一种利用黑曲霉发酵液提高纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物产量的方法与流程

1.本发明涉及纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物的制备方法，特别涉及一种利用黑曲霉 发酵液提高纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物产量的方法。


背景技术：

2.表面活性素是一类具有广泛生物活性的细菌脂肽，由七个氨基酸和一个长链脂肪酸 链构成，其中脂肪酸链长度的不同形成了多种同系物。从野生型纳豆芽孢杆菌中发现的 三个表面活性素同系物nt-5，nt-6和nt-7表现出很好的抗菌活性，同时具有低毒、可 生物降解、不污染环境等特点，在食品防腐、替代抗生素、生态养殖、生防农业等方面， 应用潜能巨大。该菌株的表面活性素同系物产量较低，生产成本较高。共培养发酵，能 够激活微生物活性次级代谢产物的表达，提高活性产物的产量，但是通过真菌发酵液提 升细菌表面活性素同系物产量的研究尚未报道。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明的目的是提供一种产量高的利用黑曲霉(cicc：40294)发酵 液提高纳豆芽孢杆菌(cctcc no：m2019479)表面活性素同系物产量的方法。纳豆 芽孢杆菌的保藏编号：cctcc no：m2019479，时间：2019-06-21，保藏单位：中国 典型培养物保藏中心，分类号：bacillus subtilis natto zypnd2019，地址：中国，武汉， 武汉大学。
4.技术方案：本发明所述的利用黑曲霉发酵液提高纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物产 量的方法，包括如下步骤：将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.2～0.4的接种密度 接入发酵培养基中，通气量0.12～0.17vvm，搅拌桨叶尖线速度2.1～2.7m/s；发酵7～9h 后，通气量降为0.75～1.0vvm，搅拌桨叶尖线速度降为1.2～1.8m/s rpm；按1/40倍稀 释发酵液，其od
600
超过0.8～1.0时，按2％～10％量加入黑曲霉发酵液，持续发酵，即 得产品。
5.进一步地，得到的表面活性素同系物产品为nt-5、nt-6和nt-7。所述黑曲霉发酵 液的制备：利用平板培养法，在pda培养基上活化黑曲霉；划取含菌体和孢子的培养 基方块接种培养。所述发酵培养基配方：葡萄糖8～12g/l，海藻糖8～12g/l，酵母粉3～7 g/l，大豆蛋白胨8～12g/l，mgso4·
7h2o 1.0～3.0g/l，mnso4·
4h2o 0.01～0.03g/l， znso4·
7h2o 0.01～0.03g/l，余量为水，初始ph 7.0～7.6。
6.进一步地，方块大小为1cm
×
1cm，按3块/100ml接种培养，使用pdb培养基， 培养温度28℃，转速150rpm，培养时间7d。
7.进一步地，纳豆芽孢杆菌种子是在种子培养基培养获得，培养温度36℃，转速200 rpm，培养时间6h。纳豆芽孢杆菌种子培养基(g/l)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5， ph 7.0，余量为水。
8.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：利用黑曲霉发酵液诱导纳豆芽 孢杆菌发酵过程中活性代谢产物的表达，使三种表面活性素同系物nt-5，nt-6和nt-7 产量
相对对照组提高6～11倍。
附图说明
9.图1为表面活性素及其同系物结构图；
10.图2为实施例1高效液相色谱图与色谱峰信息；
11.图3为对照组1高效液相色谱图与色谱峰信息；
12.图4为实施例2高效液相色谱图与色谱峰信息；
13.图5为对照组2高效液相色谱图与色谱峰信息；
14.图6为实施例3高效液相色谱图与色谱峰信息；
15.图7为对照组3高效液相色谱图与色谱峰信息。
具体实施方式
16.实施例1
17.(1)一种利用黑曲霉发酵液提高纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物产量的方法，包括如 下步骤：将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.4的接种密度接入发酵罐内，通气量 0.17vvm，搅拌桨叶尖线速度2.1m/s，罐压0.1mpa；发酵8h后，通气量降为0.10vvm， 搅拌桨叶尖线速度降低至1.5m/s；按1/40倍稀释发酵液，其od
600
超过1.0时，按10％ 量加入黑曲霉发酵液，持续发酵至24h后下罐，得到含有表面活性素同系物nt-5，nt-6 和nt-7的发酵液。
18.(2)发酵培养基配方：葡萄糖10g/l，海藻糖10g/l，酵母粉5g/l，大豆蛋白胨10g/l， mgso4·
7h2o 1.0g/l，mnso4·
4h2o 0.01g/l，znso4·
7h2o 0.01g/l，余量为水，初始ph 7.0。
19.(3)表面活性素同系物nt-5产量为171.4mg/l，nt-6产量为263.1mg/l，nt-7产量 为566.4mg/l。
20.(4)对照组1
21.(5)将将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.4的接种密度接入发酵罐内，通气量 0.17vvm，搅拌桨叶尖线速度2.1m/s，罐压0.1mpa；发酵8h后，通气量降为0.10vvm， 搅拌桨叶尖线速度降低至1.5m/s，持续发酵至24h后下罐，得到含有表面活性素同系 物nt-5，nt-6和nt-7的发酵液。
22.(6)表面活性素同系物nt-5产量为15.4mg/l，nt-6产量为33.5mg/l，nt-7产量为 90.2mg/l。
23.实施例2
24.(1)一种利用黑曲霉发酵液提高纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物产量的方法，包括如 下步骤：将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.3的接种密度接入发酵罐内，通气量 0.12vvm，搅拌桨叶尖线速度2.4m/s，罐压0.1mpa；发酵7h后，通气量降为0.75vvm， 搅拌桨叶尖线速度降低至1.2m/s；按1/40倍稀释发酵液，其od
600
超过0.9时，按5％ 量加入黑曲霉发酵液，持续发酵至24h后下罐，得到含有表面活性素同系物nt-5，nt-6 和nt-7的发酵液。
25.(2)发酵培养基配方：葡萄糖8g/l，海藻糖8g/l，酵母粉3g/l，大豆蛋白胨8g/l， mgso4·
7h2o 2.0g/l，mnso4·
4h2o 0.02g/l，znso4·
7h2o 0.02g/l，余量为水，初始ph 7.6。
26.(3)表面活性素同系物nt-5产量为61.1mg/l，nt-6产量为175.7mg/l，nt-7产量为 359.9mg/l。
27.(4)对照组2
28.(5)将将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.3的接种密度接入发酵罐内，通气量 0.12vvm，搅拌桨叶尖线速度2.4m/s，罐压0.1mpa；发酵7h后，通气量降为0.75vvm， 搅拌桨叶尖线速度降低至1.2m/s，持续发酵至24h后下罐，得到含有表面活性素同系 物nt-5，nt-6和nt-7的发酵液。
29.(6)表面活性素同系物nt-5产量为7.6mg/l，nt-6产量为20.6mg/l，nt-7产量为 371.9mg/l。
30.实施例3
31.(1)一种利用黑曲霉发酵液提高纳豆芽孢杆菌表面活性素同系物产量的方法，包括如 下步骤：将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.2的接种密度接入发酵罐内，通气量 0.15vvm，搅拌桨叶尖线速度2.7m/s，罐压0.1mpa；发酵9h后，通气量降为0.8vvm， 搅拌桨叶尖线速度降低至1.8m/s；按1/40倍稀释发酵液，其od
600
超过0.8时，按2％ 量加入黑曲霉发酵液，持续发酵至24h后下罐，得到含有表面活性素同系物nt-5，nt-6 和nt-7的发酵液。
32.(2)发酵培养基配方：葡萄糖12g/l，海藻糖12g/l，酵母粉7g/l，大豆蛋白胨12g/l， mgso4·
7h2o 3.0g/l，mnso4·
4h2o 0.03g/l，znso4·
7h2o 0.03g/l，余量为水，初始ph 7.4。
33.(3)表面活性素同系物nt-5产量为47.3mg/l，nt-6产量为134.6mg/l，nt-7产量为 345.2mg/l。
34.(4)对照组3
35.(5)将将纳豆芽孢杆菌种子按生物量od
600
为0.2的接种密度接入发酵罐内，通气量 0.15vvm，搅拌桨叶尖线速度2.7m/s，罐压0.1mpa；发酵9h后，通气量降为0.8vvm， 搅拌桨叶尖线速度降低至1.8m/s，持续发酵至24h后下罐，得到含有表面活性素同系 物nt-5，nt-6和nt-7的发酵液。
36.(6)表面活性素同系物nt-5产量为5.3mg/l，nt-6产量为18.3mg/l，nt-7产量 为54.9mg/l。