灵芝多糖的发酵方法和灵芝发酵培养基与流程

1.本发明涉及微生物发酵领域，具体公开了一种灵芝发酵培养基和一种灵芝多糖的发酵方法。


背景技术：

2.灵芝多糖是有三股单糖链构成、具有螺旋状立体构型的葡聚糖，在医药、食品和化妆品行业应用广泛。灵芝多糖有多方面的药理活性：能提高机体免疫力，加速血液微循环，提高血液供氧能力，降低机体静止状态下的无效耗氧量，消除体内自由基，提高机体细胞膜的封闭度，抗放射，提高肝脏、骨髓、血液合成dna、rna、蛋白质的能力。
3.灵芝多糖多以灵芝子实体提取法和微生物发酵法生产。我国多采用微生物深层发酵法，通过微生物生长代谢得到灵芝多糖，且液体发酵时具有灵芝菌菌体生长快，产灵芝多糖能力强的优势。
4.但灵芝菌在发酵生长过程中，形态不固定，生长形态难以控制，存在球状和菌丝状。在液体深层发酵中，灵芝菌的形态受温度、ph、营养物质、搅拌转速等因素的影响较大，使得发酵不稳定，发酵产物含量降低，所产生的能耗、物料损耗较大，成本增加。因此寻找一种高产、低能耗的灵芝菌发酵方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术存在的液体发酵灵芝菌中存在的发酵不稳定和发酵效果不佳等问题，提供一种灵芝发酵培养基和一种灵芝多糖的发酵方法，利用所述灵芝发酵培养基进行灵芝多糖的发酵能够稳定灵芝菌在发酵液中的菌体形态，降低了由于溶氧所产生的能耗，并提高了灵芝多糖的产量，节约成本。
6.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种灵芝发酵培养基，所述培养基包含玉米糖化液、玉米麸皮、玉米芯粉和氮源；
7.其中，所述灵芝发酵培养基中，相比于100重量份的玉米糖化液，所述玉米麸皮的含量为0.5-2重量份，所述玉米芯粉的含量为0.4-1.5重量份，以氮元素计的所述氮源的含量为0.03-0.12重量份。
8.优选地，至少90重量％的所述玉米麸皮具有200-600μm的粒径；和/或
9.至少90重量％的所述玉米芯粉具有200-600μm的粒径。
10.本发明第二方面提供一种灵芝多糖的发酵方法，该方法包括：将灵芝菌(ganoderma lingzhi)接种到如上所述的灵芝发酵培养基中进行发酵。
11.在本发明中，以玉米糖化液、玉米麸皮和玉米芯粉作为碳源配制发酵培养基用于灵芝菌的发酵时，尤其是玉米麸皮和玉米芯粉在优选的粒径范围内时，能够使得菌体形态更好，生长状态更佳，基本不会出现其他常用的培养基(比如用于真菌培养的pda培养基)经常出现的结块、成球和贴壁等现象，还能够提高灵芝多糖的产量。
具体实施方式
12.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
13.本发明第一方面提供一种灵芝发酵培养基，所述培养基包含玉米糖化液、玉米麸皮、玉米芯粉和氮源；
14.其中，所述灵芝发酵培养基中，相比于100重量份的玉米糖化液，所述玉米麸皮的含量为0.5-2重量份(比如可以为0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2重量份以及任意两个值之间组成的任意范围)，所述玉米芯粉的含量为0.4-1.5重量份(比如可以为0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.5重量份以及任意两个值之间组成的任意范围)，以氮元素计的所述氮源的含量为0.03-0.12重量份(比如可以为0.03、0.05、0.06、0.08、0.1、0.12重量份以及任意两个值之间组成的任意范围)。
15.本发明的发明人发现，当所述灵芝发酵培养基中各组分的含量过高或过低时，会造成菌体生长状况不佳的情况，例如发酵过程中，因氮源含量高导致发酵初期灵芝菌体生长过于旺盛，会出现菌体结块现象，导致发酵液流动性变差、发酵液中传质不均匀，反而影响发酵效果。
16.优选地，所述灵芝发酵培养基中，相比于100重量份的玉米糖化液，所述玉米麸皮的含量为0.8-1.5重量份，所述玉米芯粉的含量为0.5-1重量份，以氮元素计的所述氮源的含量为0.05-0.1重量份。在所述优选的情况下，能够进一步提高灵芝多糖的产量。
17.所述玉米糖化液可以经过玉米粉经液化和糖化得到。
18.所述玉米粉可以以常规的方式制备，比如可以是以玉米或脱胚玉米为原料经过粉碎和干燥制备得到。
19.所述玉米粉的粒径可以在较宽范围内，优选地，至少90重量％的所述玉米粉具有90-200μm的粒径。比如可以通过两个不同目数的筛网来确定一定粒径内的物料占比。
20.在本发明中，各物料的粒径可以通过过筛的方式进行控制。
21.在本发明的一种优选的实施方式中，所述玉米糖化液的制备方法包括：对玉米粉依次进行调浆、液化和糖化，得到糖化液。
22.在本发明中，所述调浆的条件可以是本领域常规调浆的条件，优选地，调浆的条件包括：温度为92-98℃；ph为5.5-6。
23.调浆得到的粉浆中的干物质浓度可以在较宽的范围内选择，可以以较高浓度调浆，然后在液化或糖化过程中稀释，也可以直接以适宜的浓度进行调浆，在后续过程中可以不稀释而直接使用，优选地，所述调浆得到的粉浆中的干物质浓度为3-4.5重量％。
24.在本发明中，所述液化的方法可以是本领域常规的制备方法，优选地，所述液化的方法包括：在淀粉酶的存在下，对调浆后的物料进行液化处理，得到玉米液化液。
25.应当理解的是，所述淀粉酶可以也可以在调浆过程中添加，也可以在液化之前添加。
26.淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶。
27.在本发明中，所述淀粉酶可以是本领域现有的淀粉酶，能够用于糊化过程即可，所述淀粉酶可以通过商购获得，比如为购自诺维信公司的高温淀粉酶。
28.所述液化酶用量越多越好，但出于成本的考虑，优选地，相比于每g玉米粉，所述淀粉酶的用量为20-50u。
29.优选地，所述液化的条件包括：液化温度为95-100℃，ph为5.4-6，时间为40-60min。
30.其中，可以通过添加ph调节剂的方式调节ph，所述ph调节剂可以为本领域常规使用的酸或碱，比如可以为盐酸、硫酸、硝酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氨水和碳酸钠中的至少一种，优选为氨水。
31.所述液化处理的方法可以为本领域常规的液化方法，比如可以为喷射液化法或者蒸煮法。本领域技术人员可以根据常规的操作方法进行液化，在此不再赘述。
32.在本发明中，所述糖化的方法可以是本领域常规的制备方法，优选地，所述糖化的方式包括：在糖化酶存在下，对玉米液化液进行糖化，得到玉米糖化液。
33.糖化酶又称淀粉α-1,4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1,6糖苷键的寡糖，作用于直链淀粉后产物几乎全部是葡萄糖。
34.优选地，所述糖化的条件包括：ph为3.8-4.5，温度为60-65℃，时间为5-20h。应当理解的是，玉米液化液需要冷却至糖化温度，并将其ph调整至糖化ph后，再加入糖化酶进行糖化。
35.在本发明中，所述糖化酶可以是本领域现有的糖化酶，能够用于糖化即可，所述糖化酶可以通过商购获得，比如为购自诺维信公司的糖化酶。
36.所述糖化酶用量越多越好，但出于成本的考虑，优选地，相比于每g玉米粉，所述糖化酶的用量为20-50u。
37.优选地，所述玉米糖化液中的干物质含量为3-4.5重量％。
38.在本发明中，所述玉米麸皮为由玉米粒制作玉米粉剩下的玉米颗粒外皮。
39.优选地，至少90重量％的所述玉米麸皮具有200-600μm的粒径，更优选具有300-400μm的粒径。
40.为了获得上述粒径的玉米麸皮，可以将玉米麸皮烘干后通过粉碎机粉碎并经过60目筛网得到筛上物，再将筛上物经过30目筛得到筛下物获得200-600μm粒径的所需玉米麸皮，例如更优选的将粉碎后的玉米麸皮经过50目筛网得到筛上物，再将筛上物经过40目筛网得到筛下物获得300-400μm粒径的所需玉米麸皮。
41.在本发明中，所述玉米芯粉来自于玉米棒脱粒后剩下的部分，经过烘干粉碎过筛后得到。
42.优选地，至少90重量％的所述玉米芯粉具有200-600μm的粒径，更优选具有300-400μm的粒径。
43.在本发明中，所述发酵培养基中还含有氮源。所述氮源可以是本领域现有的氮源，包括但不限于有机氮源(比如蛋白胨、酵母粉和玉米浆等)和无机氮源(比如硫酸铵)，优选地，所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、玉米浆和硫酸铵中的至少一种，更优选为酵母粉。
44.优选地，所述灵芝发酵培养基的ph为5-6.5。应当理解的是，本领域技术人员可以
采用常规手段调整培养基的ph，在此不再赘述。
45.在本发明中，所述灵芝发酵培养基的制备方法可以是本领域常规的制备方法，优选地，所述灵芝发酵培养基的制备方法包括：将玉米糖化液与玉米麸皮和玉米芯粉以及氮源后，得到发酵培养基。
46.其中，各组分的添加顺序和添加方法没有特别的限制，可以以任意的方式添加，比如可以先将玉米糖化液与玉米麸皮和玉米芯粉混合后，在加入氮源。
47.本发明第二方面提供一种灵芝多糖的发酵方法，该方法包括：将灵芝菌(ganoderma lingzhi)接种到如上所述的灵芝发酵培养基中进行发酵。
48.在本发明中，所述灵芝菌(ganoderma lingzhi)可以是任意的灵芝菌菌种，只要能够生产灵芝多糖和灵芝酸即可。比如，可以为菌种编号为cicc14020、cicc 14023、cicc 14042、cicc 14029或bncc143276(北纳生物菌种保藏中心)的灵芝菌。
49.其中，所述灵芝菌优选以种子液的形式接种。
50.灵芝菌种子液的接种量可以在较宽的范围内选择，优选地，种子液的接种量为8-13体积％。
51.在本发明中，灵芝菌种子液可以采用本领域常规的培养方法制备。优选地，所述种子液的制备方法包括：将灵芝菌接种到种子培养基中进行扩培，得到种子液。
52.其中，所述种子培养基可以是本领域常规的培养基，比如pda培养基。
53.所述扩培的条件优选包括：温度为26-30℃，ph为5.5-6.5，时间为6-7天。
54.在本发明中，所述发酵的条件可以是本领域常规用于灵芝菌发酵的条件，优选地，所述发酵的条件包括：温度为26-30℃，比如可以为26、27、28、29、30℃以及任意两个值之间组成的任意范围；ph为5-6.5，比如可以为5、5.5、5.7、5.9、6.1、6.3、6.5以及任意两个值之间组成的任意范围，时间为6-7天，通气量为0.6-1vvm，比如可以为0.6、0.7、0.8、0.9、1vvm以及任意两个值之间组成的任意范围。
55.应当理解的是，发酵培养基的ph与发酵ph基本保持一致，或在发酵前调节至发酵ph。
56.在本发明中，用于灵芝菌发酵的发酵设备为本领域技术人员所公知，例如，可采用发酵罐进行实验，所述发酵罐没有特别限制，本领域所常用的各种发酵罐。
57.在本发明中，所述发酵过程中的搅拌转速可以根据发酵规模(发酵罐的大小)进行调整。
58.在本发明中，采用《中国药典》中记载的灵芝多糖的检测方法，对发酵终点的发酵液进行检测。
59.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
60.以下实施例中，采用《中国药典》中记载的灵芝多糖的检测方法，对发酵终点的发酵液进行检测。
61.以下实施例中，如无特殊说明，淀粉酶为购自诺维信公司的α-淀粉酶；
62.糖化酶为购自诺维信公司的糖化酶；
63.氮源为购自安琪公司的酵母粉，氮含量为10重量％。
64.以下实施例中，如无特殊说明，实际操作中，实际温度会在设定温度的上下波动，控制波动温度为
±
2℃。
65.如无特殊说明，实施例和对比例中的试剂和材料均可商购得到。
66.实施例1
67.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
68.(1)灵芝发酵培养基的制备
69.玉米糖化液的制备：将粉碎的玉米粉过70目筛网得到玉米粉(至少90重量％的玉米粉的粒径在90-200μm范围内)。将水与的玉米粉进行调浆得到调浆后的物料，水的添加量使得调浆后的物料中干物质的浓度为3.5重量％。将调浆后的物料与淀粉酶(相对于每g玉米粉，淀粉酶用量为20u)混合，并调节ph至5.8，得到的混合物在95℃下保持40min，得到玉米液化液。将玉米液化液ph调节至4.3，然后与糖化酶(相对于每g玉米粉，糖化酶用量为20u)混合，得到混合物在60℃下保持5h得到玉米糖化液。
70.玉米麸皮制备：将烘干后的玉米麸皮通过粉碎机粉碎后，经过50目筛网得到筛上物，再将筛上物经过40目筛网得到筛下物，即得到所需玉米麸皮(至少90重量％以上玉米麸皮粒径在300-400μm范围内)。
71.玉米芯粉制备：将烘干后的玉米芯通过粉碎机粉碎后，经过50目筛网得到筛上物，再将筛上物经过40目筛网得到筛下物，即得到所需玉米芯粉(至少90重量％以上玉米麸皮粒径在300-400μm范围内)。
72.发酵培养基的配制：将玉米糖化液与玉米麸皮以及玉米芯粉混合后，再加入酵母粉，搅拌溶解后将ph调至6，得到发酵培养基。其中，相比于100重量份的玉米糖化液，玉米麸皮的用量为1.0重量份，玉米芯粉的用量为0.5重量份，以氮元素计的氮源的含量为0.08重量份。
73.(2)灵芝多糖的发酵
74.种子培养：将灵芝菌从平板上转接至普通液体pda培养基中，在温度28℃、转速200rpm条件下培养7天，得到灵芝种子液。
75.灵芝发酵：将灵芝种子液按照发酵体系10体积％的量接入已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中，在温度28℃，转速200rpm，通气量0.6vvm条件下进行培养。培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
76.实施例2
77.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
78.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，相比于100重量份的玉米糖化液，所述玉米麸皮的含量为0.8重量份，所述玉米芯粉的含量为1重量份，以氮元素计的所述氮源的含量为0.1重量份。
79.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
80.实施例3
81.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
82.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，相比于100重量份的玉米糖
化液，所述玉米麸皮的含量为1.5重量份，所述玉米芯粉的含量为0.5重量份，以氮元素计的所述氮源的含量为0.05重量份。
83.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
84.实施例4
85.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
86.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，相比于100重量份的玉米糖化液，所述玉米麸皮的含量为0.5重量份，所述玉米芯粉的含量为1.5重量份，以氮元素计的所述氮源的含量为0.12重量份。
87.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
88.实施例5
89.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
90.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，相比于100重量份的玉米糖化液，所述玉米麸皮的含量为2重量份，所述玉米芯粉的含量为0.4重量份，以氮元素计的所述氮源的含量为0.03重量份。
91.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
92.实施例6
93.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
94.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，玉米麸皮和玉米芯粉过筛的目数为50-80目之间(将玉米麸皮和玉米粉先经过80目筛网得到筛上物，再经过50目筛网得到筛下物，即为所需粒径玉米麸皮和玉米芯粉)(至少90重量％以上的玉米麸皮或玉米芯粉的粒径在200-300μm范围内)。
95.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
96.实施例7
97.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
98.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是玉米麸皮和玉米芯粉过筛的目数为30-40目之间(将玉米麸皮和玉米粉先经过40目筛网得到筛上物，再经过30目筛网得到筛下物，即为所需粒径玉米麸皮和玉米芯粉)(至少90重量％以上的玉米麸皮或玉米芯粉的粒径在400-600μm范围内)。
99.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
100.实施例8
101.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
102.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，使用脱胚后的玉米粉替代玉米粉。
103.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
104.实施例9
105.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
106.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，加入的氮源为玉米浆。
107.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
108.实施例10
109.本实施例用于说明本发明所述的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
110.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，加入的氮源为硫酸铵。
111.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
112.对比例1
113.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
114.(1)灵芝发酵培养基的制备
115.按照实施例1所述的方法进行粉碎、调浆和液化，得到玉米液化液。
116.发酵培养基的配制：将玉米液化液与酵母粉混合，并将ph调至6.0得到发酵培养基，其中，相对于100重量份的玉米液化液，以氮元素计的氮源的含量为0.08重量份。
117.(2)灵芝多糖的发酵
118.按照实施例1所述的方法进行种子培养和灵芝多糖的发酵。
119.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
120.对比例2
121.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
122.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，不添加玉米麸皮与玉米芯粉。
123.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
124.对比例3
125.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
126.(1)灵芝发酵培养基配制：将葡萄糖作为发酵培养基碳源，称取葡萄糖用水溶解并加入酵母粉，定容，使得灵芝发酵培养基中葡萄糖浓度为3.5重量％，以氮元素计的氮源的含量为0.08重量％。
127.(2)灵芝多糖的发酵
128.按照实施例1所述的方法进行种子培养和灵芝多糖的发酵。
129.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
130.对比例4
131.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
132.按照对比例3的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，在灵芝发酵培养基中添加玉米麸皮和玉米芯粉进行发酵，其中，相比于100重量份的所述培养基，玉米麸皮的添加量为1.0重量份，玉米芯粉的添加量为0.5重量份。
133.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
134.对比例5
135.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
136.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，使用等重量的玉米麸皮替代玉米芯粉。
137.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
138.对比例6
139.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
140.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，使用等重量的玉米芯粉替代玉米麸皮。
141.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
142.对比例7
143.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
144.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，使用等重量的麦麸替代玉米麸皮。
145.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
146.对比例8
147.本对比例用于说明参比的灵芝发酵培养基的制备以及灵芝多糖的发酵方法。
148.按照实施例1的方法进行灵芝发酵的制备，不同的是，使用等重量的棉子粉替代玉米芯粉。
149.培养结束后，测定发酵液中的灵芝多糖含量和灵芝菌的干重，并计算灵芝多糖的转化率，结果见表1。
150.表1
[0151][0152][0153]
通过表1的结果可以看出，相比于对比例，采用本发明所述的技术方案能够显著提高菌体干重、灵芝多糖的含量以及转化率，且能够缩短发酵时间，具有明显更好的效果。
[0154]
在实验过程中还发现，采用对比例1-8的方案进行灵芝多糖的发酵时，多发生结块和贴壁现象，尤其是对比例1-3的方案。而采用实施例的方案则基本不会出现结块情况，且菌体粗壮，生长状态更佳。
[0155]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。