats和笼子形成了比较稳定的主-客体包合物。
[0090]
实施例5：moc-68与dats的结合比测定
[0091]
储备液配制：分别配制5mm的moc-68的溶液5ml(dmso-d6:d2o＝1:2v/v)作为主体的储备液和5mm的dats的溶液5ml作为客体的储备液。
[0092]
核磁样品的准备：准备13根核磁管，按表1分别加入相应体积的笼子和客体的溶液，使客体分子的浓度在0.00～1.00mm的范围内连续变化，而笼子加客体的总浓度保持为1mm不变，配置后的溶液平衡10min后测试核磁。
[0093]
表1绘制moc-68和dats job曲线的溶液的配制以及相应的化学位移值
[0094][0095]
用得到的数据中客体dats的摩尔分数χ
dats
作为横坐标，客体dats的摩尔分数和相对于自由客体的化学位移变化值的乘积χ
dats
·
δδ作为纵坐标绘制job曲线(具体参见图7)。
[0096]
从图7中可以看出随着客体的摩尔分数的逐渐增加，纵坐标的变化在χ
dats
＝0.75出现最大值，说明主-客体的结合比是1:3，即一个moc-68笼子能包合3个dats分子。
[0097]
实施例6：moc-68与dats的结合常数ka测定
[0098]
结合常数的测定过程与job曲线的绘制稍有差别：在结合常数的测试过程中，主体moc-68的浓度(1.0mm)保持不变，连续改变客体分子dats的浓度，配置后的溶液平衡10min后测试核磁。以客体分子dats的浓度为横坐标，笼子moc-68的质子f’质子的化学位移与不加客体时的化学位移的差值为纵坐标作图，用hill方程进行非线性拟合，结果参见图8。
[0099]
从拟合得到的结果来看，拟合得到的曲线呈s型(ka＝425.64，n＝2.21，r2adj＝0.968)。其中，hill系数n为2.21，说明笼子moc-68对dats的包合是一个正的协同过程，即笼子moc-68结合一个dats分子后，有利于增强笼子moc-68对下一分子dats的结合作用。表观结合常数ka＝425.64m-1
，说明笼子moc-68对dats的结合相对较强，同样证明了主-客体的作用是一个比较稳定的过程。
[0100]
实施例7：peg-nh2修饰的中空介孔的mno2的制备与表征
[0101]
向250ml的圆底烧瓶中加入56ml乙醇、8ml去离子水和2ml氨水，缓慢滴加2ml原硅酸四乙酯，在50℃下搅拌2h后离心，分别用乙醇和去离子水洗涤两次后，得到sio
2 nps。
[0102]
将2.4g高锰酸钾溶解在80ml去离子水中，超声下滴加入sio
2 nps中，然后在室温下搅拌过夜，离心后水洗3次，得到sio2@mno
2 nps。将sio2@mno
2 nps分散在na2co3水溶液中(2m)，室温搅拌过夜，离心后水洗多次，真空干燥，得到中空介孔的mno
2 nps。
[0103]
将40mg mno
2 nps分散在20ml去离子水中，在超声下滴加到pah(mw≈15000)水溶液(5mg/ml)中，室温搅拌2h，离心后水洗3次，然后分散到paa(mw≈2000)溶液(5mg/ml)中，室温搅拌2h，离心后水洗3次，再加入mpeg-nh2(mw≈5000)溶液(10mg/ml)和edc溶液(3mg/ml)，搅拌过夜后离心，水洗3次，得到的mno2@peg nps。
[0104]
用hitachi ht7800透射电镜对所得mno2@peg nps进行形貌表征和粒径测定，结果参见图9。由图可见，所有的纳米粒子均为球形，具有良好的单分散性。同时纳米球呈现灰色中心和深黑色的边缘，表明中空介孔结构的mno2成功合成。此外，由tem图可知制备的nps的平均粒径约为140nm，理论上满足epr效应的要求。
[0105]
实施例8：dmmp nps的制备与表征
[0106]
将50mg moc-68溶于5ml乙腈中，将5mg mno2@peg nps分散于15ml乙醚中，二者在室温下混合搅拌24h，离心后分别用乙醚和去离子水洗涤3次，得到moc-68@mno2@peg nps。
[0107]
将moc-68@mno2@peg nps和大蒜新素(dats,3mm)在混合溶液(dmso:pbs＝1:2)中搅拌12h，离心后用pbs洗涤3次，得到@mno2@peg nps(dmmp nps)。
[0108]
用jem-arm200p球差校正透射电镜对dmmp nps进行元素分布分析结果参见图10；由图可见，ru元素代表的moc-68与mn元素代表的mno2@peg nps的元素分布轮廓相似，证实moc-68成功负载在mno2@peg nps上。
[0109]
用分光光度法检测dats，并用标准曲线法(h2s作标准物质)定量，结果参见图10。统计结果参见表2，可见dmmp nps体系中dats含量为1.026mg/l。
[0110]
表2 dats含量计算结果
[0111][0112]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。