一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法。


背景技术：

2.脊髓损伤(spinal cord injuries,sci)是一种毁灭性的创伤，会导致长期残疾。sci通常是由各种意外引起的颈椎或胸椎区域的脊柱脱位或骨折引起的。可导致急性水肿或出血性挫伤，并导致损伤水平以下的运动、感觉和自主神经功能障碍。sci带来了沉重的公共卫生负担。据不完全统计，我国sci患者已超过100万，而且还在以每年12万的速度增长。
3.少突胶质祖细胞(oligodendrocyte progenitor cells,opc)是成人中枢神经系统中增殖能力最强和最分散的祖细胞群，这使得这些细胞能够对损伤做出快速反应。外伤性sci后少突胶质细胞和髓鞘丢失，影响信号有效传导，并可能影响轴突的长期健康。内源性脊髓损伤修复能力有限，患者由于缺乏有效及时的治疗或损伤程度较重而未能达到预期的治疗效果。而细胞移植治疗被认为是替换受损细胞和促进神经保护和修复最有前途的治疗手段。细胞疗法通过诱导恢复髓鞘再生和轴突生长的合适条件，随后与新神经元重新连接，提供了更新脊髓功能的可能性。lineagecell公司的一项被列为已完成的试验是1/2a期剂量递增研究，研究立体定向注射人多能干细胞(hescs)衍生的opc，在脊髓损伤后7天移植hescs衍生的opc后，髓鞘再生和运动功能恢复有显着改善。
4.目前，体外诱导hpscs产生opc的方法主要有贴壁培养和悬浮培养。贴壁培养具有天然的劣势，如难以规模化、耗费人力、换液过程中容易造成污染等。目前，悬浮培养为主要培养方式(nistor等人，glia,2005,49(3):385-396.)，但仍存在如起始诱导时细胞状态不一致、诱导过程中eb过大、诱导过程中eb不扩增等问题，从而导致生产制备hpscs衍生的opc存在不同批次差异大，甚至同一批次中opc差异大，将造成后续opc移植治疗产出不确定因素。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法，通过悬浮培养hpscs，并通过细胞筛分割法分割传代细胞，标准化了起始hpscs形成的eb的大小，直接通过诱导悬浮培养hpscs形成的eb，降低了细胞死亡，提高了细胞利用率，通过细胞筛分割法分割eb，实现了诱导分化培养过程中eb总量的扩增，最终提高了opc的产量。
6.为了实现上述目的，本发明提供了一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法，包括以下步骤：
7.步骤一：标准化制备hpscs形成的eb
8.1)将贴壁的hpscs经accutase消化为单细胞后，离心收集细胞，加入适量mtesr1完
全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中培养3～7天，对形成的eb进行传代；
9.2)离心收集eb，加入适量mtesr1完全培养基重悬eb，将悬液过35μm～80μm的细胞筛，将筛选得到的35μm～80μm的eb接种到培养瓶中继续培养3～7天，以制备大小一致的标准化的eb，根据需要可继续传代；
10.步骤二：eb向opc前体细胞分化
11.计时d0，将步骤一得到的eb使用50％egm培养基 50％gpm培养基 4ng/ml bfgf 20ng/ml egf培养1天；
12.d1，将eb使用50％egm培养 50％gpm培养基 10μm all-trans-retinoic acid 20ng/ml egf培养1天；
13.d2～8，将eb使用100％gpm培养基 10μm all-trans-retinoic acid 20ng/ml egf培养，隔天换液；
14.步骤三：eb分割与培养
15.d9～26，将eb使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；当eb较大时，可将eb通过120μm～200μm的细胞筛分割，获得120μm～200μm的eb，以产生出更多的eb，实现eb扩增；
16.步骤四：eb贴壁培养
17.步骤五：贴壁细胞酶消化后扩增培养。
18.采用上述方案，通过悬浮培养hpscs，并通过细胞筛分割法分割传代细胞，标准化了起始hpscs形成的eb的大小，直接通过诱导悬浮培养hpscs形成的eb，降低了细胞死亡，提高了细胞利用率；现有技术在诱导分化过程中存在eb形成过大而导致中心部位细胞坏死的情况，降低了细胞产量，本发明通过细胞筛分割法分割eb，减小诱导分化过程中eb过大问题；现有技术在诱导分化过程中eb数量几乎不会增加，反而由于eb过大或细胞死亡导致eb总量减少，本发明通过细胞筛分割法分割eb，实现了诱导分化培养过程中eb总量的扩增，最终提高了opc的产量。
19.进一步地，步骤四具体为：d27～33，将eb接种到包被基质的培养皿上贴壁培养，使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液。
20.进一步地，步骤五具体为：d34～40，将贴壁的细胞消化为单细胞后，扩增在包被基质的培养皿上，进行贴壁培养，使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；
21.d41，将贴壁的细胞消化为单细胞后，离心收集，加入适量冻存液进行细胞冻存。
22.进一步地，egm培养基包括以下成分：80％ko-dmem、20％kosr、1mm l-glutamine、0.1mmβ-mercaptoethanol、1％nonessential amino acids、4ng/ml bfgf；gpm培养基包括以下成分：dmem:f12、1
×
b27 supplement、25μg/ml insulin、6.3ng/ml progesterone、10μg/ml putrescin、50ng/ml sodium selenite、50μg/ml holotransferin、40ng/ml triiodothyroidin。
23.进一步地，步骤一1)和2)中细胞培养的条件具体为：接种到t25或t75培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.(1)直接将hpscs的单细胞进行诱导分化培养，存在起始细胞差异大，产生大量死细胞，形成的eb大小不一致等问题，本发明通过悬浮培养hpscs，通过细胞筛分割法传代细
胞，标准化了起始hpscs形成的eb的大小，并直接通过诱导悬浮培养hpscs形成的eb，降低了细胞死亡，提高了细胞利用率。
26.(2)现有技术在诱导分化过程中存在eb形成过大而导致中心部位细胞坏死的情况，降低了细胞产量，本发明通过细胞筛分割法分割eb，减小诱导分化过程中eb过大问题。
27.(3)现有技术在诱导分化过程中eb数量几乎不会增加，反而由于eb过大或细胞死亡导致eb总量减少，本发明通过细胞筛分割法分割eb，实现了诱导分化培养过程中eb总量的扩增，最终提高了opc的产量。
具体实施方式
28.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
29.实施例1
30.一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法，包括以下步骤：
31.步骤一：标准化制备hpscs形成的eb
32.1)将贴壁的hpscs经accutase消化为单细胞后，200g离心5分钟收集细胞，加入适量mtesr1完全培养基重悬细胞，接种到t75培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养3天，对形成的eb进行传代；
33.2)200g离心5分钟收集eb，加入适量mtesr1完全培养基重悬eb，将悬液过60μm～80μm的细胞筛，将筛选得到的60μm～80μm的eb接种到培养瓶中继续培养3天；
34.步骤二：eb向opc前体细胞分化
35.计时d0，将步骤一得到的传代eb使用50％egm培养基 50％gpm培养基 4ng/ml bfgf 20ng/ml egf培养1天；
36.d1，将eb使用50％egm培养 50％gpm培养基 10μm all-trans-retinoic acid 20ng/ml egf培养1天；
37.d2～8，将eb使用100％gpm培养基 10μm all-trans-retinoic acid 20ng/ml egf培养，隔天换液；
38.步骤三：eb分割与培养
39.d9～26，将eb使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；当eb较大时，将eb通过200μm的细胞筛分割，以产生出更多的eb，实现eb扩增；
40.步骤四：eb贴壁培养
41.d27～33，将eb接种到包被基质的培养皿上贴壁培养，使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；
42.步骤五：贴壁细胞酶消化后扩增培养
43.d41，将贴壁的细胞消化为单细胞后，离心收集，加入适量冻存液进行细胞冻存。
44.egm培养基包括以下成分：80％ko-dmem、20％kosr、1mm l-glutamine、0.1mmβ-mercaptoethanol、1％nonessential amino acids、4ng/ml bfgf；gpm培养基包括以下成分：dmem:f12、1
×
b27 supplement、25μg/ml insulin、6.3ng/ml progesterone、10μg/ml putrescin、50ng/ml sodium selenite、50μg/ml holotransferin、40ng/ml triiodothyroidin。
45.实施例2
46.一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法具体同实施例1，所不同的是：
47.步骤一：标准化制备hpscs形成的eb
48.1)将贴壁的hpscs经accutase消化为单细胞后，200g离心5分钟收集细胞，加入适量mtesr1完全培养基重悬细胞，接种到t25培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养4天，对形成的eb进行传代；
49.2)200g离心5分钟收集eb，加入适量mtesr1完全培养基重悬eb，将悬液过35μm～60μm的细胞筛，将筛选得到的35μm～60μm的eb接种到培养瓶中继续培养5天；
50.步骤三：eb分割与培养
51.d9～26，将eb使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；当eb较大时，将eb通过160μm的细胞筛分割，以产生出更多的eb，实现eb扩增。
52.实施例3
53.一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法具体同实施例1，所不同的是：
54.步骤一：标准化制备hpscs形成的eb
55.1)将贴壁的hpscs经accutase消化为单细胞后，200g离心5分钟收集细胞，加入适量mtesr1完全培养基重悬细胞，接种到t25培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养7天，对形成的eb进行传代；
56.2)200g离心5分钟收集eb，加入适量mtesr1完全培养基重悬eb，将悬液过35μm～55μm的细胞筛，将筛选得到的35μm～55μm的eb接种到培养瓶中继续培养5天；
57.步骤三：eb分割与培养
58.d9～26，将eb使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；当eb较大时，将eb通过140μm的细胞筛分割，以产生出更多的eb，实现eb扩增。
59.实施例4
60.一种制备人多能干细胞衍生的少突胶质祖细胞的方法具体同实施例1，所不同的是：
61.步骤一：标准化制备hpscs形成的eb
62.1)将贴壁的hpscs经accutase消化为单细胞后，200g离心5分钟收集细胞，加入适量mtesr1完全培养基重悬细胞，接种到t75培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养6天，对形成的eb进行传代；
63.2)200g离心5分钟收集eb，加入适量mtesr1完全培养基重悬eb，将悬液过35μm～45μm的细胞筛，将筛选得到的35μm～45μm的eb接种到培养瓶中继续培养7天；
64.步骤三：eb分割与培养
65.d9～26，将eb使用100％gpm培养基 20ng/ml egf培养，隔天换液；当eb较大时，将eb通过120μm的细胞筛分割，以产生出更多的eb，实现eb扩增。
66.对比例1
67.具体同实施例1，所不同的是：步骤一的2)中的eb未经过细胞筛筛选。
68.对比例2
69.具体同实施例1，所不同的是：步骤一的2)中以吹打的方式将eb分散；步骤三中当eb较大时，采用吹打的方式来分散连结在一起的细胞团。
70.对比例3
71.具体同实施例1，所不同的是：步骤一具体为：将贴壁的hpscs经accutase消化为单细胞后，离心收集细胞，将收集得到的细胞进行后续步骤二～步骤五操作。
72.试验例1起始诱导形成eb的成功率和opc产量测试
73.测试实施例1和对比例1-3的步骤一诱导形成的eb的成功率，具体结果见表1。
74.表1实施例1和对比例1-3的步骤一诱导形成的eb的成功率
75.试验组步骤一诱导形成的eb的成功率实施例1100％对比例185％对比例292％对比例360％
76.由表1数据可知，实施例1的步骤一诱导形成的eb的成功率为100％，显著高于对比例1-3，说明采用实施例1的hpscs经悬浮培养后诱导的方法能够提高起始诱导形成eb的成功率。
77.对实施例1和对比例1-3制备的opc的产量进行测试，具体结果见表2。
78.表2实施例1和对比例1-3制备的opc的产量
79.试验组制备的opc的产量实施例1200％对比例1140％对比例2165％对比例3100％
80.注：实施例1和对比例1-2制备的opc的产量以对比例3制备的opc产量为基准计算。
81.由表2数据可知，对比例3采用了hescs的单细胞直接诱导为opc的方法，实施例1制备的opc的产量相对于对比例3提高至200％，说明本发明实施例1提供的方法能够显著提高opc的产量，这是由于实施例1通过细胞筛的方法可以有效分散直径大于200μm的eb，同时不损伤200μm以下的eb，步骤三通过细胞筛分割后可以提高约50％的eb总量；对比例1和对比例2制备的opc的产量明显低于对比例1，这是由于未经过细胞筛筛选的eb容易聚集成细胞团不利于后续eb细胞的分化，通过吹打的方式来分散eb易造成eb解体或者吹打不完全，降低了eb的总量，且难以实现标准化。
82.实施例2-4也进行了上述相应的对比试验，其结果与实施例1、对比例1-3得到的结果相似。
83.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
84.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。