FGFR4/PD-1组合治疗的制作方法

fgfr4/pd-1组合治疗
技术领域
1.本发明涉及可用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症的组合疗法。具体地，本发明涉及包含pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼(fisogatinib,即fgfr4抑制剂)的组合疗法。


背景技术：

2.免疫疗法是治疗过度增殖性障碍的一种方法。科学家和临床医生在开发各种类型的癌症免疫疗法中遇到的主要障碍是破坏自体抗原(癌症)的耐受性，以便增强导致肿瘤消退的强有力的抗肿瘤反应。与靶向肿瘤的小和大分子试剂的传统开发不同，癌症免疫疗法靶向具有生成效应细胞记忆库的潜能的免疫系统细胞，以诱导更持久的效应并使复发最小化。
3.程序性死亡1(pd-1)受体和pd-1配体1和2(分别为pd-l1和pd-l2)在免疫调节中发挥着不可或缺的作用。在活化t细胞上表达的pd-1被基质细胞、肿瘤细胞、或这两者表达的pd-l1(也称为b7-h1)和pd-l2活化，从而引发t细胞死亡和局部免疫抑制，潜在地提供肿瘤发展和生长的免疫耐受环境。相反地，抑制这种相互作用可增强局部t细胞反应，并且在非临床动物模型中介导抗肿瘤活性。
4.来自临床前和临床结果的越来越多的证据表明，靶向免疫检查点正成为治疗癌症患者的最具前景的方法。程序性细胞死亡分子1是免疫检查点蛋白之一，其在限制t细胞活性中发挥着主要的作用，其提供肿瘤细胞可借此逃避免疫监视的主要免疫抗性机制。活化t细胞上表达的pd-1与肿瘤细胞上表达的pd-l1的相互作用负性调节免疫反应并减弱抗肿瘤免疫。肿瘤上pd-l1的表达与食道癌、胰腺癌和其他类型的癌症中降低的存活相关联，强调了该途径是肿瘤免疫疗法的新的具前景性的靶标。
5.目前的晚期肝细胞癌(hcc)疗法作用不大。虽然免疫疗法具有引发无毒、全身、长期存在的抗肿瘤活性的潜能，但事实上hcc存在若干独特特性限制了基于免疫的疗法的效力。特别地，基于免疫的疗法在hcc中最具挑战性的障碍是肝的独特免疫生物学。处于健康和患病状态的肝均具有过多的维持肝的免疫抑制环境并充当有效hcc免疫疗法的障碍的调节机制(oncoimmunology 1:1,48-55；2012年1月/2月)。最近，意料不到地发现，wo2015/061572中所述的非索替尼具有免疫调节能力。具体地，发现非索替尼下调免疫基因ccl20并诱导t细胞浸润，这使得其能够高度抵消存在于hcc及其他癌症中的免疫抑制机制。因此，非索替尼是与pd-1轴结合拮抗剂组合使用的有吸引力的药剂。
6.虽然在癌症的治疗中取得许多最新进展，但仍然需要对遭受癌症效应的个体进行更有效和/或增强的治疗。本文的组合和方法解决了这一需求，所述组合和方法涉及将用于增强抗肿瘤免疫的治疗方法组合。


技术实现要素：

7.本发明涉及用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症的组合治疗方案。
8.本文提供了使用包含pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼的组合疗法来治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症的方法，所述pd-1轴结合拮抗剂阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用。
9.在一些实施方案中，所述方法包括向受试者给药组合疗法，该组合疗法包含药学上有效量的抗体以及药学上有效量的非索替尼，所述抗体阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用。在一些实施方案中，所述病症是免疫相关疾病或病症、肿瘤、癌症或慢性病毒感染。
10.本文还提供了pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼的组合，其用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症，特别是用于治疗癌症，所述pd-1轴结合拮抗剂阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用。在一些实施方案中，本发明提供了包含pd-1轴结合拮抗剂的组合物、药物或药剂，所述pd-1轴结合拮抗剂用于与非索替尼组合以治疗癌症。在一些实施方案中，本发明提供了包含非索替尼的组合物、药物或药剂，该非索替尼用于与pd-1轴结合拮抗剂组合以治疗癌症。
11.本文还提供了pd-1轴结合拮抗剂(如阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用的抗体)和非索替尼在制造用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症，特别是用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，药物包含试剂盒，并且试剂盒还包含包装插页，该包装插页包含使用pd-1轴结合拮抗剂与非索替尼的组合治疗受试者中的癌症的说明书。
12.其他实施方案提供了pd-1轴结合拮抗剂当与非索替尼组合给药时在制造治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及非索替尼当与pd-1轴结合拮抗剂组合给药时在制造治疗受试者中的癌症的药物中的用途。
13.还提供了试剂盒，该试剂盒包含第一容器、第二容器和包装插页，其中第一容器包含至少一个剂量的包含pd-1轴结合拮抗剂的药物，第二容器包含至少一个剂量的包含非索替尼的药物，并且包装插页包含使用所述药物治疗受试者的说明书。
14.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂可选自pd-1结合拮抗剂、pd-l1结合拮抗剂和pd-l2结合拮抗剂；优选地，其是抗体或其抗原结合片段；优选地，所述抗体是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、或它们的组合；更优选地，所述抗体是抗pd-l1抗体；最优选地，所述抗pd-l1抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合pd-l1并阻断pd-l1与pd-1的结合。
15.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39和41的重链cdr序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含选自seq id no:7、9、11、19、21、23、31、33和35的轻链cdr序列。包括选自seq id no:1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39和41的重链cdr序列，以及选自seq id no:7、9、11、19、21、23、31、33和35的轻链cdr序列的所有序列也公开于cn106432501a中(其以引用方式并入本文作为本技术的公开内容的一部分)。
16.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区：
17.a)包含seq id no:1、seq id no:3和/或seq id no:5的重链可变区；
18.b)包含seq id no:13、seq id no:15和/或seq id no:17的重链可变区；
19.c)包含seq id no:25、seq id no:27和/或seq id no:29的重链可变区；以及
20.d)包含seq id no:37、seq id no:39和/或seq id no:41的重链可变区。
21.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含选自以下的轻链可变区：
22.a)包含seq id no:7、seq id no:9和/或seq id no:11的轻链可变区；
23.b)包含seq id no:19、seq id no:21和/或seq id no:23的轻链可变区；以及
24.c)含seq id no:31、seq id no:33和/或seq id no:35的轻链可变区。
25.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:47的重链可变区；和包含seq id no:49轻链可变区；以及非索替尼。
26.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，所述受试者是人类；优选地，所述受试者已接受至少一轮先前疗法；更优选地，所述受试者具有上调的pd-l1表达。
27.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，先前疗法是手术切除、移植、局部区域疗法(包括但不限于冷冻疗法、放射栓塞术、放射疗法、外照射放射、经动脉化疗栓塞术(tace)、经动脉栓塞术(tae)、微波热疗、激光消融、射频消融(rfa)、经皮肝内化疗给药和经皮乙醇注射(pei))、全身疗法(包括但不限于化疗(例如细胞毒素剂)、靶向疗法(通过靶向癌症的特定基因、蛋白质、或促进癌症生长和/或存活的组织环境而起作用的药剂)、免疫疗法(如：检查点抑制剂(免疫刺激剂、免疫阻断剂)、过继性细胞转移、单克隆抗体、治疗疫苗、细胞因子、卡介苗)、激素疗法(减缓或妨碍利用激素生长的癌症的生长的药剂)，以及化学疗法、靶向疗法、免疫肿瘤学疗法、激素疗法或局部区域疗法的任何组合)，和/或最佳支持性治疗(best supportive care)。
28.在以上方法、用途、组合、组合物、药物或试剂盒的一些实施方案中，所述病症是免疫相关疾病或病症、肿瘤、癌症或慢性病毒感染。在一些实施方案中，所述病症是癌症，特别地，所述癌症是实体瘤或血癌。在一些实施方案中，所述癌症是复发的或转移性的，是局部晚期的和/或转移性的或复发性的或难治性的。
29.在以上方法、组合、组合物、药物、用途或试剂盒的一些实施方案中，所述pd-1轴结合拮抗剂例如以约150mg、约500mg、或约1500mg的剂量配制为液体药物，尤其是注射剂；并且非索替尼例如以约300mg、约400mg、或约600mg的剂量尤其配制为片剂。在一些实施方案中，所述pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼以任一次序依次给药或同时地给药。
30.在以上方法、组合、组合物、药物、用途或试剂盒的一些实施方案中，所述pd-1轴结合拮抗剂在治疗周期期间每三周以约1200mg的剂量给药一次。
31.在以上方法、组合、组合物、药物、用途或试剂盒的一些实施方案中，非索替尼在治疗周期期间每天以约300mg、约400mg、或约600mg的剂量给药一次。
附图说明
32.图1是一系列两个曲线图。图1a显示当用递增浓度的非索替尼治疗时各种人类肝细胞癌细胞系产生的ccl20，并且图1b显示细胞fgf19表达与这些细胞系的ccl20产生或输出的相关性。
33.图2是显示用非索替尼(blu-554)治疗降低了jhh7和hep3b上清液对调节性t细胞
(treg)的趋化性的曲线图。
34.图3a是一系列两个曲线图，它们显示在用和不用非索替尼(blu-554)治疗的免疫缺陷jhh7异种移植模型中肿瘤体积随时间推移而变化的百分比。
35.图3b是一系列两个曲线图，它们显示在用和不用非索替尼(blu-554)治疗的免疫感受态(immune competent)jhh7异种移植模型中肿瘤体积随时间推移变化的百分比。组合的数据显示，虽然非索替尼可在免疫缺陷环境中诱导肿瘤停滞，但其抗肿瘤效应在完整免疫系统的存在下更强，导致肿瘤收缩。
36.图4显示非索替尼治疗诱导jhh7肿瘤的t细胞浸润。
37.图5是显示在用非索替尼(blu-554)体外治疗后几种免疫基因在细胞中被调节的火山图。
38.图6是显示在rhifn-γ预治疗的hep-3b中，非索替尼和/或抗pd-l1抗体ab-1(单一或组合)表现出显著增强的pbmc介导的肿瘤杀伤效力的曲线图。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
具体实施方式
39.提供以下公开内容和示例性实施方案，以使得本领域的普通技术人员能够制造和使用本发明。实施方案的各种修改形式对于本领域的技术人员将显而易见，且本文的一般原理可应用于其它实施方案。因此，本发明并不旨在限于所示的实施方案，而是符合与本文所述的原理和特征一致的最宽范围。
40.i.定义
41.为了更容易地理解本发明，下面具体定义一些技术和科学术语。除非在本文档的别处明确定义，否则本文使用的所有其他技术术语和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
[0042]“约”在用于修饰数值上定义的参数(例如，pd-1轴结合拮抗剂或非索替尼的剂量，或本文所述的组合疗法的治疗时间长度)时意指该参数可在该参数的所述数值以下或以上变化多达10％。例如，约5mg/kg的剂量可以在4.5mg/kg与5.5mg/kg之间变化。
[0043]
如本文(包括所附权利要求书)所用，词语的单数形式(如“一个”、“一种”和“所述”)包括其对应的复数指代，除非上下文另有明确规定。
[0044]
如在整个说明书和权利要求书中所用，“基本上由
……
组成(consists essentially of)”和变型形式如“基本上由
……
组成(consist essentially of)”或“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”指示包括任何列举的要素或要素组，并且任选包括与列举的要素类似或不同性质的其他要素，这些要素不实质上改变指定的剂量方案、方法、或组合物的基本或新颖特性。作为非限制性实例，基本上由所列举氨基酸序列组成的pd-1轴结合拮抗剂还可包括一个或多个氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的置换，其不实质上影响结合化合物的特性。
[0045]“患者”或“受试者”是指期望疗法或参与临床试验、流行病学研究或用作对照的任何单个受试者，包括任何生物体，优选地动物，更优选地人类和哺乳动物兽医学患者，如大鼠、小鼠、兔、牛、马、狗和猫。
[0046]“给药”在应用于动物、人类、实验受试者、细胞、组织、器官、或生物流体时，是指使
外源性药物、治疗剂、诊断剂、或组合物与动物、人类、受试者、细胞、组织、器官、或生物流体进行接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触；以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。“给药”还意指通过试剂、诊断剂、结合化合物，或者通过另一细胞例如在体外和离体处理细胞。
[0047]
病症的“治疗”或“疗法”包括预防或缓和病症、降低病症出现或发展的速率、降低发展病症的风险、预防或延迟与病症相关联的症状的发展、减少或终止与病症相关联的症状、产生病症的完全或部分逆转、治愈病症、或上述的组合。
[0048]
对于癌症，“治疗”或“疗法”可指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞的生长、繁殖、或转移、或上述的一些组合。对于肿瘤，“治疗”或“疗法”包括清除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤进展、或上述的一些组合。
[0049]
如本文所用，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”癌症意指将pd-l1拮抗剂和另一种治疗剂的组合疗法给药于患有癌症或诊断患有癌症的受试者，以实现至少一种积极治疗效果，如例如癌细胞数目减少、肿瘤尺寸减小、癌细胞在周围器官中浸润率减小、或肿瘤转移或肿瘤生长的速率减小。癌症的积极治疗效果能够以多种方式测量(参见w.a.weber,j.nucl.med.50:1 s-10s(2009))。
[0050]
在一些实施方案中，由本发明的组合实现的治疗是部分反应(pr)、完全反应(cr)、总体反应(or)、无进展生存率(pfs)、无病生存率(dfs)和总生存率(os)中的任一种。pfs，也称为“肿瘤进展时间”，指示治疗期间和之后癌症不生长的时间长度，并且包括患者经历cr或pr的时间量，以及患者经历稳定疾病(sd)的时间量。dfs是指治疗期间和之后患者保持无疾病的时间长度。os是指与从未接受过治疗或未经治疗的受试者或患者相比预期寿命延长。在一些实施方案中，对本发明的组合的反应是pr、cr、pfs、dfs、or、或os中的任一种，其使用实体瘤疗效反应评价标准(response evaluation criteria in solid tumors，recist)1.1反应标准来评估。
[0051]
有效治疗癌症患者的本发明组合的治疗方案可根据如患者的疾病状态、年龄和体重，以及疗法在受试者中引发抗癌反应的能力等因素而变化。虽然本发明的任何方面的实施方案可能无法有效地在每一个受试者中实现积极治疗效果，但其应当在统计上显著数量的受试者中实现，如通过本领域已知的任何统计测试所确定，如学生氏t检验、chi2检验、根据mann和whitney的u检验、kruskal-wallis检验(h检验)、jonckheere-terpstra检验以及wilcoxon检验。
[0052]
如本文所用，“治疗”是获得有益或期望临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减少(或破坏)赘生性或癌性细胞的增殖，抑制赘生性细胞的转移，缩小或减小肿瘤尺寸，缓解免疫相关疾病(例如，pd-l1相关联的疾病、癌症)，减少由免疫相关疾病(例如，癌症)引起的症状，提高遭受免疫相关疾病(例如，癌症)的那些患者的生活质量，减少治疗免疫相关疾病(例如，癌症)所需的其他药物的剂量，延迟免疫相关疾病(例如，癌症)的进展，治愈免疫相关疾病(例如，癌症)，和/或延长患有免疫相关疾病(例如癌症)的患者的存活。
[0053]“改善”意指与未给药本发明的组合、组合物、药物或试剂盒相比，一种或多种症状的减轻或改善。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
[0054]
如本文所用，药物、化合物、或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任
何一种或多种有益或期望结果的量。对于预防性用途，有益或期望的结果包括消除或降低疾病(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及在疾病发展期间呈现的中间病理表型)的风险、减轻疾病的严重程度、或延迟疾病的发作。对于治疗性用途，有益或期望的结果包括临床结果，如降低各种免疫相关疾病或病症(如例如晚期癌症)的一种或多种症状的发生率或改善一种或多种症状、减小治疗疾病所需的其他药物的剂量、增强另一种药物的效果，和/或延迟患者的免疫相关疾病的进展。可将有效剂量以一次或多次给药来给药。出于本发明的目的，药物、化合物、或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接地实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床情况下所理解，药物、化合物、或药物组合物的有效剂量可以或不可与另一种药物、化合物、或药物组合物联合实现。因此，如果与一种或多种其他试剂联合可以实现或实现期望的结果，则“有效剂量”可在给药一种或多种治疗剂的情况下考虑，并且可将单一试剂以有效量给予。
[0055]
例如，对于本发明中所公开的药物、化合物、组合、或药物组合物的用途，治疗有效量是指药物、化合物、组合、或药物组合物可消除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、抑制介导癌症状态细胞的生长或繁殖、抑制肿瘤细胞转移、减轻与肿瘤或癌症病症相关联的任何症状或标记、预防或延迟肿瘤或癌症病症的进展、或上述的一些组合的剂量或浓度。
[0056]
如本文所用，“与
……
组合”是指除了一种治疗形式之外还给药另一种治疗形式。因此，“与
……
组合”是指在向个体给药其他治疗形式之前、期间、或之后给药一种治疗形式。
[0057]“治疗方案”、“给药规程(dosing protocol)”和剂量方案可互换地用于指本发明的组合中各治疗剂的给药剂量和时间。
[0058]
在免疫功能障碍的情境中，“功能障碍”是指对抗原刺激的免疫反应降低的状态。该术语包括其中可发生抗原识别的衰竭和/或失能的共同要素，但随后的免疫反应对控制感染或肿瘤生长无效。
[0059]
如本文所用，“功能障碍的”还包括抗拒或不反应于抗原识别，具体地，使抗原识别翻译成下游t细胞效应子功能(如增殖、细胞因子产生(例如il-2)和/或靶细胞杀伤)的能力受损。
[0060]“失能”是指由通过t细胞受体递送的不完全或不足的信号引起的对抗原刺激无反应性的状态(例如，在不存在ras活化的情况下细胞内ca
2
增加)。在不存在共刺激情况下被抗原刺激时也可导致t细胞失能，从而导致即使在共刺激的情况下，细胞也变得抗拒后续被抗原活化。白细胞介素-2的存在通常可以推翻无反应状态。无能t细胞不经历克隆扩增和/或获取效应子功能。
[0061]“衰竭”是指呈t细胞功能障碍状态的t细胞衰竭，由在许多慢性感染和癌症期间发生的持续tcr信号转导引起。它与失能的区别在于，其不是通过不完全或有缺陷的信号转导，而是由持续的信号转导引起。其由较差的效应子功能、抑制性受体的持续表达，以及不同于功能性效应子或记忆t细胞的转录状态来定义。
[0062]
衰竭阻碍对感染和肿瘤的最佳控制。衰竭可由外在负调节途径(例如，免疫调节细胞因子)以及细胞内在负调节(共刺激)途径(pd-1、b7-h3、b7-h4等)两者引起。
[0063]“增强t细胞功能”意指诱导、引起或刺激t细胞具有持续或扩增的生物功能，或者更新或再活化衰竭或失活的t细胞。增强t细胞功能的实例包括：相对于干预前这样的水平，
γ干扰素自cd8 t细胞的分泌增加，增殖增加，抗原反应性(例如，病毒、病原体、或肿瘤清除)增加。在一个实施方案中，增强水平为至少50％、或者60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％。测量这种增强的方式是本领域的普通技术人员已知的。
[0064]“t细胞功能障碍性障碍”是以对抗原刺激的反应性降低为特征的t细胞的障碍或病症。在特定实施方案中，t细胞功能障碍性障碍是与通过pd-1的不适当增加的信号转导特定相关联的障碍。在另一个实施方案中，t细胞功能障碍性障碍是其中t细胞无能或者分泌细胞因子、增殖、或执行溶细胞活性的能力降低的障碍。在一个特定方面，降低的反应性导致对表达免疫原的病原体或肿瘤的控制无效。以t细胞功能障碍为特征的t细胞功能障碍性障碍的实例包括未解决的急性感染、慢性感染和肿瘤免疫。
[0065]“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，当这样的逃避减弱，并且肿瘤被免疫系统识别和攻击时，肿瘤免疫被“治疗”。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤收缩和肿瘤清除。
[0066]“免疫原性”是指特定物质激发免疫反应的能力。肿瘤是免疫原性的，并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫反应清除肿瘤细胞。增强肿瘤免疫原性的实例包括用pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼治疗。
[0067]“持续反应”是指治疗停止后对减少肿瘤生长的持续效应。例如，与给药阶段开始时的尺寸相比，肿瘤尺寸可以保持相同或更小。在一些实施方案中，持续反应的持续时间至少与治疗持续时间相同、为治疗持续时间长度的至少1.5x、2.0x、2.5x、或3.0x。
[0068]“障碍”是受益于治疗的任何病症，包括但不限于慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论障碍的那些病理学病症。
[0069]“细胞增殖性障碍”和“增殖性障碍”是指与一定程度的异常细胞增殖相关联的障碍。在一个实施方案中，细胞增殖性障碍是癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性障碍是肿瘤。
[0070]
本发明中的“免疫相关疾病”是指与功能障碍(特别是调节异常，如免疫系统的过度活化)有关或者由功能障碍所致的任何疾病。根据本发明的免疫相关疾病优选地选自炎性疾病，特别是慢性炎性疾病、炎性皮肤病、自身免疫疾病和变应性疾病。
[0071]
本发明中的“与pd-l1相关联的疾病或者与pd-l1相关联”意指由于pd-l1(例如，人pd-l1)的表达或活性的增加或降低而引起、加重或以其他方式相关的任何病症。
[0072]“肿瘤”在应用于被诊断患有或怀疑患有癌症的受试者时是指任何尺寸的恶性或潜在恶性赘生物或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性赘生物。实体瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常生长或组织块。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成实体瘤(national cancer institute,dictionary of cancer terms)。
[0073]“肿瘤负担”也称为“肿瘤负荷”，是指遍及身体分布的肿瘤物质的总量。肿瘤负担是指遍及身体(包括淋巴结和骨髓)的癌细胞的总数或者一个或多个肿瘤的总尺寸。肿瘤负担可以通过本领域已知的多种方法来确定，如例如通过在从受试者移除时测量一个或多个肿瘤的尺寸，例如使用卡尺，或者在体内时使用成像技术，例如超声、骨扫描、计算机断层摄影(ct)或磁共振成像(mri)扫描。
[0074]
术语“肿瘤尺寸”是指肿瘤的总尺寸，其可测量为肿瘤的长度和宽度。肿瘤尺寸可
以通过本领域已知的多种方法来确定，如例如通过在从受试者移除时测量一个或多个肿瘤的尺寸，例如使用卡尺，或者在体内时使用成像技术，例如骨扫描、超声、ct或mri扫描。
[0075]“癌症”、“癌性的”、或“恶性的”是指或者描述典型地以不受调节的细胞生长为特征的哺乳动物中的生理状况。在一些实施方案中，癌症的特征在于扩增的fgfr-4。在一些实施方案中，癌症的特征在于fgfr-4的过表达。在一些实施方案中，癌症的特征在于扩增的fgf-19。在一些实施方案中，癌症的特征在于fgf-19的过表达。癌症的实例包括但不限于上皮细胞癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样的癌症的更具体实例包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、胃部或胃癌(包括胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(包括肝细胞癌(hcc))、膀胱癌、尿路癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级免疫母细胞性nhl；高级淋巴母细胞性nhl；高级小非核裂细胞nhl；大体积疾病nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；以及华氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性疾病(ptld)，以及与母斑细胞病、水肿(如与脑肿瘤相关联)、梅格斯综合征、脑以及头颈癌相关联的异常血管增生，以及相关联的转移。在一些实施方案中，适合用本发明的抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、非何杰金淋巴瘤(nhl)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波济氏肉瘤、类癌瘤、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(crc)和hcc。然而，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括这些癌症的转移形式。在一些实施方案中，癌症是hcc。在一些实施方案中，hcc的特征在于扩增的fgfr-4。在一些实施方案中，hcc的特征在于fgfr-4的过表达。在一些实施方案中，癌症的特征在于扩增的fgf-19。在一些实施方案中，癌症的特征在于fgf-19的过表达。
[0076]
如本文所用，“recist 1.1反应标准”意指eisenhauer等人,e.a.等人,eur.j cancer 45:228-247(2009)中对靶病变或非靶病变所示的定义，基于测量反应的情况视情况而定。
[0077]“持续反应”意指在停止用治疗剂或本文所述的组合疗法治疗后的持续治疗效果。在一些实施方案中，持续反应的持续时间至少与治疗持续时间相同，或者是治疗持续时间的至少1.5、2.0、2.5或3倍。
[0078]
如本文所用，“样品”是指获自或源自所关注的受试者和/或个体的组合物，其含有待表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体，例如基于物理、生物化学、化学和/或生理特征。例如，短语“疾病样品”及其变型形式是指获自所关注受试者的预期或已知含有待表征的细胞和/或分子实体的任何样品。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳汁、全血、血源性细胞、尿、脑脊液、唾液、痰、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物和组织培养基、组织
提取物如匀浆组织、肿瘤组织、细胞提取物、以及它们的组合。
[0079]“组织样品”或“细胞样品”意指获自受试者或个体的组织的类似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可为实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活体组织切片和/或抽出物；血液或任何血液成分，如血浆；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液；来自受试者妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品获自患病组织/器官。组织样品可以含有性质上不与组织天然混合的化合物，如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。
[0080]
如本文所用，“参考样品”、“参考细胞”、“参考组织”、“对照样品”、“对照细胞”、或“对照组织”是指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准、或水平。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞、或对照组织获自同一受试者或个体的身体的健康和/或非患病部分(例如，组织或细胞)。例如，与患病细胞或组织相邻的健康和/或非患病细胞或组织(例如，与肿瘤相邻的细胞或组织)。在另一个实施方案中，参考样品获自同一受试者或个体的身体的未治疗的组织和/或细胞。在又一个实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞、或对照组织获自不是该受试者或个体的个体的身体的健康和/或非患病部分(例如，组织或细胞)。在甚至另一个实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞、或对照组织获自不是该受试者或个体的个体的身体的未治疗的组织和/或细胞。
[0081]
出于本文的目的，组织样品的“切片”意指组织样品的单个部分或片，例如从组织样品切下的组织或细胞的薄片。应当理解，可以获取组织样品的多个切片并经受分析，前提条件是应当理解，可以将组织样品的相同切片在形态学和分子水平两者上分析，或者关于多肽和多核苷酸两者进行分析。
[0082]“相关(correlate)”或“相关(correlating)”意指以任何方式对第一分析或规程的性能和/或结果与第二分析或规程的性能和/或结果进行比较。例如，可以使用第一分析或规程的结果来实施第二规程，和/或可以使用第一分析或规程的结果来确定是否应当执行第二分析或规程。关于多肽分析或规程的实施方案，可以使用多肽表达分析或规程的结果来确定是否应当执行特定的治疗方案。关于多核苷酸分析或规程的实施方案，可以使用多核苷酸表达分析或规程的结果来确定是否应当执行特定的治疗方案。
[0083]
当在本文中使用时，词语“标签”是指可检测的化合物或组合物。标签典型地直接或间接地与试剂如多核苷酸探针或抗体缀合或融合，并且有利于与之缀合或融合的试剂的检测。标签本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标签或荧光标签)，或者在酶标签的情况下，其可以催化底物化合物或组合物的化学改变导致可检测的产物。
[0084]
患者的“有效反应”或患者对药物治疗的“反应性”和类似用词是指赋予处于疾病或障碍(如癌症)风险或者患有疾病或障碍的患者的临床或治疗益处。在一个实施方案中，这样的益处包括以下中的任一者或多者：延长生存率(包括总体生存率和无进展生存率)；导致客观反应(包括完全反应或部分反应)；或改善癌症的体征或症状。
[0085]
对治疗“不具有有效反应”的患者是指不具有以下中的任一者的患者：延长生存率(包括总体生存率和无进展生存率)；导致客观反应(包括完全反应或部分反应)；或改善癌症的体征或症状。
[0086]“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与
chemistry,283:1 156-1 166,2008。另一些cdr边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与kabat cdr的至少一部分重叠，然而鉴于特定残基或残基组或甚至整个cdr不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可被缩短或延长。如本文所用，cdr可指由本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的cdr。本文使用的方法可以利用根据这些方法中的任一种定义的cdr。对于含有多于一个cdr的任何给定的实施方案，可以根据kabat、chothia、扩展、abm、接触和/或构象定义中的任一者来定义cdr。
[0111]“分离的抗体”和“分离的抗体片段”是指纯化状态，并且在该语境中意指所命名的分子基本上不含其他生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、或其他材料如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”不旨在指完全不存在这样的材料或者不存在水、缓冲液、或盐，除非它们以基本上干扰如本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
[0112]
如本文所用，“单克隆抗体”或“mab”或“mab”是指基本同质性抗体群体，即，包含所述群体的抗体分子除了可能以微量存在的可能的天然存在的突变以外，在氨基酸序列上是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂典型地包括在其可变结构域，特别是其cdr中具有不同氨基酸序列的多种不同的抗体，它们通常针对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示如从基本上同质性抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过kohler等人(1975)nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法(参见例如美国专利4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可以使用例如clackson等人(1991)nature 352:624-628和marks等人(1991)j.mol.biol.222:581-597所描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。还可参见presta(2005)j.allergy clin.immunol.1 16:731。
[0113]“嵌合抗体”是指如下抗体以及这样的抗体的片段：其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种(例如人类)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一物种(例如小鼠)或属于另一抗体类别或亚类的抗体(以及所述抗体的片段)中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可。
[0114]“人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞、或衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则人抗体可含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
[0115]“人源化抗体”是指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，并且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的fr区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，典型地人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。当需要区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体时，将前缀“hum”、“hu”或“h”增添到抗体克隆名称中。啮齿动物抗体的人源化形式通常包含与亲本啮齿动物抗体相同的cdr序列，但为了增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性、或出于其他原因，可包括一些氨基酸置换。
[0116]“保守修饰的变体”或“保守置换”是指用具有类似特征(例如电荷、侧链尺寸、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸置换蛋白质中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白质的生物活性或其他期望的特征，如抗原亲和力和/或特异性。本领域的技
术人员通常认识到，一般来讲，在多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如watson等人(1987)molecular biology of the gene,the benjamin/cummings pub.co.,第224页(第4版))。
[0117]“同源性”是指当两个多肽序列最佳比对时它们之间的序列相似性。当两个比较序列中的一个位置被相同的氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两种不同ab的轻链cdr中的一个位置被丙氨酸占据，则这两种ab在该位置处是同源的。同源性百分比是两个序列共有的同源位置的数目除以比较的位置总数目
×
100。例如，当序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置中有8个匹配或同源，则两个序列是80％同源的。通常，当两个序列被比对以给出最大百分比的同源性时进行比较。例如，可以通过blast算法执行比较，其中算法的参数被选择成在相应参考序列的全长上给出相应序列之间的最大匹配。
[0118]
如本文所用，“pd-l1”是指程序性细胞死亡配体1(pd-l1，参见例如freeman等人(2000)j.exp.med.192:1027)。代表性人pd-l1的氨基酸序列是ncbi登录号:np_054862.1，并且代表性人pd-l1的核酸序列是ncbi登录号:nm_014143.3。pd-l1在胎盘、脾、淋巴结、胸腺、心脏、胎肝中表达，并且也存在于许多肿瘤或癌细胞中。pd-l1与活化t细胞、b细胞和骨髓细胞上表达的受体pd-1或b7-1结合。pd-l1与其受体的结合触发信号转导，以抑制tcr介导的细胞因子产生和t细胞增殖的活化。因此，pd-l1在如妊娠、自身免疫疾病、组织移植的一些事件中发挥着抑制免疫系统的重要作用，并且被认为允许肿瘤或癌细胞逃避免疫检查点并逃避免疫反应。
[0119]
成熟pd-l1缺乏分泌前前导序列，也称为前导肽。术语“pd-l1”和“成熟pd-l1”在本文中可互换使用，并且应理解为意指相同的分子，除非另外指明或从上下文中显而易见。
[0120]“pd-1轴结合拮抗剂”是指抑制pd-1轴结合配偶体与其结合配偶体中的一种或多种相互作用的分子，从而移除由pd-1信号转导轴上的信号转导引起的t细胞功能障碍——结果是恢复或增强t细胞功能(例如增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文所用，pd-1轴结合拮抗剂包括pd-1结合拮抗剂、pd-l1结合拮抗剂和pd-l2结合拮抗剂。
[0121]“pd-1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-1与其结合配偶体(如pd-l1、pd-l2)中的一种或多种的相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抑制pd-1与其结合配偶体中的一种或多种的结合的分子。在一个特定方面，pd-1结合拮抗剂抑制pd-1与pd-l1和/或pd-l2的结合。例如，pd-1结合拮抗剂包括抗pd-1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，pd-1结合拮抗剂减少由或通过t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的(即通过pd-1信号转导介导的)负共刺激信号，从而使功能障碍的t细胞呈现较小的功能障碍(例如，增强对抗原识别的效应子反应)。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-1抗体。“pd-l1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其结合配偶体中的一种或多种(如pd-1、b7-1)的相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂是抑制pd-l1与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面，pd-l1结合拮抗剂抑制pd-l1与pd-1和/或b7-1的结合。在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂包括抗pd-l1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其结合配偶体中的一种或多种(如pd-1、b7-1)的相互作用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，pd-l1结合拮
抗剂减少由或通过t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的(即通过pd-l1信号转导介导的)负共刺激信号，从而使功能障碍的t细胞呈现较小的功能障碍(例如，增强对抗原识别的效应子反应)。
[0122]
在治疗人受试者的本发明的任何治疗方法、药物和用途中，pd-l1拮抗剂阻断人pd-l1与人pd-1的结合。本发明的治疗方法、药物和用途中可用的pd-l1拮抗剂包括单克隆抗体(mab)，其特异性结合pd-l1，并优选地特异性结合人pd-l1。mab可为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可包括人恒定区。在一些实施方案中，人恒定区选自lgg1、lgg2、lgg3和lgg4恒定区，并且在优选的实施方案中，人恒定区是lgg1或lgg4恒定区。在一些实施方案中，抗原结合片段选自fab、fab'-sh、f(ab')2、scfv和fv片段。
[0123]
在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。在一个特定方面，抗pd-l1抗体是pct申请号pct/cn2016/093560中要求保护的抗体。
[0124]
如本文所用，“抗pd-l1抗体”是指能够以足够用于诊断和/或治疗用途的亲和力特异性结合pd-l1(例如，人或猴pd-l1)的抗体。如本文所用，抗人pd-l1 mab或诊断性抗hpd-l1 mab是指特异性结合成熟人pd-l1的单克隆抗体。
[0125]“pd-l2结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l2与其结合配偶体中的一种或多种(如pd-1)的相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-l2结合拮抗剂是抑制pd-l2与其结合配偶体中的一种或多种的结合的分子。在一个特定方面，pd-l2结合拮抗剂抑制pd-l2与pd-1的结合。在一些实施方案中，pd-l2拮抗剂包括抗pd-l2抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l2与其结合配偶体中的一种或多种(如pd-1)的相互作用引起的信号转导的其他分子。
[0126]
如本文所用，“pd-l1”表达意指细胞表面上pd-l1蛋白或细胞或组织内pd-l1 mrna的任何可检测水平的表达。可以用诊断性pd-l1抗体在肿瘤组织切片的ihc测定中或者通过流式细胞术来检测pd-l1蛋白表达。或者，可以使用特异性结合pd-l1的结合剂(例如，抗体片段、亲和体等)，通过pet成像来检测肿瘤细胞的pd-l1蛋白表达。用于检测和测量pd-l1 mrna表达的技术包括rt-pcr和实时定量rt-pcr。一种方法采用针对pd-l1表达呈阳性或阴性的简单二元终点，其中阳性结果根据表现出细胞表面膜染色的组织学证据的肿瘤细胞的百分比来定义。肿瘤组织切片的pd-l1表达计数为阳性，即是总肿瘤细胞的至少1％，并优选地5％。在另一种方法中，肿瘤组织切片中的pd-l1表达在肿瘤细胞以及浸润性免疫细胞(主要包含淋巴细胞)中定量。表现出膜染色的肿瘤细胞和浸润性免疫细胞的百分比分别定量为《5％、5至9％，然后以10％递增多至100％。对于肿瘤细胞，如果评分是《5％的评分，则pd-l1表达计数为阴性，并且如果评分》5％，则为阳性。免疫浸润中的pd-l1表达报告为半定量测量，称为调节炎症评分(ais)，其通过将膜染色细胞的百分比乘以浸润强度来确定，分级为无(0)、轻度(评分为1，罕见淋巴细胞)、中度(评分为2，淋巴组织细胞聚集体对肿瘤的局部浸润)、或重度(评分为3，弥漫性浸润)。如果ais》5，则肿瘤组织切片的免疫浸润的pd-l1表达计数为阳性。
[0127]
pd-l1 mrna表达水平可与定量rt-pcr中常用的一种或多种参考基因如泛素c的mrna表达水平进行比较。
[0128]
在一些实施方案中，基于与适当对照的pd-l1表达(蛋白质和/或mrna)的水平的比较，恶性细胞和/或肿瘤内浸润性免疫细胞的pd-l1表达(蛋白质和/或mrna)的水平确定为“过表达”或“升高”。例如，对照pd-l1蛋白或mrna表达水平可以是在相同类型的非恶性细胞中或在来自匹配的正常组织的切片中定量的水平。
[0129]“fgfr-4”或“fgfr-4蛋白”是指fgfr-4蛋白的任何形式，包括野生型和所有变体形式(包括但不限于突变体形式和剪接变体)。fgfr-4蛋白是fgfr-4基因的产物，因此fgfr-4蛋白包括由任何形式的fgfr-4基因编码的任何蛋白，包括所有畸变，例如点突变、插入缺失、易位融合和局灶性扩增。
[0130]“抑制剂”是指抑制酶以使得可例如在生物化学测定中观察到酶活性降低的化合物。在一些实施方案中，抑制剂具有小于约1μm、小于约500nm、小于约250nm、小于约100nm、小于约50nm、或小于约10nm的ic 50。fgfr-4的抑制剂是指抑制fgfr-4的化合物。
[0131]
如本文所用，“过表达”意指样品中基因产物的产生显著高于对照样品群体(例如正常组织)中观察到的基因产物的产生。
[0132]“选择性”是指这样的化合物：与其抑制其他蛋白质的活性相比，更强效地抑制靶蛋白例如fgfr-4的活性。在该情况下，同种型fgfr-1、fgfr-2、fgfr-3和fgfr-4都被视为不同的蛋白质。在一些实施方案中，化合物能够以比其抑制非靶蛋白的活性强至少1.5、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少500、或至少1000倍或更多倍来抑制靶蛋白例如fgfr-4的活性。
[0133]“药学上可接受的”指示出所指定的载体、媒介物、稀释剂、一种或多种赋形剂和/或盐通常在化学上和/或物理上与构成制剂的其他成分相容，并且在生理学上与其受者相容。
[0134]
ii.方法、用途和药物
[0135]
本发明涉及用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症的方法。
[0136]
本文提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，该方法包括向个体给药有效量的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼。非索替尼是选择性fgfr4抑制剂，出乎意料地发现其对于相应蛋白可具有免疫调节能力的基因的表达具有效应。更具体地，非索替尼显示降低了可影响免疫细胞的某些基因(ccl20)的表达，从而潜在地削弱肿瘤周围的驱避层。非索替尼削弱驱避层的事实可允许t细胞容易地浸润肿瘤，使得pd-1轴结合拮抗剂对它们的活化更有利，并因此提供优异的组合。本文还提供了增强患有癌症的个体中的免疫功能的方法，该方法包括向个体给药有效量的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼。
[0137]
本文还提供了pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼的组合，其用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症，特别是用于治疗癌症，所述pd-1轴结合拮抗剂阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用。在一些实施方案中，本发明提供了包含pd-1轴结合拮抗剂的组合物、药物或药剂，其与非索替尼组合用于治疗癌症。在一些实施方案中，本发明提供了包含非索替尼的组合物、药物或药剂，其与pd-1轴结合拮抗剂组合用于治疗癌症。
[0138]
本文还提供了pd-1轴结合拮抗剂(如阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用的抗体)和非索替尼在制造用于治疗受益于调节免疫功能的受试者的病症，特别是用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，药物包含试剂盒，并且试剂盒还包含包装插页，该包装插页包含使用pd-1轴结合拮抗剂与非索替尼组合地治疗受试者中的癌症的说明书。
[0139]
其他实施方案提供了pd-1轴结合拮抗剂在制造当与非索替尼组合给药时治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及非索替尼在制造当与pd-1轴结合拮抗剂组合给药时治
疗受试者中的癌症的药物中的用途。
[0140]
还提供了试剂盒，该试剂盒包含第一容器、第二容器和包装插页，其中第一容器包含至少一个剂量的包含pd-1轴结合拮抗剂的药物，第二容器包含至少一个剂量的包含非索替尼的药物，并且包装插页包含使用所述药物治疗受试者的说明书。
[0141]
pd-1轴结合拮抗剂
[0142]
例如，pd-1轴结合拮抗剂包括pd-1结合拮抗剂、pdl1结合拮抗剂和pdl2结合拮抗剂。“pd-1”的别名包括cd279和sleb2。“pdl1”的别名包括b7-h1、b7-4、cd274和b7-h。“pdl2”的别名包括b7-dc、btdc和cd273。在一些实施方案中，pd-1、pdl1和pdl2是人pd-1、pdl1和pdl2。
[0143]
在以上方法、组合、组合物、药物、用途或试剂盒的一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抑制pd-1与其配体结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面，pd-1配体结合配偶体是pdl1和/或pdl2。在另一个实施方案中，pdl1结合拮抗剂是抑制pdl1与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面，pdl1结合配偶体是pd-1和/或b7-1。在另一个实施方案中，pdl2结合拮抗剂是抑制pdl2与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面，pdl2结合配偶体是pd-1。拮抗剂可为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、或低聚肽。
[0144]
在以上方法、组合、组合物、药物、用途或试剂盒的一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体(例如，人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体)或其抗原结合片段。在以上方法、组合、组合物、药物、用途或试剂盒的一些实施方案中，提供了示例性完全人单克隆抗体1.4.1、1.14.4、1.20.15和1.46.11，它们的cdr序列显示于表1中。并且重链或轻链可变区序列也在以下列出。
[0145]
表1
[0146]
[0147]
[0148][0149]
1.4.1-vh(30511)：(seq id no:43是氨基酸，seq id no:44是核酸)重链cdr1-3：seq id no:1、3、5是氨基酸序列并且seq id no:2、4、6是核酸序列。
[0150]
区段v：ighv4-39*01
[0151]
区段d：ighd1-26*01
[0152]
区段j：ighj4*02
[0153]
[0154][0155]
1.4.1-vl(30027)：(seq id no:45是氨基酸，并且seq id no:46是核酸)轻链cdr1-3：seq id no:7、9、11是氨基酸序列并且seq id no:8、10、12是核酸序列：
[0156]
区段v：iglv3-1*01
[0157]
区段j：iglj2*01
[0158][0159]
1.14.4-vh(29812)：(seq id no:47是氨基酸，seq id no:48是核酸)重链cdr1-3：seq id no:13、15、17是氨基酸序列并且seq id no:14、16、18是核酸序列：
[0160]
区段v：ighv3-23*01
[0161]
区段d：ighd5-5*01
[0162]
区段j：ighj4*02
[0163][0164]
1.14.4-vl和1.46.11-vl(29841)：(seq id no:49是氨基酸，seq id no:50是核酸)轻链cdr1-3：seq id no:19、21、23是氨基酸序列并且seq id no:20、22、24是核酸序列：
[0165]
区段v：iglv3-21*02
[0166]
区段j：iglj2*01
[0167][0168]
1.20.15-vh(30712)：(seq id no:51是氨基酸，seq id no:52是核酸)轻链cdr1-3：seq id no:25、27、29是氨基酸序列并且seq id no:26、28、30是核酸序列：
[0169]
区段v：ighv4-39*01
[0170]
区段d：未确定
[0171]
区段j：ighj4*02
[0172][0173]
1.20.15-vl(29907)：(seq id no:53是氨基酸，seq id no:54是核酸)轻链cdr1-3：seq id no:31、33、35是氨基酸序列并且seq id no:32、34、36是核酸序列：
[0174]
区段v：iglv3-1*01
[0175]
区段j：iglj2*01
[0176][0177]
1.46.11-vh(30626)：(seq id no:55是氨基酸，seq id no:56是核酸)轻链cdr1-3：seq id no:37、39、41是氨基酸序列并且seq id no:38、40、42是核酸序列：
[0178]
区段v：ighv3-23*01
[0179]
区段d：ighd5-5*01
[0180]
区段j：ighj4*02
[0181][0182]
1.46.11-vl(29841)：(seq id no:49是氨基酸，seq id no:50是核酸)轻链cdr1-3：seq id no:19、21、23是氨基酸序列并且seq id no:20、22、24是核酸序列：
[0183]
区段v：iglv3-21*02
[0184]
区段j：iglj2*01
[0185]
[0186][0187]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含选自以下的重链cdr序列：seq id no:1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39和41。
[0188]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含选自以下的轻链cdr序列：seq id no:7、9、11、19、21、23、31、33和35。
[0189]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含选自以下的重链可变区：包含seq id no:1、seq id no:3和/或seq id no:5的重链可变区；包含seq id no:13、seq id no:15和/或seq id no:17的重链可变区；包含seq id no:25、seq id no:27和/或seq id no:29的重链可变区；以及包含seq id no:37、seq id no:39和/或seq id no:41的重链可变区。
[0190]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含选自以下的轻链可变区：包含seq id no:7、seq id no:9和/或seq id no:11的轻链可变区；包含seq id no:19、seq id no:21和/或seq id no:23的轻链可变区；以及包含seq id no:31、seq id no:33和/或seq id no:35的轻链可变区。
[0191]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含：
[0192]
a)包含seq id no:1、seq id no:3和/或seq id no:5的重链可变区；以及包含seq id no:7、seq id no:9和/或seq id no:11的轻链可变区；
[0193]
b)包含seq id no:13、seq id no 15和/或seq id no:17的重链可变区；以及包含seq id no:19、seq id no:21和/或seq id no:23的轻链可变区；
[0194]
c)包含seq id no:25、seq id no:27和/或seq id no:29的重链可变区；以及包含seq id no:31、seq id no:33和/或seq id no:35的轻链可变区；
[0195]
d)包含seq id no:37、seq id no:39和/或seq id no:41的重链可变区；以及包含seq id no:19、seq id no:21和/或seq id no:23的轻链可变区。
[0196]
本领域的技术人员将理解，表1中所提供的cdr序列可被修饰成含有一个或多个氨基酸置换，由此导致增强的生物活性，如与人pd-l1增强的结合亲和力。例如，可以采用噬菌体展示技术产生和表达抗体变体(例如fab或fcfv变体)文库，并筛选对人pd-l1具有亲和力的抗体。又如，可以使用计算机软件来模拟抗体与人pd-l1的结合，并且可以鉴定在抗体上形成结合界面的氨基酸残基。可以避免这些残基的置换以防止结合亲和力降低，或者这些残基可以靶向置换以形成更强的结合。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，cdr序列中的至少一个(或所有)置换是保守置换。
[0197]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体和抗原结合片段包含与表1中所列的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的一个或多个cdr序列，同时保留与其亲本抗体相比类似或甚至更高的与人pd-l1的结合亲和力，所述亲本抗体具有与表1中所列的序列基本上相同的序列，但相应的cdr序列与之具有100％的序列同一性。
[0198]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-1抗体及其抗原结合片段是完全人的。完全人抗体在人体内不具有如通常人源化抗体所观察到的免疫原性或降低的结合亲和力的问题。
[0199]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，完全人抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含重链可变区，其中重链可变区选自seq id no:43、seq id no:47、seq id no:51和seq id no:55，以及具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；和/或轻链可变区，其中轻链可变区选自seq id no:45、seq id no:49和seq id no:53，以及具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。这些完全人抗体所保留的与人pd-l1的结合亲和力优选地类似于示例性抗体的水平：1.4.1、1.14.4、1.20.15和1.46.11。
[0200]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，完全人抗pd-l1抗体及其抗原结合片段包含：a)包含seq id no:43的重链可变区；以及包含seq id no:45的轻链可变区；b)包含seq id no:47的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区；c)包含seq id no:51的重链可变区；以及包含seq id no:53的轻链可变区；或d)包含seq id no:55的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区。
[0201]
本技术还包括与本技术的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段竞争相同表位的抗体及其抗原结合片段。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体以小于10-6
m、小于10-7
m、小于10-7.5
m、小于10-8
m、小于10-8.5
m或小于10-9
m或小于10-10m的ic
50
值(即半抑制浓度)阻断1.4.1、1.14.4、1.20.15和1.46.11与人或猴pd-l1的结合。通过竞争性测定如elisa测定、放射性配体竞争结合测定和facs分析来测定ic
50
值。
[0202]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段能够以≤10-6
m(例如≤5
×
10-7
m、≤2
×
10-7
m、≤10-7
m、≤5
×
10-8
m、≤2
×
10-8
m、≤10-8
m、≤5
×
10-9
m、≤2
×
10-9
m、≤10-9
m,10-10
m、约10-10
m、10-10
m至10-8.5
m或10-10
m至10-8
m)的结合亲和力(kd)与人pd-l1特异性结合。通过等离子体共振结合测定来测量结合亲和力。结合亲和力可由kd值表示，其计算为在抗原与抗原结合分子的结合达到平衡时解离速率与结合速率的比率(k
off
/k
on
)。抗原结合亲和力(例如kd)可以通过本领域已知的合适方法适当地测定，包括使用仪器如biacore等离子体共振结合测定(参见例如murphy,m.等人,current protocols in protein science,第19章,19.14单元,2006)。
[0203]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗体及其抗原结合片段以0.1nm-100nm(例如，0.1nm-50nm、0.1nm-30nm、0.1nm-20nm、或0.1nm-10nm或0.1nm-1nm)的ec
50
(即，半结合浓度)与人pd-l1结合。抗体与人pd-l1的结合可以通过本领域已知的方法测定，如sandwich法如elisa、蛋白质印迹、facs或其他结合测定。在说明性实例中，允许待测试的抗体(即，第一抗体)与固定化pd-l1或表达人pd-l1的细胞结合，然后洗去未结合的抗体，引入能够与第一抗体结合的标记的第二抗体，因此可以检测结合的第一抗体。检测可以在使用固定化pd-l1时在酶标仪上执行，或者可以在使用表达人pd-l1的细胞时通过使用facs分析执行。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗体及其抗原结合片段以1nm至10nm或1nm至5nm(如由facs分析测定)的ec
50
(即，50％有效浓度)与人pd-l1结合。
[0204]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗体及其抗原结合片段以0.2nm至100nm(例如0.2nm至50nm、0.2nm至30nm、0.2nm至20nm、0.2nm至10nm、或1nm至10nm)的ic
50
抑制人pd-l1与其受体的结合，其通过竞争性测定来测量。
[0205]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗体及其抗原结合片段抑制人pd-l1与其受体的结合，并由此提供生物活性，包括例如诱导活化t细胞(如cd
4
t细胞和cd
8
t细胞)产生细胞因子、诱导活化t细胞(如cd
4
t细胞和cd
8
t细胞)增殖以及逆转调节性treg的抑制功能。示例性细胞因子包括il-2和ifnγ。术语“il-2”是指白介素2，它是调节白血细胞(例如白细胞)活性的免疫系统中的细胞因子信号传导分子。术语“干扰素γ(ifnγ)”是由自然杀伤(nk)细胞、nk t细胞、cd
4
和cd
8
t细胞产生的细胞因子，其是巨噬细胞的关键活化剂和主要组织相容性复合体(mhc)分子表达的诱导剂。细胞因子的产生可以通过本领域已知的方法如elisa来测定。这些方法也可用于检测t细胞增殖，包括[3h]胸腺嘧啶掺入测定。
[0206]
所述抗pd-l1抗体及其抗原结合片段对人pd-l1具有特异性。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段不与pd-l2(例如人pd-l2)结合。例如，与pd-l2的结合亲和力甚至比与人pd-l1的结合亲和力低15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0207]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段以不超过100nm，例如，不超过10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、
1nm、0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm、0.3nm、0.2nm、0.1nm、0.09nm、0.08nm、0.07nm、0.06nm、0.05nm、0.04nm、0.03nm、0.02nm或0.01nm的ec
50
(由elisa测定)与猴pd-l1结合。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段以约1nm-10nm的ec
50
与猴pd-l1结合。
[0208]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段不结合鼠pd-l1，但以与人pd-l1类似的结合亲和力结合猴pd-l1。例如，示例性抗体1.4.1、1.14.4、1.20.15和1.46.11与鼠pd-l1的结合通过常规结合测定如elisa或facs分析不可检测到，而根据elisa或facs的检测，这些抗体以与人pd-l1类似的亲和力或ec
50
值与猴pd-l1结合。
[0209]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，所述抗pd-l1抗体及其抗原结合片段具有降低或消除的效应子功能。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段具有igg4同种型的恒定区，其具有降低的或消除的效应子功能。效应子功能如adcc和cdc可导致对表达pd-l1的细胞的细胞毒性。许多细胞(包括正常细胞)能够表达pd-l1。为了避免对这些正常细胞的潜在不期望毒性，本发明的抗体及其抗原结合片段的一些实施方案具有降低或甚至消除的效应子功能。已知有许多测定法评价adcc或cdc活性，如fc受体结合测定、补体c1q结合测定和细胞裂解方法，它们可容易地由本领域的技术人员进行选择。不受理论的束缚，据信具有降低或消除的效应子功能如adcc和cdc的抗体对表达pd-l1的细胞如那些正常细胞不引起细胞毒性或使细胞毒性最小化，因此避免了不期望的副效应。同时，表达pd-l1的肿瘤细胞与抗pd-l1抗体结合，并因此不能从免疫检查点逃逸，因此可被免疫系统识别和消除。
[0210]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段具有降低的副效应。例如，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段可具有完全人igg序列，因此其免疫原性低于人源化抗体。又如，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段可为igg4形式以消除adcc和cdc。
[0211]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段的优点在于，它们可以与免疫原性物质，如肿瘤细胞、纯化的肿瘤抗原以及用编码免疫刺激细胞因子转染的细胞、肿瘤疫苗以组合的形式使用。此外，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段可包括在组合疗法中，包括标准化学疗法和放射疗法、基于靶标的小分子疗法，以及其他新兴的免疫检查点调节剂疗法。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段可用作抗体-药物缀合物、双特异性或多价抗体的基础分子。
[0212]
本技术所述的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而非在动物中产生的抗体。双特异性抗体或二价抗体是具有能够结合两种不同抗原的两种不同单克隆抗体的片段的人工抗体。“二价”抗体及其抗原结合片段包括两个抗原结合位点。两个抗原结合位点可以结合相同的抗原或者分别结合不同的抗原，在这种情况下，抗体或抗原结合片段是“双特异性的”。
[0213]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本技术
的抗pd-1抗体及其抗原结合片段是完全人抗体。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，使用重组方法产生完全人抗体。例如，可以制备携带人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的转基因动物如小鼠，因此能够在用适当的抗原如人pd-1免疫后产生完全人抗体。完全人抗体可以从这样的转基因动物中分离，或另选地可以通过杂交瘤技术制备——使转基因动物的脾细胞与永生化细胞系融合以产生分泌完全人抗体的杂交瘤细胞。示例性转基因动物包括但不限于omni大鼠，其内源性大鼠免疫球蛋白基因的表达失活并同时被工程化成含有功能性重组人免疫球蛋白基因座；omni小鼠，其内源性小鼠免疫球蛋白基因的表达失活并同时被工程化成含有具有j-基因座缺失和c-κ突变的重组人免疫球蛋白基因座。
[0214]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本文所述的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段是骆驼化单链结构域抗体、双体抗体、scfv、scfv二聚体、bsfv、dsfv、(dsfv)2、dsfv-dsfv'、fv片段、fab、fab'、f(ab')2、ds双功能抗体(ds双体抗体)、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
[0215]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，本文所述的抗pd-l1抗体及其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含ch1、ch1-ch2或ch1-ch3区域。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区还可包含一个或多个修饰以实现期望的特性。例如，恒定区可被修饰成减少或消除一种或多种效应子功能以增强fcrn受体结合，或者引入一个或多个半胱氨酸残基。
[0216]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗pd-l1抗体及其抗原结合片段还包含缀合物。预期本发明的抗体或其抗原结合片段可与多种缀合物连接(参见例如"conjugate vaccines",contributions to microbiology and immunology,jmcruse and r.e.lewis,jr.(编辑),carger press,new york,(1989))。这些缀合物可以通过共价连接、亲和结合、插入、配位结合、络合、结合、混合或添加等与抗体或抗原结合物质连接。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，除了表位结合部分以外，本文所公开的抗体及抗原结合片段还可被工程化成含有可用于结合一种或多种缀合物的特异性位点。例如，这样的位点可以包含一个或多个反应性氨基酸残基，如半胱氨酸残基和组氨酸残基，以利于与缀合物的共价连接。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，抗体可间接地或经由另一种缀合物与缀合物连接。例如，抗体或其抗原结合片段可结合生物素，然后间接地与亲和素连接的第二缀合物结合。缀合物可以是可检测标签、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测标签的实例可包括荧光标签(例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白、或德克萨斯红)、酶-底物标签(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶或β-d-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如
123
i、
124
i、
125
i、
131
i、
35
s、3h、
111
in、
112
in、
14
c、
64
cu、
67
cu、
86
y、
88
y、
90
y、
177
lu、
211
at、
186
re、
188
re、
153
sm、
212
bi和
32
p、其他镧系元素、发光标签)、发色团、地高辛、生物素/亲和素、dna分子或用于检测的金。
[0217]
在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，缀合物可以是有助于增加抗体半衰期的药代动力学修饰部分，如peg。其他合适的聚合物包括例如
羟甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在以上方法、组合、用途、组合物、药物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，缀合物可以是纯化部分，如磁珠。“细胞毒性部分”可以是对细胞有害或者可损伤或杀伤细胞的任何试剂。细胞毒性部分的实例包括但不限于紫杉醇、松胞菌素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖孢苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c以及顺式二氯二胺合铂(ii)(ddp)即顺铂)、蒽环类抗生素(例如道诺霉素(原名柔红霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(原名称为放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(amc))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
[0218]
由本文的细胞制备的抗体可以通过纯化方法进行纯化，如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、deae-纤维素离子交换层析柱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和层析，其中亲和层析是优选的纯化技术。抗体的物类和抗体中存在的任何免疫球蛋白的fc结构域决定了蛋白a是否适合作为亲和配体。蛋白a可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(lindmark等人,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。蛋白g适用于所有鼠同种型和人γ3(guss等人,embo j.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用于亲和配体的附着基质，但其他基质也是可用的。与琼脂糖相比，机械稳定基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现更快的流速和更短的处理时间。如果抗体含有ch3结构域，则可以使用bakerbond abx.tm树脂对其进行纯化(j.t.baker,phillipsburg,n.j.)。其他蛋白质纯化技术也可以基于所获得的抗体来确定。取决于期望的抗体，其他蛋白质纯化技术，如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、硅胶层析、基于阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)的肝素琼脂糖凝胶层析、层析聚焦、sds-page和硫酸铵沉淀也是可用的。
[0219]
在任何初步纯化步骤后，可以使用ph为约2.5-4.5，优选地低盐浓度(例如约0至0.25m盐浓度)的洗脱缓冲液，使包含所关注的抗体和污染物的混合物经受低ph疏水相互作用层析。
[0220]
示例性抗pd-1抗体包括但不限于纳武单抗、西米普利单抗、派姆单抗、卡瑞利珠单抗(shr1210)、信迪利单抗(ibi308)、替雷利珠单抗(bgb-a317)、特瑞普利单抗(js 001)和amp 224(glaxosmithkline)。示例性抗pd-l1抗体包括但不限于阿维单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、pct申请pct/cn2016/093560中要求保护的抗体、kn035(3d medicines)和ck-301(checkpoint therapeutics)。
[0221]
在上述方法、用途、组合、组合物、药剂或试剂盒的一些实施方案中，非索替尼在单独给药之后且在给药pd-1轴结合拮抗剂之前，和/或在与pd-1轴结合拮抗剂并行给药期间调节ccl20基因。在一些实施方案中，非索替尼降低ccl20基因表达的量。
[0222]
在上述方法、用途、组合、组合物、药剂或试剂盒的其他实施方案中，非索替尼在单独给药之后且在给药pd-1轴结合拮抗剂之前，和/或在与pd-1轴结合拮抗剂并行给药期间促进t细胞流入治疗的受试者的组织中。
[0223]
在上述方法、用途、组合、组合物、药剂或试剂盒的其他实施方案中，非索替尼降低
no:43、seq id no:47、seq id no:51和seq id no:55，以及具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。
[0249]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的轻链可变区：seq id no:45、seq id no:49和seq id no:53，以及具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。
[0250]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：
[0251]
a)包含seq id no:43的重链可变区；以及包含seq id no:45的轻链可变区；
[0252]
b)包含seq id no:47的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区；
[0253]
c)包含seq id no:51的重链可变区；包含seq id no:53的轻链可变区；或
[0254]
d)包含seq id no:55的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区。
[0255]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:47的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区。
[0256]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体、双体抗体、scfv、scfv二聚体、bsfv、dsfv、(dsfv)2、dsfv-dsfv'、fv片段、fab、fab'、f(ab')2、ds双体抗体、纳米抗体、结构域抗体、或二价结构域抗体。
[0257]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区。
[0258]
在一些实施方案中，抗pd-l1抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:47的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区。
[0259]
适应症和受试者
[0260]
本文所述的方法可用于治疗期望增强的免疫原性的病症，如增加肿瘤免疫原性以用于治疗癌症。本文还提供了增强患有癌症的个体中的免疫功能的方法，该方法包括向个体给药有效量的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼。本文提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，该方法包括向个体给药有效量的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼。
[0261]
在另外方面，本文提供了治疗感染(例如，感染有细菌或病毒或其他病原体)的方法。在一些实施方案中，感染是病毒和/或细菌感染。在一些实施方案中，感染是病原体感染。在一些实施方案中，感染是急性感染。在一些实施方案中，感染是慢性感染。
[0262]
在一些实施方案中，个体在用pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼组合治疗之前已经用非索替尼治疗。
[0263]
在一些实施方案中，个体患有对一种或多种pd-1轴拮抗剂有抗性(已展示有抗性)的癌症。在一些实施方案中，对pd-1轴拮抗剂的抗性包括癌症复发或难治性癌症。复发可指治疗后癌症在原始部位或新部位重新出现。在一些实施方案中，对pd-1轴拮抗剂的抗性包括在用pd-1轴拮抗剂治疗期间癌症进展。在一些实施方案中，对pd-1轴拮抗剂的抗性包括对治疗不反应的癌症。癌症可在治疗开始时有抗性，或者其可在治疗期间变得有抗性。在一些实施方案中，癌症处于早期或晚期。
[0264]
在另一方面，个体患有表达(例如在诊断测试中已显示表达)pd-l1生物标记的癌症。在一些实施方案中，患者的癌症表达低pd-l1生物标记。在一些实施方案中，患者的癌症表达高pd-l1生物标记。在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，当pd-l1生物标记占样品的0％时，其不存在于样品中。
[0265]
在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，当pd-l1生物标记占样品的超
过0％时，其存在于样品中。在一些实施方案中，pd-ll生物标记以样品的至少1％存在。在一些实施方案中，pd-l1生物标记以样品的至少5％存在。在一些实施方案中，pd-l1生物标记以样品的至少10％存在。
[0266]
在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，使用选自facs、蛋白质印迹、elisa、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射性免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、hplc、表面等离子体共振、光谱学、质谱、hplc、qpcr、rt-qpcr、多重qpcr或rt-qpcr、rna-seq、微阵列分析、sage、massarray技术和fish，以及它们的组合的方法，检测样品中的pd-l1生物标记。
[0267]
在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，通过蛋白质表达检测样品中的pd-l1生物标记。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(ihc)测定蛋白质表达。在一些实施方案中，使用抗pd-l1抗体检测pd-l1生物标记。在一些实施方案中，pd-l1生物标记由ihc检测为弱染色强度。在一些实施方案中，pd-l1生物标记由ihc检测为中等染色强度。在一些实施方案中，pd-l1生物标记由ihc检测为强染色强度。在一些实施方案中，在肿瘤细胞、肿瘤浸润性免疫细胞、基质细胞以及它们的任何组合上检测pd-l1生物标记。在一些实施方案中，染色是膜染色、细胞质染色或它们的组合。
[0268]
在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，pd-l1生物标记的不存在被检测为样品中不存在或没有染色。在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，pd-l1生物标记的存在被检测为样品中的任何染色。
[0269]
可以在本领域已知的各种模型如临床或临床前模型中测试本文所述的任何方法(例如，组合治疗，包括给药pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼的有效量的组合)的效力。本文例示了合适的临床前模型，并且进一步可包括但不限于id8卵巢癌、gem模型、b16黑素瘤、renca肾细胞癌、ct26结肠直肠癌、mc38结肠直肠癌，以及癌症的cloudman黑素瘤模型。
[0270]
对于任何这些示例性模型，在发展肿瘤之后，将小鼠随机招募到接受组合抗pdl1和非索替尼治疗或对照治疗的治疗组中。在疗程期间测量肿瘤尺寸(例如，肿瘤体积)，并且还监测总生存率。
[0271]
在另一方面，本文提供了用于调节患有癌症的受试者中的免疫功能的方法，该方法包括给药有效量的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼的组合。
[0272]
在本公开的方法的一些实施方案中，癌症(在一些实施方案中，如使用诊断测试所检查的患者的癌症样品)具有升高水平的t细胞浸润。如本文所用，癌症的t细胞浸润可以指处于癌症组织内或以其它方式与癌症组织相关联的t细胞如肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的存在。本领域已知t细胞浸润可以与某些癌症中改善的临床结果相关联(参见例如zhang等人,n.engl.j.med.348(3):203-213(2003))。
[0273]
在本公开的方法的一些实施方案中，个体患有t细胞功能障碍性障碍。在本公开的方法的一些实施方案中，t细胞功能障碍性障碍的特征在于t细胞失能或者分泌细胞因子、增殖或执行溶细胞活性的能力降低。在本公开的方法的一些实施方案中，t细胞功能障碍性障碍的特征在于t细胞衰竭。在本公开的方法的一些实施方案中，t细胞是cd4 和cd8 t细胞。不受理论的约束，相对于给药组合之前而言，非索替尼治疗可增加t细胞(例如，cd4 t细胞、cd8 t细胞、记忆t细胞)引发、活化和/或增殖。在一些实施方案中，t细胞是cd4 和/或cd8 t细胞。
[0274]
在本公开的方法的一些实施方案中，癌症(在一些实施方案中，使用诊断测试检查患者的癌症样品)具有低水平的t细胞浸润。在一些实施方案中，癌症(在一些实施方案中，使用诊断测试检查患者的癌症的样品)具有不可检测的t细胞浸润。在一些实施方案中，癌症是非免疫原性癌症(例如，非免疫原性结肠直肠癌和/或卵巢癌)。不受理论的约束，相对于给药组合之前而言，非索替尼治疗可增加t细胞(例如，cd4 t细胞、cd8 t细胞、记忆t细胞)引发、活化和/或增殖。
[0275]
本文所述的任何癌症可用于方法中。
[0276]
在一些实施方案中，受试者或个体为人类。
[0277]
剂量水平和剂量方案
[0278]
可以给药有效量的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼以预防或治疗疾病。pd-1轴结合拮抗剂和/或非索替尼的适当剂量可以基于待治疗疾病的类型、pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应，以及主治医师的判断来决定。在一些实施方案中，非索替尼和pd-1轴结合拮抗剂(例如，抗pd-1或抗pdl1抗体)的组合治疗是协同的，由此相对于作为单一试剂的非索替尼的有效剂量而言，组合中非索替尼的有效剂量降低。
[0279]
作为一般建议，无论是通过一次还是多次给药，本文所提供的给药于人的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量将在约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.5mg/kg)患者体重的范围内。在一些实施方案中，使用的抗体或其抗原结合片段为每天给药1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段以约50mg/kg或更少、10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.1mg/kg或更少给药。
[0280]
在一些实施方案中，给药剂量可以在疗程内变化。例如，在一些实施方案中，初始给药剂量可以高于后续给药剂量。在一些实施方案中，给药剂量可以在疗程内根据受试者的反应而变化。
[0281]
特定剂量可以以多个间隔给药，如每天一次、每天两次或更多次、每月两次或更多次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、或每两个月一次或更更长时间一次。在某些实施方案中，给药的剂量可以随着疗程而变化。例如，在某些实施方案中，给药的初始剂量可以高于后续剂量。在某些实施方案中，给药的剂量在疗程期间根据待给药受试者的反应而调整。可以调整剂量方案以实现最佳反应(例如，治疗反应)。例如，可以给药单剂量，或者在一段时间内给药多个分剂量。
[0282]
一般来讲，非索替尼的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这样的有效剂量通常取决于上述因素。通常，对于患者而言，本发明化合物的剂量在约0.0001至约100mg/kg体重/天的范围内。例如，剂量可为10至2000mg/天。或者，剂量可为100至1000mg/天、或200至600mg/天。根据需要，活性化合物的有效日剂量能够以一个、二个、三个、四个、或更多个亚剂量给药，在全天任选地以单位剂型按适当的间隔分开给药所述亚剂量。
[0283]
在一些实施方案中，本发明的组合疗法包含给药pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼。
可将pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼以本领域已知的任何合适的方式给药。例如，pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼可依次(在不同时间)或并行(在相同时间)给药。在一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂处于与非索替尼分开的组合物中。在一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂处于与非索替尼相同的组合物中。
[0284]
pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼可以通过相同的给药途径或者通过不同的给药途径给药。在一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眼眶内、经植入、经吸入、鞘内、心室内、或鼻内给药。在一些实施方案中，非索替尼经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眼眶内、经植入、经吸入、鞘内、心室内、或鼻内给药。
[0285]
在一些实施方案中，本发明的组合疗法中的每种治疗剂可以同时地(即，在同一药物中)、并行(即，在以任何次序一个接一个给药的分开药物中)或以任何次序依次给药。当组合疗法中的治疗剂为不同剂型(一种试剂为片剂或胶囊且另一种试剂为无菌液体)和/或以不同给予计划表给药时，例如，至少每天给药的化学治疗剂以及不太频繁给药(如每周一次、每两周一次、或每三周一次)的生物治疗剂，依次给药是特别有用的。
[0286]
在一些实施方案中，在给药pd-l1拮抗剂之前给药非索替尼，而在其他实施方案中，在给药pd-l1拮抗剂之后给药非索替尼。
[0287]
在一些实施方案中，组合疗法中的至少一种治疗剂利用该试剂作为单一疗法用来治疗相同的癌症时典型采用的相同剂量方案(治疗的剂量、频率和持续时间)进行给药。在其他实施方案中，患者所接受的组合疗法中的至少一种治疗剂的总量低于该试剂作为单一疗法使用时的情况，例如较小剂量、较低频率剂量、和/或较短治疗持续时间。本发明的组合疗法中的每种小分子治疗剂可以经口服或胃肠外给药，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠、局部、以及透皮给药途径。
[0288]
本发明的组合疗法中的治疗剂可通过连续输注或者以例如每天、每隔一天、每周三次、或每周、两周、三周、每月和两月一次等间隔给予进行给药。每周总剂量通常为至少0.05mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg体重或更多。
[0289]
本发明的组合疗法中的每种治疗剂可单独地或者以包含治疗剂和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂的药物(本文也称为药物组合物)根据标准药学实践进行给药。
[0290]
在一些实施方案中，方法还可包含额外的疗法。额外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，病灶切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、或前述的组合。额外的疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，额外的疗法是给药小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，额外的疗法是给药副作用限制剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重程度的试剂，如止吐剂等)。在一些实施方案中，额外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，额外的疗法是手术。在一些实施方案中，额外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，额外的疗法是γ辐射。
[0291]
本发明的组合疗法可以在手术移除肿瘤之前或之后使用，并且可以在放射疗法之前、期间或之后使用。在一些实施方案中，将本发明的组合疗法给药于先前未曾用生物治疗
剂或化学治疗剂治疗的患者。在其他实施方案中，将组合疗法给药于在用生物治疗剂或化学治疗剂进行先前疗法(即经历过治疗)之后未能实现持续反应的患者。
[0292]
本发明的组合疗法典型地用于治疗大到足以通过触诊或者通过本领域公知的成像技术如mri、超声、或cat扫描发现的肿瘤。在一些实施方案中，本发明的组合疗法用于治疗尺寸为至少约200mm3、300mm3、400mm3、500mm3、750mm3、或多至1000mm3的晚期肿瘤。
[0293]
在一些实施方案中，向患有pd-l1表达测试呈阳性的癌症的人患者给药本发明的组合疗法。在一些实施方案中，可以在从患者移除的肿瘤样品的ffpe或冷冻组织切片上，在ihc测定中使用诊断性抗人pd-l1抗体或其抗原结合片段来检测pd-l1表达。典型地，在开始用pd-l1拮抗剂和vegfr抑制剂治疗之前，患者的医师将要求诊断测试，以确定从患者移除的肿瘤组织样品中的pd-l1表达，但设想医师可在开始治疗之后的任何时间(例如，在治疗周期完成之后)要求第一或后续诊断测试。选择用于本发明的组合疗法的剂量方案(本文也称为给药方案)取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平、实体的免疫原性，以及所治疗受试者中靶细胞、组织或器官的可及性。优选地，剂量方案使递送至患者的每种治疗剂的量最大化，与副作用的可接受水平一致。因此，组合中每种生物治疗剂和化学治疗剂的剂量和给予频率部分地取决于特定治疗剂、所治疗癌症的严重程度和患者特征。选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量的指导是可用的。
[0294]
临床医师可以例如使用本领域已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定适当的剂量方案，并且将取决于例如患者的临床病史(例如先前的疗法)、待治疗的癌症的类型和阶段，以及对组合疗法中的一种或多种治疗剂反应的生物标记。
[0295]
药物组合物、药物和试剂盒
[0296]
本发明还提供了组合物，该组合物包含如上所述的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼以及药学上可接受的赋形剂或载体。
[0297]
用于本文所公开的药物组合物中的药学上可接受的赋形剂或载体可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性介质、非水性介质、抗微生物材料等。渗透材料、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、佐剂或无毒辅助物质、本领域已知的其他组分或上述的各种组合。
[0298]
合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘结剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、增味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、脱水山梨糖醇、丁基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。
[0299]
另外，药学上可接受的赋形剂或载体可包括例如水性媒介物，如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒介物，如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油、或花生油、抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮剂和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(tween-80)；多价螯合剂或螯合剂，如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸、或乳酸。可以将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，包括苯酚或甲酚、汞制剂、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯
铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂、或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、或环糊精的试剂。
[0300]
药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释制剂或粉末。口服制剂可包括标准载体如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0301]
在一些实施方案中，将药物组合物配制成可注射组合物。可以将可注射药物组合物以任何常规形式制备，例如，液体溶剂、悬浮液、乳化剂或适于产生液体溶剂、悬浮液或乳化剂的固体形式。
[0302]
本发明还提供了药物，该药物包含如上所述的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼以及药学上可接受的赋形剂或载体。
[0303]
在一些实施方案中，包含抗pd-l1抗体作为pd-1轴结合拮抗剂的药物可作为液体制剂提供，或者通过在使用前用无菌注射用水重构冻干粉末来制备。
[0304]
本文所述的pd-1轴结合拮抗剂和非索替尼药物可以以制品或试剂盒提供，其包含第一容器和第二容器以及包装插页。第一容器含有至少一个剂量的包含pd-1轴结合拮抗剂的药物，第二容器含有至少一个剂量的包含非索替尼的药物，并且包装插页或标签包含使用药物治疗癌症患者的说明书。在一些实施方案中，制品或试剂盒还包含包装插页，该包装插页包含使用pd-1轴结合拮抗剂与非索替尼联合治疗个体中的癌症或者延迟癌症进展或者增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。第一和第二容器可由相同或不同的形状(例如，小瓶、注射器和瓶)和/或材料(例如，塑料或玻璃)构成。
[0305]
制品或试剂盒还可包含可用于给药药物的其他材料，如稀释剂、过滤器、iv袋和管线、针和注射器。在制品或试剂盒的一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂是抗pd-l1抗体，并且说明书陈述药物旨在用于治疗患有癌症的患者，所述癌症通过ihc测定测试为对pd-l1表达呈阳性。
[0306]
在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另外药剂(例如，化学治疗剂和抗肿瘤剂)。适于一种或多种药剂的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。
[0307]
本文所述的任何pd-1轴结合拮抗剂可用于本公开的药物组合物、药物和试剂盒中。例如，在一些实施方案中，pd-1轴结合拮抗剂是抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其包含：包含seq id no:47的重链可变区；以及包含seq id no:49的轻链可变区。
[0308]
本发明的这些和其他方面，包括以下列出的示例性具体实施方案，将从本文所含的教导显而易见。
[0309]
认为本说明书足以使得本领域的技术人员实施本发明。根据前面的描述，除了本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修改形式对于本领域的技术人员将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的据此全文以引用方式并入。
[0310]
iii.实施例
[0311]
通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文所述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域的技术人员提出根据其作出各种修改或更改，并且包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求
的范围之内。
[0312]
实施例1
[0313]
ccl20与fgf19表达的相关性以及非索替尼的抑制
[0314]
ccl20 elisa测定
[0315]
将指定为fgf19表达阳性(通过broad ccle rna-seq，fgf19表达大于0.1fpkm)或指定为fgf19表达阴性(通过broad ccle rna-seq，fgf19表达小于0.1fpkm)的肝细胞癌细胞系铺板在适当的培养基中，并在37℃下用不同浓度的非索替尼处理72小时。在非索替尼孵育之后，收集每个样品的上清液，并根据推荐(r&d systems,inc.，目录号dm3a00)在新板中与测定稀释剂rd1-57以1:1混合。然后，将该板在室温下孵育2小时。接着，使用推荐的缓冲剂执行4次洗涤，并将人mip-3α缀合物添加到每个样品中。将样品在室温下孵育2小时，然后重复洗涤；然后将样品与底物溶液一起在室温下避光孵育30分钟。接着，将终止溶液添加到每个样品中，并且在该添加的30分钟内，使用设定为450nm的酶标仪读板，以测定每个样品的光密度。细胞系获自atcc、日本生物资源研究保藏中心(japanese collection of research bioresources，jcrb)或riken生物资源研究中心(riken bioresource research center)。结果如图1所示。
[0316]
实施例2
[0317]
非索替尼对调节性t细胞迁移的效应
[0318]
将指定为fgf19表达阳性(通过broad ccle rna-seq，fgf19表达大于0.1fpkm)的肝细胞癌细胞系铺板在适当的培养基中，并在37℃下用媒介物或1μm非索替尼处理72小时。在非索替尼孵育之后，收集每个样品的上清液并转移到24孔板的新孔中。将具有5.0μm孔聚碳酸酯膜插入物(sigma-aldrich，目录号cls3421-48ea)的6.5mm 置于各孔中，搁置于铺板的上清液的顶上。接着，将解冻的外周血cd4 /cd25 调节性t细胞(allcells,llc，目录号pb009-4f)置于每个transwell插入物中的不含细胞因子和趋化因子的培养基中，并允许在37℃下孵育18小时。在18小时之后，小心地移除transwell插入物。收集剩余的细胞、上清液和培养基，并在台式微量离心机中以1,500rpm旋转5分钟，以沉淀来自每个样品的迁移细胞。将沉淀的细胞重悬于pbs中，铺板，并在室温下孵育30分钟。然后将溶液(promega，目录号g7570)以1:1添加到各孔的细胞中，并将混合物以350rpm振荡2分钟。接着，允许板在室温下孵育10分钟，此后，使用酶标仪记录每个样品的发光。重组人ccl20/mip-3α蛋白(r&d systems,inc.，目录号360-mp-025)用作调节性t细胞迁移的阳性对照。用代表样品平均值的条绘制各个数据；描绘了平均值的标准误差(sem)。细胞系获自atcc、日本生物资源研究保藏中心(japanese collection of research bioresources，jcrb)或riken生物资源研究中心(riken bioresource research center)。结果如图2所示。
[0319]
实施例3
[0320]
非索替尼在jhh7小鼠的免疫缺陷异种移植物中的评估
[0321]
为了确定免疫系统是否在非索替尼的抗肿瘤功能中发挥作用，将100只雌性nu/nu小鼠用5百万个jhh7肝细胞癌细胞系(jcrb)细胞/小鼠接种。用0.1ml的bd matrigel在0.1ml悬浮液中制备细胞。2只动物指定为前哨；2只动物指定为额外动物。在整个研究期间，通过一般临床观察每天监测接种的动物。将体重在随机化之前每周记录两次，并在给药期
间每天记录，并根据体重调整剂量。根据下式计算每只小鼠的体重相对变化(rcbw)：rcbw(％)＝(bwi
–
bw0)/bw0
×
100；bwi是特定日的体重；bw0是给药第一天的体重。还计算了每组的rcbw的平均值和标准偏差。在整个研究期间使用电子数显卡尺每周测量肿瘤面积(长度
×
宽度)两次，并基于下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度
×
宽度2)/2。数据图形化表示为初始肿瘤体积的百分比(％)。一旦它们的肿瘤达到适当的尺寸(100-300mm3)，就选择50只动物用于非索替尼效力研究。将50只动物随机化(阻断随机化/使用excel软件)并分成以下组用于化合物给药：媒介物；30mg/kg bid的非索替尼，po；100mg/kg bid的非索替尼，po；200mg/kg bid的非索替尼，po。每天监测所有动物进行临床观察(动物死亡率、外观、自发活动、身体姿势以及食物和水摄入。记录任何病变和不良反应)。对显示出虚弱、显著的体重减轻(》20％)、恶病质或者会抑制动物饮食能力或运动性的大肿瘤的任何动物，立即处以安乐死。对患有严重溃疡、感染或严重出血性肿瘤、或估计肿瘤重量超过体重20％的任何动物处以安乐死。治疗21天后终止研究。免疫缺陷jhh7小鼠的结果显示于图3a中。
[0322]
非索替尼在jhh7小鼠的免疫感受态异种移植物中的评估
[0323]
根据jackson实验室推荐的程序，对雌性nsg
tm-sgm3小鼠进行骨髓细胞清除。在骨髓细胞清除后，经由尾静脉注射来自三个供体之一的人cd34 脐带血细胞来重建小鼠。一旦动物的外周血的人cd45 百分比达到》25％，在重建后约105-120天(3.5-4个月)，将30只小鼠用与bd matrigel的1:1混合物中的5百万个jhh7肝细胞癌细胞系(jcrb)细胞/小鼠接种。在整个研究期间，通过一般临床观察每天监测接种动物。将体重在随机化之前每周记录两次，并在给药期间每天记录，并根据体重调整剂量。根据下式计算每只小鼠的体重相对变化(rcbw)：rcbw(％)＝(bwi
–
bw0)/bw0
×
100；bwi是特定日的体重；bw0是给药第一天的体重。还计算了每组的rcbw的平均值和标准偏差。在整个研究期间使用电子数显卡尺每周测量肿瘤面积(长度
×
宽度)两次，并基于下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度
×
宽度2)/2。数据图形化表示为初始肿瘤体积的百分比(％)。一旦它们的肿瘤达到适当的尺寸(54-120mm3)，就选择18只动物用于非索替尼效力研究。将18只动物随机化(阻断随机化/使用excel软件)并分成以下组用于化合物给药：媒介物；200mg/kg bid的非索替尼，po。每天监测所有动物进行临床观察(动物死亡率、外观、自发活动、身体姿势以及食物和水摄入。记录任何病变和不良反应)。对显示出虚弱、显著的体重减轻(》20％)、恶病质或者会抑制动物饮食能力或运动性的大肿瘤的任何动物，立即处以安乐死。对患有严重溃疡、感染或严重出血性肿瘤、或估计肿瘤重量超过体重20％的任何动物处以安乐死。治疗41天后终止研究。免疫感受态jhh7小鼠的结果显示于图3b中。
[0324]
如图3所示，与免疫缺陷肿瘤模型中的相比，对于免疫感受态动物，相同剂量的非索替尼在移植有cd34 造血干细胞的免疫感受态jhh7小鼠肿瘤模型内显示出更高的抗肿瘤活性，其中包括t淋巴细胞的人免疫系统在免疫缺陷小鼠中重建。移植的肿瘤是具有扩增和高度表达的fgf19的jhh-7人hcc细胞，其与临床适应症有关。这些结果指示免疫系统在非索替尼的抗肿瘤功能中发挥作用(图5)。由于pd-l1抗体可以特异性阻断pd-1/pd-l1的信号通路、抑制免疫负调节信号、恢复t淋巴细胞的活性并增强免疫反应，因此基于这些结果，预期将非索替尼与抗pd-l1抗体组合提供优于单一疗法的效应。
[0325]
实施例4
[0326]
非索替尼增强肿瘤中的t淋巴细胞浸润
no:49的轻链可变区；储备溶液：30mg/ml。
[0349]
pbmc：
[0350]
来自两个不同供体的冷冻pbmc(代码为1911150123，来自stemcells)从供应商stemexppress订购。
[0351]
测定过程
[0352]
规程a：
[0353]
在第1天，将hep-3b细胞解离并收集(培养基：mem 10％fbs 1％ps 2％nahco3 1％丙酮酸钠)，并以5-20
×
106个细胞/ml重悬于适当体积的pbs中。在pbs(预热至rt)中制备2x cfse溶液(5μm)，并以等体积添加到hep-3b细胞溶液中，之后立即混合。在37℃下于暗处孵育5-10分钟之后，通过添加4-5体积的冰冷测定培养基(含有≥10％血清)完成cfse标记。在冰上孵育5分钟之后，将标记的细胞用预温热的培养基洗涤两次，并重悬于5-6ml的测定培养基中，并调节至适当的细胞密度。将细胞在培养基中培养，并以1
×
105个细胞/孔铺板在24孔板中。
[0354]
同日，将冷冻的pbmc细胞复苏并活化，然后转移到10ml测定培养基(rpmi-1640 10％fbs)中，并以1500rpm离心10分钟。将pbmc细胞重悬于适当体积的含有1μg/ml的cd3和1μg/ml的cd28 ab的测定培养基中，以使细胞密度为1.5
×
106个细胞/ml，并在37℃下孵育24小时。
[0355]
在第2天，对于细胞杀伤测定，将活化的pbmc收集到50ml管中，以1500rpm离心10分钟，用适当体积的测定培养基悬浮并用相同的培养基调节至适当的浓度。然后，将活化pbmc添加到hep-3b细胞中，以制备10:1的e:t比率(e/t比率是效应子/靶细胞比率)。按照如表1所示的规程设计，处理共培养的hep-3b和pbmc(每种处理2个独立的孔)，并在37℃下培养72小时。
[0356]
在处理后，在第5天使用flowjo通过流式细胞术检测和分析cfse 肿瘤细胞的l/d ％。结果汇总于图6-a中。
[0357]
表1.处理组
[0358][0359]
注释：“iso”或“同种型对照”意指来自与特定科学应用中使用的第一抗体相同的物种、免疫球蛋白类别、亚类和轻链的阴性对照抗体。其用于区分相比于背景噪声或其他非特异性相互作用的阳性信号或结果。
[0360]
规程b：
[0361]
在第1天，用cfse标记hep-3b细胞，以与规程a中所述相同的方式培养并铺板到24孔板中，随后用20ng/ml ifn-γ处理细胞24小时。同天，如规程a中所述复苏并活化pbmc细胞。
[0362]
在第2天，对于细胞杀伤测定，将活化pbmc收集到50ml管中，以1500rpm离心10分钟，用适当体积的测定培养基悬浮并用相同的培养基调节至适当的浓度。然后，将活化pbmc添加到hep-3b细胞中，以制备10:1的e:t比率。按照如表2所示的规程设计，处理共培养的hep-3b和pbmc(每种处理2个独立的孔)，并在37℃下培养48小时。
[0363]
在处理后，在第5天使用flowjo通过流式细胞术检测和分析l/d

％的cfse

肿瘤细胞。使用单因素方差分析，继之以tukey的多重比较检验来分析数据。结果汇总于图6-b中。这些结果展示，在rhifn-γ预处理的hep-3b中，非索替尼和/或ab-1(单一或组合)表现出显著增强的pbmc介导的肿瘤杀伤效力。
[0364]
表2.处理组
reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.nat.biotechnol.28,511-515(2010).
[0375]
应当理解，本文所述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域的技术人员提出根据其作出各种修改或更改，并且包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。此外，本文所公开的任何本发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文所公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他本发明或其实施方案组合，并且所有这样的组合设想在本发明的范围内而不限于此。