鉴定β-内酰胺酶的化合物及其使用方法与流程

鉴定
β-内酰胺酶的化合物及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119要求于2020年8月29日提交的申请号为62/893,801的临时申请的优先权，该临时申请的公开内容通过引用并入本文。
3.政府支持的声明
4.本发明是在由国立卫生研究院(the national institutes of health)授予的授权号为ai117064的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
5.本文提供可以用于鉴定样品中特定类型和种类的β-内酰胺酶的化合物及其使用方法。
6.序列表通过引用并入
7.标题为“序列_st25.txt”的序列表在此一同提交，其创建于2020年8月26日并且具有4252字节的数据，在ibm-pc、ms-windows操作系统上经机器格式化。出于所有目的，该序列表特此通过引用以其整体并入本文。
8.背景
9.β-内酰胺酶代表重要的诊断靶标，因为它们决定对β-内酰胺抗生素的抗性，并且它们在患者样品中的存在可以显著地影响临床决策制定。为通过生物化学测定进行的直接或间接的β-内酰胺酶检测所做的努力依赖于显色、荧光或化学发光化学探针，由于灵敏度差，这些方法向临床应用的转化受到了限制。该灵敏度仍然是问题，其源于诱导感染性疾病的病症所需的细菌数量低，范围为1cfu/ml至10000cfu/ml(cfu，菌落形成单位)，由这些细菌表达的赋予抗生素抗性的酶的检测需要费力且耗时的培养和/或昂贵的分析仪器。
10.先进的仪器，如pcr、基质辅助激光解吸电离质谱和显微镜检查已被认为是提高病原菌的检测限的方法。然而，该策略仅对于发达国家是实用的，并且仍然存在这样的未满足的需求，即拥有可以在全球、特别是资源可能受限的低收入和中等收入(lmic)国家使用的可靠的诊断工具。
11.概述
12.该公开内容提供β-内酰胺酶探针以及用于在扩增系统中使用这些探针以检测β-内酰胺酶变体的活性的方法和系统。还公开测定生物样品中β-内酰胺抗性的方法，所述方法包括使获自受试者的样品与β-内酰胺酶探针和扩增测定混合物接触，由此测量着色或荧光产物；和将着色或荧光产物的程度与涉及尿路感染的样品中的β-内酰胺抗性相关联。还公开区分生物样品中可能存在的β-内酰胺酶变体的方法；其中所测量的着色或荧光产物通过由抑制剂(例如包括但不限于克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦或rpx7009)对目标β-内酰胺酶的抑制而改变。还公开这样的方法，其用于在获自受试者的生物样品中进行抗生素敏感性测试并且使所述样品与抗生素药物、β-内酰胺酶探针和扩增测定混合物接触，并且测量着色或荧光产物；将着色或荧光产物的程度与药物敏感性相关联，其中光信号输出的降低或无光信号输出指示敏感性，并且信号输出的增加指示对所考虑的药物的抗性。
13.在具体实施方案中，该公开内容提供一种化合物，其具有式i或式ii的结构：
[0014][0015][0016]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：t1是含苯硫酚的基团或z2，其中如果t1是z2，则z1是t2；z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2，其中如果z1是t2，则t1是z2；t2是含苯硫酚的基团；t3是含苯硫酚的基团；z2是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；z3是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；x1是是
[0017]
y1是y2是r
1-r6、r
9-r
11
、r
13
和r
14
各自独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环；r7是任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的
芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；和r8是前提是所述化合物不具有以下结构：在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，t1或t2是选自以下的苯硫酚基团：
[0018]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，r7选自以下：
[0019]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有式i(a)的结构：
[0020][0021]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：t1是含苯硫酚的基团或z2，其中如果t1是z2，则z1是t2；z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2，其中如果z1是t2，则t1是z2；t2是含苯硫酚的基团；z2是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；x1是是r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；r6是h、或胺；r7是任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；r8是并且r9是羟基或(c
1-c3)烷氧基。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，t1或t2是选自以下的苯硫酚基团：
[0022][0022]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，r7选自以下：
[0023][0023]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有式i(b)的结构：
[0024][0025]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：t1是选自以下的含苯硫酚的基团：的含苯硫酚的基团：
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2；x1是是r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；r6是h、或胺；r7是任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；r8是并且r9是羟基或(c
1-c3)烷氧基。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，r7选自以下：
[0026]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有式i(c)的结构：
[0027][0028]
x1是
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；r6是h、或胺；r7选自以下：
[0029][0029][0029]
以及
r8是并且r9是在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物选自以下：
[0030]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有以下的结构：
[0031][0032]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，t3是选自以下的含苯硫酚的基团：
[0033][0033]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有式ii(a)的结构：
[0034][0035]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：y2是r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有式ii(b)的结构：
[0036][0037]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：y2是r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮和任选地取代的(c
1-c6)烷基。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物具有选自以下的结构：
[0038]
[0039]
在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，化合物基本上是单一对映体或单一非对映体，其中化合物具有(r)立构中心。
[0040]
该公开内容还提供一种检测样品中一种或多种目标β-内酰胺酶的存在的方法，其包括：(1)向疑似包含一种或多种目标β-内酰胺酶的样品中添加试剂，其中试剂包含：(i)所公开的化合物；(ii)半胱氨酸蛋白酶的显色底物；(iii)笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶；和(iv)任选的针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂；(2)测量样品的吸光度；(3)将样品孵育至少10min，并且然后重新测量样品的吸光度；(4)通过从步骤(3)中测量的样品的吸光度中减去步骤(2)中测量的样品的吸光度计算得分；(5)将得分与实验测定的阈值进行比较；其中如果得分超过阈值，则指示样品包含一种或多种目标β-内酰胺酶；并且其中如果得分低于阈值，则指示样品不包含一种或多种目标β-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)，样品获自受试者。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，受试者是患有或疑似患有细菌感染的人患者。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，人患者患有或疑似患有尿路感染。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)，样品是血液样品、尿液样品、脑脊液样品、唾液样品、直肠样品、尿道样品、或眼样品。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)，样品是血液样品或尿液样品。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)，样品是尿液样品。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)，一种或多种目标β-内酰胺酶选自青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶(esbl)、抑制剂抗性β-内酰胺酶、ampc-型β-内酰胺酶和碳青霉烯酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，esbl选自temβ-内酰胺酶、shvβ-内酰胺酶、ctx-mβ-内酰胺酶、oxaβ-内酰胺酶、perβ-内酰胺酶、vebβ-内酰胺酶、gesβ-内酰胺酶和ibcβ-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，一种或多种目标β-内酰胺酶包含ctx-mβ-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，碳青霉烯酶选自金属-β-内酰胺酶、kpcβ-内酰胺酶、维罗纳整合子编码的金属-β-内酰胺酶、苯唑西林酶、cmyβ-内酰胺酶、新德里金属-β-内酰胺酶、粘质沙雷氏菌酶、imi青霉烯水解β-内酰胺酶、nmcβ-内酰胺酶和ccraβ-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，一种或多种目标β-内酰胺酶包含cmyβ-内酰胺酶和/或kpcβ-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，一种或多种目标β-内酰胺酶进一步包含ctx-mβ-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)(ii)，半胱氨酸蛋白酶的显色底物是木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶k、钙蛋白酶、半胱天冬酶-1、半乳糖苷酶、分离酶(seperase)、腺病毒肽链内切酶(adenain)、焦谷氨酰肽酶i、转肽酶a、丙型肝炎病毒肽酶、辛德比斯病毒型nsp2肽酶、二肽基肽酶vi、desi-1肽酶、tev蛋白酶、酰胺磷酸核糖基转移酶前体、γ-谷氨酰水解酶、刺猬蛋白、或dmpa氨肽酶的显色底物。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，半胱氨酸蛋白酶的显色底物是木瓜蛋白酶的显色底物。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，木瓜蛋白酶的显色底物选自偶氮酪蛋白、l-焦谷氨酰基-l-苯丙氨酰基-l-亮氨酸-对硝基苯胺(pflna)、nα-苯甲酰基-l-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(bapa)、焦谷氨酰基-l-苯丙氨酰基-l-亮氨酸-对硝基苯胺(pyr-phe-leu-pna)和z-phe-arg-对硝基苯胺。在另一实施方案
或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，木瓜蛋白酶的显色底物是bapa。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)(iii)，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶包含选自以下的半胱氨酸蛋白酶：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶k、钙蛋白酶、半胱天冬酶-1、半乳糖苷酶、分离酶、腺病毒肽链内切酶、焦谷氨酰肽酶i、转肽酶a、丙型肝炎病毒肽酶、辛德比斯病毒型nsp2肽酶、二肽基肽酶vi、desi-1肽酶、tev蛋白酶、酰胺磷酸核糖基转移酶前体、γ-谷氨酰水解酶、刺猬蛋白和dmpa氨肽酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶包含木瓜蛋白酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶-s-sch3。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(1)(iii)，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶可以通过与低分子量硫醇盐阴离子或无机硫化物反应而被再活化。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶可以通过与苯硫酚盐阴离子反应而被再活化。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，一种或多种目标β-内酰胺酶与(i)的化合物反应以产生苯硫酚盐阴离子。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，从步骤(1)(i)的化合物释放的苯硫酚盐阴离子与笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶反应以使半胱氨酸蛋白酶再活化。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶-s-sch3。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，半胱氨酸蛋白酶的显色底物是bapa。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(2)，在0min测量样品的吸光度。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(3)，将样品孵育15min至60min。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，将样品孵育30min。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(2)和(3)，在400nm至450nm的波长下测量样品的吸光度。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(2)和(3)，在405nm的波长下测量样品的吸光度。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(2)和(3)，使用分光光度计或酶标仪测量样品的吸光度。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，对于步骤(5)，通过分析由产生β-内酰胺酶的细菌的分离菌组(isolate panel)生成的受试者操作特性(roc)曲线确定实验测定的阈值，其中一种或多种目标β-内酰胺酶在分离菌组中具有最低检测限(lod)。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，所述方法在步骤(1)(iv)中使用或不使用针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂的情况下进行。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，在不使用抑制剂进行的方法与使用抑制剂进行的方法之间，步骤(4)的得分的测量变化指示样品中存在特定类型或种类的β-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂是针对选自以下种类的β-内酰胺酶的抑制剂：青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶(esbl)、抑制剂抗性β-内酰胺酶、ampc-型β-内酰胺酶和碳青霉烯酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂抑制esbl，但不抑制ampc-型β-内酰胺酶。在另一实施方案或任何前述实施方案的进一步的实施方案中，抑制剂是克拉维酸或舒巴坦。
[0041]
本发明的另外的列举方面和实施方案包括：
[0042]
1.一种使用触发释放化学团(chemophore)以检测抗性标记物的方法，其包括：(a)将包含超广谱β-内酰胺酶(esbl)的临床样品与混杂的头孢菌素化学团一起孵育，所述混杂的头孢菌素化学团被内酰胺酶水解以释放硫醇触发剂；(b)将硫醇触发剂与二硫化物灭活的扩增酶一起孵育以在硫醇和二硫化物的交换反应中使扩增酶活化；(c)将活化的扩增酶与扩增酶底物一起孵育以产生扩增信号；和(d)检测扩增信号作为样品中产生超广谱β-内酰胺酶(esbl)的细菌的指示。
[0043]
2.方面1的方法，其中扩增酶是半胱氨酸蛋白酶或具有半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白酶。
[0044]
3.方面1的方法，其中扩增酶是选自以下的半胱氨酸蛋白酶：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶k和钙蛋白酶、半胱天冬酶-1和分离酶、腺病毒肽链内切酶、焦谷氨酰肽酶i、转肽酶a、丙型肝炎病毒肽酶2、辛德比斯病毒型nsp2肽酶、二肽基肽酶vi、desi-1肽酶、tev蛋白酶、酰胺磷酸核糖基转移酶前体、γ-谷氨酰水解酶、刺猬蛋白和dmpa氨肽酶。
[0045]
4.方面1的方法，其中化学团包含烃硫基部分，其被目标酶裂解以经由消除机制释放相应的芳族或烷基硫醇。
[0046]
5.方面1的方法，其中化学团是本文所公开的结构。
[0047]
6.方面1的方法，其中扩增酶底物产生着色或荧光产物。
[0048]
7.方面1的方法，其中扩增酶底物产生自催化的次级扩增剂。
[0049]
8.方面1的方法，其中扩增酶底物产生自催化的次级扩增剂，即肽，其在骨架肽的水解裂解时释放自降解化学部分，以经历分子内环化或消除机制并形成另外的硫醇物质以触发另外的半胱氨酸蛋白酶分子。
[0050]
9.方面1的方法，其中扩增酶是木瓜蛋白酶，并且扩增酶底物是具有本文所公开的结构的木瓜蛋白酶探针。
[0051]
10.方面1的方法，其中扩增酶是木瓜蛋白酶，并且扩增酶底物是具有本文所公开的结构的木瓜蛋白酶探针，并且释放硫醇的化学团具有本文所公开的结构。
[0052]
11.方面1的方法，其中样品是未处理的尿液。
[0053]
12.方面1的方法，其中样品是患者样品，并且所述方法还包括治疗患者的由对β-内酰胺抗生素具有抗性的细菌病原体引起的感染。
[0054]
13.方面1的方法，其中样品是患者未处理的尿液样品，并且所述方法还包括治疗患者的对β-内酰胺抗生素具有抗性的细菌病原体的尿路感染(uti)。
[0055]
本发明涵盖本文所列举的具体实施方案的所有组合，如同每个组合都已被着力地列举一样。
[0056]
在附图和以下描述中阐述了该公开内容的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及根据权利要求，其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
[0057]
图1提供可以应用于直接揭示临床尿液样品中ctx-mβ-内酰胺酶活性的detect测定的实施方案的概述。应用于通过detect分析尿液样品的实验工作流程的显示。将小体积的尿液转移到含有detect试剂的孔中(d；步骤1和2)。用分光光度计在0min记录405nm处的吸光度(a
405nm
)。如果存在目标抗性标记物(e1；ctx-m esbl酶)，将靶向探针水解，并从探针
中消除苯硫酚触发剂，随后使detect的扩增和比色信号输出层级活化(步骤3)。室温孵育30分钟之后，再次记录a
405nm
读数，并计算detect得分(步骤4；a
405nm t30-t0)。超过实验测定的阈值的detect得分指示样品含有目标ctx-mβ-内酰胺酶，并且因此超广谱头孢菌素抗性gnb存在于尿液样品中(步骤5)。低于阈值的detect得分指示样品不含目标抗性标记物。bapa：nα-苯甲酰基-l-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐。
[0058]
图2a-2e证明detect系统优选地被ctx-m和cmyβ-内酰胺酶活化。(a)不同重组β-内酰胺酶在20min时的detect的lod(以nm计)，其中较低的条和较低的lod指示与detect系统的较大反应性。oxa-1lod(未显示)》4μm。(b)来自大肠杆菌(e.coli)和肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)的临床分离菌在30min时的平均detect得分。使用以下布置方案，基于细胞中的β-内酰胺酶内容物将分离菌分组：ctx-m》cmy》kpc》esbl shv或esbl tem》tem》shv或oxa》β-内酰胺-敏感的。方括号中的数字[#]表示每组中分离菌的数目。误差条表示标准偏差。通过双尾t-检验分析数据。对于每次比较，黑线或蓝线下每组的p值相同，因此仅列出一个p值；**p《0.01，****p《0.0001。绿色虚线表示由roc曲线分析生成的detect阈值(0.2806)。(c)bla基因在含有不同β-内酰胺酶的分离菌中的表达。与内部对照rpob相比，确定bla基因的倍数表达，以评估酶和分离菌的β-内酰胺酶表达。误差条表示两次生物学重复的标准偏差。blakpc-2的倍数表达超过图的边界，因此写入倍数表达和标准偏差。右轴线示出detect得分；红橙色圆圈表示每种分离菌的相应detect得分。(d)当将β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸掺入系统时，在具有cmy或ctx-m的分离菌中在30min时的detect得分(detect得分除以detect 抑制剂得分)的倍数变化的比较。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌临床分离菌的β-内酰胺酶内容物显示在左轴线上。黑色虚线表示指示ctx-m的存在的正阈值(倍数变化》1.97x)，其基于detect得分的平均倍数变化加上其在含有cmy的分离菌中的标准偏差的三倍来计算(由黄色条指示)。(e)当将β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸掺入系统时，产生cmy或ctx-m的分离菌在30min时的detect得分的平均倍数变化的比较(倍数变化＝detect得分/detect 抑制剂得分)。绿色虚线表示指示ctx-m的活性的正阈值(倍数变化》1.97)。****p《0.0001。
[0059]
图3呈现尿液研究工作流程的示意图，展示标准尿液样品测试和使用detect的测试。本研究中使用提交给临床实验室用于标准尿液培养的尿液样品(即来自疑似患有uti的患者)。(a)顶部组表示由临床实验室进行的用于尿液样品检查的标准过程。产生显著菌落计数(应用≥104cfu/ml截断值)的尿液样品由临床实验室进一步测试。id，鉴定；ast，抗微生物敏感性测试。(b)中间组描绘由研究的研究者进行的微生物学和分子生物学过程，其通过与临床实验室结果(cfu/ml估计值)进行比较而确认、或者由临床实验室的id和ast结果进行指导。(c)下部组示出由研究的研究者进行的detect测试工作流程。由酶标仪记录比色信号(a
405nm
)。
[0060]
图4呈现采用detect测试的临床尿液样品的情况。(a)导致uti的生物体分解。尽管假定提交至临床实验室用于尿液培养的大多数尿液样品是由患有提示uti的症状的患者提交，但此处“真实的”uti是通过菌落计数≥104cfu/ml定义的，这是指示uti的标准微生物学截断值。方括号中的数字[#]表示由指示的生物体组引起的uti的数目。(b)从尿样中鉴定的显著的gnb和gpb的分解。从96个gnb uti中鉴定出109个gnb。方括号中的数字[#]表示鉴定出细菌菌种的次数。(c)饼图证明在总uti菌群中鉴定出的esbl uti的比例。(d)在esbl阳性
样品中鉴定的产生esbl的gnb和esbl种类的分布。
[0061]
图5a-5b证明detect测定在30分钟内直接从未处理的尿液样品中鉴定由产生ctx-m的细菌引起的uti。(a)在30min时含有不同类型的细菌的尿液样品的平均detect得分。组包括：不生长细菌的尿液样品(无生长)；生长不指示uti的细菌的尿液样品(无uti)；来自由gpb或酵母菌引起的uti的尿液样品(革兰氏阳性菌(gram-pos)或酵母菌uti)；以及来自由以下gnb引起的uti的尿液样品：不含有被检测的β-内酰胺酶的gnb(无被检测的β-lac)、含有shv的gnb(shv)、含有tem的gnb(tem)、含有shv esbl的gnb(shv esbl)、含有染色体ampc的gnb(campc)、或含有ctx-m的gnb(ctx-m)。当鉴定出超过一种β-内酰胺酶时，gnb样品的组布置：ctx-m》campc》esbl shv或esbl tem》tem》shv》无被检测的β-内酰胺酶。不考虑大肠杆菌的染色体ampc，也不考虑肺炎克雷伯氏菌的染色体β-内酰胺酶(除非它是shv、或用shv引物鉴定的len变体)。31个(89％)“无被检测的β-内酰胺酶”样品产生对β-内酰胺敏感的分离菌。方括号中的数字[#]表示每组中样品的数目。误差条表示标准偏差。通过双尾t-检验分析数据。对于每次比较，黑线或蓝线下每组的p值相同，因此仅列出一个p值；*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。绿色虚线表示由roc曲线分析生成的阈值(0.2588)。(b)鉴定由产生ctx-m的第三代头孢菌素抗性gnb引起的uti的能力的detect测定规范。用于与detect比较的标准包括esbl的表型方法(esbl确证测试)和基因型方法(采用ctx-m基因的扩增子测序的pcr)。
[0062]
图6a-6b显示产生ctx-m的细菌与多药耐药性(mdr)有关。(a)从uti阳性尿液样品中培养的肠杆菌(enterobacterales)的抗微生物抗性表型，基于ctx-m内容物分组。不包括固有的头孢西丁抗性(产气肠杆菌(e.aerogenes)，霍氏肠杆菌(e.hormaechei)，弗氏枸橼酸杆菌(c.freundii)和成团泛菌(p.agglomerans))。不包括固有的呋喃妥因和替加环素抗性(奇异变形杆菌(p.mirabilis)和雷氏普罗威登菌(p.rettgeri))。通过费歇尔精确检验分析数据。p值用于产生ctx-m的分离菌相对于缺乏ctx-m的分离菌的抗性比较；**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。(b)产生ctx-m的细菌相对于不产生ctx-m的细菌的多药耐药性(mdr)的分布。
[0063]
图7a-7b详述尿液样品外观和ph。(a)通过detect测试的尿液样品的视觉外观，包括澄清度(浊度)和颜色。(b)尿液ph，用ph试纸测量。因为一个样品没有记录其外观或ph，所以两个图中都显示471个样品。
[0064]
图8示出detect两层级式扩增平台技术的概况。detect扩增由β-内酰胺酶(例如，ctxm-14变体)引发，其水解β-内酰胺类似物底物并释放含硫醇的触发单元(t1)。释放的t1经由二硫化物交换反应活化二硫化物保护的木瓜蛋白酶，产生活化的木瓜蛋白酶(酶扩增剂ii)。通过活化的木瓜蛋白酶水解肽基指示剂(bapa，e2底物)产生比色信号。用detect平台对一组β-内酰胺酶变体的分析提供了β-内酰胺酶变体ctxm-14的存在之间的特异性相关性。所利用的β-内酰胺酶探针对该变体具有高度特异性，并且与标准分析(107cfu/ml)相比提供了改善的检测限(104cfu/ml)。比色输出信号(405nm吸光度从时间0至1h的变化)产生detect得分，其中阈值是比对照的平均detect得分大的3倍标准偏差。
[0065]
图9示出使用每种探针测试的一组纯化的重组β-内酰胺酶(tem-1、shv-12、ctxm-14、shv-1、tem-20、cmy-2和kpc-1)的detect平台的检测限(1/lod)阈值。
[0066]
图10示出使用β-内酰胺酶探针与β-内酰胺酶抑制剂，诸如克拉维酸和他唑巴坦的
组合，或不存在β-内酰胺酶抑制剂，诸如克拉维酸和他唑巴坦的情况下产生ampc的临床分离菌的detect得分(从时间0至1h的405nm吸光度的δ)。
[0067]
详述
[0068]
除非上下文另有明确指示，否则如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“β-内酰胺酶底物”包括多种这样的底物，并且提及“所述β-内酰胺酶”包括提及一种或多种β-内酰胺酶及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
[0069]
另外，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包括/包含(comprise)”、“包括/包含(comprises)”、“包括/包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是可互换的并且不旨在是限制性的。
[0070]
进一步应当理解，在各个实施方案的描述使用术语“包括/包含(comprising)”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”选择性地描述实施方案。
[0071]
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与该公开内容所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管许多方法和试剂与本文所描述的那些相似或等同，但本文公开了示例性方法和材料。
[0072]
出于描述和公开方法的目的，本文提及的所有出版物以全文引用的方式并入本文中，其可以与本文的描述结合使用。此外，对于该公开内容中明确定义的术语，在所有方面，将以该公开内容中明确提供的术语的定义为准，即使所述术语在出版物、词典、论文等中已经被赋予不同的含义。
[0073]
本文所使用的术语“含苯硫酚的基团”是指包含具有以下结构的末端苯硫酚基团的本文指定的基团(例如，t1或t2取代基)：其中r
12
是h、d、烷氧基、羟基、酯、酰胺、芳基、杂芳基、硝基、氰酸酯、腈、或卤素。“含苯硫酚的基团”的末端苯硫酚基团可以直接连接至具有由本文呈现的化学式指定的结构的化合物。供选择地，“含苯硫酚的基团”的末端苯硫酚基团可以由连接体间接连接至具有式i-iii的结构的化合物。连接体是(c
1-c
12
)烷基或(c
1-c
12
)杂烷基。出于该公开内容的目的，“含苯硫酚的基团”的实例包括但不限于：
其中r
12
是h、d、烷氧基、羟基、酯、酰胺、芳基、杂芳基、硝基、氰酸酯、腈、或卤素。在具体实施方案中，r
12
是h。
[0074]
出于该公开内容的目的，术语“杂
‑”
当用作前缀时，诸如，杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂烃，是指具有一个或多个被非碳原子替代的碳原子作为母链的一部分的指定烃。这样的非碳原子的实例包括但不限于n、o、s、si、al、b和p。如果在基于杂原子的母链中存在多于一个非碳原子，则该原子可以是相同的元素或可以是不同元素，诸如n和o的组合。在具体实施方案中，“杂烷基”包含以下基团的一个或多个拷贝，，，包括其组合。
[0075]
本文所使用的术语“杂环”是指含有至少1个非碳环原子的环结构。出于该公开内容的目的，“杂环”涵盖1至4个杂环环，其中当杂环大于1个环时，杂环环结合使得它们连接、稠合或其组合。杂环可以是芳族或非芳族的，或者在多于一个杂环环的情况下，一个或多个环可以是非芳族的，一个或多个环可以是芳族的，或其组合。杂环可以是取代的或未取代的，或者在多于一个杂环环的情况下，一个或多个环可以是未取代的，一个或多个环可以是取代的，或其组合。一般地，非碳环原子是n、o、s、si、al、b、或p。在存在多于一个非碳环原子的情况下，这些非碳环原子可以是相同的元素、或不同元素诸如n和o的组合。杂环的实例包括但不限于：单环杂环，诸如氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、咪唑烷、吡唑烷、吡唑啉、二氧戊环、环丁砜、2,3-二氢呋喃、2,5-二氢呋喃、四氢呋喃、噻吩烷、哌啶、1,2,3,6-四氢-吡啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、吡喃、噻喃、2,3-二氢吡喃、四氢吡喃、1,4-二氢吡啶、1,4-二噁烷、1,3-二噁烷、二噁烷、高哌啶、2,3,4,7-四氢-1h-氮杂高哌嗪、1,3-二氧杂环庚烷、4,7-二氢-1,3-二氧杂和环氧己烷；和多环杂环，诸如吲哚、二氢吲哚、异二氢吲哚、喹啉、四氢喹啉、异喹啉、四氢异喹啉、1,4-苯并二噁烷、香豆素、二氢香豆素、苯并呋喃、2,3-二氢苯并呋喃、异苯并呋喃、色烯、色满、异色满、呫吨、吩噁噻、噻蒽、吲哚嗪、异吲哚、吲唑、嘌呤、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、菲啶、啶、菲咯啉、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、1,2-苯并异噁唑、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并三唑、硫代黄嘌呤、咔唑、咔啉、吖啶、吡咯里西啶和喹诺里西啶。除了以上所描述的多环杂环之外，杂环还包括其中两个或更多个环之间的环稠合包括多于一个两个环共有的键和多于两个两个环共有的原子的多环杂环。这样的桥连杂环的实例包括奎宁环、二氮杂双环[2.2.1]庚烷和7-氧杂双环[2.2.1]庚烷。
[0076]
术语“任选地取代的”是指官能团，一般是烃或杂环，其中一个或多个氢原子可以被取代基替代。因此，“任选地取代的”是指被取代的官能团，其中一个或多个氢原子被取代基替代，或者未取代的官能团，其中氢原子未被取代基替代。例如，任选地取代的烃基团是
指未取代的烃基团或取代的烃基团。
[0077]
术语“取代基”是指替代氢原子的取代的原子或原子团。出于该公开内容的目的，取代基将包括氘原子。
[0078]
通常，“取代”是指以下定义的有机官能团(例如，烷基基团)，其中与其中所含的氢原子的一个或多个键被与非氢或非碳原子的键替代。取代的基团还包括其中与(多个)碳或(多个)氢原子的一个或多个键被与杂原子的一个或多个键(包括双键或三键)替代的基团。因此，除非另有说明，否则取代的基团被一个或多个取代基取代。
[0079]
在一些实施方案中，取代的基团被一至六个取代基取代。取代基基团的实例包括但不限于卤素(即f、cl、br和i)、羟基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、芳基烷氧基、杂环基、杂环基烷基、杂环基氧基和杂环基烷氧基基团；羰基(氧代)；羧酸酯、酯、氨基甲酸酯、肟、羟胺、烷氧基胺、芳烷氧基胺、硫醇、硫化物、亚砜、砜、磺酰基、五氟硫烷基(即sf5)、磺酰胺、胺、n-氧化物、肼、酰肼、腙、叠氮化物、酰胺、脲、脒、胍、烯胺、酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、氰酸酯、亚胺、硝基基团、腈等。
[0080]
关于烃、杂环等的术语“未取代的”是指其中母链不含有取代基的结构。
[0081]
产生超广谱β-内酰胺酶(esbl)的革兰氏阴性菌(gnb)表达水解和灭活大多数β-内酰胺抗生素，包括青霉素、头孢菌素、超广谱头孢菌素(包括第3和第4代药剂)和单环内酰胺的酶。产生esbl的肠杆菌(enterobacteriaceae)被疾病控制和预防中心(the centers for disease control and prevention，cdc)于2013年和2019年在其抗生素抗性威胁(antibiotic resistance threats)报告中指定为“严重威胁”，并且被世界卫生组织于2017年在其抗生素抗性细菌的全球优先级列表(global priority list of antibiotic-resistant bacteria)中指定为“危急优先级”。在2017年，美国住院患者中估计有197400例产生esbl的肠杆菌感染，导致9100人死亡和12亿美元可归因的医疗费用。esbl感染代表主要的公共健康问题—感染发生在医疗保健和社区环境中，并且它们在美国和全球的流行正在增加。
[0082]
尿路感染(uti)是社区和医疗保健环境中最常见的细菌感染之一，每年大约有1.5亿例的全球发病率。由产生esbl的gnb引起的uti是世界性问题，在全世界的许多区域中具有》20％的流行。来自肠杆菌科的大肠杆菌(escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)是uti的最常见原因，并且是最普遍的产生esbl的菌种。产生esbl的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(esbl-ek)在临床上造成问题，因为它们不仅表现出对大多数β-内酰胺的抗性，而且常常是多重耐药的。esbl-ek经常对氟喹诺酮类、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和氨基糖苷类以及用于凭经验治疗uti的β-内酰胺类—抗微生物剂具有共同抗性
7-11
。一旦esbl-ek被鉴定为uti的病原性病原体，仅剩余有限数目的治疗选项；合适的药剂包括碳青霉烯类(目前在美国仅作为肠胃外制剂可用)和呋喃妥因(仅推荐用于治疗不复杂的膀胱炎)。
[0083]
直接从患有uti的患者的尿液样品中快速检测esbl-ek仍然是未满足的临床需要。目前可以鉴定这些生物体的标准抗微生物敏感性测试方法的周转时间是2-3天。由于在初始护理点没有可用的微生物学信息以指导适当的抗微生物疗法的选择，因此提供者必须依赖当地的经验性处方指南结合患者特征。在复杂的uti和肾盂肾炎的情况下，经验疗法指南一般不指定有效对抗产生esbl的gnb的药剂作为一线疗法。少至24％的患有esbl-ek uti的
患者最初接受一致的抗微生物疗法。平均而言，与患有非esbl-ek uti的患者相比，向患有esbl-ek uti的患者施用适当的药物耗费长于两天的时间。在住院患者的研究中，esbl-ek uti与非esbl-ek uti相比，涉及更长的住院时间(6天相对于4天)和更高的护理成本(多于3658美元)。快速鉴定由产生esbl的gnb引起的uti的诊断测试可以向临床医生提供改善有效初始疗法的选择的信息。
[0084]
由产生esbl的gnb引起的uti造成显著的临床和经济负担，并且迫切需要支持用于治疗这些感染的适当疗法的选择的快速诊断测试。直接从尿液样品中快速鉴定由产生esbl的gnb引起的uti的诊断测试可以为临床医生提供重要的抗微生物剂抗性信息，实现在初始护理点选择合适的抗微生物疗法。这样的测试可能改善患者结果并降低与这些感染相关的护理成本。由于这些β-内酰胺酶展现出的序列多样性，基于传统pcr的测试对于开发用于产生esbl的gnb的广泛检测已经是有挑战性的。迄今为止鉴定出》150种ctx-m变体，根据序列同源性将其细分成5组。另外，尽管所有ctx-m都被认为是esbl，但一些酶家族涵盖介导非常不同的β-内酰胺抗性谱的序列变体。例如，tem和shvβ-内酰胺酶家族由esbl和非esbl变体组成，所述变体在序列上可能相差少至一个氨基酸。因此，检测这些β-内酰胺酶的表型(ast)或酶活性的技术或测试方法应提供用于检测这些不同抗性酶的最大效用和通用性。基于生物化学的诊断测试在该方面具有巨大的前景，并且可以提供使其适合广泛的护理点临床用途的其他优点，包括简单性、可扩展性、低成本、以及甚至很少至没有仪器要求。然而，开发可以直接从患者样品中鉴定产生esbl的gnb的护理点测试是具有挑战性的，因为尿液样品中的细菌数量少且环境复杂。为了克服传统的基于生物化学的用于β-内酰胺酶检测的方法的灵敏度限制，我们开发了双酶触发-实现的级联技术。本文所公开的方法经由所公开的化合物将目标β-内酰胺酶连接至二硫化物-笼状酶扩增剂(木瓜蛋白酶)，所公开的化合物在β-内酰胺酶介导的水解后消除触发单元(苯硫酚)，释放然后产生比色信号输出的笼状木瓜蛋白酶(参见图1)。如本文所示的，相对于标准显色探针头孢硝噻，本文所公开的方法的扩增能力在于对β-内酰胺酶的酶和产生几种常见β-内酰胺酶的β-内酰胺抗性临床分离菌的并行分析。
[0085]
本文所公开的化合物和方法实现在少至30min内鉴定由产生ctx-m的gnb引起的uti。本文所公开的化合物和方法用于在具有增加的复杂性的三个系统中鉴定uti：第一个具有纯化的重组β-内酰胺酶，第二个具有产生β-内酰胺酶的临床分离菌，并且第三个具有临床尿液样品。本文所公开的方法由两个层级组成—靶向层级和扩增/信号输出层级—其经由触发释放β-内酰胺酶探针串联连接。在本文所呈现的研究中，首先用一组不同的重组β-内酰胺酶探究由ctx-m对β-内酰胺酶探针的选择性水解。与使用更高浓度的酶和底物进行的传统动力学方法相比，所述方法的lod针对每种β-内酰胺酶被定义为对特定变体的敏感性的量度。本文所公开的化合物和方法的lod值揭示了β-内酰胺酶探针对ctx-mβ-内酰胺酶的强倾向性，其中四种测试的ctx-m变体的平均lod(0.041nm)是所测试的非ctx-mβ-内酰胺酶(排除cmy和oxa)的平均lod的42分之一。类似地，发现本文所公开的化合物和方法对cmy(染色体或质粒介导的ampc)敏感，其产生与ctx-m变体的平均值相同的lod(0.041nm)。在产生ctx-m和cmy的临床分离菌中进一步证明了所公开的化合物和方法的选择性，其平均产生比产生其他β-内酰胺酶的gnb或证明对β-内酰胺敏感性的gnb更高的detect得分。
[0086]
克拉维酸是已知的β-内酰胺酶抑制剂，其一般抑制传统esbl的酶活性，但不抑制
ampcβ-内酰胺酶的酶活性。作为解析来自产生cmy的gnb的ctx-m的手段，探究了β-内酰胺酶抑制剂与本文所公开的化合物和方法在一起的用途。由单独的本文所公开的化合物和方法产生的得分相对于与克拉维酸在一起的本文所公开的化合物和方法产生的得分的比较表明，β-内酰胺酶抑制剂与所公开的化合物和方法一起使用是辨别产生这些酶的细菌的有效方式。通过添加克拉维酸对产生cmy的分离菌的得分影响最小，而对产生ctx-m的分离菌的得分影响很大。预想任何数量的已知β-内酰胺酶抑制剂可以与本文所公开的化合物和方法一起使用，作为实现系统中的β-内酰胺酶的进一步特异性或解析的手段。
[0087]
在本文所呈现的临床尿液研究中，发现所公开的化合物和方法是稳健的，并维持了对产生ctx-m的细菌的选择性。尿液中的许多假阳性结果可以归因于产生tem-1或产生ampc的gnb的高cfu/ml。当使用本文所公开的化合物和方法作为单独的分离菌测试时(其中cfu的数目是受控的)，产生tem-1或campc的gnb被正确地测试为阴性。本文假定，与克拉维酸相反，ctx-m特异性抑制剂与所公开的化合物和方法一起使用将在从其他β-内酰胺酶解析ctx-m中具有更广泛的效用。tem-1也应该证明对克拉维酸的作用的敏感性，因此该抑制剂在区分tem-1的得分与ctx-m的得分方面可能不是有效的。本文进一步假定与其他β-内酰胺酶的交叉反应性可以通过在如本文进一步描述的β-内酰胺酶靶向探针中进行各种设计改变最小化。例如，可以修饰β-内酰胺酶靶向探针，使得其更好地类似于优先被目标酶水解的其他β-内酰胺骨架(scaffold)。因此，预期与本领域已知的其他化合物相比，本文所描述的各种化合物将对期望的被靶向的β-内酰胺酶具有增加的特异性。
[0088]
在本文所呈现的初步研究中，本文所公开的化合物和方法正确鉴定了至少91％的具有产生ctx-m的gnb的微生物学定义的uti。发现在所公开的detect测定中仅一个参考阳性尿液样品被测试为假阴性；该样品含有估计为10
4-105cfu/ml的产生ctx-m-15的肺炎克雷伯氏菌。由于临床分离菌本身在本文所公开的方法中被正确地测试为阳性，因此原始尿液样品中的cfu可能低于本文所公开的化合物和方法在尿液中的当前lod。基于真阳性样品中的cfu/ml估计值，以及基于先前采用产生ctx-m的临床分离菌的lod实验，估计当前测定具有在尿液中106cfu/ml的产生ctx-m的gnb的平均lod浓度。lod在uti的临床相关浓度范围内。预期通过本文所公开的化合物和方法的不同修改，可以调节本文所公开的detect测定的lod用于与微生物学截断值同步。该公开内容在本文所公开的各种实施方案中提供了所公开的化合物和方法的扩增/信号输出层级的修饰；木瓜蛋白酶扩增剂的修饰用于更高的催化效率；和/或比色底物的修饰以产生更高的转化率是可行的选择。
[0089]
尽管在尿液研究中鉴定的产生tem和shv esbl的gnb都不是mdr，但91％的产生ctx-m的gnb是mdr，这突出了特异性鉴定产生ctx-m的细菌的重要性。产生ctx-m的分离菌主要表现出对以下药剂/种类(除了β-内酰胺)的抗性：环丙沙星和左氧氟沙星(氟喹诺酮类)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(叶酸途径抑制剂)和庆大霉素和妥布霉素(氨基糖苷类)。10个产生ctx-m/mdr的分离菌中有六个(60％)对氟喹诺酮类和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑具有双重抗性；两者都是用于治疗复杂uti和肾盂肾炎的重要经验性药剂(如超广谱β-内酰胺)(引用)。
[0090]
已经针对很多种esbl-ek和非esbl-ek临床分离菌验证了所公开的化合物和方法。由于在尿液样品中也鉴定了其他细菌菌种—包括产生esbl的奇异变形杆菌—因此detect系统需要针对这些其他细菌菌种(在可能的情况下，采用产生esbl和不产生esbl的分离菌)的进一步测试，以建立共同的得分趋势。同样地，应评估尿液样品中常遇见的另外的β-内酰
胺酶变体(包括campc酶)的重组β-内酰胺酶形式的lod。这些实验将进一步阐明本文所公开的化合物和方法的选择性，并帮助定义其局限性。虽然我们预测产生ctx-m的任何gnb菌种将是可通过detect鉴定的，但需要进一步的实验验证该理论。
[0091]
所公开的化合物和方法具有以下特征：测定容易进行；不需要尿液样品处理；所有试剂可以以液体形式储存，使得仅需要在其现有的96孔板格式中进行测定的步骤，包括但不限于：将试剂吸移到孔中，将样品吸移到孔中，将板设置在酶标仪上用于0分钟和30分钟读数，然后计算得分。考虑到以下测定步骤，显然所述方法的实施可以由人员在工作台进行，或者使用半自动或全自动装置进行。将要以半自动或全自动方式运行所公开的化合物和方法将减轻操作者错误和操作者间可变性，限制测试复杂性，并限制进行该测试所需的总的动手时间，这将促进更广泛的适用性。所公开的化合物和方法可以在护理点使用，从而在时间期限方面提供有作用的结果，所述时间期限积极影响可以向患者开具处方的治疗有效的第一抗微生物剂的鉴定。对于护理点应用的使用，结合本文所公开的化合物和方法的装置理想地将需要是小的、稳健的且使用简单的。所公开的化合物和方法具有简单的比色输出，其应当使得整合到装置中更直接并且实现灵活的格式选择。所公开的化合物和方法的比色输出可以由酶标仪读取，但也可以由其他分光光度装置或甚至由装置应用(例如，移动电话应用程序)读取。比色信号的增强还可以实现由眼睛精确检测。
[0092]
本文所公开的化合物被本文所研究的被靶向β-内酰胺酶快速水解。结果证明所公开的化合物对称为ctx-m-型-内酰胺酶的esbl亚类的显著偏好。例如，所公开的某些化合物被esbl水解以释放活化酶扩增剂的触发单元，启动扩增级联事件，所述扩增级联事件产生指示esbl的存在的比色信号输出。检测esbl的化合物可以作为诊断试剂应用于检测产生esbl的病原体并直接护理患者。
[0093]
在各个方面，该公开内容提供用于经由鉴定β-内酰胺酶变体检测抗微生物抗性的化合物和方法，所述β-内酰胺酶变体导致革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中存在的酶介导的抗性机制。本文提供的化合物可以配制成用于所公开的方法的扩增测定组合物。还提供所述化合物在制备用于扩增方法的测定制剂中的用途。
[0094]
在具体实施方案中，该公开内容提供包含式i的结构的化合物：
[0095][0096]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0097]
t1是含苯硫酚的基团或z2，其中如果t1是z2，则z1是t2；
[0098]
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2，其中如果z1是t2，则t1是z2；
[0099]
t2是含苯硫酚的基团；
[0100]
z2是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；
[0101]
x1是
[0102]
y1是
[0103]r1-r6和r
9-r
11
各自独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环；
[0104]
r7是任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；和
[0105]
r8是在进一步的实施方案中，t1是z2或选自以下的含苯硫酚的基团：
其中r
12
是h、d、烷氧基、羟基、酯、酰胺、芳基、杂芳基、硝基、氰酸
酯、腈、或卤素。在再进一步的实施方案中，t2是选自以下的含苯硫酚的基团：是选自以下的含苯硫酚的基团：是选自以下的含苯硫酚的基团：
其中r
12
是h、d、烷氧基、羟基、酯、酰胺、芳基、杂芳基、硝基、氰酸酯、腈、或卤素。在另一实施方案中，r7选自以下：
[0106][0106][0106]
在某实施方案中，式i的化合物不具有以下结构：
[0107][0108]
在进一步的实施方案中，该公开内容提供包含式i(a)的结构的化合物：
[0109][0110][0111]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0112]
t1是含苯硫酚的基团或z2，其中如果t1是z2，则z1是t2；
[0113]
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2，其中如果z1是t2，则t1是z2；
[0114]
t2是含苯硫酚的基团；
[0115]
z2是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；
[0116]
x1是
[0117]
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；
[0118]
r6是h、或胺；
[0119]
r7是任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；
[0120]
r8是和
[0121]
r9是羟基或(c
1-c3)烷氧基。在某实施方案中，式i(a)的化合物不具有以下结构：
[0122][0123]
在具体实施方案中，该公开内容提供包含式i(b)的结构的化合物：
[0124][0125]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0126]
t1是选自以下的含苯硫酚的基团：
[0127]
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2；
[0128]
x1是
[0129]
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；
[0130]
r6是h、或胺；
[0131]
r7是任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；
[0132]
r8是
[0133]
r9是羟基或(c
1-c3)烷氧基；
[0134]r12
是h、d、烷氧基、羟基、酯、酰胺、芳基、杂芳基、硝基、氰酸酯、腈、或卤素。
[0135]
在进一步的实施方案中，r7选自以下：
[0136]
[0137]
在具体实施方案中，式i(b)的化合物不具有以下结构：
[0138][0139]
在进一步的实施方案中，该公开内容提供包含式i(c)的结构的化合物：
[0140]
[0141]
x1是是
[0142]
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；
[0143]
r6是h、或胺；
[0144]
r7选自以下：
[0145]
[0146][0147]
r8是和
[0148]
r9是在某实施方案中，式i(c)的化合物不具有以下结构：
[0149]
(即，当r
4-r6是h时，如果x1是则r7不是)。
[0150]
在进一步的实施方案中，该公开内容提供具有选自以下的结构的式i的化合物：
[0151]
[0152][0153]
在具体实施方案中，该公开内容提供包含式ii的结构的化合物：
[0154]
[0155]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0156]
y2是
[0157]
r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环；
[0158]
z3是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；和
[0159]
t3是含苯硫酚的基团。在进一步的实施方案中，t3是选自以下的含苯硫酚的基团：是选自以下的含苯硫酚的基团：
和
[0160]r12
是h、d、烷氧基、羟基、酯、酰胺、芳基、杂芳基、硝基、氰酸酯、腈、或卤素。
[0161]
在另一实施方案中，该公开内容提供包含式ii(a)的结构的化合物：
[0162]
[0163]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0164]
y2是
[0165]
r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环。
[0166]
在又另一实施方案中，该公开内容提供包含式ii(b)的结构的化合物：
[0167][0168]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0169]
y2是
[0170]
r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮和任选地取代的(c
1-c6)烷基。
[0171]
在进一步的实施方案中，该公开内容提供具有选自以下的结构的式ii的化合物：
[0172][0173]
在进一步的实施方案中，本文所公开的化合物基本上是单一对映异构体、约90重量％或更多的(-)-对映异构体和约10重量％或更少的( )-对映异构体的混合物、约90重量％或更多的( )-对映异构体和约10重量％或更少的(-)-对映异构体的混合物、基本上是单独的非对映异构体、或约90重量％或更多的单独的非对映异构体和约10重量％或更少的任何其他非对映异构体的混合物。
[0174]
在进一步的实施方案中，本文所公开的化合物基本上是单一对映异构体、约90重量％或更多的(-)-对映异构体和约10重量％或更少的( )-对映异构体的混合物、约90重量％或更多的( )-对映异构体和约10重量％或更少的(-)-对映异构体的混合物、基本上是单独的非对映异构体、或约90重量％或更多的单独的非对映异构体和约10重量％或更少的
任何其他非对映异构体的混合物。
[0175]
本文所公开的化合物可以是对映异构体纯的，诸如单一对映异构体或单一非对映异构体，或者是立体异构混合物，诸如对映异构体的混合物、外消旋混合物、或非对映异构体混合物。用于制备/分离单个对映异构体的常规技术包括从合适的光学纯前体手性合成或者使用例如手性色谱、重结晶、拆分、非对映异构体盐形成、或衍生成非对映异构体加合物随后分离来拆分外消旋体。
[0176]
当本文所公开的化合物含有酸性或碱性部分时，其也可以被公开为药学上可接受的盐(参见berge等人，j.pharm.sci.1977，66，1-19；以及“handbook of pharmaceutical salts,properties,and use”，stah和wermuth编辑；wiley-vch和vhca，苏黎世，2002)。
[0177]
用于制备药学上可接受的盐的合适的酸包括但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、酰化氨基酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、硼酸、( )-樟脑酸、樟脑磺酸、( )-(1s)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、环己烷氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡萄庚酸、d-葡糖酸、d-葡糖醛酸、l-谷氨酸、α-氧代-戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、( )-l-乳酸、(
±
)-dl-乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、(-)-l-苹果酸、丙二酸、(
±
)-dl-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、高氯酸、磷酸、l-焦谷氨酸、糖酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、( )-l-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸。
[0178]
用于制备药学上可接受的盐的合适的碱包括但不限于无机碱，诸如氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化锌、或氢氧化钠；以及有机碱，诸如伯胺、仲胺、叔胺和季胺、脂族胺和芳族胺，包括l-精氨酸、苯乙苄胺、苄星青霉素、胆碱、二甲胺乙醇、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二异丙胺、2-(二乙基氨基)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、异丙胺、n-甲基-葡糖胺、海巴明、1h-咪唑、l-赖氨酸、吗啉、4-(2-羟乙基)-吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、吡啶、奎宁环、喹啉、异喹啉、仲胺、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、n-甲基-d-葡糖胺、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。
[0179]
该公开内容提供通过使用本文所公开的化合物检测样品中一种或多种目标β-内酰胺酶的存在的方法。在具体实施方案中，本文所公开的方法具有以下步骤：向疑似包含一种或多种目标β-内酰胺酶的样品中添加试剂，其中试剂包含：(i)所公开的化合物；(ii)半胱氨酸蛋白酶的显色底物；和(iii)笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶；和(iv)任选的针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂。对于(ii)、(iii)和(iv)，这些底物、酶和抑制剂可以在如本文实施例部分所描述的缓冲液中配制。在所述方法中使用的样品一般获自受试者，但是样品也可以来自其他来源，诸如水样品、环境样品、废水样品等。获自受试者的样品可以来自身体的各个部分。例如，样品可以是血液样品、尿液样品、脑脊液样品、唾液样品、直肠样品、尿道样品、或眼样品。关于后面三种样品，这些样品可以通过擦拭各个区域获得。在具体实施方案中，样品是血液或尿液样品。由其获得样品的受试者可以来自任何动物，包括但不限于人、灵长类动物、猫、狗、马、鸟、蜥蜴、牛、猪、兔、大鼠、小鼠、绵羊、山羊等。在具体实施方案中，样品获自患有或疑似患有细菌感染的人患者。例如，人患者可以患有或疑似患有尿路感染、败血症、或其他感染。
[0180]
关于被靶向的β-内酰胺酶，所公开的化合物可以用于靶向每种已知种类的β-内酰胺酶，包括其亚型。例如，本文所公开的化合物和方法可以用于描绘和检测青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶(esbl)、抑制剂抗性β-内酰胺酶、ampc-型β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的存在。特别地，超广谱β-内酰胺酶或esbl可以通过本文所公开的化合物和方法被靶向。例如，本文所公开的化合物和方法可以检测temβ-内酰胺酶、shvβ-内酰胺酶、ctx-mβ-内酰胺酶、oxaβ-内酰胺酶、perβ-内酰胺酶、vebβ-内酰胺酶、gesβ-内酰胺酶、ibcβ-内酰胺酶。如本文所呈现的研究中显示的，本文所公开的各种化合物可以以高特异性检测ctx-mβ-内酰胺酶。本文所公开的化合物和方法还检测碳青霉烯酶的各种亚型，包括但不限于金属-β-内酰胺酶、kpcβ-内酰胺酶、维罗纳整合子编码的金属-β-内酰胺酶、苯唑西林酶、cmyβ-内酰胺酶、新德里金属-β-内酰胺酶、粘质沙雷氏菌酶、imi青霉烯水解β-内酰胺酶、nmcβ-内酰胺酶和ccraβ-内酰胺酶。例如，本文所呈现的研究证明所公开的各种化合物可以以高特异性检测cmyβ-内酰胺酶和kpcβ-内酰胺酶。在具体实施方案中，本文所公开的化合物可以以高特异性检测ctx-mβ-内酰胺酶、cmyβ-内酰胺酶和kpcβ-内酰胺酶。关于样品中特异性目标β-内酰胺酶的进一步描绘可以通过使用β-内酰胺酶抑制剂确定，如本文进一步描述的。
[0181]
显色底物一般是指酶可以将其转化为深度着色的化学品的无色化学品。在具体实施方案中，显色底物是半胱氨酸蛋白酶的底物，如本文进一步公开的。一旦被酶(例如，半胱氨酸蛋白酶)作用，则可以基于在一定波长，例如，400nm、405nm、410nm、415nm、420nm、425nm、430nm、435nm、440nm、445nm、450nm、455nm、460nm、465nm、470nm、475nm、480nm、485nm、490nm、495nm、500nm、或者包括或在任何两个前述吸光度值之间的范围下测量吸光度定量裂解的产物。例如：nα-苯甲酰基-l-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(bapa)的裂解产物可以通过在405nm下测量吸光度定量；l-焦谷氨酰基-l-苯丙氨酰基-l-亮氨酸-对硝基苯胺(pflna)的裂解产物可以通过在410nm下测量吸光度定量；偶氮酪蛋白的裂解产物可以通过在440nm下测量吸光度定量；焦谷氨酰基-l-苯丙氨酰基-l-亮氨酸-对硝基苯胺的裂解产物可以通过在410nm下测量吸光度定量。可以使用任何数目的装置以测量光吸收，包括酶标仪、分光光度计、扫描仪等。可以在各种时间点，例如，0min、5min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min、240min、或者包括或在任何两个前述时间点之间的范围测量样品的光吸收。例如，可以在0min和30min、或在其间的不同时间点测量样品的光吸收以确定反应速率。
[0182]
半胱氨酸蛋白酶，也称为硫醇蛋白酶，是降解蛋白质的酶。这些蛋白酶共有共同的催化机制，其涉及催化三联体或二联体中的亲核半胱氨酸硫醇。半胱氨酸蛋白酶通常在包括番木瓜、菠萝、无花果和猕猴桃的果实中遇到。笼状或无活性半胱氨酸蛋白酶是指可以通过去除抑制性片段或蛋白质而活化的半胱氨酸蛋白酶。例如，笼状/无活性木瓜蛋白酶将包括木瓜蛋白酶-s-sch3，由此可以通过二硫键的断裂去除抑制性硫醇片段。可以用于本文所公开的方法中的半胱氨酸蛋白酶的实例包括但不限于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶k、钙蛋白酶、半胱天冬酶-1、半乳糖苷酶、分离酶、腺病毒肽链内切酶、焦谷氨酰肽酶i、转肽酶a、丙型肝炎病毒肽酶、辛德比斯病毒型nsp2肽酶、二肽基肽酶vi、desi-1肽酶、tev蛋白酶、酰胺磷酸核糖基转移酶前体、γ-谷氨酰水解酶、刺猬蛋白和dmpa氨肽酶。在具体实施方案中，在本文所公开的方法中将笼状/无活性木瓜蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶-s-sch3)与木瓜蛋白酶的显色底物(例如，bapa)组合使用。笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶通常可以通过与
低分子量硫醇盐阴离子(例如，苯硫酚盐阴离子)或无机硫化物反应而被再活化。在具体实施方案中，所公开的化合物是一种或多种被靶向的β-内酰胺酶的底物并释放苯硫酚盐阴离子产物：其然后通过使笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶活化而充当反应扩增剂(例如，参见图1)。
[0183]
对于所公开的方法，可以将样品的吸光度与实验确定的阈值进行比较以确定样品中是否存在被靶向的β-内酰胺酶。例如，如果样品吸光度值大于实验确定的阈值，则样品可能包含被靶向的β-内酰胺酶。供选择地，如果样品吸光度值小于实验确定的阈值，则样品可能不包含被靶向的β-内酰胺酶。本文在实施例部分更详细地教导了产生实验测定的阈值的方法。简言之，实验测定的阈值可以通过分析受试者操作特性(roc)曲线确定，所述受试者操作特性(roc)曲线由产生β-内酰胺酶的细菌的分离菌组生成，其中一种或多种目标β-内酰胺酶在分离菌组中具有最低检测限(lod)。
[0184]
该公开内容进一步提供一种或多种β-内酰胺酶抑制剂与本文所公开的化合物和方法在一起的用途。β-内酰胺酶抑制剂设计成在通常是β-内酰胺的β-内酰胺酶的活性位点处结合。使用两种用于β-内酰胺酶抑制剂的策略：(i)产生以高亲和力可逆地和/或不可逆地结合酶但形成不利的空间相互作用如酰基-酶的底物，或(ii)开发基于机制的或不可逆的“自杀性抑制剂”。前者的实例是超广谱头孢菌素、单内酰胺、或碳青霉烯，它们形成酰基-酶并采取水解差的不能催化的构象。不可逆的“自杀性抑制剂”可以通过酶活性位点中的次级化学反应使β-内酰胺酶永久失活。不可逆的自杀性失活剂的实例包括市售的a类抑制剂克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。
[0185]
克拉维酸是临床医学中引入的第一种β-内酰胺酶抑制剂，其在二十世纪七十年代，即30多年之前，从棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)中分离。克拉维酸盐(酸在溶液中的盐形式)单独显示出很小的抗微生物活性，但当与阿莫西林组合时，克拉维酸盐显著降低阿莫西林对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌的mic。舒巴坦和他唑巴坦是后来由制药工业分别在1978年和1980年作为合成化合物开发的青霉素酯砜。所有三种β-内酰胺酶抑制剂化合物与青霉素共有结构相似性；有效对抗许多表达a类β-内酰胺酶的易感生物体(包括ctx-m和tem-1、tem-2和shv-1的esbl衍生物)；并且通常抗b、c和d类β-内酰胺酶的有效性较低。抑制剂的活性可以通过转换数(tn)(也相当于分配比[k
催化
/k
失活
])评价，转换数定义为在一个酶分子不可逆失活之前每单位时间水解的抑制剂分子的数目。例如，金黄色葡萄球菌pc1需要一个克拉维酸盐分子以使一个β-内酰胺酶失活，而tem-1需要160个克拉维酸盐分子，shv-1需要60个，并且蜡样芽胞杆菌(b.cereus)i需要超过16000个。为了比较，舒巴坦tn对于tem-1和shv-1分别是10000和13000。
[0186]
a类β-内酰胺酶的抑制剂的低ki(nm至μm)、比β-内酰胺“更长”占据活性位点的能力(高酰化和低脱酰化速率)和不能有效水解对其功效是不可或缺的。克拉维酸盐、舒巴坦和他唑巴坦不同于β-内酰胺抗生素，因为它们在五元环的位置c-1处具有离去基团(舒巴坦和他唑巴坦是砜，而克拉维酸盐在该位置处具有烯醇醚氧)。更好的离去基团实现二次开环和β-内酰胺酶修饰。与克拉维酸盐相比，舒巴坦中未修饰的砜是相对差的离去基团，一种反映在该抑制剂的高分配比中的性质(例如，对于tem-1，舒巴坦tn＝10000并且克拉维酸盐tn＝160)。他唑巴坦在c-2β-甲基位置处具有三唑基团。该修饰导致他唑巴坦对于代表性a类和c类β-内酰胺酶的改善的ic
50
、分配比和降低的mic。
[0187]
基于机制的抑制剂的功效可以在β-内酰胺酶的种类内和种类之间变化。对于a类，shv-1比tem-1对舒巴坦的失活更有抗性，但对克拉维酸盐的失活更敏感。tem-和shv-来源的酶，包括esbl的对比研究发现，克拉维酸盐针对tem-1和shv-1的ic
50
分别是舒巴坦针对tem-1和shv-1的ic
50
的1/60和1/580。对失活化学中的这些差异的解释可能是酶活性位点中的细微但非常重要的差异。例如，tem-1和shv-1的原子结构模型表明，负责在克拉维酸盐的失活机制中重要的水分子定位的残基val216与arg244之间的距离在shv-1中比在tem-1中大超过该增加的距离对于水分子的配位可能太大，表明关键的水位于shv-1中的其他位置，并且可以通过底物或抑制剂的酰化而被募集到活性位点中。该变化强调了基于机制的抑制剂即使在高度相似的酶中也可以经历不同的失活化学的概念。通过利用该β-内酰胺酶的机制和敏感性的差异，可以在本文所公开的方法中使用β-内酰胺酶抑制剂以更好地鉴定样品中的目标β-内酰胺酶。例如，在本文所公开的方法中使用克拉维酸作为从产生cmy的gnb中解析ctx-m的手段(例如，参见图10)。如此，该公开内容充分认识到β-内酰胺酶可以用于所公开的方法中以便更好地鉴定样品中的一种或多种目标β-内酰胺酶。
[0188]
该公开内容还提供一种试剂盒，其包含本文所公开的一种或多种化合物。试剂盒将一般包含一个或多个另外的容器，每个容器具有一种或多种不同材料(诸如试剂，任选地以浓缩形式，和/或装置)，其从商业和用户角度考虑对于使用本文所描述的寡糖是理想的。这样的材料的非限制性实例包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器；载体、包装、容器、小瓶和/或管、列出内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明书的包装说明书。典型地还将包括一组说明书。
[0189]
标签可以在容器上或与容器相关联。当形成标签的字母、数字或其他符号被附着、模刻或蚀刻到容器自身中时，标签可以在容器上；当标签存在于也容纳容器的接受器或载体内时，标签可以与容器相关联，例如，作为包装说明书。标签可以用于指示内容物用于特定治疗应用。标签还可以指示内容物的使用说明，诸如在本文所描述的方法中。这些其他治疗剂可以例如以physicians'desk reference(pdr)中指示的量或如本领域普通技术人员以其他方式确定的量使用。
[0190]
该公开内容进一步规定，本文所描述的方法和组合物可以通过以下方面(方面1至54)进一步定义：
[0191]
1.一种化合物，其具有式i或式ii的结构：
[0192]
[0193]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0194]
t1是含苯硫酚的基团或z2，其中如果t1是z2，则z1是t2；
[0195]
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2，其中如果z1是t2，则t1是z2；
[0196]
t2是含苯硫酚的基团；
[0197]
t3是含苯硫酚的基团
[0198]
z2是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；
[0199]
z3是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；
[0200]
x1是
[0201]
y1是
[0202]
y2是
[0203]r1-r6、r
9-r
11
、r
13
和r
14
各自独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环；
[0204]
r7是任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；和
[0205]
r8是
[0206]
前提是所述化合物不具有以下结构：
[0207][0208]
2.方面1的化合物，其中t1或t2是选自以下的苯硫酚基团：
[0209][0210][0211]
3.方面1或方面2的化合物，其中r7选自：
[0212][0213][0214]
4.前述方面中任一项的化合物，其中化合物具有式i(a)的结构：
[0215][0216]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0217]
t1是含苯硫酚的基团或z2，其中如果t1是z2，则z1是t2；
[0218]
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2，其中如果z1是t2，则t1是z2；
[0219]
t2是含苯硫酚的基团；
[0220]
z2是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、或-s(o)2oh；
[0221]
x1是
[0222]
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；
[0223]
r6是h、或胺；
[0224]
r7是任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；
[0225]
r8是和
[0226]
r9是羟基或(c
1-c3)烷氧基。
[0227]
5.方面4的化合物，其中t1或t2是选自以下的苯硫酚基团：
[0228][0229][0230]
6.方面4的化合物，其中r7选自：
[0231][0232][0233]
7.前述方面中任一项的化合物，其中化合物具有式i(b)的结构：
[0234][0235]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0236]
t1是选自以下的含苯硫酚的基团：：
[0237]
z1是羧酸酯、羰基、酯、酰胺、砜、磺酰胺、磺酰基、-s(o)2oh或t2；
[0238]
x1是
[0239]
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；
[0240]
r6是h、或胺；
[0241]
r7是任选地取代的芳基、任选地取代的苄基、或任选地取代的杂环；
[0242]
r8是和
[0243]
r9是羟基或(c
1-c3)烷氧基。
[0244]
8.方面7的化合物，其中r7选自：
[0245][0246]
[0247]
9.方面1的化合物，其中化合物具有式i(c)的结构：
[0248][0249]
x1是是
[0250]
r4、r5和r
10
独立地是h或(c
1-c6)烷基；
[0251]
r6是h、或胺；
[0252]
r7选自以下：
[0253]
以及
[0254]
r8是和
[0255]
r9是
[0256]
10.前述方面中任一项的化合物，其中化合物选自：
[0257][0257]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物。
[0258]
11.方面10的化合物，其中化合物具有以下的结构：
[0259][0260]
12.前述方面中任一项的化合物，其中t3是选自以下的含苯硫酚的基团：
[0261]
[0262][0263]
13.前述方面中任一项的化合物，其中化合物具有式ii(a)的结构：
[0264][0265]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0266]
y2是
[0267]
r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、
任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮、任选地取代的(c
1-c6)烷基、任选地取代的(c
1-c6)烯基、任选地取代的(c
1-c6)炔基、任选地取代的(c
5-c7)环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的苄基和任选地取代的杂环。
[0268]
14.前述方面中任一项的化合物，其中化合物具有式ii(b)的结构：
[0269][0270]
或者其盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、或溶剂化物，其中：
[0271]
y2是
[0272]
r9、r
13
和r
14
独立地选自h、d、羟基、腈、卤素、胺、硝基、酰胺、硫醇、醛、羧酸、烷氧基、任选地取代的(c
1-c4)酯、任选地取代的(c
1-c4)酮和任选地取代的(c
1-c6)烷基。
[0273]
15.前述方面中任一项的化合物，其中化合物具有选自以下的结构：
[0274][0275]
16.前述方面中任一项的化合物，其中化合物基本上是单一对映体或单一非对映体，其中化合物具有(r)立构中心。
[0276]
17.一种检测样品中一种或多种目标β-内酰胺酶的存在的方法，其包括：
[0277]
(1)向疑似包含一种或多种目标β-内酰胺酶的样品中添加试剂，其中试剂包含：
[0278]
(i)前述方面中任一项的化合物；
[0279]
(ii)半胱氨酸蛋白酶的显色底物；和
[0280]
(iii)笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶；
[0281]
(iv)任选的针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂；
[0282]
(2)测量样品的吸光度；
[0283]
(3)将样品孵育至少10min，并且然后重新测量样品的吸光度；
[0284]
(4)通过从步骤(3)中测量的样品的吸光度中减去步骤(2)中测量的样品的吸光度计算得分；
[0285]
(5)将得分与实验测定的阈值进行比较；其中如果得分超过阈值，则指示样品包含
一种或多种目标β-内酰胺酶；并且其中如果得分低于阈值，则指示样品不包含一种或多种目标β-内酰胺酶。
[0286]
18.方面17的方法，其中对于步骤(1)，样品获自受试者。
[0287]
19.方面17或18的方法，其中受试者是患有或疑似患有细菌感染的人患者。
[0288]
20.方面17至19中任一项的方法，其中人患者患有或疑似患有尿路感染。
[0289]
21.方面17至20中任一项的方法，其中对于步骤(1)，样品是血液样品、尿液样品、脑脊液样品、唾液样品、直肠样品、尿道样品、或眼样品。
[0290]
22.方面21的方法，其中对于步骤(1)，样品是血液样品或尿液样品。
[0291]
23.方面22的方法，其中对于步骤(1)，样品是尿液样品。
[0292]
24.方面17至22中任一项的方法，其中对于步骤(1)，一种或多种目标β-内酰胺酶选自青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶(esbl)、抑制剂抗性β-内酰胺酶、ampc-型β-内酰胺酶和碳青霉烯酶。
[0293]
25.方面24的方法，其中esbl选自temβ-内酰胺酶、shvβ-内酰胺酶、ctx-mβ-内酰胺酶、oxaβ-内酰胺酶、perβ-内酰胺酶、vebβ-内酰胺酶、gesβ-内酰胺酶和ibcβ-内酰胺酶。
[0294]
26.方面24的方法，其中一种或多种目标β-内酰胺酶包含ctx-mβ-内酰胺酶。
[0295]
27.方面24的方法，其中碳青霉烯酶选自金属-β-内酰胺酶、kpcβ-内酰胺酶、维罗纳整合子编码的金属-β-内酰胺酶、苯唑西林酶、cmyβ-内酰胺酶、新德里金属-β-内酰胺酶、粘质沙雷氏菌酶、imi青霉烯水解β-内酰胺酶、nmcβ-内酰胺酶和ccraβ-内酰胺酶。
[0296]
28.方面27的方法，其中一种或多种目标β-内酰胺酶包含cmyβ-内酰胺酶和/或kpcβ-内酰胺酶。
[0297]
29.方面28的方法，其中一种或多种目标β-内酰胺酶还包含ctx-mβ-内酰胺酶。
[0298]
30.方面17至29中任一项的方法，其中对于步骤(1)(ii)，半胱氨酸蛋白酶的显色底物是木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶k、钙蛋白酶、半胱天冬酶-1、半乳糖苷酶、分离酶、腺病毒肽链内切酶、焦谷氨酰肽酶i、转肽酶a、丙型肝炎病毒肽酶、辛德比斯病毒型nsp2肽酶、二肽基肽酶vi、desi-1肽酶、tev蛋白酶、酰胺磷酸核糖基转移酶前体、γ-谷氨酰水解酶、刺猬蛋白、或dmpa氨肽酶的显色底物。
[0299]
31.方面30的方法，其中半胱氨酸蛋白酶的显色底物是木瓜蛋白酶的显色底物。
[0300]
32.方面31的方法，其中木瓜蛋白酶的显色底物选自偶氮酪蛋白、l-焦谷氨酰基-l-苯丙氨酰基-l-亮氨酸-对硝基苯胺(pflna)、nα-苯甲酰基-l-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(bapa)、焦谷氨酰基-l-苯丙氨酰基-l-亮氨酸-对硝基苯胺(pyr-phe-leu-pna)和z-phe-arg-对硝基苯胺。
[0301]
33.方面31的方法，其中木瓜蛋白酶的显色底物是bapa。
[0302]
34.方面17至33中任一项的方法，其中对于步骤(1)(iii)，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶包含选自以下的半胱氨酸蛋白酶：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶k、钙蛋白酶、半胱天冬酶-1、半乳糖苷酶、分离酶、腺病毒肽链内切酶、焦谷氨酰肽酶i、转肽酶a、丙型肝炎病毒肽酶、辛德比斯病毒型nsp2肽酶、二肽基肽酶vi、desi-1肽酶、tev蛋白酶、酰胺磷酸核糖基转移酶前体、γ-谷氨酰水解酶、刺猬蛋白和dmpa氨肽酶。
[0303]
35.方面34的方法，其中笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶包含木瓜蛋白酶。
[0304]
36.方面35的方法，其中笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶-s-sch3。
[0305]
37.方面17至36中任一项的方法，其中对于步骤(1)(iii)，笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶可以通过与低分子量硫醇盐阴离子或无机硫化物反应而被再活化。
[0306]
38.方面37的方法，其中笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶可以通过与苯硫酚盐阴离子反应而被再活化。
[0307]
39.方面38的方法，其中一种或多种目标β-内酰胺酶与(i)的化合物反应以产生苯硫酚盐阴离子。
[0308]
40.方面39的方法，其中从步骤(1)(i)的化合物释放的苯硫酚盐阴离子与笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶反应以使半胱氨酸蛋白酶再活化。
[0309]
41.方面41的方法，其中笼状/无活性半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶-s-sch3。
[0310]
42.方面40的方法，其中半胱氨酸蛋白酶的显色底物是bapa。
[0311]
43.方面17至42中任一项的方法，其中对于步骤(2)，在0min测量样品的吸光度。
[0312]
44.方面17至43中任一项的方法，其中对于步骤(3)，将样品孵育15min至60min。
[0313]
45.方面44的方法，其中将样品孵育30min。
[0314]
46.方面17至45中任一项的方法，其中对于步骤(2)和(3)，在400nm至450nm的波长下测量样品的吸光度。
[0315]
47.方面46的方法，其中对于步骤(2)和(3)，在405nm的波长下测量样品的吸光度。
[0316]
48.方面17至47中任一项的方法，其中对于步骤(2)和(3)，使用分光光度计、或酶标仪测量样品的吸光度。
[0317]
49.方面17至48中任一项的方法，其中对于步骤(5)，通过分析由产生β-内酰胺酶的细菌的分离菌组生成的受试者操作特性(roc)曲线确定实验测定的阈值，其中一种或多种目标β-内酰胺酶在分离菌组中具有最低检测限(lod)。
[0318]
50.方面17至49中任一项的方法，其中方法在步骤(1)(iv)中使用或不使用针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂的情况下进行。
[0319]
51.方面50的方法，其中在不使用抑制剂的情况下进行的方法与使用抑制剂进行的方法之间，步骤(4)的得分的测量变化指示样品中存在特定类型或种类的β-内酰胺酶。
[0320]
52.方面50的方法，其中针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂是针对选自以下种类的β-内酰胺酶的抑制剂：青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶(esbl)、抑制剂抗性β-内酰胺酶、ampc-型β-内酰胺酶和碳青霉烯酶。
[0321]
53.方面52的方法，其中针对一种或多种特定类型或种类的β-内酰胺酶的抑制剂抑制esbl但不抑制ampc-型β-内酰胺酶。
[0322]
54.方面53的方法，其中抑制剂是克拉维酸或舒巴坦。
[0323]
以下实施例旨在说明而非限制该公开内容。虽然它们是可以使用的方法中的典型，但是可以选择性地使用本领域技术人员已知的其他方法。
实施例
[0324]
研究设计。评估detect测定直接在来自患有疑似uti的患者的尿液样品中鉴定ctx-mβ-内酰胺酶/产生ctx-m的细菌的活性的能力。detect系统在三个增加复杂度的水平上进行了测试：第一个用纯化的重组β-内酰胺酶的酶，第二个用产生β-内酰胺酶的临床分离菌，并且第三个用临床尿液样品。尿液研究是irb批准的临床验证研究，利用来自县级医
院的当地临床实验室的、经历常规尿液培养的尿液样品，主要包括来自患有疑似uti的患者的尿液样品。尿液研究设盲，因为在用detect进行尿液测试和后续detect数据分析的时间期间，研究的研究者不知道尿液样品对尿路病原体和随后的尿路病原体鉴定、抗微生物敏感性和β-内酰胺酶产生呈阳性。对研究期期间提交给临床实验室用于尿液培养的所有尿液样品进行测试。未排除异常值。
[0325]
用于detect试剂的材料。除非另有指明，否则所使用的所有化学品和溶剂均是商品级。l-半胱氨酸盐酸盐，n-α-苯甲酰基-l-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(bapa)、甲烷-硫代磺酸s-甲酯(cas 2949-92-0)和来自番木瓜(carica papaya)的木瓜蛋白酶(cas 9001-73-4)购自sigma-aldrich。乙酸钠购自alfa aesar。冰醋酸购自fischer scientific。磷酸二氢钠购自mp bio。磷酸氢二钠购自acros organics。氯化钠购自vwr chemicals。bis-tris和乙二胺四乙酸购自emd millipore。百里酚(cas：89-83-8)购自tokyo chemical inventory。
[0326]
detect试剂。detect系统由五种主要试剂组成：(1)缓冲液1，50：50的乙酸钠：磷酸钠缓冲液混合物(制备成5mm、ph 4.7、含有50mm nacl和0.5mm edta的乙酸钠溶液，和制备成40mm、ph 7.6、含有2mm edta的磷酸钠溶液)，用于溶解笼状木瓜蛋白酶或稀释重组酶和细菌分离菌；(2)缓冲液2，bis-tris缓冲液(50mm bis-tris，ph 6.7，含有1mm edta)，用于溶解bapa；(3)β-内酰胺酶探针，靶向探针(苯硫酚-β-lac)，溶解于乙腈(1mg/800μl，除非另有指明)，合成描述于deboer等人，2018中；(4)笼状/灭活木瓜蛋白酶(以下所描述的)；和(5)bapa(7.2mg bapa/2.5ml“缓冲液2”，在5％dmso中，除非另有指明)。
[0327]
木瓜蛋白酶笼。将10ml乙酸钠(50mm，ph 4.5，含有0.01％百里酚)转移至25ml圆底烧瓶中，所述烧瓶首先用缓冲溶液冲洗并用氮气鼓泡。在单独的100ml圆底烧瓶中，使29ml的磷酸盐缓冲液(20mm，ph 6.7，1mm etda)也经受氮气饱和，然后转移到包含搅拌棒的100ml圆底烧瓶中。在15min的脱气之后，将乙酸钠溶液(1.5ml)转移至包含79.9mg的固体未修饰木瓜蛋白酶(0.003mmol，1当量)的闪烁管中。然后将浆液转移至包含磷酸盐缓冲液的烧瓶中。然后将一部分木瓜蛋白酶浆液溶液转移到装有6mg的l-半胱氨酸盐酸盐(0.038mmol，13当量)的闪烁管中，以溶解半胱氨酸并促进半胱氨酸定量转移到反应溶液中。然后将反应烧瓶置于冰浴(0℃)中搅拌。15min之后，将甲烷硫代磺酸s-甲酯(0.113mmol，33当量)直接吸移到反应烧瓶中，并将溶液置于氮气下搅拌。15min之后，将反应从冰浴中移出，并将最终溶液转移到透析管中并用乙酸钠缓冲溶液透析以去除过量的试剂。进行总共三次交换，然后冻干最终的修饰的木瓜蛋白酶溶液。取每批的nanodrop读数以确定浓度。然后将溶液吸移到15ml falcon管中，使得将有2.07mg/ml的溶液。然后将管在-80℃下冷冻并冻干。然后对完全冻干的固体进行质量控制。
[0328]
重组β-内酰胺酶的表达和纯化。重组β-内酰胺酶oxa-1、shv-1、tem-1、kpc-2、cmy-2、shv-12、tem-20、ctx-m-2、ctx-m-8、ctx-m-14和ctx-m-15如先前所描述的制备和纯化(deboer等人，2018)。通过nanodrop(thermo fisher scientific)protein a280方法测定每种纯化酶的浓度，并在公式1中给出计算。
[0329]
c＝a/(ε*b)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(公式1)
[0330]
c是摩尔浓度，a是a
280nm
，ε是摩尔消光系数，并且b是以mm计的路径长度。使用重组酶的分子量将摩尔浓度转化为μg/μl。每种重组β-内酰胺酶的摩尔消光系数和分子量显示
于表1中，并且通过将重组β-内酰胺酶的氨基酸序列提交至瑞士生物信息研究所(the swiss institute of bioinformatics)expasy资源门户(web.expasy.org/protparam/)上的protparam工具(protparam tool)确定。
[0331]
表1.重组酶的消光系数和分子量。
[0332][0333]
定义重组β-内酰胺酶活性的检测限(lod)。重组β-内酰胺酶shv-1、tem-1、kpc-2、cmy-2、ctx-m-2、ctx-m-8、ctx-m-14和ctx-m-15如先前所描述的纯化。重组β-内酰胺酶oxa-1、shv-12和tem-20如先前所描述的克隆和纯化，采用在本研究中设计的并描述于表2的克隆引物。通过定义detect可以区分由目标β-内酰胺酶产生的信号输出与阴性对照时的最低浓度，确定给定β-内酰胺酶的检出限。
[0334]
表2.用于β-内酰胺酶基因克隆的引物和信息。
[0335]
[0336][0337]
bps，碱基对；aa，氨基酸。
[0338]a这些引物以先前所描述的克隆方法使用。2[0339]b每种引物中加下划线的序列代表在pcr期间结合感兴趣的β-内酰胺酶基因的核苷酸。
[0340]cpcr之后预期的扩增子尺寸；信号序列未被扩增。
[0341]d该信号序列在pcr期间未被扩增。在最终的重组蛋白质中不期望信号序列。
[0342]e由于在pet26b 载体插入和表达之后向其序列中添加了atg切割位点和6x-his标签，每种重组蛋白质的长度包括另外的9aa。
[0343]
测定。制备每种β-内酰胺酶的储备溶液和四个连续2倍稀释液(通过nanodrop定量β-内酰胺酶)。在96孔板中，将75μl的笼状木瓜蛋白酶溶液和75μl的bapa溶液转移到14个孔中。对于14个孔中的10个，将4μl的五种不同的β-内酰胺酶浓度各自添加至两个测试孔中。对于剩余孔中的两个，添加4μl的β-内酰胺酶探针溶液(“对照1”孔)或4μl的β-内酰胺酶储备溶液(“对照2”孔)。然后最后两个对照孔接受10μl的半胱氨酸溶液(0.0016m)(“阳性对照”孔)。最后，向每个测试孔中添加4μl的β-内酰胺酶探针溶液。用酶标仪以2min间隔记录在405
nm
下的吸光度值(a
405nm
)持续20min，以定义对应于detect的比色对硝基苯胺产物的形成的吸光度的时间依赖性生长。我们将20min定义为这些实验的终点，因为当测试重组β-内酰胺酶时，在30min时没有发现最大吸光度值会更大。
[0344]
计算lod。在这些研究中收集了十四个对照样品。我们取所有实验中所有对照孔的最终a
405nm
值的平均值，以归一化潜在的批次变异性。对照1条件产生两组更大的a
405nm
值；因此，我们的lod阈值被定义为对照1数据集的平均a
405nm
值的标准偏差的三倍。将每个测试的β-内酰胺酶的a
405nm
值相对β-内酰胺酶浓度作图，并进行线性回归。通过将x定义为β-内酰胺酶浓度外推最终lod浓度。
[0345]
临床分离菌和最低抑菌浓度(mic)的抗微生物敏感性测试(ast)。用detect测试的大肠杆菌(e.coli)和肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)临床分离菌获自来自以下几个地方的医院或门诊诊所的患者的血液、尿液、脑脊液和拭子(直肠、尿道、或眼睛)的样品：美国旧金山总医院(san francisco general hospital)(sf菌株)；巴西里约热内卢(b、cb、d、fb、haf、hcd、hon和xb菌株)；巴西圣保罗；以及美国加利福尼亚大学伯克利分校的大学保健服务部(university health services)(it菌株)。细菌分离菌也获自cdc和fda抗生素耐药性分离菌库(the cdc and fda antibiotic resistance isolate bank)(cdc菌株)。先前测试了分离菌对β-内酰胺的敏感性和β-内酰胺酶基因的携带(引用以上参考文献)。另外，我们用β-内酰胺氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢噻肟和头孢他啶进行肉汤微量稀释法测试，以获
得mic。根据由临床和实验室标准协会(the clinical and laboratory standards institute，clsi)设定的标准，用β-内酰胺氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢噻肟和头孢他啶进行肉汤微量稀释法测试，以获得最小抑菌浓度(mic)。
[0346]
使用临床分离菌的detect。将来自冷冻甘油储备液的临床分离菌传代培养到mueller-hinton阳离子调节的肉汤(mhb)中，并在37℃下振荡过夜持续16-20h。为了洗涤细胞，将1ml的过夜肉汤培养物用微型离心机在微量离心管中成团，然后将团粒重悬于1ml的“缓冲液1”中。然后将细菌悬浮液制备成在600nm下的光密度(od
600nm
)为0.5
±
0.005(其中od
600nm
为0.1＝1.0
×
108cfu/ml)。将5μl的该全细胞细菌悬浮液转移至96孔板的两个孔中，每个孔包含75μl的0.6mg/ml笼状木瓜蛋白酶溶液和75μl的7.2mg/2.5ml bapa溶液。当将4μl的β-内酰胺酶探针溶液添加至一个孔(样品孔)中并将4μl的乙腈添加至第二个孔(对照孔)中时，开始孵育时间，其中第二个孔用作对照以评价非特异性背景信号。在室温孵育的0min和30min时，用酶标仪收集a
405nm
值。用公式2计算30min时的detect得分：
[0347]
(a
405nmt30
样品孔-a
405nm t30
对照孔)-(a
405nmt0
样品孔-a
405nmt0对照孔
)
ꢀꢀꢀ
(公式2)
[0348]
进行roc曲线分析以建立阳性阈值，通过所述阈值评估临床分离菌产生的个体detect得分。重组β-内酰胺酶结果指导对该分析的真阳性和真阴性指定(对于96-分离菌组)：产生ctx-m和cmy的分离菌被认为是真阳性(48个分离菌)，而所有其他分离菌被认为是真阴性(48个分离菌)。产生大于阈值的detect得分的临床分离菌被detect视为阳性。然后确定detect测定的灵敏度和特异性。
[0349]
临床分离菌中的bla表达分析。如先前所描述的(deboer等人，chembiochem 19：2173-2177(2018))进行rna提取、cdna合成和实时定量逆转录pcr(qrt-pcr)-以评估β-内酰胺酶基因(bla基因)的表达的过程，稍作修改。将用于qrt-pcr分析的分离菌从冷冻甘油储备液传代培养到mhb中，并在37℃下振荡过夜持续16-18小时。为了洗涤细胞，将1ml的过夜肉汤培养物用微型离心机在微量离心管中成团，然后将团粒重悬于1ml的新的mhb中。然后将细菌悬浮液制备成od
600nm
为0.5-0.6用于rna提取。在qrt-pcr分析中利用β-内酰胺酶种类特异性引物、或β-内酰胺酶种类内的组特异性引物以评估临床分离菌中不同β-内酰胺酶基因(bla基因)的表达。在本研究中设计并验证了引物，并列于表3中。
[0350]
表3.用于qrt-pcr的引物序列和其他信息
[0351][0352][0353]
进行两次生物学重复实验用于表达分析。为了比较不同bla基因在细菌分离菌中的表达，我们使用公式3评估了每种菌株中bla相比于内部对照rpob的表达水平：
[0354]
其中δc
t
＝c
t-bla-c
t-rpob
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(公式3)
[0355]
采用β-内酰胺酶抑制剂的detect。掺入β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸的detect实验以与“采用临床分离菌的detect”中所描述的相同的方式进行，不同的是还采用克拉维酸盐，以2：1的克拉维酸盐：β-内酰胺酶探针的比率测试一式两组的孔。在“缓冲液1”中将克拉维酸钠的溶液制备成1mg/400μl，并将4μl的该溶液添加至被测试的每种分离菌的样品和对照孔中，两分钟之后分别向样品和对照孔中添加β-内酰胺酶探针或乙腈。将从原始detect过程产生的detect得分与在克拉维酸的存在下产生的detect得分进行比较(对每种分离菌同时进行过程)；采用公式4计算detect得分的倍数变化：
[0356]
倍数-变化＝原始detect得分/抑制剂detect得分
ꢀꢀ
(公式4)
[0357]
临床尿液样品收集。本研究的伦理批准由阿拉米达卫生系统(alameda health system)(ahs)irb委员会提供。本研究中包括了7月23日至7月27日和7月30日至8月4日提交至高地医院临床实验室(th highland hospital clinical laboratory)的尿液样品。高地医院(the highland hospital)(奥克兰，加利福尼亚州)是ahs内最大的医院(236张住院病床)，其临床实验室向医疗系统内的其他两家医院和三个保健中心提供微生物学服务。研究期期间提交至临床实验室用于常规尿液培养的所有尿液样品—其主要代表来自患有疑似uti的患者的尿液—均用于本研究。首先由临床实验室人员使用尿液样品用于标准尿液培养铺平板，然后(在同一天内)由本研究的研究者使用。未从本研究中使用其尿液样品的患者获得临床信息。尿液样品不含有细菌生长抑制剂/防腐剂。
[0358]
尿液培养、生物体鉴定、ast和esbl确证测试。根据临床实验室的标准操作程序，作
为本研究中使用的所有尿液样品的常规处理的一部分，由临床实验室进行标准微生物学过程。首先，将1μl或10μl的尿液样品铺于标准琼脂平板(血琼脂和曙红亚甲蓝琼脂双板)上，然后在第二天肉眼检查uti的显著生长指示(应用≥104cfu/ml截断值)。采用miscroscan walkaway系统(beckman coulter)用于gnb的ast和细菌鉴定，以及和选择引起uti的gpb。所测试的抗微生物剂种类和药剂是：β-内酰胺类(氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和哌拉西林/他唑巴坦)、叶酸途径抑制剂(甲氧苄啶/磺胺甲噁唑)、氨基糖苷类(阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素)、氟喹诺酮类(环丙沙星和左氧氟沙星)、硝基呋喃类(呋喃妥因)和甘氨酰环素类(替加环素)。ast解释基于clsi的2017指南。
[0359]
在进行标准尿液铺平板的第一步骤之后，临床实验室将剩余的尿液样品置于冰箱中。同日，研究的研究者将在本研究中使用样品。在采用detect测试尿液样品之前，将尿液样品重新铺到血琼脂平板上，使得在detect测试时能够估算cfu/ml并且确认菌落计数保持与由临床实验室在初始铺平板时获得的菌落计数相似。在37℃下孵育过夜之后，将来自这些平板的尿路病原体传代培养至mhb并且在37℃下振荡过夜持续16-20小时。通过将1ml的肉汤培养物与450μl的无菌50％甘油在冷冻小瓶中混合制备过夜肉汤培养物用于冷冻储存，然后将冷冻小瓶在-80℃下储存。为了筛选尿路病原体的任何β-内酰胺抗性，使用根据clsi的标准纸片扩散法测试gnb(其缺乏先前在microscan上测试的其他β-内酰胺抗性)对氨苄青霉素的敏感性。另外，根据clsi(采用头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸纸片)，使用标准纸片扩散法，采用esbl-确证测试进一步测试被测试到对第3代头孢菌素(头孢噻肟、头孢曲松或头孢他啶，在microscan上)有抗性的尿路病原体。
[0360]
使用尿液样品的detect以及尿液样品特征。在由临床实验室将尿液样品铺平板之后，将剩余的尿液样品置于冰箱中，直到研究的研究者到达的当天以测试用于本研究的尿液样品。目视检查尿液样品，并记录外观(颜色、透明度)。还通过将1ml的尿液等分到微量离心管中，然后用ph测试条通过将测试条浸入等分的尿液中测量ph，并相对于所提供的解释图表在视觉上解释结果来确定尿液样品的ph。
[0361]
对于detect测试，将尿液样品以八字形图案旋转来混合，然后将50μl的尿液转移至96孔板的两个孔中，每个孔包含75μl的1.0mg/ml笼状木瓜蛋白酶溶液和75μl的6.4mg/2.5ml bapa溶液。当将4μl的β-内酰胺酶探针溶液添加至一个孔(样品孔)中并将4μl的乙腈添加至第二个孔(对照孔)中时，开始孵育时间，其中第二个孔用作对照以说明来自尿液的非特异性背景信号。在室温孵育0min和30min时，用酶标仪收集a
405nm
读数(infinite m nano，tecan)。计算30min时的detect得分。
[0362]
为了评估detect鉴定在尿液样品中产生ctx-m的细菌的能力的性能，所述尿液样品的尿路病原体浓度被认为是临床相关的(由临床实验室应用的≥104cfu/ml截断值)，采用以下标准表型和基因型分析作为参考测试方法：阳性esbl确证测试(表型)和阳性ctx-m测序结果(基因型)。因此，通过参考测试方法，产生阳性esbl确证测试结果并且携带bla
ctx-m
是阳性的含有临床相关浓度的gnb的尿液样品被认为是真阳性，而所有其他样品被认为是真阴性。使用真阳性(11个尿液样品)和真阴性(460个尿液样品)标记对尿液detect得分分组用于roc曲线分析，使得可以建立detect的阳性阈值用于解释单个detect得分。产生大于阈值的detect得分的尿液样品根据detect被视为阳性。确定detect测定的灵敏度和特异
性。
[0363]
在可能的情况下，使用“采用临床分离菌的detect”过程和结果判读的阳性阈值，将来自产生有差异的detect结果(假阳性或假阴性)的尿液样品的细菌作为单个分离菌通过detect重新测试。
[0364]
β-内酰胺酶基因的dna提取和pcr扩增。如先前所描述的，通过pcr测试所有β-内酰胺抗性gnb(至少对氨苄青霉素具有抗性)的bla
tem
、bla
shv
和bla
oxa
β-内酰胺酶基因的携带(deboer等人，2018)，其包括tem和shv的esbl变体的测试。另外，如先前所描述的(tarlton 2018和dallenne)，还通过pcr测试了第3代头孢菌素抗性gnb对bla
ctx-m
基因和ampc基因bla
cmy
和bla
dha
的携带。在加利福尼亚大学伯克利dna测序机构(berkeley dna sequencing facility)清洁pcr扩增子并通过sanger测序进行测序。使用9.1.3版本(biomatters ltd.)目视检查，编辑，然后比对正向和反向序列以获得共有序列。将修饰的共有序列与已知的β-内酰胺酶序列变体—其从k.bush、t.palzkill和g.jacoby的数据库(externalwebapps.lahey.org/studies/)和genbank获得—比对以鉴定存在的β-内酰胺酶变体。
[0365]
统计分析。用双尾t-检验分析从采用临床分离菌和尿液样品的detect实验产生的detect得分。使用graphpad quickcalcs软件(www.graphpad.com/quickcalcs/catmenu/)，用费歇尔精确检验分析产生ctx-m或不产生ctx-m的细菌的抗微生物敏感性分类变量。使用prism 8(graphpad software)进行roc曲线分析。采用medcalc(medcalc software，www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php)计算detect测定灵敏度和特异性。也采用medcalc计算阳性和阴性预测值。对于所有分析，p《0.05被认为是统计学上显著的。
[0366]
β-内酰胺酶探针的制备和表征：
[0367]
方案1呈现可以用于制备所公开的各种β-内酰胺酶探针的通用方案。
[0368][0369]
方案2提供(7r)-7-氨基-8-氧代-3-((苯基硫基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸4的制备。
[0370][0371]
方案3提供用于从4合成ceph-3，一个β-内酰胺酶探针的代表性实例的方案。
[0372][0373]
(7r)-7-((e)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-(甲氧基亚氨基)乙酰氨基)-8-氧代-3-((苯基硫基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸(ceph-3)：
[0374][0375]
将三乙胺(18.2μl，0.131mmol)添加至在ch2cl2(4ml)中的(7r)-7-氨基-8-氧代-3-((苯基硫基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2甲酸(20.mg，0.62mmol)的在冰上的溶液中。然后使所得混合物升温至环境温度。向混合物中添加s-2-苯并噻唑基-2-氨基-α-(甲氧基亚氨基)-4-噻唑硫代乙酸酯(23.9mg，0.682mmol)。将混合物在环境温度下搅
拌5.5h之后，用水淬灭反应。用水(
×
5)萃取有机层。合并水层并用ch2cl2(
×
3)洗涤。然后用etoac(
×
4)萃取水层。合并有机层、干燥并浓缩以得到为呈浅黄色粉末的标题化合物。1h nmr(300mhz,丙酮-d6)δ7.41(m,j＝32.5hz,5h),6.93(s,1h),5.90(s,1h),5.21(s,1h),4.37(s,1h),4.03(s,1h),3.99
–
3.90(m,3h),3.86(s,1h),3.64(s,1h)。
[0376]
方案4呈现可以用于制备所公开的另外的β-内酰胺酶探针的通用方案。
[0377][0378]
方案5提供可以用于制备ceph-2-头孢氨苄9的方案。
[0379][0380]
步骤1：
[0381][0382]
opmb保护的(1s,8r)-8-氨基-7-氧代-4-((苯基硫基)甲基)-2-硫杂双环[4.2.0]辛-4-烯-5-甲酸中间体6。在200-ml rbf中，制备氯代头孢烯5(1g，2.46mmol)在丙酮(79ml)中的浆液并在冰浴中搅拌。在等量的丙酮和水(各11ml)中制备khco3(0.40g，4mmol)和苯硫酚(0.41ml，4.018mmol)的溶液，并将其搅拌5min，然后滴加至反应混合物中。向混合物中添加所有苯硫酚/khco3溶液之后，使反应达到环境温度并搅拌6h。使用ph 2溶液将反应混合物酸化至ph～0。向该酸化的混合物中添加己烷(25ml)并将其搅拌5min，然后分离各层。然后将水性部分用己烷再洗涤两次，并将水层用浓khco3溶液(～25ml)碱化至ph》7。用etoac(3
×
20ml)萃取碱化的水层，并将合并的有机物干燥并浓缩以得到黄橙色固体(80％收率)。
[0383]
步骤2：
[0384][0385]
boc和opmb保护的(1s,8r)-8-((r)-2-氨基-2-苯基乙酰氨基)-7-氧代-4-((苯基硫基)甲基)-2-硫杂双环[4.2.0]辛-4-烯-5-甲酸中间体8。在含有boc-苯基甘氨酸7(0.056g，0.226mmol)、n-甲基吗啉(25μl，0.226mmol)和氯甲酸异丁酯(29μl，0.226mmol)在thf(4ml)中的溶液的25-ml rbf中，在冰(0℃)浴中在氮气下搅拌5分钟以形成混合的酸酐中间体。同时，在单独的25ml烧瓶中，在thf(4ml)中制备opmb保护的中间体6(0.100g，0.226mmol)和n-甲基吗啉(nmm，25μl，0.226mmol)的溶液，并在冰浴上搅拌。在氮气下，经5-7分钟的历程将中间体混合物缓慢添加至混合的酸酐溶液中，并将混合物在0℃下搅拌1h。1h的搅拌之后，将反应混合物恢复至环境温度并通过tlc(40/60，己烷/etoac)监测，直到大部分opmb保护的中间体6被消耗。rfsm int.＝0.40，rf明显的产生点(prod spot)＝0.83，并且rf苯基甘氨酸～0.50。12h的反应时间之后，通过tlc不可再观察到ceph-2中间体。将反应混合物过滤以去除不溶性副产物并将粗品浓缩以在烧瓶的侧面上得到粗膜状固体。向该粗固体中添加5-10滴thf并将烧瓶在4℃下储存10min。在旋转烧瓶的同时，添加己烷(10-15ml)以析出(crash out)白色无定形固体，并将固体过滤来收集。将留在烧瓶中的任何固体用几滴thf再溶解并用类似量的己烷(10-15ml)再次析出，并过滤以收集固体产物。通过tlc分析滤液以确保去除可溶性(通常是有色的)副产物并将观察到一些产物损失。将固体收集在小瓶中并在高真空下干燥。灰白色无定形固体具有0.069g的重量，收率为45％。
[0386]
步骤3：
[0387][0388]
ceph-2-头孢氨苄9。向8-ml小瓶的boc和opmb保护的中间体8(0.034g，0.059mmol)中装入搅拌棒并置于冰浴中。在单独的小瓶中，制备tfa(160μl)和苯甲醚(160μl)的混合物，并将该溶液缓慢加入反应小瓶中。将反应混合物在0℃下搅拌1h，并且使其达到环境温度并再搅拌4h。5h的搅拌之后，添加另外的tfa(50μl)和苯甲醚(50μl)混合物，并将其再搅拌一小时。将反应混合物用乙酸乙酯(10ml)淬灭，并将有机层用盐水洗涤直至得到中性水层。然后将有机层用硫酸镁干燥并浓缩以得到含有残余苯甲醚的粗化合物。通过添加过量己烷(10ml
×
3)去除苯甲醚并倾析几次。将产物小瓶置于高真空下以得到浅橙色固体(0.011g)。
[0389]
detect优先鉴定ctx-mβ-内酰胺酶的活性。首先通过定义一批纯化的重组β-内酰胺酶的检测限(lod)研究detect对独特β-内酰胺酶的选择性。所测试的重组酶代表主要β-内酰胺酶种类内的常见酶变体，并且包括：(a)oxa-1，青霉素酶；(b)tem-1和shv-1，它们是青霉素酶/早代头孢菌素酶；(c)主要的ctx-m变体，以及tem-20和shv-12，它们是esbl；(d)cmy-2，ampc；和(e)kpc-2，碳青霉烯酶。在不同的gnb中发现了这些酶种类，包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)、假单胞菌属(pseudomonas)和不动杆菌属(acinetobacter)。
[0390]
lod实验证明detect系统(其目前利用头孢菌素样靶向探针)对ctx-mβ-内酰胺酶以及cmy的酶活性高度敏感(参见图2a)。由ctx-m-14产生detect中最低的lod，其中纯化的重组酶的lod为0.025nm。测试的其他ctx-m变体—ctx-m-2、ctx-m-15和ctx-m-8—以及cmy-2分别产生0.036nm、0.043nm、0.060nm和0.041nm的类似低lod。ctx-m和cmy是相似的，因为它们可以介导对第3代头孢菌素的抗性。有趣地，detect系统对介导第3代头孢菌素抗性的其他酶，即tem和shv esbl变体和kpc碳青霉烯酶的酶活性较不敏感。在2.3nm、1.6nm和0.64nm下，tem-20、kpc-2和shv-12的lod分别是ctx-m-14的lod的25至92倍。青霉素酶/早代头孢菌素酶shv-1和tem-1也产生3.6nm和0.41nm的较高的lod，其分别是ctx-m-14的lod的145和16倍。oxa-1青霉素酶在活化detect系统方面很差；因此，未获得近似的lod，但估计至少大于4μm。
[0391]
detect可以用于鉴定临床分离菌中的ctx-m型β-内酰胺酶活性。虽然在生物化学条件下证实了ctx-m型β-内酰胺酶对β-内酰胺酶探针的酶促偏好，但临床细菌病原体可以是广泛多样和复杂的。特别地，产生β-内酰胺酶的尿路病原体可以从单个细菌菌株产生单个或多个β-内酰胺酶变体。例如，相对于从另一个患者培养的产生tem-1的大肠杆菌分离菌，从一个患者分离的产生tem-1的大肠杆菌可以产生显著不同水平的tem-1。因此，评价了detect揭示从临床分离菌产生的ctx-m-型β-内酰胺酶的活性的能力。
[0392]
进行实验以评价detect揭示细菌分离菌中ctx-mβ-内酰胺酶活性的能力。与纯化的β-内酰胺酶测试相比，临床分离菌代表复杂得多的环境，其中相同的细菌分离菌可以产生多于一种类型的β-内酰胺酶，并且其中细菌分离菌内和细菌分离菌间的β-内酰胺酶表达
是可变的。
[0393]
通过detect分析了大肠杆菌的大约一半临床分离菌和一半肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)—最常见的产生esbl的gnb—的96-分离菌组。分离菌源自多种临床来源并且先前被表征为单独或组合产生多种β-内酰胺酶(表4)。这些β-内酰胺酶属于先前以重组形式测试的相同种类的酶，并且包括tem、shv和oxa的非esbl变体；ctx-m esbl，以及tem和shv的esbl变体；质粒介导的ampc(pampc)cmy；和kpc碳青霉烯酶。分离菌特征的完整表—包括β-内酰胺酶内容物、选择的β-内酰胺最小抑菌浓度(mic)和detect得分—如表4中所示。
[0394]
表4.采用detect测试的临床分离菌组
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399][0400]
*大肠杆菌的染色体ampc未通过pcr筛选，并且在肺炎克雷伯氏菌染色体β-内酰胺酶中，仅shv被适当地筛选。
[0401]
用该符号标记的分离菌用于掺入克拉维酸的detect实验。确定detect得分的倍数变化，比较来自原始detect测定的得分与来自detect 抑制剂测定的得分(原始得分/抑制剂得分)。
[0402]
基于细胞中的β-内酰胺酶内容物对由分离菌产生的detect得分进行分组(参见图2b)。由于超过三分之一的分离菌产生多种β-内酰胺酶(临床分离菌中的共同特征)，建立了等级次序以指导适当的组别设置用于分析，并且如下：ctx-m》cmy》kpc》esbl shv或esbl tem》tem》shv或oxa》β-内酰胺-敏感的。因此，无论其他β-内酰胺酶内容物如何，将含有cmy
的分离菌分组在一起(除非分离菌含有ctx-m，在该情况下将其与其他ctx-m一起分组)，等等。
[0403]
与重组β-内酰胺酶结果一致，产生ctx-m的分离菌和产生cmy的分离菌优先被detect系统鉴定，与其他分离菌相比，在30min时产生最高的平均detect得分(参见图2b)。产生ctx-m的分离菌的平均detect得分是0.77—是shv/tem esbl、tem、shv或oxa和β-内酰胺易感分离菌的平均得分的大致4至15倍(所有的p《0.0001)。类似地，产生cmy的分离菌的平均detect得分是0.92—是其他四组的平均得分的大致5至18倍(所有的p《0.01)。有趣地，产生kpc的分离菌也产生更高的detect得分，平均得分为0.59，是四个非ctx-m和非cmy组的平均得分的3至12倍(所有的p《0.01)。生成roc曲线以建立阳性detect得分的阈值。重组β-内酰胺酶结果指导roc曲线的真阳性和真阴性分组；即，产生ctx-m和cmy的分离菌被认为是真阳性(48个分离菌)，而所有其他分离菌被认为是非目标(48个分离菌)。这导致0.895的auc(95％ci：0.832至0.958)。选择0.2806的阈值以优化高灵敏度(85％)和特异性(81％)。除了几种产生kpc的分离菌，由两种产生tem-1的大肠杆菌(e.coli)和一种产生shv-12(esbl)的肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)产生假阳性结果。
[0404]
对单一产生β-内酰胺酶的分离菌的缩写组进行表达分析以研究产生kpc的分离菌的高于预期的detect得分(参见图2c)。bla基因和内部对照rpob的qrt-pcr证明，bla
kpc-2
在耐碳青霉烯的大肠杆菌分离菌“b2”(具有高detect得分，0.8)中的表达是rpob的表达的33倍。相比之下，具有次最高β-内酰胺酶表达的分离菌是“cdc-87”(具有低detect得分，0.1)，产生shv-12esbl的分离菌具有相比于rpob为4倍的bla
shv-12
的表达。虽然基于纯化的酶实验将预测两种分离菌产生低的detect得分，但如果表达模式确实反映细胞中蛋白质的量，则来自kpc的分离菌的高detect得分可以归因于与其他β-内酰胺酶相比相对高水平的kpc。
[0405]
通过将β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸掺入detect中探究区分产生cmy(ampc)和ctx-m(esbl)的分离菌的可能性。克拉维酸是已知的esbl抑制剂，但不明显抑制ampc酶的活性。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌临床分离菌的子组同时用初始detect系统和detect加抑制剂系统测试，揭示当将克拉维酸添加至系统中时，所有分离菌在30min时产生较低的detect得分。然而，detect得分受影响的程度(得分的倍数变化)与产生的β-内酰胺酶的类型相关(参见图2d)。与产生ctx-m的分离菌相比，产生cmy的分离菌中detect得分(初始detect得分除以抑制剂detect得分)的倍数变化更低，因为cmy对抑制剂不太敏感。产生倍数变化阈值以区分指示非cmy/非ampcβ-内酰胺酶的detect得分的变化，并确定为1.97x。含有cmy的所有分离菌的得分的倍数变化低于该阈值(包括含有双重cmy和ctx-m的分离菌)，而含有ctx-m的所有其他分离菌的得分的倍数变化高于该阈值，表明在需要时区分这些产生β-内酰胺酶的分离菌的能力。
[0406]
detect鉴定未处理的尿液样品中产生ctx-m的细菌。在未处理的临床尿液样品中评价detect作为诊断测试的临床潜力，以检测作为esbl-uti的指示物的ctx-m的存在。临床尿液样品的复杂和多样的环境代表阻碍基于生物化学的方法用于直接检测尿液中β-内酰胺酶活性的一个技术障碍。因此，在加利福尼亚州奥克兰(oakland,ca)的公立医院进行了irb批准的研究，其中测试了在11天时间内提交至临床实验室用于尿液培养的所有尿液样品。对尿液样品进行detect测定而不应用样品特征排除，诸如定义的样品收集方法；ph、颜色、或澄清度限制；cfu/ml截断值；或病原体鉴定入选标准。该临床尿液研究的工作流程在
图3中示出，包括作为常规测试一部分的由临床实验室进行的标准微生物学过程(参见图3a)，由研究的研究者进行的微生物学和分子生物学过程(参见图3b)，以及由研究的研究者进行的detect测定(参见图3c)。detect测定快速；向detect试剂中添加少量的未处理的尿液样品(总计100μl)之后，在30min内完成测试。
[0407]
总体而言，用detect测试了472份尿液样品，基于标准微生物学标准(应用≥104cfu/ml截断值)，118份(25％)被分类为代表真实uti。发现测试的尿液样品在外观和ph方面均不同。尿液颜色范围从标准浅黄色至红色；尿液澄清度范围从澄清至非常浑浊(参见图7a)。尿液ph范围从ph 5至9(参见图7b)。在118个微生物学定义的uti中，96个(81％)由gnb引起，20个(17％)由gpb引起，以及2个(2％)由酵母菌引起(参见图4a)。基于临床上显著的cfu/ml计数，有109个gnb分离菌来自96个gnb uti样品；九个尿液样品生长2种gnb菌种，而两个尿液样品生长3种gnb菌种。肠杆菌科是uti的最常见原因，大肠杆菌(73种分离菌)、肺炎克雷伯氏菌(17)和奇异变形杆菌(9)是最常见的分离菌菌种(参见图4b)。在118个uti中，13个(11％)由产生esbl的gnb引起，其中11个(85％)产生ctx-m型esbl(参见图4c和4d)。有九种产生esbl的大肠杆菌(8种ctx-m和1种tem esbl)、三种产生esbl的肺炎克雷伯氏菌(2种ctx-m和1种shv esbl)和一种产生esbl的奇异变形杆菌(ctx-m)(参见图4d)。参见表5描述在esbl阳性尿液样品中鉴定的微生物学特征、detect得分和esbl变体。鉴定了以下esbl基因：来自13种产生esbl的分离菌的九种(69％)ctx-m-15、一种(8％)ctx-m-14、一种(8％)ctx-m-27、一种(8％)tem-10和一种(8％)shv-9/12。
[0408]
表5.采用detect检测的esbl阳性尿液样品。
[0409]
[0410][0411]aint.，detect结果的判读(阈值＝0.2588)；tp，真阳性；错误(error)，由于30min时信号过饱和而无法生成detect得分；fn，假阴性；tn，真阴性。
[0412]
b“纯的”指示尿液样品产生指定生物体的纯培养物。当没有指示“纯的”时，样品还含有可忽略的cfu的皮肤/泌尿生殖菌群。g-，革兰氏阴性菌。
[0413]c假定的campc指示已知所述菌种含有campc。由于它们的内在性质，这些酶没有通过pcr测试而是假定存在。nd，未检测到。
[0414]
根据微生物内容物对尿液样品分组，以评估由这些不同类型的样品产生的detect得分(参见图5a)。这些组包括：不生长细菌的尿液样品(无生长)；生长不指示uti的细菌的尿液样品(无uti)；来自由gpb或酵母菌引起的uti的尿液样品(革兰氏阳性菌或酵母菌uti)；以及来自由以下gnb引起的uti的尿液样品：不含有被检测的β-内酰胺酶的gnb(无被检测的β-内酰胺酶)、含有shv的gnb(shv)、含有tem的gnb(tem)、含有shv esbl的gnb(shv esbl)、含有染色体ampc的gnb(campc)、或含有ctx-m的gnb(ctx-m)。由含有产生ctx-m的gnb的uti样品产生的平均detect得分是1.3，其是由含有产生campc的gnb的uti样品产生的平均detect得分的3倍(0.44，p《0.01)，并且是由所有其他类型的尿液样品产生的平均detect得分的8至36倍(0.04-0.16，所有的p《0.001)。无法计算一份尿液样本的detect得分—在30min时该样品产生的信号超出了分光光度计的检测范围。参见表6提供了完整的尿液样品数据。
[0415]
表6.采用detect检测的临床尿液样品
[0416]
[0417]
[0418]
[0419]
[0420]
[0421]
[0422]
[0423]
[0424]
[0425]
[0426]
[0427]
[0428]
[0429]
[0430]
[0431]
[0432]
[0433]
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438]
[0439]
[0440][0441]a如果从尿液样品中分离出多于一种生物体，则尿液样品编号被列出多于一次，以指示以显著cfu/ml鉴定的菌种的数目(例如：hh-098-1、hh-098-2、hh-098-3)。
[0442]b测试具有任何β-内酰胺抗性(至少对氨苄青霉素具有抗性)的分离菌的β-内酰胺酶基因的携带。大肠杆菌的染色体ampc未通过pcr筛选，并且在肺炎克雷伯氏菌染色体β-内酰胺酶中，仅shv通过pcr适当地筛选(尽管len有时用shv引物检测)。来自其他革兰氏阴性细菌菌种的campc也未被测试，但假定存在。
[0443]c使用esbl确证测试的kirby-bauer纸片扩散方法(根据clsi)。
[0444]
使用微生物学和分子生物学结果的组合作为对比detect的参考：(a)“参考标准阳性”定义为微生物学定义的uti样品，其包含esbl确证测试(clsi纸片扩散方法)阳性的gnb分离菌，所述gnb分离菌的ctx-m基因也为阳性(通过pcr和扩增子测序)[n＝11个样品]；(b)“参考标准阴性”定义为不满足参考标准阳性标准的任何样品[n＝460个样品]。构建roc曲线以建立阳性detect得分的阈值，并优化detect测定规格。这导致0.937的auc(95％ci：0.828至1.047)。选择0.2588的截断值，其得到detect的双重高灵敏度(91％)和特异性(98％)(参见图5b)。
[0445]
仅十二个尿液样品产生被认为不正确的detect结果。在可能的情况下，将从这些尿液样品分离的细菌如单独的临床分离菌一样采用detect重新测试，以进一步理解预期的与观察到的detect结果之间的不一致性。一个“参考标准阳性”尿液样品由detect测试为假阴性；从该样品分离的产生ctx-m-15的肺炎克雷伯氏菌产生正确的阳性detect结果(参见表7)。
[0446]
表7.采用detect测试的、来自产生不一致的结果的尿液样品的细菌分离菌。
[0447][0448][0449]aint.，用尿液判读detect结果(阈值＝0.2588)；fp，假阳性；错误(error)，由于30min时信号过饱和而无法生成detect得分；fn，假阴性；ep，预期阳性(即使尿液样品产生“正确”结果，预期由于cmyβ-内酰胺酶内容物和第3代头孢菌素抗性而产生fp结果)。
[0450]
b“纯的”指示尿液样品产生所示生物体的纯培养物。当没有指示“纯的”时，样品还
含有可忽略的cfu的皮肤/泌尿生殖菌群。g-，革兰氏阴性菌。
[0451]c假定的campc指示已知所述菌种含有campc。由于它们的内在性质，这些酶没有通过pcr测试而是假定存在。nd，未检测到。
[0452]d由pcr发现奇异变形杆菌分离菌是dha-9-阳性的(pampc)，尽管其缺乏与质粒介导的dha基因相关的β-内酰胺抗性表型(即第三代头孢菌素抗性)。
[0453]e采用临床分离菌的detect结果的判读(阈值＝0.2806)。
[0454]
十一份“参考标准阴性”尿液样品由detect测试为假阳性。从这些样品中的10个培养的细菌产生以下正确的阴性detect结果(注意，一些样品以显著数量生长多于一种生物体，因此测试了所有分离菌)：六个产生tem-1的大肠杆菌测试为阴性；两个产生shv的肺炎克雷伯氏菌测试为阴性；两个β-内酰胺敏感性奇异变形杆菌和一个tem-1/dha-9阳性奇异变形杆菌测试为阴性；三个产生campc的gnb测试为阴性。由于由临床实验室未将一个“参考标准阴性”尿液样品视为uti(105cfu/ml混合皮肤/泌尿生殖菌群)，并且未保存从该尿液样品中培养的混合细菌，因此无法重新测试该“参考标准阴性”尿液样品。由于样品在30min时产生超过分光光度计的检测范围的a
405nm
信号(a
405nm
》4.0)，因此不能测定一个尿液样品的detect得分(错误)。出人意料地，从该样品分离的产生tem-10的大肠杆菌产生阳性detect结果。有趣地是，一个detect-阴性尿液样品生长出第3代头孢菌素-抗性弗氏枸橼酸杆菌(产生cmy型campc)；基于该生物体的cmy基因型和抗性表型，我们将预期该尿液样品在detect中产生阳性结果。因此，我们用detect测试了弗氏枸橼酸杆菌分离菌，并且发现它产生了阳性结果(证明与先前的产生cmy的分离菌实验一致)。
[0455]
引起uti的产生ctx-m的细菌具有有限的抗生素治疗选择。本研究中鉴定的产生ctx-m的分离菌包括大肠杆菌(8种分离菌)，肺炎克雷伯氏菌(2种分离菌)和奇异变形杆菌(1种分离菌)—肠杆菌科的所有成员，以及本研究中含有产生ctx-m的细菌的唯一家族。在本研究中进一步评估肠杆菌科分离菌以确定产生ctx-m的细菌和缺乏ctx-m的细菌的抗微生物抗性谱(参见图6a)。大多数第3代头孢菌素抗性(头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶)可以归因于产生ctx-m的细菌。三个例外是产生tem-10esbl的大肠杆菌、产生shv-9/12esbl的肺炎克雷伯氏菌和产生campc cmy-41/112的弗氏枸橼酸杆菌。同样地，对氨曲南(单胺菌素)和头孢吡肟(第4代头孢菌素)的抗性主要是由于产生ctx-m的细菌。除了产生campc的肠杆菌科固有抗性之外，对头孢西丁抗性是罕见的；在分离菌中未检测到哌拉西林/他唑巴坦抗性和碳青霉烯抗性。因此，通过正确鉴定11个ctx-m阳性尿液样品中的10个(91％)，detect鉴定了本研究中发现的超广谱头孢菌素抗性的71％(14个中的10个)。
[0456]
在氨基糖苷类中，仅在一种产生ctx-m的大肠杆菌中出现阿米卡星抗性。相比之下，在5种(45％)产生ctx-m的细菌和7种(7％)缺乏ctx-m的细菌中鉴定出庆大霉素抗性(p《0.01)，而在5种(45％)产生ctx-m的细菌和2种(2％)缺乏ctx-m的细菌中鉴定出妥布霉素抗性(p《0.0001)。氟喹诺酮和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑抗性在所有分离菌中更为普遍；然而，在产生ctx-m的细菌中仍然更可能出现对这些种类的药剂的抗性。在8种(73％)产生ctx-m的细菌和14种(15％)缺乏ctx-m的细菌中鉴定出环丙沙星抗性(p＝0.0001)；类似地，在8种(73％)产生ctx-m的细菌和13种(14％)缺乏ctx-m的细菌中鉴定出左氧氟沙星抗性(p《0.0001)。另外，在8种(73％)产生ctx-m的细菌和21种(22％)缺乏ctx-m的细菌中鉴定出甲氧苄啶/磺胺甲噁唑抗性(p《0.01)。不包括固有抗性(奇异变形杆菌和雷氏普罗威登菌)，呋
喃妥因抗性是罕见的；它在1种(10％)产生ctx-m的细菌和2种(2％)缺乏ctx-m的细菌中被鉴定。替加环素已经被考虑用于治疗由具有有限的治疗选择(包括esbl-ek)的gnb引起的uti。不包括固有抗性(奇异变形杆菌和雷氏普罗威登菌)，没有鉴定出抗替加环素的分离菌。
[0457]
多药耐药性(mdr)典型地被定义为对三类或更多类抗微生物剂中的至少一种药剂的抗性，不包括固有抗性。患有mdr感染的患者不太可能接受一致的(根据ast结果)经验性治疗，因为mdr细菌对多种潜在的治疗选择具有抗性。产生ctx-m的细菌更可能是mdr而不是其他导致uti的gnb；与六种(6％)非ctx-m细菌相比，10种(91％)产生ctx-m的细菌(图6b)是mdr(p《0.0001)。ctx-m-阳性肠杆菌科是mdr的阳性预测值是90.9％(ci：57.8％至98.6％)，并且阴性预测值是93.7％(ci：88.8％至96.6％)。detect鉴定了10种由产生mdr ctx-m的gnb引起的uti中的九种(90％)。
[0458]
应当理解，在不脱离该公开内容的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案在以下权利要求的范围内。