一株鼠李糖乳杆菌及其在预防和缓解便秘症状中的应用的制作方法

1.本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株鼠李糖乳杆菌及 其在预防和缓解便秘症状中的应用。


背景技术：

2.益生菌(probiotics)一词起源于希腊语，随着人们对益生菌认识的深入， 调节肠道菌群、原籍菌、活的微生物、活菌数量等关键词也融入到益生菌的 概念中。目前，益生菌被广泛接受的是联合国粮农组织/世界卫生组织的定义， 即施以足够数量时，对宿主起到有益作用的活性微生物。益生菌菌体及其裂 解物近年来也被证实能够为人体提供有益作用。
3.益生菌有助于改善肠道微生态平衡，能促进宿主肠道维持正常功能。益生 菌改善肠道失调机制可能是通过免疫调节、对抗肠道内异常侵入的细菌、促 进淀粉/非淀粉类多糖生成短链脂肪酸等途径实现的。益生菌所含菌种可定植 在肠道，在肠黏膜表面形成有保护作用的生物膜。由于肠道上皮细胞上的生 态位是有限的，它还可与细菌病原体竞争性地与争夺定植位点，从而达到抑 制病原体的作用。益生菌产生的胞外糖苷酶可降解肠黏膜上皮细胞上作为潜 在致病菌及其内毒素结合受体的复合多糖，从而可预防病原菌的定植和入侵， 防止肠道细菌易位并通过调节细胞因子减轻炎症。益生菌可激活肠相关淋巴 和上皮免疫反应，增加机体免疫力；通过清除自由基降低血中过氧化脂质， 延缓细胞的衰老。益生菌代谢产生的有机酸，能降低肠道环境的ph，有利于 二价铁、钙、磷、钴及维生素d的吸收。因此，益生菌目前已被适用于多种 胃肠道疾病的治疗，如肠道菌群失调、抗生素相关性肠病、肠道感染、乳糖 不耐受病、炎症性肠病、结肠癌等。
4.便秘的发生发展与肠道菌群失调有关，补充双歧杆菌和乳杆菌等益生菌来 调节肠道微生态是治疗便秘的有效措施之一。目前应用于便秘的益生菌可以 分为单菌、混菌和合生元(单菌/混菌 益生元)三类，常用益生菌有动物双 歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、链球菌、肠球菌和芽孢 杆菌，合生元中常用的益生元有低聚果糖、低聚木糖等低聚糖。
5.在便秘儿童的研究中，coccorullo等发现罗伊氏乳杆菌dsm 17938能够 显著缓解便秘，bu等也发现lactobacillus rhamnosuslcr35对便秘具有一定的 治疗效果，而且副作用较小。在一项包括56名4岁～12岁便秘儿童的临床试 验中，研究人员每天给便秘儿童提供乳果糖和7种益生菌在内的混菌，发现 4周后便秘儿童的排便频率得到了明显的改善。另一项研究中，服用含有聚 葡萄糖、嗜酸乳杆菌ncfm和乳双歧杆菌hn019的酸奶2周后，便秘患者 的结肠转运时间显著缩短。wang等利用洛哌丁胺诱导的balb/c小鼠便秘模 型来研究青春双岐杆菌缓解便秘的效果，灌胃17d后便秘小鼠的各项便秘症 状得到了显著的改善，青春双歧杆菌ccfm 669和青春双歧杆菌ccfm 667 处理组便秘小鼠粪便中的乳杆菌丰度增加，梭菌的丰度降低，表明益生菌通 过影响肠道微生物组来改善便秘症状。
6.便秘发病机制复杂，且益生菌的益生特性在株水平上具有差异，同种不 同株的益
生菌株其预防和缓解便秘的效果及其作用机制存在差异。因此，筛 选获得便秘缓解效果突出，作用机制明确的益生菌株仍是目前研究的难点和 热点。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一株鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)及其 在预防和缓解便秘症状中的应用。所提供的鼠李糖乳杆菌是从母乳中分离获 得的，能有效调节胃肠功能，预防和缓解便秘症状。
8.本发明提供的鼠李糖乳杆菌，为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus) vhprobi m15株，已于2021年7月19日保藏于中国武汉武汉大学的中国典 型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021904。
9.所述鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的riboprinter指纹图谱如图1所示， rapd指纹图谱如图2所示，rep-pcr指纹图谱如图3所示。
10.本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15，其16s rdna序列如seq idno:1所示。
11.本发明还提供了鼠李糖乳杆菌vhprobi m15在制备用于预防和缓解便秘 症状的制品中的应用。
12.本发明还提供一种预防和缓解便秘症状的制品，所述的制品中包含有鼠 李糖乳杆菌vhprobi m15株和/或鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的发酵产物。
13.所述制品为食品、保健品或药品。
14.本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对模拟人工胃肠液具有很强 的耐受能力，在人工胃液中消化3h后，其存活率高达99.8％，能顺利经过胃 肠道在结肠处定植下来发挥益生功能。该菌株对氨苄西林和四环素等常见抗 生素较敏感，不产生溶血素，不会溶解血细胞，生物安全性良好。同时，鼠 李糖乳杆菌vhprobi m15具有一定的抗氧化功能活性，对dpph自由基的清 除率达到46.19％，其上清液抗脂质过氧化抑制率达43.37％。该菌株还能够有 效降解胆固醇，具有降低血清胆固醇的益生特性。
15.鼠李糖乳杆菌vhprobi m15可以显著提高小鼠粪便的含水量，提高便秘 小鼠小肠的转运能力，从而有利于促进排便，改善便秘症状。
16.鼠李糖乳杆菌m15还能显著提高小鼠粪便中乙酸和总有机酸含量，乙酸 是结肠发酵的主要产物，增加肠道乙酸浓度可导致肠道渗透压增加，肠内容 物含水量增加，从而刺激肠壁，增加肠蠕动，进而缓解便秘。
17.鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能有效调节胃肠调节肽的分泌，通过促进兴 奋性递质胃动素、胃泌素和p物质的分泌，减少抑制性递质内皮素、生长抑 素-1、血管活性肠肽分泌实现对胃肠道运动和胃酸分泌的有效调节，缓解便 秘症状。
18.鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能预防及缓解便秘引起的肠壁屏障破坏，减 轻炎症反应，使肠黏膜屏障趋于完整。
19.鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能使便秘小鼠粪便菌群的丰富度和均匀度提 升，使门和属水平上的优势物种的丰度趋向于空白组小鼠菌群特征，菌群组 成的差异性减少，群落结构组成与空白组相似，趋于正常小鼠水平。
20.本发明所述鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对机体无毒害作用，有望用于开 发具有预防或缓解便秘功效的食品、保健品或药品，应用前景广阔。
附图说明
21.图1为m15菌株革兰氏染色镜检图；
22.图2为m15菌株riboprinter指纹图谱；
23.图3为m15菌株的rapd指纹图谱；
24.图4为m15菌株的rep-pcr指纹图谱；
25.图5为各组小鼠粪便含水量结果图；
26.图6为各组小鼠小肠推进率解剖图；
27.图7为各组小鼠小肠推进率结果图；
28.图8为各组小鼠回肠病理切片结果图；
29.图9为各组小鼠胃肠调节肽结果图；
30.图10为各组小鼠粪便样本α多样性指数组间差异性检验图；
31.图11为各组小鼠粪便样本在门水平上群落组成分析饼图；
32.图12为各组小鼠粪便样本在属水平上群落组成分析柱状图；
33.图13为各组小鼠粪便样本pcoa分析结果图。
具体实施方式
34.本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的 的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保 护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤 或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
35.下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
36.实施例1 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的分离筛选
37.1、初筛
38.依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺 书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，取1ml半年内未食用过 益生菌制剂的哺乳期产妇的新鲜母乳，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品 袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μl混匀液梯度稀释，涂布于mrs琼脂培 养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请 人共筛选出20株潜在乳酸杆菌，分别命名为m01，m02，
……
m19，m20。
39.其中mrs(man rogosa sharpe)琼脂培养基的配制方法如下：
40.纯化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物5.0g,乙酸 钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0ml，柠檬酸二胺2.0g,碳酸 钙20g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，琼脂15g，调ph 6.2-6.5，121℃ 高压灭菌15min。
41.2、复筛
42.配制1l的mrs液体培养基121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加 入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h制成耐酸 性培养基。
43.将筛选得到的20株乳酸杆菌m01，m02，
……
m19，m20按6％接种量 分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液 进行菌量计数。
44.结果显示，初筛获得的20株乳酸杆菌发酵液中，活菌量的对数值分别为 7.23、6.94、6.76、7.56、6.33、5.39、8.18、6.35、4.17、5.28、7.32、7.35、 5.35、8.18、8.43、4.99、
6.36、7.41、5.83、5.39log cfu/ml，其中m15菌 株经耐酸性培养基复筛后的活菌量最多，对数值高达8.43log cfu/ml；表 明m15号菌株的耐酸能力最高。
45.实施例2 m15菌株的菌株鉴定菌及理化性质
46.1、菌落形态鉴定
47.将m15菌株接种于mrs琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，观察m15 的菌落形态，结果如图1所示。可见m15菌株单菌落呈米黄色，菌落直径在 0.5-1.5mm左右，表面湿润，革兰氏染色后显微镜下呈短杆状，有的会呈链状。
48.2、生理生化特性鉴定
49.在无菌条件下，取适量新鲜m15菌液，5000rpm/min离心5min，用pbs 缓冲液洗2次，再用同体积pbs缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
50.1)盐度耐受性试验
51.在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μl盐浓度为1％、2％、3％、 4％、5％、6％、7％、8％的mrs液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然 后再加入10μl接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μl高压灭菌过的 石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变 浑浊。结果显示，m15菌株最大耐受盐浓度为7％。
52.2)碳源代谢试验
53.利用api50chl试剂盒对m15菌株进行碳源代谢试验，实验方法参照 api 50chl试剂盒说明书。检测结果显示，m15菌株为鼠李糖乳杆 菌，％id＝99.6,t值＝0.78，评语为非常好的鉴定。
54.3)葡萄糖产酸产气试验
55.本实施例中所用的培养基配方如下：
56.蛋白胨0.5g；酵母提取物0.3g；吐温80 0.1ml；盐溶液a 0.5ml；盐溶 液b 0.5ml；乙酸钠0.5g；葡萄糖2.5g；2％溴甲酚绿(w/v)0.05ml；蒸 馏水100ml；ph6.8～7.0。
57.将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3ml/管，121℃， 高压灭菌15min。
58.盐溶液a成分：kh2po
4 10g、k2hpo
4 1g，溶于蒸馏水，定容至100ml。
59.盐溶液b成分：mgso4·
7h2o 11.5g、mnso4·
2h2o 2.4g、feso4·
7h2o 0.68g， 溶于蒸馏水，定容至100ml。
60.在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种培养基，不接菌的培养基 作为对照，然后用2ml无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养。连续培养 6d，每天观察培养基颜色有无变化。
61.结果显示：37℃培养6d后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体， 说明m15菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。
62.4)温度耐受性试验
63.在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种到10ml mrs液体培养基 中，不接菌的10ml mrs液体培养基作为对照，置于15℃恒温振荡培养箱培 养2天，45℃恒温振荡培养箱7天，观察培养液是否变浑浊。
64.结果显示：15℃恒温培养2天后，培养基变浑浊；45℃恒温培养7天后， 培养基仍澄清。从而说明，m15菌株在15℃能生长，在45℃条件下不能正常 生长。
65.3、分子生物学鉴定
66.3.1 16s rdna基因序列分析
67.3.1.1、基因组dna提取
68.参照天根细菌基因组dna提取试剂盒(目录号：dp302)操作。
69.3.1.2、16s rdna基因扩增
70.1)引物序列:
71.27f：agagtttgatcctggctca；
72.1492r：ggttaccttgttacgactt。
73.2)反应体系(50μl)
74.表1：16s rdna pcr扩增体系表
[0075][0076]
通过对pcr产物进行测序，获得m15菌株的16s rdna序列seq id no:1， 并将该序列在ncbi数据库中进行比对。结果显示seq id no:1与鼠李糖乳 杆菌(lactobacillus rhamnosus)的相似性最高，因此，初步确定m15菌株为 鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)。
[0077]
3.2、riboprinter指纹图谱
[0078]
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有 缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架 放入加热器中灭活后放入riboprinter系统中，样品经过dna制备、转膜、 成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，m15菌株为鼠 李糖乳杆菌，其riboprinter指纹图谱结果如图2所示。
[0079]
3.3、rapd和rep-pcr指纹图谱鉴定
[0080]
3.3.1、rapd指纹图谱鉴定
[0081]
1)引物序列：m13(5
’‑
gagggtggcggttct-3’)；
[0082]
2)rapd反应体系
[0083]
表2：rapd反应体系表
[0084][0085]
3)电泳
[0086]
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，dl2000 dna marker作为结果对照，稳压 100v电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图；m15菌株的rapd指 纹图谱如图3所示。
[0087]
3.4、rep-pcr指纹图谱
[0088]
1)rep-pcr引物
[0089]
ctacggcaaggcgacgctgacg。
[0090]
2)rep-pcr的反应体系
[0091]
表3：rep-pcr的反应体系表
[0092][0093][0094]
3)电泳
[0095]
dl2000 dna marker作为结果对照。电压100v，电泳时间80min检测 扩增结果。m15菌株的rep-pcr指纹图谱如图4所示。
[0096]
综上，将m15菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站 http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html，同时结合文献declerck e，et al.systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果， 进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，m15菌株为一株新 型的鼠李糖乳杆菌，将其命名为鼠李糖乳杆菌vhprobi m15，已于2021年7 月19日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 cctcc no：m2021904。
[0097]
实施例3鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对人工胃液和人工肠液的耐受性 试验
[0098]
1、人工胃液的配制
[0099]
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和nacl 2g，加入 1000ml蒸馏水，用稀盐酸调ph3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加 入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶
解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟 人体温度。
[0100]
2、人工肠液的配制
[0101]
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、kh2po
4 6.8g和牛胆 盐3.0g，加入77ml的0.2mol/l的naoh溶液，定容至1000ml，用稀盐酸 或者氢氧化钠溶液调ph6.8
±
0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶， 摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
[0102]
3、试验方法
[0103]
1)将鼠李糖乳杆菌vhprobi m15培养24h后，取新鲜菌液，20000
×
g、 4℃离心10min，弃上清，将菌体清洗一次，然后用灭菌生理盐水悬浮；
[0104]
2)取1ml菌悬液加到50ml人工胃液中，用盐酸调节ph3.0；
[0105]
3)37℃消化培养3h后，取样检测活菌量；
[0106]
4)取25ml人工胃液消化3h后的样品，20000
×
g，4℃离心10min，弃 上清，将菌体清洗一次，然后用灭菌生理盐水悬浮；将收集的菌悬液重新加 入到50ml人工肠液中，37℃消化培养3h后，取样检测活菌量。
[0107]
活菌计数方法参照国标《gb4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》。 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15菌株经过人工胃液和人工肠液消化后的活菌量见 表4。
[0108]
表4：人工胃肠液消化后的活菌量表(log cfu/ml)
[0109][0110]
从表4可知，本发明筛选到的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对人工胃液和 人工肠液均有较强的的耐受性。在人工胃液中消化3h后，该菌株的存活率高 达到99.8％；在人工肠液中消化3h后，该菌株的存活率也能达到31.4％。从 而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15菌株能活着到达肠道，并 在人体肠道中实现有效定植，发挥益生作用。
[0111]
实施例4 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的溶血性及抗生素耐受性实验
[0112]
1、溶血性实验
[0113]
(1)接种液制备：将冷冻保存的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15菌株划线 接种于mrs琼脂培养基中，在温度37℃培养24～48h，再经mrs液体培养 基传代培养1次后，以5％的接种量把鼠李糖乳杆菌vhprobi m15接种到新 鲜的mrs液体培养基中37℃培养24～48h，获得新鲜的菌液，作为接种液。
[0114]
(2)血细胞培养基准备：称取tbs基础培养基的各种组分，溶解，121℃ 高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血， 混匀，倒平板。
[0115]
(3)划线培养：将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养 箱培养，24～48h观察测试菌是否有溶血现象。
[0116]
结果显示鼠李糖乳杆菌vhprobi m15在血细胞培养基上不能生长，血细 胞平板没有变化，说明鼠李糖乳杆菌vhprobi m15不产生溶血素，不能够溶 解血细胞。
[0117]
2、抗生素耐受性实验
[0118]
(1)抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、 四环素、万古
霉素均配制成2048μg/ml的贮存液，-20℃保存备用。使用时 将贮存液用bsm液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度 为1～1024μg/ml共11个梯度。
[0119]
(2)接种液制备：取适量新鲜菌液(37℃培养24h)，5000rpm离心5min， 用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接 种液。
[0120]
(3)微量肉汤稀释法测定抗生素对鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的最小 抑菌浓度mic值
[0121]
a.96孔板第1列次加入不含抗生素的mrs液体培养基，作为阴性对照， 向第2～12列依次加入190μl含不同浓度抗生素的mrs液体培养基，然后分 别接种10μl上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。
[0122]
b.加入50μl石蜡油覆盖防止水分蒸发。
[0123]
c.将96孔板于37℃培养24h后取出，测定od
600
值，用24h的结果统 计抗生素对菌株的mic值，具体结果见表5。
[0124]
表5：鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的抗生素mic值(μg/ml)
[0125][0126]
从表5的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对氨 苄西林和四环素等常见抗生素较敏感，生物安全性良好。
[0127]
实施例5 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的疏水性细胞表面测试
[0128]
1、待测菌液制备
[0129]
挑取纯化好的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15菌落接种于新配制的mrs 液体培养基中，于37℃培养24～48h。再按1％(v/v)的接种量接至mrs液 体培养基中于37℃继续培养24～48h后6000
×
g离心10min，收集菌体后用 无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1m kno
3 1ml溶液重悬菌体，作为 待测菌液。
[0130]
2、表面疏水性测定
[0131]
吸取50μl上述菌悬液加入2450μl的0.1m kno3并记录od
600
为a0, 取1.5ml菌悬液与500μl二甲苯混匀后在室温下静置10min(此时形成两 相体系)。将两相体系涡旋振荡2min后再静置20min,重新形成水相和有 机相。小心吸取水相(不要吸到有机相)，od
600
处测量吸光度a1。
[0132]
疏水性％＝(a
0-a1)/a1×
％计算，测三次实验取平均值。
[0133]
结果显示：本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15细胞表面疏水性为 14.39％，标准差为0.11％。
[0134]
实施例6 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15抗氧化功能测定
[0135]
1、菌株清除dpph能力测定
[0136]
1)pbs菌悬液制备
[0137]
将生长状态优良的单菌落接种于3ml的mrs液体培养基中，37℃条件 下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50ml的mrs 液体培养基中，静置培养24h，获
得菌株的培养液。吸取1ml菌液收集菌体 后用1mlpbs缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mlpbs溶液重悬菌体备用。
[0138]
2)菌株清除dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力测定
[0139]
取1ml待测菌株的pbs菌悬液，加入1ml 0.4mm的现配的dpph自由 基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在 波长517nm处的吸光度a
样本
，测3次平行。对照组样品以等体积pbs溶液 和dpph
·
乙醇混合液，并以等体积pbs菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除 率按下列公式计算：清除率％＝[1-(a
样品-a
空白
)/a
对照
]
×
100％。结果见表6。
[0140]
表6：dpph自由基清除率表
[0141][0142][0143]
从表6的数据可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能有 效清除dpph自由基，清除率达到46.19％。
[0144]
2、菌株抗脂质过氧化实验
[0145]
1)乳酸菌的培养及发酵上清液、菌体、胞内提取物的制备：
[0146]
乳酸菌在mrs液体培养基中37℃培养24h，传3代后，6000rpm/min， 4℃离心10min，收集上清液即为发酵上清液。收集的菌体用pbs缓冲液(ph7.4)于6000r/min离心10min，洗涤3次。将菌体重悬于pbs缓冲液，调 整菌体浓度为1.0
×
109cells/ml，获得菌悬液。
[0147]
2)亚油酸乳化液的制备：0.1ml亚油酸，0.2ml tween 20，19.7ml去离 子水。
[0148]
3)0.5ml的pbs溶液(ph 7.4)中加入1ml亚油酸的乳化液，1mlfeso
4 (1％)，再加入0.5ml样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2ml tca(4％)， 2ml tba(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min， 收集上清液在532nm下测吸光度即为a；对照组以0.5ml蒸馏水代替样品 即为a0。
[0149]
抑制率/％＝(a0－a)/a0×
100％。
[0150]
注：a为样品组吸光度；a0为对照组吸光度。结果见表7。
[0151]
表7抗脂质过氧化抑制率表
[0152][0153][0154]
从表7的数据可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15的上 清液抗脂质过氧化抑制率为43.37％。
[0155]
实施例7 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15体外胆固醇降解实验
[0156]
1.胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g胆固醇，溶于无水乙醇中，并 定容至100ml，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
[0157]
2.称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、 葡萄糖20.0g、吐温80 1.0ml，乙酸钠5.0g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.05g、 磷酸氢二钾2.0g、胆盐1g，蒸馏水1000ml，调节至ph7.3，115℃灭菌30min， 然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1％。
[0158]
按照0.1％的接种量接种新鲜的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15菌液，37℃静 止培养48h，然后取0.2ml菌液，加入1.8ml无水乙醇，混匀，静止10分钟， 3000转离心5分钟，取上清液用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法参照 gb/t 5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》。
[0159]
结果显示：本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对胆固醇的降解率 达到12.27％。
[0160]
实施例8 鼠李糖乳杆菌vhprobi m15在缓解小鼠便秘中的应用
[0161]
1实验动物处理及模型构建
[0162]
1.1实验耗材
[0163]
表8：实验耗材信息表
[0164][0165]
1.2实验动物处理
[0166]
选用spf级balb/c小鼠，雄性，24只，随机分为4组，每组6只，分 别为空白组、建模组、阳性组、益生菌组。其中，空白组小鼠不做任何处理， 全程灌胃生理盐水；建模组、阳性组和益生菌组小鼠采用硫糖铝构建便秘模 型，建模组和阳性组小鼠在建模后分别灌胃等量的生理盐水和酚酞(治疗便 秘药物)，益生菌组小鼠建模前后灌胃益生菌液。各组小鼠自由饮水。具体的 处理方法如下：
[0167]
(1)空白组：适应性结束后每天灌胃1ml生理盐水；
[0168]
(2)建模组：每次灌胃生理盐水1ml至试验结束；
[0169]
(3)阳性组：每次灌胃酚酞溶液1ml至第14天，从第15天开始每天 灌胃生理盐水1ml至实验结束，酚酞用量依小鼠体重按照70mg/kg的标准灌 胃；
[0170]
(4)益生菌组：在适应性饲喂结束后开始灌胃益生菌，一直持续至试验 结束，每天灌胃1
×
109cfu/ml菌液1ml。
[0171]
在第15d，除空白组外，建模组、阳性组、益生菌组分别按照1ml/只灌 胃给予浓度为50％的硫糖铝，连续灌胃2天；第2天灌胃后禁食过夜，自由 饮水；第3天按照0.5ml/只灌胃给予50％硫糖铝，连续灌胃5天至第21天。
[0172]
2指标检测
[0173]
2.1粪便含水量
[0174]
末次灌胃硫糖铝24h后(第22天)，收集小鼠湿便(晚8:00至早8:00)， 称量湿便重量(只/天)，将粪便进行冷冻干燥后记录粪便干重，计算含水量。
[0175]
2.2小肠推进率
[0176]
末次灌胃硫糖铝24h后，各组小鼠分别灌胃给予3％失活炭，1h后co2窒息处死，快速分取小肠并拉成直线，置于无菌垫单上，测量肠管(幽门至 回盲部)长度作为小肠总长度，从碳粉前沿至幽门的距离为碳粉在小肠内推 进距离，计算碳粉推进率及碳粉推进抑制率。
[0177]
碳粉推进率(％)＝碳粉在肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)
×
100％。
[0178]
2.3粪便中有机酸含量
[0179]
所有组别于第7、14、21天取粪便，检测粪便中乙酸、丙酸、丁酸和总 的有机酸含量。
[0180]
2.4血清中神经递质含量
[0181]
末次灌胃硫糖铝24h后，眼眶取血，离心，取血清，elisa法检测血清中 胃动素(mtl)、胃泌素(gas)、p物质(sp)、内皮素(ss)、生长抑 素-1(et-1)和血管活性肠肽(vip)6种神经递质的含量。
[0182]
2.5组织病理检查
[0183]
末次灌胃硫糖铝24h后，处死小鼠，取小鼠回肠组织，脱水、包埋、切 片，he染色，观察组织病理改变。
[0184]
2.6粪便菌群检测
[0185]
所有组别于第14天、第21天取粪便，-80℃冻存，提取dna用以16s rrna 高通量测序分析肠道菌群的结构。
[0186]
3数据处理
[0187]
所有实验数据以均数
±
标准差表示，用graphpad prism 7.0软件进行数据 统计和作图，多组数据间比较采用单因素方差分析，两组数据间比较采用t 检验，以p《0.05判定为有显著性差异。
[0188]
4实验结果
[0189]
4.1粪便含水量
[0190]
粪便含水量与粪便的软硬度有关，含水量少则粪便干燥，导致排便困难， 因而粪便含水量是便秘治疗的常见指标之一。各组小鼠粪便含水量变化比较 如图5、表9所示。
[0191]
与空白组比较，建模组小鼠的粪便含水量降低，且具有显著性差异 (p《0.05)，说
明便秘造模成功。
[0192]
与建模组比较，益生菌组小鼠粪便含水量显著升高，恢复到正常水平， 与空白组相当，略低于阳性组。从而说明，服用本发明提供的鼠李糖乳杆菌 vhprobi m15可以有效软化小鼠粪便，有利于改善便秘。
[0193]
表9：各组小鼠粪便含水量对比表(n＝6，)
[0194][0195]
4.2小肠推进率
[0196]
小肠转运时间是衡量整个肠道转运能力的指标之一。申请人采用碳粉推 进实验观察小肠推进率。结果如图6、图7所示。
[0197]
与空白组比较，建模组小肠推进率降低，差异具有显著性(p《0.05)。 与建模组比较，益生菌组的小肠推进率显著升高，与空白组相当，略低于阳 性组。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能够显著提高便 秘小鼠小肠的转运能力，从而有利于促进排便，改善便秘症状。
[0198]
4.3粪便中短链脂肪酸含量
[0199]
益生菌需要在肠道中定植代谢才会对宿主产生有益影响，代谢产物短链 脂肪酸(scfas)包括乙酸、丙酸、丁酸等是哺乳动物肠道菌群发酵的重要 产物，能参与体内重要的生理代谢过程，如为结肠黏膜细胞提供能力，促进 水和电解质的吸收，促进上皮细胞的增殖，影响胃肠运动和其它生理效应。 因此，测定肠道内scfas含量已经成为评价菌株是否能缓解便秘的重要手段。 通过测定粪便中的scfas浓度来评估不同处理方法对便秘小鼠肠道微环境的 影响。具体结果见表10。
[0200]
结果显示，建模前(前14天)，空白组、建模组和阳性组小鼠粪便中乙 酸、丙酸、丁酸及总的有机酸含量均相对稳定；但益生菌组小鼠粪便中乙酸 含量显著升高(p＜0.05)，第14天时比空白组提高了19.8％，但丙酸、丁酸 和总的有机酸含量没有显著性变化。
[0201]
建模后(第15-21天))，与空白组比较，建模组小鼠粪便中乙酸、丙酸、 丁酸和总的有机酸含量显著降低(p＜0.05)。与建模组比较，益生菌组小鼠 粪便中乙酸含量显著提高，接近空白组水平，略低于阳性组；总有机酸含量 也显著提高，与空白组和阳性组相当；但丙酸和丁酸含量与建模组无显著差 异。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌m15能显著提高小鼠粪便中乙酸 和总有机酸含量，乙酸是结肠发酵的主要产物，增加肠道乙酸浓度可导致肠 道渗透压增加，肠内容物含水量增加，从而刺激肠壁，增加肠蠕动，进而缓 解便秘。
[0202]
表10：各组小鼠粪便中短链脂肪酸含量比较表
[0203][0204][0205]
不同行数字上的a～f表示各组之间的显著性差异(p《0.05)
[0206]
4.4血清中mtl、gas、et-1、ss、sp、vip 6种胃肠调节肽的含量变化
[0207]
便秘相关胃肠调节肽能够对胃肠道运动发挥重要的调节运动，胃动素 (mtl)、胃泌素(gas)和p物质(sp)为兴奋性递质，内皮素(ss)、 生长抑素-1(et-1)和血管活性肠肽(vip)为抑制性递质。胃动素影响水和 电解质的运输，促进胃的收缩和小肠节段性运动，加速肠道传输时间和增加 结肠运动。胃泌素刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，促进消化道黏膜上皮的生长， 促进胃肠道平滑肌的收缩和幽门括约肌的松弛。p物质主要调节胃肠道的收 缩、肠蠕动和胃酸分泌。内皮素-1作为一种多功能肽，在心血管、神经内分 泌和胃肠功能等方面给发挥重要作用。生长抑素可以抑制胃肠激素的释放。 血管活性肽可以使胃肠道括约肌放松。
[0208]
本发明采用elisa法检测小鼠血清中胃动素、胃泌素、生长抑素-1、内皮 素、p物质、血管活性肽6种胃肠调节肽的变化。结果如图9所示。
[0209]
结果显示，与空白组比较，建模组小鼠血清中兴奋性递质胃动素、胃泌 素和p物质显著降低(p《0.01)，抑制性递质内皮素、生长抑素-1和血管活 性肠肽显著升高(p《0.01)；而与建模组比较，益生菌组和阳性组的兴奋性 递质胃动素、胃泌素和p物质显著升高(p《0.01)，抑制性递质内皮素、生 长抑素-1、血管活性肠肽显著降低(p《0.01)，与空白组相当。从而说明，本 发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能通过调节胃肠调节肽的分泌，增加 小肠蠕动和胃酸分泌。
[0210]
4.5小鼠回肠组织病理观察
[0211]
光学显微镜下观察各组小鼠回肠病理切片结果如图8所示。
[0212]
(1)空白组：小鼠肠壁三层结构完整，黏膜表面被覆单层纤毛柱状上皮， 上皮与其
下的固有层形成突向肠腔的肠绒毛，上皮向固有层内陷形成肠腺；
[0213]
(2)建模组：小鼠肠道黏膜组织出现炎性细胞浸润，肠病变为肠绒毛坏 死脱离，出现黏膜溃疡；
[0214]
(3)益生菌组：小鼠肠道炎症程度减轻，肠黏膜基本正常，肠绒毛出现 水肿，少量肠绒毛坏死；
[0215]
(4)阳性组：小鼠肠道黏膜结构基本正常，肠黏膜出现少量炎性细胞浸 润。
[0216]
上述结果表明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌m15能有效预防及缓解便秘 引起的肠壁屏障破坏，减轻炎症反应，使肠黏膜屏障趋于完整。
[0217]
4.6各组小鼠粪便菌群差异
[0218]
为了研究鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对便秘小鼠肠道菌群的影响，对收 集到的各组小鼠粪便进行菌群结构分析，48个样本共产生了2350178条16s rdna v4区的有效序列数目，平均序列长度为252bp。
[0219]
4.6.1菌群多样性分析
[0220]
通过α多样性分析来反应不同组小鼠粪便样本菌群的多样性，用sobs指 数来反应不同样本群落的丰富度，用shannon指数反应样本群落的多样性。 结果如图10所示。
[0221]
(1)与空白组相比，建模组sobs指数和shannon指数均降低，且有显 著性差异，说明建模组小鼠粪便中物种的丰富度和均匀度显著降低。
[0222]
(2)与建模组相比，阳性组和益生菌组sobs指数上升且有显著性差异 (阳性组，p《0.01；益生菌组，p《0.05)，shannon指数上升但没有显著性差 异。从而说明阳性组和益生菌组小鼠粪便中物种丰富度明显上升，菌群多样 性有改善。
[0223]
4.6.2菌群组成分析
[0224]
在门水平上小鼠粪便菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和疣微 菌门构成。各组小鼠粪便中门水平上的物种组成情况如图11所示。
[0225]
(1)与空白组相比，建模组小鼠粪便中拟杆菌门减少，而厚壁菌门、疣 微菌门和变形菌门增加较多，放线菌门也有所增加。
[0226]
(2)与建模组相比，阳性组小鼠粪便中厚壁菌门和变形菌门显著减少， 疣微菌门显著增加。
[0227]
(3)与建模组相比，益生菌组小鼠粪便中拟杆菌门增加，厚壁菌门、疣 微菌门和变形菌门减少，在门水平上的物种组成与空白组相当，接近正常水 平。
[0228]
各组小鼠在属水平上的物种组成如图12所示。
[0229]
(1)与空白组相比，建模组中muribaculaceae属(由下往上第1色块) 和乳杆菌属(由下往上第3色块)的丰度显著下降，而阿克曼菌属(由下往 上第2色块)和链球菌属(由下往上第6色块)的丰度显著增加；
[0230]
(2)与建模组相比，阳性组中muribaculaceae属的丰度下降，阿克曼 菌属和alloprevotella属(由下往上第5色块)的丰度显著增加。
[0231]
(3)与建模组相比，益生菌组的muribaculaceae属、乳杆菌属和 alloprevotella属的丰度上升，而阿克曼菌属和链球菌属的丰度下降，在属水 平上的物种组成趋向于空白组的群落结构。
[0232]
阳性组和益生菌组在属水平上的优势物种的丰度不同，说明阳性组使用 的药物
与益生菌对肠道菌群的调节作用是不同。
[0233]
4.6.3菌群组成差异性分析
[0234]
采用β多样性来研究不同组小鼠粪便样本菌群组成的差异性，如图13所 示。
[0235]
通过pcoa主坐标分析发现，空白组和建模组小鼠菌群结构存在差异， 阳性组和益生菌组小鼠菌群结构存在差异，空白组和益生菌组小鼠菌群结构 存在一定相似性。
[0236]
上述结果表明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15能使便秘小鼠 粪便菌群的丰富度和均匀度提升，使门和属水平上的优势物种的丰度趋向于 空白组小鼠菌群特征，菌群组成的差异性减少，群落结构组成与空白组相似， 趋于正常小鼠水平。
[0237]
综上所述，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi m15对模拟人工胃肠液 具有很强的耐受能力，这对于益生菌株顺利经过胃肠道在结肠处定植下来发 挥益生功能奠定了基础。溶血性试验证实鼠李糖乳杆菌vhprobi m15不产生 溶血素，不会溶解血细胞，生物安全性良好。同时，鼠李糖乳杆菌vhprobi m15 能够清除dpph自由基，抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化功能活性，能 够降解胆固醇，具有降低血清胆固醇的益生特性。经动物实验证实，鼠李糖 乳杆菌vhprobi m15能显著提高小鼠粪便的含水量和小鼠小肠的运转能力， 还能提高小鼠粪便中乙酸和总有机酸含量。鼠李糖乳杆菌vhprobi m15通过 调节胃肠调节肽的分泌、增加小肠蠕动能力以及调节肠道菌群等途径能有效 预防并缓解小鼠便秘症状，有望开发成具有预防或缓解便秘功效的食品、保 健品或药品。