提高离子交换色谱过程中抗体产率的方法与流程

1.本公开涉及一种在通过离子交换色谱从样品中纯化抗体期间提高抗体产率的方法。该方法包括抗体样品以流穿模式进行多模式阴离子交换色谱的步骤，在iex步骤之前，使用tris而不使用nacl对抗体样品进行预处理以调整电导率。tris的加入，不仅调整了电导率，还增加了单体含量较高的流穿液中抗体的产率。此外，本发明涉及包括用本文所述方法纯化的抗体的药物组合物。


背景技术：

2.单克隆抗体(mab)被用于治疗和诊断应用，以及基础研究中广泛的免疫化学技术。在制药应用中，治疗性抗体必须符合高质量标准。因此，为了满足这些要求，每个制造和纯化工艺开发的目标都是开发一种稳健、可扩展和可靠的工艺，从而获得高产率和高纯度的目标产品。
3.纯化期间，目标抗体将从不想要的污染物(例如宿主细胞蛋白质(hcp)、核酸、病毒、培养基成分(例如胰岛素)、细胞培养添加剂(例如peg醚、消泡剂)以及任何可能存在的聚集化和碎片化产物)中解放出来。抗体通常由杂交瘤细胞或转染的宿主细胞(例如cho、hek)产生。因此，在纯化过程开始时，必须从细胞培养物中去除细胞材料。随后，通常通过结合-洗脱模式(“捕获”，例如通过proteina色谱获得igg抗体)下的亲和色谱步骤处理含有抗体的样品，然后进行病毒灭活、中和和深度过滤。为了达到治疗级产品的质量标准，纯化过程中还包括了额外的所谓“精制”步骤。通常，在“捕获”步骤之后执行两个或多个色谱步骤，以去除残留的聚集体和杂质。在这些步骤中通常去除的杂质是过程衍生的污染物，例如hcp、核酸、培养基组分、浸出的蛋白a、内毒素等。在初始抗体亲和色谱之后，通常通过使用离子交换色谱(iex)来去除聚集体和杂质。特别是，多模式色谱(mmc)介质非常适合于在mab的蛋白a纯化之后(pinto if等人,pharm.bioprocess.(2015)3(3),263-279)。操作模式对成功的多模式色谱也起着重要作用。例如，在流穿(ft)模式下，选择样品和缓冲液的ph，以修饰抗体或色谱介质的电荷，从而使抗体不会结合，而是流穿过色谱柱，留下大多数杂质结合。通过优化如蛋白质装载量、ph和电导率等条件，可以提高流穿级分中抗体的纯度。
4.例如，wo2010071208公开了一种使用ph 6.2的含有20mm柠檬酸和选自精氨酸、组氨酸、脯氨酸、谷氨酸和瓜氨酸的特定氨基酸的上样溶液以ft模式通过mmc进行抗体纯化的方法。us10023608描述了阿达木单抗的纯化，使用流穿模式下的mmc步骤，然后是hic步骤，样品用nacl和tris碱作为缓冲液预处理，以在装载到mmc树脂之前分别达到样品的适当电导率(～15至19ms/cm)和ph(～6.9至7.3)。此处，用包括nacl的缓冲液调整电导率。存在大量多种其他多步骤色谱纯化方法。例如，wo2005044856涉及使用羟基磷灰石树脂可选地结合阴离子交换色谱从抗体样品中去除高分子量聚集体。在为流穿模式羟基磷灰石色谱作准备时，使用含有0.2-2.5m nacl的上样缓冲液调整抗体样品。wo2010048183涉及在酸性ph和hic色谱条件下通过连续离子交换从抗体样品中去除hcp。在进行ft模式下的iex步骤之前，用20mm磷酸钠和150mm nacl或含有25mm三乙胺和40mm nacl的缓冲液平衡样品。
wo2011090719描述了一种包括多个色谱步骤的抗体纯化的方法，其中在不需要ph调整的情况下进一步纯化来自蛋白a色谱的低ph洗脱液。wo2012059308公开了中间精制步骤，其包括任意顺序的流穿模式下的阴离子交换色谱(aex)色谱或阳离子交换色谱(cex)色谱。在分别进入aex和cex柱之前，用去矿质水稀释样品使其最终电导率达到5ms，或用50mm nah2po4调整样品以调整ph和电导率。
5.使用一个以上色谱步骤的方法的普遍缺点是，在每个颗粒步骤后，目标蛋白质丢失，通常导致抗体产率显著降低。更多步骤也意味着更长的纯化时间，这可能对蛋白质的稳定性和活性有害。因此，仍然需要开发能够增加产率并同时获得满意纯度的方法。这些方法对于治疗性和诊断性化合物的纯化过程具有重要价值。
6.在流穿模式下，需要定义适当的ph和电导率条件，以定制目标抗体的电荷，从而使抗体不会结合，而是流穿过树脂，大部分杂质结合到柱上。流穿模式的好处是可以使用更高的装载量，并且清洗和洗脱步骤更少。通过优化装载量、ph、盐和电导率等条件，可以提高流穿中抗体的纯度，但是预测最佳条件很困难，因为不同细胞系之间的污染物水平不同。此外，之前的纯化步骤可能存在差异，导致装载的样品成分不同。一般来说，现有技术(ge healthcare instructions 28-9064-05aa)指出，使用流穿模式下的多模式capto adhere时为了获得最佳产率，样品装载量应高、ph低和电导率高。为了获得最佳聚集体清除率，ph应较高，而装载量和电导率应较低。与protein a和hcp清除率相比，聚集体清除率受电导率的影响通常较小。为了获得最佳的protein a和hcp清除率，ph应较高，电导率应较低。因此，上样条件将是有利于产率的条件和有利于污染物清除率的条件之间的折中。最佳上样条件将是装载量、ph和电导率之间的平衡。nacl是一种用于电导率调整的有用的盐，因其价格低廉而被广泛使用。nacl浓度和电导率的变化会影响与离子交换剂结合的蛋白质带电基团的结合强度。在流穿模式下，清洗步骤可用于通过允许弱结合蛋白被收集来增加目标抗体的产率。
7.进一步的纯化方法如ep2639239中所述，其涉及使用cex从样品中去除蛋白质聚集体的方法。在该文中，进料样品被透析到tris-hcl缓冲液(ph 7.5，电导率3ms/cm)中。wo2014196780涉及一种通过顺序使用cex、过滤器和aex而不使用亲和色谱去除杂质的方法。在aex前，样品用tris-hcl和bis-tris处理，并调整至1.4ms/cm的电导率。wo2014207763公开了通过亲和和疏水相互作用色谱纯化阿达木单抗。现有技术中的蛋白质纯化方法均未将tris碱描述为调整电导率的化合物。
8.本技术潜在的技术问题可以从提供一种在ft模式下的多模式离子交换色谱期间增加抗体产率同时保持含抗体样品的聚集体和其他杂质的有效减少的方法中看出。本发明通过提供一种方法来满足这些需求，其特征在于，在上样到流穿模式下的色谱柱之前，通过仅使用tris(即不使用nacl或任何其他盐)预处理样品来增加待纯化抗体样品的电导率。


技术实现要素：

9.如本文所述，发明人已发现，在上样到流穿模式下的混合模式阴离子交换色谱树脂之前，在初始protein a捕获色谱之后，与执行不使用tris预处理样品洗脱液(即不增加电导率)或通过使用nacl调整电导率的步骤相比，向抗体样品洗脱液中添加中性ph的tris竟令人惊讶地导致更高的抗体产率。
10.在某些实施方式中，本公开提供一种从包括抗体和聚集物和/或杂质的组合物中纯化抗体的方法，其中该方法包括以下步骤：a)使所述组合物经过捕获色谱以产生捕获色谱洗脱液；b)以5％-20％(v/v)的范围向捕获洗脱液中添加2m tris，ph 7.1；c)使步骤b)中的预处理洗脱液以流穿模式经过混合模式(多模式)阴离子交换色谱，生成混合模式洗脱液；d)使所述混合模式洗脱液以结合-洗脱模式经过第二次混合模式色谱，生成第二次的混合模式洗脱液；和e)收集包括所述抗体的级分，其中所述方法提高所述抗体的产率。
11.在某些实施方式中，本公开提供一种从包括抗体和聚集物和/或杂质的组合物中纯化抗体的方法，其中该方法包括以下步骤：a)使所述组合物经过捕获色谱以产生捕获色谱洗脱液；b)以5％-20％(v/v)的范围向捕获洗脱液中添加2m tris，ph 7.1；c)使步骤b)中的预处理洗脱液以流穿模式经过混合模式(多模式)阴离子交换色谱，生成混合模式洗脱液；d)使所述混合模式洗脱液以结合-洗脱模式经过第二次混合模式色谱，生成第二次的混合模式洗脱液；和e)收集包括所述抗体的级分，其中所述方法减少来自所述组合物的聚集体和/或杂质的量。
12.在某些实施方式中，本公开提供一种从包括抗体和聚集物和/或杂质的组合物中纯化抗体的方法，其中该方法包括以下步骤：a)使所述组合物经过捕获色谱以产生捕获色谱洗脱液；b)以5％-20％(v/v)的范围向捕获洗脱液中添加2m tris，ph 7.1；c)使步骤b)中的预处理洗脱液以流穿模式经过混合模式(多模式)阴离子交换色谱，生成混合模式洗脱液；d)使所述混合模式洗脱液以结合-洗脱模式经过第二次混合模式色谱，生成第二次的混合模式洗脱液；和e)收集包括所述抗体的级分，其中所述方法提高所述抗体的产率并减少来自所述组合物的聚集体和/或杂质的量。
13.本发明的某些实施方式涉及从样品中纯化抗il-17c抗体或其抗原结合部分的方法，以使抗体基本上不含宿主细胞蛋白(hcp)、浸出的protein a、聚集体和其他杂质。在一实施方式中，本公开提供一种纯化il-17c抗体的方法，该方法包括去除细胞和细胞碎片的初始回收步骤。所述回收步骤包括一个或多个离心或深度过滤步骤。
14.在特定实施方式中，对包括抗体的初始回收样品进行亲和色谱步骤。示例包括protein a、protein g、包括其他fc结合蛋白质的亲和性载体，以及包括针对其产生目标抗体的抗原的亲和性载体。尤其是，protein a可用于igg抗体的亲和纯化。在一方面，在上样之前，用合适的缓冲液平衡protein a柱。合适的缓冲液的一个例子是pbs，ph7.0-7.3。平衡后，可上样到色谱柱中。在上样到色谱柱中后，可使用(例如)平衡缓冲液进行一个或多个清洗步骤。在洗脱色谱柱之前，也可以使用采用不同缓冲液的其他清洗液。使用合适的洗脱缓冲液从亲和柱中洗脱抗体。合适的洗脱缓冲液的一个示例是ph为3.6的50mm醋酸盐缓冲液。可以使用本领域技术人员熟知的技术来监测洗脱液。例如，可以测量od280处的吸光度。然后，目标洗脱级分可为通常包括精制色谱的进一步步骤做准备。
15.在一实施方式中，在protein a亲和色谱之后进行低ph调整步骤。在该实施方式中，使用1m乙酸将包括抗体的protein a洗脱液ph调整至约2.5至约3.5，以减少和/或灭活可能污染样品的ph敏感病毒。在特定实施方式中，用1m乙酸将亲和洗脱液调整至ph 3。在定义的孵育期后，将溶液中和至ph介于约6.5和约7.5之间。在一实施方式中，可使用1m tris，ph 9.5缓冲液完成ph中和。在一实施方式中，在病毒失活(即低ph调整)和中和后进行深度过滤。
16.在某些实施方式中，离子交换色谱紧接在亲和色谱之后。在其他实施方式中，离子交换紧接在低ph调整步骤之后。在优选实施方式中，离子交换紧接在病毒失活步骤后的深度过滤之后。所述离子交换步骤可以是阳离子交换或阴离子交换。该步骤可以是单个离子交换步骤，也可以包括按顺序组合的多个离子交换步骤，例如先进行阳离子交换，然后进行阴离子交换，反之亦然。
17.在某些实施方式中，作为具有多模式功能性的强阴离子交换色谱树脂的capto adhere impres(ge healthcare)可用作精制步骤。在一实施方式中，在待纯化抗体不结合离子交换树脂的条件下以流穿模式执行该步骤，而诸如dna、rna、宿主细胞蛋白质、聚集体和病毒等主要污染物能结合并因此有效分离。
18.在一方面，通过调整样品的ph和离子强度或电导率，为离子交换色谱制备抗体样品(例如亲和色谱洗脱液、深度过滤后的滤液)。
19.在优选实施方式中，纯化抗体的方法包括以下步骤：
20.a.提供包括抗体的样品；
21.b.调整所述样品的电导率；
22.c.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
23.d.收集包括所述抗体的流穿液，
24.其中步骤b)中样品的电导率用tris调整，优选用2m tris，ph 7.1调整。
25.在另一实施方式中，用于提高抗体产率的方法包括以下步骤：
26.a.提供包括抗体的样品；
27.b.调整所述样品的电导率；
28.c.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
29.d.收集包括所述抗体的流穿液，
30.其中步骤b)中样品的电导率用tris调整，优选用2m tris，ph 7.1调整。
31.在一方面，纯化抗体的方法包括以下步骤：
32.a.提供包括抗体的样品；
33.b.调整所述样品的电导率；
34.c.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
35.d.收集包括所述抗体的流穿液，
36.其中步骤b)中样品的电导率用tris调整至约10至约50ms/cm的电导率。优选地，将电导率调整至约10至约30ms/cm。在某些实施方式中，在步骤b)中用tris预处理后样品的电导率为至少10ms/cm、至少12ms/cm、至少14ms/cm、至少15ms/cm。在某些实施方式中，在上样到iex树脂上之前，在步骤b)中用tris预处理后的抗体样品的电导率在约10ms/cm到约30ms/cm的范围内、在约12ms/cm到约28ms/cm的范围内、在约14ms/cm到约26ms/cm的范围内、在约15ms/cm到约25ms/cm的范围内。重要的是，仅使用tris进行电导率调整。
37.在一方面，用于提高抗体产率的方法包括以下步骤：
38.a.提供包括抗体的样品；
39.b.调整所述样品的电导率；
40.c.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
41.d.收集包括所述抗体的流穿液，
42.其中步骤b)中样品的电导率用tris调整至约10至约50ms/cm的电导率。优选地，将电导率调整至约10至约30ms/cm。在某些实施方式中，在步骤b)中用tris预处理后样品的电导率为至少10ms/cm、至少12ms/cm、至少14ms/cm、至少15ms/cm。在某些实施方式中，在上样到iex树脂上之前，在步骤b)中用tris预处理后的抗体样品的电导率在约10ms/cm到约30ms/cm的范围内、在约12ms/cm到约28ms/cm的范围内、在约14ms/cm到约26ms/cm的范围内、在约15ms/cm到约25ms/cm的范围内。重要的是，仅使用tris进行电导率调整。
43.在一实施方式中，所提供的样品包括在protein a色谱、病毒灭活、中和和深度过滤之后获得的抗体，随后调整样品的电导率，然后通过包括流穿模式下的离子交换色谱的第一次精制步骤处理调整后的样品，随后是包括结合-洗脱模式下的多模式阳离子交换色谱步骤的第二次精制步骤。在绑定和洗脱模式下进行的第二次混合模式色谱可采用梯度洗脱。
44.在某些实施方式中，在第一个离子交换步骤之前、两个离子交换步骤之间或两处均对离子交换样品进行中间过滤步骤。在某些方面，所述过滤步骤包括捕获超滤/透析过滤(“uf/df”)。除其他外，这种过滤有助于抗体及其抗原结合部分的浓缩和缓冲液交换。
45.在一实施方式中，所述待纯化的抗体为单克隆抗体。
附图说明
46.图1
47.抗体纯化可采用1步、2步或3步程序。数字指的是步骤。指示出了典型的产率和纯度期望值。ac＝亲和色谱；sec＝尺寸排阻色谱；iex＝离子交换色谱；ciex＝阳离子交换色谱；aiex＝阴离子交换色谱。
48.图2
49.样品的代表性流穿洗脱色谱图，所述样品包括具有seq id no.:10重链和seq id no.:9轻链的抗体，所述样品经tris预处理或不经tris预处理，并通过多模式aiex纯化。预处理：(1)不添加tris，电导率：8.2[ms/cm]，(2)添加5％(v/v)tris，电导率13.6ms/cm，(3)添加10％(v/v)tris，电导率17.2ms/cm，(4)添加20％(v/v)tris，电导率25.5ms/cm。ft：流穿。cip：原位清洁。
具体实施方式
[0050]
通过色谱进行蛋白质纯化
[0051]
治疗性抗体制造通常分为i)上游处理(usp)，包括抗体蛋白的生产；ii)下游处理(dsp)，包括通过纯化获得纯形式的抗体；以及iii)最终处理，以获得产品完整性和安全性。通常，在生产阶段之后，下游纯化过程的第一步涉及对收获的细胞培养混合物进行澄清，其中可以使用沉淀、絮凝、(深度)过滤和/或离心的一个或多个步骤将所需抗体与细胞、细胞碎片和其他污染物分离。下游纯化通常包括一个或多个基于例如亲和性、离子交换、疏水相互作用、羟基磷灰石、色谱聚焦、凝胶过滤和反相的(正交的)色谱分离步骤，以有效去除工艺和产品相关杂质。这些污染物包括但不限于hcp、浸出的蛋白a、产品异构体、高分子量(hmw)、低分子量(lmw)和剪切或降解产品。
[0052]
亲和色谱指的是使用与待纯化的所需目标蛋白质特异性相互作用的化合物。通
常，为了分离、纯化或去除所需的目标产物，将化合物固定在树脂上。例如，对于抗体纯化而言，亲和树脂包括从staphylococcus aureus获得的protein a、从streptococcus sp.获得的protein g、从peptostreptococcus magnus获得的蛋白质l，以及这些蛋白质的重组或合成版本或肽。这些树脂包括mabselect
tm
(gehealthcare)、prosep(millipore)等。对于实验室规模的应用，一步亲和纯化通常可以获得令人满意的纯度。例如，protein a色谱作为捕获igg抗体最广泛使用的亲和纯化法，由于其对igg的fc部分的高度特异性，支持纯度》95％且具有极好的回收率。其他成熟的纯化方法包括亲硫吸附、疏水相互作用或芳香吸附色谱、金属螯合亲和色谱和尺寸排阻色谱。(vijayalakshmi,m.a.,appl.biochem.biotech.75(1998)93-102)。
[0053]
可以通过组合一个或两个进一步的正交的色谱步骤来进一步去除聚集物/杂质，这些步骤可能包括羟基磷灰石、疏水相互作用(hic)和离子交换色谱(iex，例如阳离子交换(cex)、阴离子交换(aex)或混合模式交换)。在制造规模上，通常在初始抗体亲和色谱后通过使用iex来去除聚集体和杂质。商用多模式离子交换剂，如capto mmc和capto adhere，以及capto mmc impres和capto adhere impres(均来自ge healthcare)可用于去除初始亲和捕获下游的污染物。iex分离表面电荷不同的蛋白质，以提供具有高样品装载能力的高分辨率分离。这种分离基于带电荷的蛋白质(即带电荷的氨基酸侧链)和带相反电荷的色谱介质之间的可逆静电相互作用。aex涉及在带有正电官能团的树脂(例如，带有季胺基的强阴离子交换剂，或带有仲胺基的弱阴离子交换剂)上的蛋白质纯化。cex涉及在带有负电荷官能团的树脂上纯化蛋白质(例如，带有亚硫酸盐基团的强阳离子交换剂，或带有羧酸盐阴离子的弱阳离子交换剂)。aex和cex已被证明在生产规模过程中不仅能有效去除聚集体，还能有效去除其他杂质。根据目标蛋白质和杂质的物理化学性质，每个色谱步骤，无论是阳离子交换还是阴离子交换，都可以在结合和洗脱或流穿模式下进行。蛋白质分子的电荷性质差异很大，并且根据其总电荷、电荷密度和表面电荷分布的不同，与带电色谱介质表现出不同程度的相互作用。例如，单克隆抗体包括可电离基团，例如羧基和氨基。这些基团的电荷取决于ph。因此，根据抗体的等电点(pi)，蛋白质分子的电荷可以通过将批量产品暴露在不同的ph条件下来控制。单克隆igg1抗体的基本pi通常为7-9左右。在流穿模式下，需要定义适当的ph和电导率条件来定制目标抗体的电荷，从而使抗体不会结合而是流穿过树脂，大部分杂质结合到柱上。当产品收集在非结合级分中时，aex色谱通常在中性至微碱性ph下以流穿模式运行，以去除预计会与树脂结合的杂质(如病毒和dna)。由于aex色谱树脂的分离模式基于静电相互作用，因此电导率(由盐浓度控制)等因素也会影响ft模式下aex中dna、宿主细胞蛋白质、聚集体和其他杂质清除的能力。
[0054]
本发明的基本核心是仅用tris调整样品的电导率。令人惊讶的是，研究发现，添加tris，而不仅仅是调整电导率(例如使用nacl)，还提高了ft模式下多模式aex色谱的产率。在对仅使用tris调整的装载样品和使用nacl调整的装载样品进行头对头比较时，发现仅添加tris时，ft模式下mmc后的抗体产率高出约5％，单体含量略低，但仍在规范范围内。
[0055]
实施方式
[0056]
在一个实施方式中，本公开涉及一种纯化抗体的方法，其包括以下步骤：
[0057]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0058]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0059]
c.调整所述样品的电导率并将第二ph调整为第三ph；
[0060]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0061]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0062]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整。
[0063]
在另一实施方式中，本公开涉及一种提高抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0064]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0065]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0066]
c.调整所述样品的电导率并将第二ph调整为第三ph；
[0067]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0068]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0069]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整。
[0070]
在特定实施方式中，本公开涉及一种纯化抗体的方法，包括以下步骤：
[0071]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0072]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0073]
c.调整所述样品的电导率并将第二ph调整为第三ph；
[0074]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0075]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0076]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整，调整至至少10ms/cm的电导率。
[0077]
在特定实施方式中，本公开涉及一种纯化抗体的方法，包括以下步骤：
[0078]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0079]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0080]
c.调整所述样品的电导率并将第二ph调整为第三ph；
[0081]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0082]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0083]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整，调整至10和50ms/cm之间的电导率。优选地，将电导率调整至15ms/cm。
[0084]
在另一实施方式中，本公开涉及一种提高抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0085]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0086]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0087]
c.调整所述样品的电导率并将第二ph调整为第三ph；
[0088]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0089]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0090]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整，调整至10和50ms/cm之间的电导率。优选地，将导电性调整至15ms/cm。
[0091]
在另一实施方式中，本公开涉及一种纯化抗体的方法，包括以下步骤：
[0092]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0093]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0094]
c.调整所述样品的电导率并将第二ph调整为第三ph；
[0095]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0096]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0097]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整，调整至10和30ms/cm之间的电导率，约为6.5至7.5的第三ph。优选地，将电导率调整至15ms/cm，并将ph调整至约7.1。
[0098]
在另一实施方式中，本公开涉及一种提高抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0099]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0100]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0101]
c.调整样品的电导率并将第二ph调整至第三ph；
[0102]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0103]
e.收集包括抗体的流穿液，
[0104]
其中步骤c)中样品的ph和电导率用tris调整，调整至10和30ms/cm之间的电导率，约为6.5至7.5的第三ph。优选地，将电导率调整至15ms/cm，并将ph调整至约7.1。
[0105]
在优选实施方式中，步骤a)中的样品是在亲和色谱步骤后获得的亲和色谱洗脱液。最优选地，步骤a)中的样品为protein a色谱洗脱液，其具有约为3至4的第一ph，理想情况下，其具有为3.6的第一ph。亲和色谱载体的非限制性示例包括但不限于protein a、protein g、protein l和包括针对其产生目标抗体的抗原的亲和载体。在某些方面，protein a色谱树脂选自prosep ultra plus、mabselect sure
tm
、或者amsphere protein a
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树脂。在上样之前，用合适的缓冲液(例如pbs，ph 7.0-7.3)平衡亲和柱。在上样到色谱柱上后，使用合适的清洗缓冲液(例如pbs，ph 7.0-7.3)对色谱柱进行一次或多次清洗。然后可以使用适当的洗脱缓冲液(例如，ph为3.6的醋酸钠缓冲液)洗脱结合到亲和载体上的抗体。
[0106]
在其他实施方式中，本公开涉及根据前述任何实施方式的方法，其中将步骤b)的第二ph调整至约5.2至约5.6的ph。优选地，将第二ph调整至ph 5.5。
[0107]
在优选实施方式中，混合模式或混合模态或多模式(“mm”)色谱可用作步骤d)中的离子交换色谱。这种混合模式步骤可以采用阳离子交换或阴离子交换，或者两者的组合。该步骤可以基于单一类型的离子交换剂混合模式程序，也可以包括多个离子交换剂混合模式步骤，例如先进行阳离子交换混合模式步骤，再进行阴离子交换混合模式步骤，反之亦然。mm色谱的色谱介质包括以下混合物：阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、亲水相互作用介质、氢键、π-π键和金属亲和性。在一些实施方式中，在mm色谱中使用至少具有离子交换介质(例如阴离子交换介质或阳离子交换介质)的mm色谱介质。合适的阳离子交换柱是其固定相包括阴离子基团的柱。这种柱的一个示例是capto mmc
tm
、capto mmc
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impres(ge healthcare)、nuvia
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cprime
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(biorad)。在一实施方式中，阳离子交换混合模式色谱包括n-苄基-n-甲基乙醇胺。在另一方面中，合适的阴离子交换柱是其固定相包括阳离子基团的柱。在一实施方式中，混合模式色谱是capto
tm
adhere色谱或capto
tm
adhere impres色谱(ge healthcare)。在一实施方式中，以流穿模式执行第一混合模式色谱。在将样品(例如亲和洗脱液)装入混合模式色谱柱之前，可使用合适的缓冲液平衡色谱柱。
[0108]
在其他实施方式中，通过调整样品的装载量、ph、电导率和离子强度，为混合模式步骤制备抗体样品(例如亲和色谱洗脱液)。
[0109]
在一实施方式中，本公开涉及一种纯化抗体的方法，包括以下步骤：
[0110]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0111]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0112]
c.调整样品的电导率并将第二ph调整为第三ph，以及调整装载密度；
[0113]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，
[0114]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0115]
其中步骤c)中样品的电导率调整为10至30ms/cm之间的电导率，第三ph为约6.5至7.5，装载密度为约10至约200g/l。优选地，电导率调整至15ms/cm，第三ph调整至ph 7.1，装载密度为20至40g/l。
[0116]
在另一实施方式中，本公开涉及一种提高抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0117]
a.提供具有第一ph的包括抗体的样品；
[0118]
b.将样品的第一ph调整至第二ph；
[0119]
c.调整样品的电导率，并将第二ph调整为第三ph，以及调整装载密度；
[0120]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的样品，以及
[0121]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0122]
其中步骤c)中样品的电导率调整为10至30ms/cm之间的电导率，第三ph为约6.5至7.5，装载密度为约10至约200g/l。优选地，电导率调整至15ms/cm，第三ph调整至ph 7.1，装载密度为20至40g/l。
[0123]
在一实施方式中，将待纯化抗体在电导率大于10ms/cm的溶液中施加于多模式阴离子交换色谱树脂上。在另一实施方式中，将抗体施加在电导率在约10ms/cm至约30ms/cm范围内的溶液中。在一些实施方式中，将在电导率约为15ms/cm的溶液中的抗体施加于多模式阴离子交换色谱树脂上。
[0124]
在一方面中，在多模式阴离子交换色谱步骤中，抗体样品以每升树脂材料约1至300克、约5至200克、约10至100克、约20至50克、20至40克的范围施加。
[0125]
在一实施方式中，本公开涉及一种以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0126]
a.提供具有第一ph的包括抗il-17c抗体的亲和色谱(ac)洗脱液；
[0127]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至第二ph；
[0128]
c.调整所述洗脱液的电导率，并将第二ph调整至第三ph；
[0129]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0130]
e.收集包括抗il-17c抗体的流穿液，
[0131]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)、20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括seq id no.:5的氨基酸序列的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区、以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0132]
在另一实施方式中，本公开涉及一种以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0133]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0134]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0135]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0136]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0137]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0138]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)、20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区、以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0139]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱的纯化期间纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0140]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0141]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0142]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约为7.1的第三ph；
[0143]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0144]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0145]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)、20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链和轻链。
[0146]
在另一实施方式中，本公开涉及一种用于在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体的产率的方法，包括以下步骤：
[0147]
a.提供包括抗il17c抗体的具有第一ph的亲和色谱(ac)洗脱液；
[0148]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至第二ph；
[0149]
c.调整所述洗脱液的电导率，并将第二ph调整为第三ph；
[0150]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0151]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0152]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)、20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基
酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0153]
在另一实施方式中，本公开涉及一种以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0154]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0155]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0156]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0157]
d.通过流穿模式下的离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0158]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0159]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)或20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0160]
在另一实施方式中，本公开涉及一种以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0161]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0162]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0163]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10至30ms/cm，优选15ms/cm，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0164]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0165]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0166]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)或20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链和轻链。
[0167]
在优选实施方式中，在步骤c)中用tris调整抗体样品的ph和电导率，导致在多模式阴离子交换色谱后的流穿液中抗体的产率提高。在一实施方式中，使用2m tris，ph 7.1调整至5％(v/v)的浓度导致在多模式阴离子交换色谱步骤后抗体产率大于或等于70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％。在另一实施方式中，使用2m tris，ph 7.1调整至10％(v/v)的浓度导致在多模式阴离子交换色谱步骤后抗体产率大于或等于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％。在另一实施方式中，使用2m tris，ph 7.1调整至15％(v/v)的浓度导致在多模式阴离子交换色谱步骤后抗体产率大于或等于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％。在另一实施方式中，使用2m tris，ph 7.1调整至20％(v/v)的浓度导致在多模式阴离子交换色谱步骤后抗体产率大于或等于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％。
[0168]
在一实施方式中，待纯化的抗体或抗体片段是人、人源化或嵌合抗体或抗体片段。
[0169]
在某些实施方式中，待纯化的抗体是iga1、iga2、igd、ige、igg1、igg2、igg3、igg4或igm同种型抗体。
[0170]
在优选实施方式中，待纯化抗体为igg同种型或其变体。更优选地，所述抗体是igg1抗体。
[0171]
在一实施方式中，本公开涉及il-17c特异性抗体的纯化。在其他实施方式中，待纯化的mab的cdr与seq id no.:1、seq id no.:2、seq id no.:3和seq id no.:4、seq id no.:5和seq id no.:6的cdr相比，具有大于或等于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0172]
可应用本发明的抗体制剂可包括来自天然、合成或重组来源的未纯化或部分纯化抗体。抗体样品可以是细胞培养材料，例如可溶性细胞和细胞培养上清液。在某些实施方式中，它是澄清的细胞培养收获物。本发明的方法可用作从含有抗体的任何混合物中纯化抗体的精制步骤。例如，这种混合物可以是protein a洗脱液。
[0173]
此外，本公开涉及包括通过本文所述方法纯化的一种或多种抗体的药物组合物。
[0174]
可使用本领域技术人员熟知的方法(例如尺寸排阻色谱法、poros
tm
a hplc分析、hcp elisa、protein a elisa和western blot分析法)分析所得样品产物中感兴趣的抗体的纯度。
[0175]
在优选实施方式中，本文提供的方法产生所具有的sec单体含量等于或大于95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的纯化抗体。在另一实施方式中，纯化蛋白质的sec单体含量为100％。
[0176]
在另一实施方式中，本文提供的方法产生产率等于或大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化抗体。
[0177]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0178]
a.提供具有第一ph的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il17c抗体；
[0179]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至第二ph；
[0180]
c.调整所述洗脱液的电导率，并将第二ph调整为第三ph；
[0181]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0182]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0183]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用tris调整，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seqid no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0184]
在另一实施方式中，本公开涉及一种通过流穿模式下的多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0185]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il17c抗体；
[0186]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0187]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0188]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0189]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0190]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用tris调整，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0191]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0192]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0193]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0194]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0195]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0196]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0197]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用tris调整，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链和轻链。
[0198]
在另一实施方式中，本公开涉及一种以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0199]
a.提供具有第一ph的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0200]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至第二ph；
[0201]
c.调整所述洗脱液的电导率，并将第二ph调整为第三ph；
[0202]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0203]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0204]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用tris调整，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0205]
在另一实施方式中，本公开涉及一种以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0206]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0207]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0208]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0209]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0210]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0211]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用tris调整，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0212]
在另一实施方式中，本公开涉及一种通过流穿模式下的多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0213]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0214]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0215]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10至30ms/cm，优选15ms/cm，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0216]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0217]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0218]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用tris调整，其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:10的
重链和seq id no.:9的轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链和轻链。
[0219]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0220]
a.提供具有第一ph的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0221]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至第二ph；
[0222]
c.调整所述洗脱液的电导率，并将第二ph调整为第三ph；
[0223]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0224]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0225]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，并且其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0226]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0227]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0228]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0229]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0230]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0231]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0232]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，并且其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0233]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0234]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0235]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0236]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0237]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0238]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0239]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，并且其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:10的重链和seqid no.:9的轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链和轻链。
[0240]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0241]
a.提供具有第一ph的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0242]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至第二ph；
[0243]
c.调整所述洗脱液的电导率，并将第二ph调整为第三ph；
[0244]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0245]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0246]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，并且其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0247]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0248]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0249]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0250]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0251]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0252]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0253]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，并且其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:8的可变重链和seq id no.:7的可变轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的可变重链和可变轻链。
[0254]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0255]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0256]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0257]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0258]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，
[0259]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0260]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，并且其中所述抗体包括：包括氨基酸序列seq id no.:1的hcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:2的hcdr2区、包括氨基酸序列seq id no.:3的hcdr3区、包括氨基酸序列seq id no.:4的lcdr1区、包括氨基酸序列seq id no.:5的lcdr2区和包括氨基酸序列seq id no.:6的lcdr3区，以及与seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链和轻链。
[0261]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0262]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0263]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0264]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0265]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0266]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0267]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)或20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体具有seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链。
[0268]
在另一实施方式中，本公开涉及以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化抗体的方法，包括以下步骤：
[0269]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗体；
[0270]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0271]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0272]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0273]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0274]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)或20％(v/v)或在5％(v/v)至20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体具有seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链。
[0275]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间增加il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0276]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0277]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0278]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将
第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0279]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，
[0280]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0281]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，其中所述抗体具有seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链。
[0282]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0283]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0284]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0285]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0286]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，
[0287]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0288]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用tris调整，其中所述抗体具有seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链。
[0289]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间提高il-17c特异性抗体产率的方法，包括以下步骤：
[0290]
a.提供第一ph为约3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0291]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0292]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0293]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0294]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0295]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率或在没有nacl的情况下用2m tris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)或20％(v/v)，或在5％(v/v)到20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体具有seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链。
[0296]
在另一实施方式中，本公开涉及一种在以流穿模式通过多模式阴离子交换(mm-aiex)色谱纯化期间纯化il-17c特异性抗体的方法，包括以下步骤：
[0297]
a.提供第一ph约为3至约4的亲和色谱(ac)洗脱液，其包括抗il-17c抗体；
[0298]
b.将ac洗脱液的第一ph调整至约5.2至约5.6(优选5.5)的第二ph；
[0299]
c.将所述洗脱液的电导率调整至10和30ms/cm之间，优选15ms/cm的电导率，并将第二ph调整至约7.1的第三ph；
[0300]
d.以流穿模式通过离子交换色谱处理调整后的洗脱液，以及
[0301]
e.收集包括所述抗体的流穿液，
[0302]
其中步骤c)中洗脱液的ph和电导率在没有nacl的情况下用2mtris调整至5％(v/v)、10％(v/v)、15％(v/v)或20％(v/v)，或在5％(v/v)到20％(v/v)范围内的tris浓度，其中所述抗体具有seqid no.:10的重链和seq id no.:9的轻链。
[0303]
在其他实施方式中，将电导率调整至至少10ms/cm、10至50ms/cm的范围、10至30ms/cm、11至30ms/cm、12至30ms/cm、13至30ms/cm、10至29ms/cm、10至28ms/cm、10至27ms/
sciences的sp sepharose
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xl、sp-sepharose
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fast flow、sp sepharose
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high performance、cm sepharose
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fast flow、cm sepharose
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s、和eshmuno
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[0312]
术语“阴离子交换树脂”、“阴离子交换吸附剂”或“阴离子交换基质”在本文中用于指带正电的固相，例如，其上附着有一个或多个带正电的配体，例如季氨基。市售阴离子交换树脂包括来自ge healthcare life sciences的deae-sepharose
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fast flow、q sepharose
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fast flow、q sepharose
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high performance、q sepharose
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q impres，或来自emd millipore的emd tmae hicap、deae、和eshmuno q，或来自bio-rad的u ospher
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q和nuvia
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[0313]
术语“抗体”是指免疫球蛋白五大类(同种型)：iga、igd、ige、igg和igm中任何一类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白，或其亚类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)及其组合和变体。如本文所用，该术语包括来自任何种类(例如小鼠、犬、猫、igy等)的抗体(例如人、人源化嵌合抗体)及其组合。该术语指单克隆和多克隆抗体，以及单特异性和多特异性抗体(如双特异性抗体)。如本文所用，该术语还包括：包括抗原决定部分的融合蛋白和包括抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及涉及抗体保持与抗原特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定空间分布)能力的一个或多个部分的抗体片段。结合片段的示例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fd、fv和dab片段(ward等人,(1989)nature 341:544-546)、单链fv(scfv)(例如，bird等人,(1988)science 242:423-426；和huston等人,(1988)proc.natl.acad.sci.85:5879-5883)。任何特异性结合抗原的天然产生的、可通过酶获得的、合成的、替代性支架或基因工程的多肽，旨在包括在本文使用的术语“抗体”中。
[0314]
术语“污染物”和“杂质”在本文中互换使用，并指任何有害分子，包括可能存在于含有目标蛋白质的样品中的生物大分子，例如dna、rna、一种或多种宿主细胞蛋白质、内毒素、脂质和一种或多种添加剂，所述目标蛋白质使用本发明的方法从一种或多种外来或有害分子中分离出来。此外，此类污染物可包括可能发生在纯化过程之前的步骤中使用的任何试剂。
[0315]“高分子量(hmw)物质”包括分子量高于目标蛋白质质量的物质，如多聚体。多聚体包括除目标蛋白质单体以外的所有物质。例如，igg抗体的单体包括含有两条重链和轻链的传统四聚体抗体组合物。多聚体包括分子质量高于目标蛋白质质量的物质，例如二聚体(共价或非共价结合的两种相同蛋白质)和聚集体(共价或非共价结合的全部和/或部分蛋白质)。
[0316]“低分子量(lmw)物质”包括分子量低于目标蛋白质质量的物质，如片段和降解产物。
[0317]
如本文所用，术语“精制”是指在初始(亲和性)捕获步骤之后发生的下游处理步骤，其旨在去除产品流中存在的残留量的杂质，并且其通常比在捕获步骤中去除的杂质更类似于产品。
[0318]
本领域技术人员已知测定多肽产率或纯度的方法。可通过任何合适的分析方法(例如，银染凝胶上的条带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、elisa、hplc等)确定多肽的产率或纯度。示例性方法是尺寸排阻色谱(sec)、高效液相色谱(hplc)。可使用相对“曲线下面积”(auc)值来测定纯度，该值通常可通过色谱图(如hplc色谱图)中的峰获得。
[0319]
术语“结合和洗脱模式”指的是一种产品分离技术，其中样品中含有的至少一种产品(例如，含有蛋白质的fc区)与色谱树脂或介质结合，并随后洗脱。
[0320]
术语“流穿模式”指的是目标蛋白质将流穿而污染物将与色谱载体结合的条件。
[0321]
表1中的氨基酸和编码核酸序列是il-17c抗体及其部分的示例。
[0322]
表1.示例性il-17c抗体序列
[0323]
[0324]
[0325][0326]
工作实施例
[0327]
实施例1：
[0328]
为了测试在上样到流穿模式下的capto adhere impres柱(ge healthcare)之前，向包括具有seq id no.:10的重链和seq id no.:9的轻链的抗体的样品中添加tris(即增加tris浓度)对产率和纯度的影响，进行了四个不同的纯化轮次。一个轮次不添加tris，三个轮次向样品洗脱液中添加5％、10％和20％(v/v)的2m tris(ph 7.1)。分析所产生的流穿液的抗体产率和纯度(sec单体)。结果如表2所示，对应的色谱图如图2所示。添加5％(v/v)tris可使产率增加20％，所得池的sec单体部分仅减少0.4％。添加到样品中的tris的量增加导致产率进一步提高，但程度较小(与5％tris相比，添加10％和20％tris分别提高～4％和～7％)，并且单体部分进一步轻微减少。
[0329]
表2：使用adhere impres(ge healthcare)进行多模式aex色谱后的流穿液中抗体的产率和单体含量
[0330][0331]
实施例2：
[0332]
为了阐明是如实施例1所示向抗体样品中添加tris，而不仅仅是电导率的调整，还提高了capto adhere impres色谱后流穿液中的抗体产率，对使用tris(轮次1)预处理的样品和使用nacl预处理的样品(轮次2)进行了头对头(head-to-head)比较。对于样品制备，在轮次1中用2m tris(ph 7.1)调整电导率，在轮次2中用5m nacl调整电导率，使目标电导率为15ms/cm(表3)。
[0333]
表3：
[0334][0335]
两种装载样品具有相同的电导率，但缓冲液基质不同。ph和电导率测量在环境温度20℃
±
20℃下进行。纯化结果和qc数据如表4所示。
[0336]
表4：
[0337][0338]
在不添加tris(轮次2)的情况下，与轮次1(使用2m tris，ph 7.1将电导率调整为15ms/cm)相比，产率约低5％。