一种结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置及方法

介电泳分选装置作为第二筛选区域，具体的：
9.交流-介电泳分选装置，包括微通道层、微电极层和ito玻璃基底层；ito玻璃基底层与微电极层键合，采用双面导电铜箔纸从ito玻璃基底层延伸出导线与信号发生器连接，用于为微藻颗粒的筛选与分离施加交流信号；
10.多孔流动分离装置，包括多孔段，多孔段的一端连通有第一进液口、过滤器，多孔段的另一端连通有第一出液口、第二出液口、第三出液口。
11.进一步地，所述微通道层包括微流体通道，微流体通道一侧用于连接第二进液口和微藻细胞入口，另一侧用于连接第一出样口和第二出样口；微通道层的一侧壁分别设置有第一通孔、第二通孔，对应第一通孔的另一侧壁设置有第三通孔，对应第二通孔的另一侧壁设置有第四通孔；第一通孔和第三通孔构成第一对不对称孔结构；第二通孔和第四通孔构成第二对不对称孔结构；
12.微电极层包括有第一ag-pdms电极、第二ag-pdms电极、第三ag-pdms电极和第四ag-pdms电极分别镀在ito玻璃基底层上；
13.ito玻璃基底层包括第一ito电极、第二ito电极、第三ito电极和第四ito电极；第一ito电极、第二ito电极、第三ito电极和第四ito电极作为电源线和微电极层之间的导线。
14.进一步地，所述第一通孔、第二通孔的宽度与第一ag-pdms电极、第二ag-pdms电极、第三ag-pdms电极和第四ag-pdms电极的宽度相同，且宽度大于所述第三通孔以及第四通孔的宽度。
15.进一步地，所述第一ag-pdms电极通过第三通孔与微通道层连通并通过第一通孔与另一侧第三ag-pdms电极在所述微通道层形成高梯度不均匀电场；
16.第二ag-pdms电极通过第四通孔与微通道层连通并通过第二通孔与另一侧第四ag-pdms电极在所述微通道层形成高梯度不均匀电场。
17.进一步地，所述第一出液口、第二出液口之间设置有第一夹角，第二出液口、第三出液口之间设置有第二夹角，便于不同体积的微藻在经过多孔段后分别进入不同的出液通道；
18.第二进液口和微藻细胞入口之间设置有第三夹角，用于形成鞘液流使得微藻细胞挤压到一侧的微通道壁上；出样口之间设置有第四夹角，便于不同脂质含量的微藻在分选后分别进入不同的出液通道。
19.进一步地，所述第一夹角和第二夹角为45
°
，所述第三夹角和第四夹角为60
°
。
20.进一步地，所述微通道层为pdms材料，采用光刻浇注工艺制作而成；所述微电极层采用的ag-pdms复合材料由ag和pdms以4：1的比例搅拌而成。
21.进一步地，所述多孔段由单个孔结构依次连接构成。
22.本发明还提供了一种基于上述结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置的微藻颗粒筛选与分离方法，包括如下步骤：
23.s1、将键合后的结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置放入等离子清洗机中进行等离子清洗，提高通道的亲水性，便于液体流动；
24.s2、用导线连接电压信号发生器和第一ag-pdms电极、第二ag-pdms电极、第三ag-pdms电极以及第四ag-pdms电极，打开信号发生器开关，调整电压和频率，使微流控芯片处于工作状态；
25.s3、用注射泵在第一进液口和第二进液口中先后注入微藻细胞溶液和缓冲液；
26.s4、用显微镜观察微藻细胞分离效果，采用多孔流动分离装置的时候，适当调节微藻细胞溶液流速，提高一级分离效率；采用交流-介电泳分选装置的时候，适当调整电压与频率，提高二级分离效率。
27.较现有技术相比，本发明具有以下优点：
28.1、本发明提供的结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置，以多孔流动分离作为交流-介电泳分选的预富集阶段实现一级分离，并利用交流-介电泳实现二级分离，从而实现微藻溶液样品中小球藻与盐藻、扁藻以及塔胞藻的连续分离，无需对微藻细胞进行标记，不影响细胞生理活性。
29.2、本发明提供的结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置，对实验人员没有过多的要求，只需掌握正确的实验方法即可。
30.3、本发明提供的结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置，其实验过程快、实验设备简单便携。
31.基于上述理由本发明可在微藻分选等领域广泛推广。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1为本发明装置结构示意图。
34.图2为本发明装置中交流-介电泳分选装置图。
35.图3为本发明装置中多孔段放大图。
36.图中：1、微通道层；10、微流体通道；100、第二进液口；101、微藻细胞入口；102、第一出样口；103、第二出样口；40、第一通孔；41、第二通孔；42、第三通孔；43、第四通孔；50、第一ag-pdms电极；51、第二ag-pdms电极；52、第三ag-pdms电极；53、第四ag-pdms电极；2、多孔段；20、第一进液口；21、过滤器；22、第一出液口；23、第二出液口；24、第三出液口；30、第一夹角；31、第二夹角；32、第三夹角；33、第四夹角。
具体实施方式
37.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根
据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
40.除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当清楚，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员己知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任向具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
41.在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制：方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。
42.为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在
……
之上”、“在
……
上方”、“在
……
上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其位器件或构造之下”。因而，示例性术语“在
……
上方”可以包括“在
……
上方”和“在
……
下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
43.此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
44.如图1所示，本发明提供了一种结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置，包括：交流-介电泳分选装置和多孔流动分离装置，其中，将多孔流动分离装置作为第一筛选区域，用于分离不同体积大小的微藻细胞；将交流-介电泳分选装置作为第二筛选区域，用于筛选不同脂质含量的微藻细胞；具体的：
45.交流-介电泳分选装置，包括微通道层1、微电极层和ito玻璃基底层；ito玻璃基底层与微电极层键合，采用双面导电铜箔纸从ito玻璃基底层延伸出导线与信号发生器连接，用于为微藻颗粒的筛选与分离施加交流信号，正弦交流信号在一个周期内信号频率由捕获频率跳转到释放频率，在整个实验过程中反复进行。
46.多孔流动分离装置，包括多孔段2，多孔段2的一端连通有第一进液口20、过滤器21，多孔段2的另一端连通有第一出液口22、第二出液口23、第三出液口24。
47.具体实施时，作为本发明优选的实施方式，微通道层1包括有微流体通道10，微流体通道10一侧用于连接第二进液口100和微藻细胞入口101，另一侧用于连接第一出样口
102和第二出样口103；微通道层1的一侧壁分别设置有第一通孔40、第二通孔41，对应第一通孔40的另一侧壁设置有第三通孔42，对应第二通孔41的另一侧壁设置有第四通孔43；第一通孔40和第三通孔42构成第一对不对称孔结构；第二通孔41和第四通孔43构成第二对不对称孔结构；
48.微电极层包括有第一ag-pdms电极50、第二ag-pdms电极51、第三ag-pdms电极52和第四ag-pdms电极53分别镀在ito玻璃基底层上；
49.ito玻璃基底层包括第一ito电极、第二ito电极、第三ito电极和第四ito电极；第一ito电极、第二ito电极、第三ito电极和第四ito电极作为电源线和微电极层之间的导线。
50.具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述第一通孔40、第二通孔41的宽度与第一ag-pdms电极50、第二ag-pdms电极51、第三ag-pdms电极52和第四ag-pdms电极53的宽度相同，且宽度大于所述第三通孔42以及第四通孔43宽度。本实施例中，第一通孔40、第二通孔41的宽度均为300μm，第三通孔42、第四通孔43的宽度均为20μm。
51.具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述第一ag-pdms电极50、第二ag-pdms电极51、第三ag-pdms电极52以及第四ag-pdms电极53的宽度为300μm，长度为1000μm，厚度为1μm，且ag-pdms电极间的距离为110μm；第一ag-pdms电极50通过第三通孔42与微通道层1连通并通过第一通孔40与另一侧第三ag-pdms电极52在所述微通道层形成高梯度不均匀电场；第二ag-pdms电极51通过第四通孔43与微通道层1连通并通过第二通孔41与另一侧第四ag-pdms电极53在所述微通道层1形成高梯度不均匀电场。利用非对称孔结构产生不均匀电场，微藻经过不均匀电场区域时，被极化后受到介电泳力。
52.具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述第一出液口22、第二出液口23之间设置有第一夹角30，第二出液口23、第三出液口24之间设置有第二夹角31，便于不同体积的微藻在经过多孔段后分别进入不同的出液通道；第二进液口100和微藻细胞入口101之间设置有第三夹角32，用于形成鞘液流使得微藻细胞挤压到一侧的微通道壁上；出样口之间设置有第四夹角33，便于不同脂质含量的微藻在分选后分别进入不同的出液通道。在本实施例中，所述第一夹角30和第二夹角31为45
°
，所述第三夹角32和第四夹角33为60
°
。
53.具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述微通道层1为pdms材料，采用光刻浇注工艺制作而成；所述微电极层采用ag-pdms复合材料由ag和pdms以4：1的比例搅拌而成。其制作过程包括如下步骤：
54.清洗步骤：使用流水将ito玻璃清洗干净，用高压氮气吹干；
55.压膜步骤：将负干膜抗蚀剂压在冲洗干净的ito玻璃上方；
56.曝光步骤：曝光时间为四秒；
57.显影步骤：将曝光后的玻璃底片放入na2co3溶液中进行显影，洗掉电极部分干膜，形成3d电极膜具；
58.填充步骤：使用ag-pdms复合导电材料填满3d电极膜具；
59.去膜步骤：固化后，将ito玻璃放入naoh溶液中，使得剩余的干膜破裂脱落，保留ag-pdms微电极。
60.原理如下：
61.因为小球藻的体积较于盐藻、扁藻以及塔胞藻等藻类体积小，在多孔流动分离区域所受流体惯性力不同于其他种类微藻颗粒。体积较小的小球藻颗粒在通过多孔段后最终
流入第一出液口22和第三出液口24。因为盐藻、扁藻以及塔胞藻等微藻体积大，在通过多孔段后最终流入第二出液口23，实现分离，即基于小球藻、盐藻、扁藻以及塔胞藻等微藻体积大小的一级分离。
62.在交流电场中，微藻颗粒受到的交流-介电泳力方向与所施加的正弦交流频率有关。调节所施加的交流电压信号，调节捕获频率和释放频率，频率的范围以及一个周期内捕获频率和释放频率的比例，需要根据目标藻种进行调节。同样的，本装置致力于筛选脂质含量高的微藻颗粒，由于脂质含量越高的微藻其电导率越低所受负介电泳力越大，而小球藻的脂质含量高于盐藻、扁藻以及塔胞藻等微藻颗粒。因此，脂质含量较高的小球藻受到更强的负介电泳力作用并产生更大的位移变化。在微流体通道10中的小球藻等高脂微藻受到负介电泳力作用，随着正弦交流频率的调节通过第一通孔40和第二通孔41，随着缓冲液流至第二出样口103。而在第一步未分离彻底盐藻、扁藻、塔胞藻以及含脂质较低的部分小球藻颗粒在微流体通道10中受到正介电泳力作用，随着正弦交流频率的调节通过第三通孔42和第四通孔43，随着缓冲液流至第一出样口102，实现分离，即基于小球藻、盐藻、扁藻以及塔胞藻等微藻脂质含量不同的二级分离。
63.本发明还提供了一种基于上述微藻颗粒筛选与分离装置的微藻颗粒筛选与分离方法，包括如下步骤：
64.s1、将键合后的结合多孔流动和交流-介电泳的微藻颗粒筛选与分离装置放入等离子清洗机中进行等离子清洗，提高通道的亲水性，便于液体流动；
65.s2、用导线连接电压信号发生器和第一ag-pdms电极50、第二ag-pdms电极51、第三ag-pdms电极52以及第四ag-pdms电极53，打开信号发生器开关，调整电压和频率，使微流控芯片处于工作状态；
66.s3、用注射泵在第一进液口20和第二进液口100中先后注入微藻细胞溶液和缓冲液；
67.s4、用显微镜观察微藻细胞分离效果，采用多孔流动分离装置的时候，适当调节微藻细胞溶液流速，提高一级分离效率；采用交流-介电泳分选装置的时候，适当调整电压与频率，提高二级分离效率。
68.实施例：
69.本实施例中，微藻混合溶液包含小球藻(chlorella)、盐藻(dunaliella salina)、扁藻(tetraselmis chui)以及塔胞藻(pyramimonas sp)样品。
70.具体的，经过24小时缺氮情况下培养的微藻样品溶液进入多孔流动分离区域，通过第一进液口20，在多孔段2中由于盐藻、扁藻以及塔胞藻体积较小球藻更大从而受到不同的流体惯性力。体积较小的小球藻颗粒随鞘液进入第一出液口22和第三出液口24，体积较大的盐藻、扁藻以及塔胞藻颗粒随鞘液进入第二出液口23。流入第一出液口22和第三出液口24的微藻样品汇合进入交流-介电泳分选区域的微藻细胞入口101，此时的微藻样品包括小球藻及在第一分离区域未彻底分离的盐藻、扁藻以及塔胞藻颗粒，此时样品体积接近可用介电泳进一步分离。在交流-介电泳分离区域通过调节交流电场，微藻颗粒在介电泳力的作用下实现分离并流入不同的出液口。脂质含量较高的小球藻颗粒，电导率较低，受到负介电泳力的作用，远离电场强度大的区域，随着正弦交流频率的调节通过第一通孔40和第二通孔41，随着缓冲液流至第二出样口103。未分离彻底盐藻、扁藻、塔胞藻以及含脂质较低的
部分小球藻颗粒，电导率较高，在微流体通道中受到正介电泳力作用，靠近电场强度大的区域，随着正弦交流频率的调节通过第三通孔42和第四通孔43，随着缓冲液流至第一出样口102。
71.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。