肺及肺癌组织培养方法及用其构建肺癌小鼠动物模型方法与流程

1.本发明属于肺及肺癌组织培养技术领域，尤其涉及一种肺及肺癌组织培养方法及用其构建肺癌小鼠动物模型方法。


背景技术：

2.目前，肺癌的临床表现比较复杂，症状和体征的有无、轻重以及出现的早晚，取决于肿瘤发生部位、病理类型、有无转移及有无并发症，以及患者的反应程度和耐受性的差异。肺癌早期症状常较轻微，甚至可无任何不适。中央型肺癌症状出现早且重，周围型肺癌症状出现晚且较轻，甚至无症状，常在体检时被发现。肺癌的症状大致分为：局部症状、全身症状、肺外症状、浸润和转移症状。然而，现有肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法对获取的肺组织及肺癌组织体外培养效果差；同时，由于小鼠肿瘤基因组研究结果距离直接用于指导人类肿瘤基因组学研究还有较大距离；而细胞系移植瘤模型则局限于细胞系与人源肿瘤细胞从基因及生物学功能等方面差异；pdx模型(人源肿瘤异种移植模型,patient-derived tumorxenograft模型)，将病人的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立的，在组织病理学、分子生物学和基因水平上保留了大部分原代肿瘤的特点、具有较好的临床疗效预测性。虽然部分弥补了上述两种模型的缺陷，且也是当前较为流行的研究人源肿瘤生物学特征或药物筛选及鉴定的主要方法，但仍存在局限，由于皮下移植的原因，传统pdx模型无法提供肺组织原位微环境，进而可能导致人源肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失，无法模拟人体内的情况。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
4.(1)现有肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法对获取的肺组织及肺癌组织体外培养效果差；同时，由于小鼠肿瘤基因组研究结果距离直接用于指导人类肿瘤基因组学研究还有较大距离；而细胞系移植瘤模型则局限于细胞系与人源肿瘤细胞从基因及生物学功能等方面差异.
5.(2)pdx模型虽然部分弥补了上述两种模型的缺陷，且也是当前较为流行的研究人源肿瘤生物学特征或药物筛选及鉴定的主要方法，但仍存在局限，由于皮下移植的原因，传统pdx模型无法提供肺组织原位微环境，进而可能导致人源肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失，无法模拟人体内的情况。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肺及肺癌组织培养方法及用其构建肺癌小鼠动物模型方法。
7.本发明是这样实现的，一种肺及肺癌组织培养方法，所述肺及肺癌组织培养方法包括以下步骤：
8.步骤一，获取人源肺癌组织并进行预处理：获取新鲜的人源肺癌组织；在冰上剪碎或同等低温环境剪碎或同等低温环境机械破碎后，得人源肺癌组织块；利用蛋白酶溶解液
将所述人源肺癌组织块裂解为人源肺癌组织单细胞；
9.步骤二，进行肺癌组织类器官模型的构建：将所述人源肺癌组织单细胞与基质胶混匀后置于培养箱进行固化及三维培养，建立肺癌组织类器官模型；
10.步骤三，进行人源肺癌组织单细胞的克隆培养：采用促克隆培养基和基质胶对所述人源肺癌组织单细胞进行克隆培养，得到克隆培养产物；取出所述克隆培养产物中的克隆细胞进行扩增培养，建立肺癌信息数据库；
11.步骤四，进行肺癌细胞类器官库的构建：冻存所述肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库，复苏所述肺癌细胞类器官并重新培养。
12.进一步，所述步骤一中的人源肺癌组织采用低温存储的方式进行运输。
13.进一步，所述步骤一中的利用蛋白酶溶解液将所述人源肺癌组织块裂解为人源肺癌组织单细胞包括：
14.(1)清洗所述人源肺癌组织；
15.(2)将所述人源肺癌组织切碎并与所述蛋白酶溶解液混合并置培养箱中培养，并通过70μm细胞过滤器过滤得到单细胞悬液；
16.(3)将所述单细胞悬液离心去上清液后收集单细胞混合液；其中，所述单细胞包括正常人源肺细胞和人源肺癌细胞。
17.进一步，所述离心温度为2～8℃，200～400g单细胞悬液离心10～15min。
18.进一步，所述步骤二中的肺癌组织类器官模型的构建包括：
19.(1)将所述单细胞混合液与基质胶均匀混合后，得混合细胞液；
20.(2)将所述混合细胞液倒入培养板孔并置于培养箱中固化得到三维结构；
21.(3)将所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于所述二氧化碳培养箱中培养，构建得到肺癌组织类器官模型。
22.进一步，所述置于所述二氧化碳培养箱中进行培养的温度为35～37℃，所述培养时间为24～36h。
23.进一步，所述步骤三中的肺癌信息数据库的建立包括：
24.(1)采用扩增培养基和基质胶对所述克隆细胞进行第一扩增培养，得到扩增培养产物；
25.(2)将所述扩增培养产物进行第一分离处理，得到扩增细胞；
26.(3)采用所述扩增培养基对所述扩增细胞进行第二扩增培养，并建立肺癌信息数据库。
27.进一步，所述步骤四中的冻存所述肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库包括：
28.去除所述肺组织器官培养基并冲洗所述单细胞后，进行离心去上清液，收集细胞冻存液；将所述细胞冻存液重悬后倒入冻存管中；将所述冻存管放入程序降温盒保存一段时间后，将所述冻存管转移至液氮中长期存储。
29.进一步，所述将所述冻存管放入程序降温盒在-80℃保存24h。
30.本发明的另一目的在于提供一种应用所述肺及肺癌组织培养方法的构建肺癌小鼠动物模型方法，所述构建肺癌小鼠动物模型方法包括：
31.(1)获取新鲜的人源肺癌组织，胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合后在48孔板中
使用条件培养基培养，得到人肺癌组织类器官；
32.(2)将人肺癌组织类器官，原位注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中，得到人源、原位肺癌的小鼠动物模型；
33.(3)通过注射将人肺癌组织注射到免疫缺陷的小鼠肺组织，构建动物模型。
34.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过肺及肺癌组织培养方法能够成功的培养出大量与来源器官遗传角度高度一致的体外培养细胞，并进行长期保存，培养效果好，对肺组织器官和肺癌发展的研究提供有利工具，能够有助于更深入地了解人类发展，以及为制定疾病建模、药物发现和再生医学提供新的视角；同时，通过构建肺癌小鼠动物模型方法基于体外3d培养技术培养的大量的高度一致性的肺癌类器官进行原位注射，体外3d培养的肺癌组织细胞具有较高的活性，在原位注射以后可以分化形成人源、原位肺肿瘤，非常接近人体内肺癌发生情况，可以更好的应用于肺癌研究工作。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1是本发明实施提供的肺及肺癌组织培养方法流程图。
37.图2是本发明实施提供的利用蛋白酶溶解液将所述人源肺癌组织块裂解为人源肺癌组织单细胞的方法流程图。
38.图3是本发明实施提供的肺癌组织类器官模型的构建方法流程图。
39.图4是本发明实施提供的肺癌信息数据库的建立方法流程图。
40.图5是本发明实施提供的构建肺癌小鼠动物模型方法流程图。
具体实施方式
41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
42.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肺及肺癌组织培养方法及用其构建肺癌小鼠动物模型方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
43.如图1所示，本发明实施例提供的肺及肺癌组织培养方法包括以下步骤：
44.s101，获取人源肺癌组织并进行预处理：获取新鲜的人源肺癌组织；在冰上剪碎或同等低温环境剪碎或同等低温环境机械破碎后，得人源肺癌组织块；利用蛋白酶溶解液将所述人源肺癌组织块裂解为人源肺癌组织单细胞；
45.s102，进行肺癌组织类器官模型的构建：将所述人源肺癌组织单细胞与基质胶混匀后置于培养箱进行固化及三维培养，建立肺癌组织类器官模型；
46.s103，进行人源肺癌组织单细胞的克隆培养：采用促克隆培养基和基质胶对所述人源肺癌组织单细胞进行克隆培养，得到克隆培养产物；取出所述克隆培养产物中的克隆
细胞进行扩增培养，建立肺癌信息数据库；
47.s104，进行肺癌细胞类器官库的构建：冻存所述肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库，复苏所述肺癌细胞类器官并重新培养。
48.本发明实施例提供的步骤s101中的人源肺癌组织采用低温存储的方式进行运输。
49.如图2所示，本发明实施例提供的步骤s101中的利用蛋白酶溶解液将所述人源肺癌组织块裂解为人源肺癌组织单细胞包括：
50.s201，清洗所述人源肺癌组织；
51.s202，将所述人源肺癌组织切碎并与所述蛋白酶溶解液混合并置培养箱中培养，并通过70μm细胞过滤器过滤得到单细胞悬液；
52.s203，将所述单细胞悬液离心去上清液后收集单细胞混合液；其中，所述单细胞包括正常人源肺细胞和人源肺癌细胞。
53.本发明实施例提供的离心温度为2～8℃，200～400g单细胞悬液离心10～15min。
54.如图3所示，本发明实施例提供的步骤s102中的肺癌组织类器官模型的构建包括：
55.s301，将所述单细胞混合液与基质胶均匀混合后，得混合细胞液；
56.s302，将所述混合细胞液倒入培养板孔并置于培养箱中固化得到三维结构；
57.s303，将所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于所述二氧化碳培养箱中培养，构建得到肺癌组织类器官模型。
58.本发明实施例提供的置于所述二氧化碳培养箱中进行培养的温度为35～37℃，所述培养时间为24～36h。
59.如图4所示，本发明实施例提供的步骤s103的肺癌信息数据库的建立包括：
60.s401，采用扩增培养基和基质胶对所述克隆细胞进行第一扩增培养，得到扩增培养产物；
61.s402，将所述扩增培养产物进行第一分离处理，得到扩增细胞；
62.s403，采用所述扩增培养基对所述扩增细胞进行第二扩增培养，并建立肺癌信息数据库。
63.本发明实施例提供的步骤s104中的冻存所述肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库包括：
64.去除所述肺组织器官培养基并冲洗所述单细胞后，进行离心去上清液，收集细胞冻存液；将所述细胞冻存液重悬后倒入冻存管中；将所述冻存管放入程序降温盒保存一段时间后，将所述冻存管转移至液氮中长期存储。
65.本发明实施例提供的将所述冻存管放入程序降温盒在-80℃保存24h。
66.如图5所示，本发明实施例提供的构建肺癌小鼠动物模型方法包括：
67.s501，获取新鲜的人源肺癌组织，胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合后在48孔板中使用条件培养基培养，得到人肺癌组织类器官；
68.s502，将人肺癌组织类器官，原位注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中，得到人源、原位肺癌的小鼠动物模型；
69.s503，通过注射将人肺癌组织注射到免疫缺陷小鼠肺组织，构建动物模型。
70.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所
作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。