单克隆抗体及其用途的制作方法

单克隆抗体及其用途
1.本技术是一项国际申请，其要求于2020年4月08日提交的美国临时专利申请号63/006,822的优先权，其内容通过引用以其全文并入本文。
2.本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均特此通过引用以其全文并入本文。这些出版物的公开内容特此通过引用以其全文并入本技术，以更全面地描述自本文所描述和要求保护的发明的日期起本领域技术人员已知的现有技术的状态。
3.本专利公开内容含有受版权保护的材料。版权所有人不反对任何人对本专利文件或专利公开内容进行复制再现，因为其出现在美国专利与商标局的专利文档和记录中，但在其他方面保留任何和所有版权。
4.序列表
5.本技术包含已经以ascii格式电子提交的序列表，并特此通过引用以其全文并入。在[]上创建的所述ascii副本被命名为[]，并且大小为[]字节。
技术领域
[0006]
本发明的一些方面涉及与培养滤液抗原-10(cfp-10)蛋白或其肽片段的表位结合的分离的单克隆抗体，以及使用其检测结核分枝杆菌的方法。


背景技术：

[0007]
结核病(tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)引起的疾病，其可以产生肺组织感染，但也可以在多种其他组织和器官(包括肝脏、肾脏、脊柱和脑)中引起感染。tb是造成人感染性死亡的主要原因，但并非每个感染结核分枝杆菌的人均患有tb，因为免疫系统可以包含病原体以产生潜伏性tb感染(ltbi)，这种感染未表现出tb病理，但其可以在任何时间点(即使是几十年后)进展成活跃性tb，因此这种遏制均失败了。


技术实现要素：

[0008]
本发明基于与培养滤液抗原-10(cfp-10)蛋白或其肽片段的表位结合的单克隆抗体的发现。
[0009]
在一些实施方案中，表位包括tdaatlaqeagnfer或tqidqvestagslqgqwr或其一部分。例如，表位可以包括肽1593和肽2004的线性氨基酸序列，其长度为约5或6个氨基酸。
[0010]
在一些实施方案中，表位包括蛋白的氨基酸位置氨基酸6-20和27-44。
[0011]
示例性单克隆抗体包括单克隆抗体65d3-1、17e4-1、21h3-1、119c10-1、65d3-1、67g8-1、135a6-1、101g10-2、125d9-1、91b4-1、70a12-1、6d10-1、5b7-1、55h8-1、10g3-1、76c4-1、3e9-1、76h12-1、74d3-1、4g6-1、21f10-1、65d3-1 hv1、65d3-1 hv2、65d3-1 lv1，或者与以下各项相同的表位、相似的表位或相邻的表位结合的抗体：65d3-1、17e4-1、21h3-1、119c10-1、65d3-1、67g8-1、135a6-1、101g10-2、125d9-1、91b4-1、70a12-1、6d10-1、5b7-1、55h8-1、10g3-1、76c4-1、3e9-1、76h12-1、74d3-1、4g6-1、21f10-1、65d3-1 hv1、65d3-1 hv2或65d3-1 lv1。例如，与65d3-1、17e4-1、21h3-1、119c10-1、65d3-1、67g8-1、135a6-1、
101g10-2、125d9-1、91b4-1、70a12-1、6d10-1、5b7-1、55h8-1、10g3-1、76c4-1、3e9-1、76h12-1、74d3-1、4g6-1、21f10-1、65d3-1 hv1、65d3-1 hv2或65d3-1 lv1的相同的表位、相似的表位或相邻的表位结合的抗体与单克隆抗体65d3-1、17e4-1、21h3-1、119c10-1、65d3-1、67g8-1、135a6-1、101g10-2、125d9-1、91b4-1、70a12-1、6d10-1、5b7-1、55h8-1、10g3-1、76c4-1、3e9-1、76h12-1、74d3-1、4g6-1、21f10-1、65d3-1 hv1、65d3-1 hv2或65d3-1 lv1竞争结合。
[0012]
本发明的单克隆抗体可以具有单克隆抗体65d3-1、17e4-1、21h3-1、119c10-1、65d3-1、67g8-1、135a6-1、101g10-2、125d9-1、91b4-1、70a12-1、6d10-1、5b7-1、55h8-1、10g3-1、76c4-1、3e9-1、76h12-1、74d3-1、4g6-1、21f10-1、65d3-1 hv1、65d3-1 hv2或65d3-1 lv1的结合亲和力。
[0013]
单克隆抗体具有包含seq id no:[]、[]、[]或[]的重链可变氨基酸序列和/或包含seq id no:[]、[]、[]或[]的轻链可变氨基酸序列。
[0014]
单克隆抗体具有包含seq id no:[]、[]、[]或[]的重链可变核酸序列和/或包含seq id no:[]、[]、[]或[]的轻链可变核酸序列。
[0015]
本发明还提供了一种单克隆抗体或其片段，其中该抗体具有：具有分别包括氨基酸序列scdvn(seq id no:[])、viaragstyyaswakg(seq id no:[])和eefdf(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssqsvynnnels(seq id no:[])、ysstlas(seq id no:[])和lggyasiidmwt(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列sydvs(seq id no:[])、visrggttystnwakg(seq id no:[])和eefnl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasesvywnnrla(seq id no:[])、easklas(seq id no:[])和agyksssdgpa(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列synmg(seq id no:[])、figttgrafyaswakg(seq id no:[])和gapgytpfnl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssqsvisndls(seq id no:[])、qtsklas(seq id no:[])和aggysssldiya(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列thdis(seq id no:[])、viarrgstyyaswakg(seq id no:[])和eefdf(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssqsvynnkels(seq id no:[])、yastlas(seq id no:[])和lggyastidmwa(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列nydgh(seq id no:[])、viatigdtyyaswakg(seq id no:[])和gdsrtsneifnl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qstrsvhnnicls(seq id no:[])、sastlas(seq id no:[])和agcfpsksdmyg(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列nydis(seq id no:[])、viatvgdtyyaswakg(seq id no:[])和gdspstneifgl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssrtvynnicls(seq id no:[])、gastlts(seq id no:[])和agcfpstsdmyg(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列sydmt(seq id no:[])、visyggsayyaswakg(seq id no:[])和gdsdgsselfnl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssksvynnncls(seq id no:[])、gastlas(seq id no:[])和agcfastndmyg(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列sydmt(seq id no:[])、vvayggatyyaswakg(seq id no:[])和gdsdgsselfnl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列
qssksvynnncls(seq id no:[])、qastpas(seq id no:[])和agcfastsdmyg(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列rfgvs(seq id no:[])、yihtdgnvyyaswakg(seq id no:[])和ggyaadl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssesvyknyla(seq id no:[])、atstlvs(seq id no:[])和vggytgknv(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列nhyii(seq id no:[])、aisrrsktdyaswakg(seq id no:[])和qldgstsvvcdi(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqnvyndrnlg(seq id no:[])、gpstlas(seq id no:[])和qgeficssadcca(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列dvtms(seq id no:[])、iigrrgriwyanwakg(seq id no:[])和gavssdwnmygmdl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qssqsvynnenla(seq id no:[])、gastlas(seq id no:[])和qgefdcssadcfa(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列dvtis(seq id no:[])、iigrrgriryadwakg(seq id no:[])和ayvssdwniygmdl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvynnknla(seq id no:[])、easklas(seq id no:[])和qgefdcssadcfv(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列dhams(seq id no:[])、ivgrrgrtyyaswakg(seq id no:[])和gyvssdwniygmdl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvynnknla(seq id no:[])、eastlas(seq id no:[])和qgefdcssadcfa(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列ddams(seq id no:[])、iigrrgktwyanwakg(seq id no:[])和gyvssdwniygmdl(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvynnknla(seq id no:[])、easklas(seq id no:[])和qgefscssadcft(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列kytmg(seq id no:[])、aigatgrtvyanwakg(seq id no:[])和nvvdasdsdgmiafdp(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvynnknla(seq id no:[])、kastlas(seq id no:[])和qgefscssgdcva(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列snamg(seq id no:[])、siyasgntyyaswakg(seq id no:[])和lfni(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvfdnknls(seq id no:[])、gastlds(seq id no:[])和ggrdsgniyd(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列gsamg(seq id no:[])、siyvsgntyyaswakg(seq id no:[])和llni(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvydnknla(seq id no:[])、gastlas(seq id no:[])和ggrdsdniyd(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列nnamg(seq id no:[])、tiyasgntyyaswakg(seq id no:[])和lfni(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvydnknls(seq id no:[])、aastlas(seq id no:[])和ggrdsgniyd(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列snamg(seq id no:[])、siyssgntyyaswarg(seq id no:[])和lfni(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvydnknla(seq id no:[])、gastvas(seq id no:[])和ggrdndniyd(seq id no:[])的三个cdr的轻链；具有分别包括氨基酸序列snavg(seq id no:[])、siyssgnsyyaswakg(seq id no:[])和lfni(seq id no:[])的三个cdr的重链，和/或具有分别包括氨基酸序列qasqsvydnknls(seq id no:[])、gastlas(seq id no:[])和ggrdddniyd(seq id no:[])的三个cdr的轻
链；具有分别包括氨基酸序列thdis(seq id no:[])、viarrgwtyyaswakg(seq id no:[])和eefdf(seq id no:[])的三个cdr的重链；具有分别包括氨基酸序列thdis(seq id no:[])、viarrgwtyyaswakk(seq id no:[])和eefdf(seq id no:[])的三个cdr的重链；或具有分别包括氨基酸序列qssqsvynnkels(seq id no:[])、yastlat(seq id no:[])和lggyastidmwa(seq id no:[])的三个cdr的轻链。
[0016]
在实施方案中，单克隆抗体包括具有氨基酸序列
[0017]
qsleesggrlvtpgtpltltctvsgfslsscdvnwvrqapgkglewigviaragstyyaswakgrftvsktsttvyleiasptiedtatyfcvreefdfwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0018]
avltqtaspvsaanggtvtitcqssqsvynnnelswfqqkpgqppkllinysstlasgvpsrfkgsgsgtqftltisgvqcddaatyyclggyasiidmwtfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0019]
qsleesggrlvtpgtpltltctvsgfslssydvswvrqapgkglewigvisrggttystnwakgrftisktsttvdlritsptiedtatyfcareefnlwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0020]
ivmtqtpssksvpvgdtvtincqasesvywnnrlawfqqkpgqppkqliyeasklasgvpsrfkgsgsgtqftltisdvvcddaatyycagyksssdgpafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0021]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslssynmgwvrqapgkgleyigfigttgrafyaswakgrftisktsttvnlkvtslttedtatyfcaggapgytpfnlwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0022]
qvltqtpssvsaavggtvsiscqssqsvisndlswfqqkpgqpprqliyqtsklasgvpsrfsgsgsgtqftltisdlkcddaatyscaggysssldiyafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0023]
qsleesggrlvtpggsltltctvsgfslsthdiswvrqapgkglewigviarrgstyyaswakgrftisktsttvdlkitsptiedtatyfcareefdfwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0024]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0025]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslgnydghwvrqtpekglewigviatigdtyyaswakgrfsisktsatvelritspttedtatyfcvrgdsrtsneifnlwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0026]
avltqtpspvsaavggtltincqstrsvhnniclswyqqkpgqppklliysastlasgvpsrfkgsgsgtqftlaindvqcgdaatyycagcfpsksdmygfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0027]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslgnydiswvrqapgkglewigviatvgdtyyaswakgrftisktsatvdlkitspttedtatyfcvrgdspstneifglwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0028]
avltqtpspvsaavggtltincqssrtvynniclswyqqklgqppklliygastltsgvpsrfrgsgsgtqftltindvqcgdaatyycagcfpstsdmygfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0029]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslssydmtwvrqapgkgleyigvisyggsayyaswakgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargdsdgsselfnlwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0030]
avltqtpspvsapvggtvsincqssksvynnnclswyqqkpgqppnlliygastlasgvpsrfkgsgsgtqftltindvqcddaatyycagcfastndmygfgggsevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0031]
qpveesggrlvtpgtpltltctvsgfslssydmtwvrqapgkgleyigvvayggatyyaswakgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargdsdgsselfnlwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0032]
avltqtpspvsaavggtvtincqssksvynnnclswyqqkqgqppklliyqastpasgvpsrfkgsgsgtqftltindvqcddaatyycagcfastsdmygfgggtgvvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0033]
qsleesggrlvspggsltltctvsgidlsrfgvswvrqapgkglewtgyihtdgnvyyaswakgrftisktsttvdlkmtslttedtatyfcarggyaadlwgqaalvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0034]
dpmltqtpssvsaavggtvtiscqssesvyknylawyqqklgqppklligatstlvsgvpsrfkgsgsrtqfsltisdlecddaatyycvggytgknvfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0035]
qsveesggrlvtpgtpltltctasgfslsnhyiiwvrqtpgkglewigaisrrsktdyaswakgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcarqldgstsvvcdiwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0036]
qvltqtpspvsaavggtvtincqasqnvyndrnlgwyqqkpgqppklliygpstlasgvssrftgsgsgtqftltisdlqcddaatyycqgeficssadccafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0037]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsdvtmswvrqapgkglewigiigrrgriwyanwakgrftisktsptvdlkiisptsddtatyfcargavssdwnmygmdlwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0038]
qvltqtpssvsapvggtvtincqssqsvynnenlawyqqklgqppklliygastlasgvssrfegsgsgtqfaltisgvqcddaatyycqgefdcssadcfafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0039]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsdvtiswvrqapgkglkwtgiigrrgriryadwakgrftisktsttvdlkitspttddtatyfcarayvssdwniygmdlwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0040]
qvltqtaspvsapvggtvtincqasqsvynnknlawyqqklgqppklliyeasklasgvssrfegsgsgtqfaltisgvqcddaatyycqgefdcssadcfvfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0041]
qsmeesggrlvtpgtpltltctvsgfslsdhamswvrqapgkglewigivgrrgrtyyaswakgrftisktsttvdlkitsptiedtatyfcargyvssdwniygmdlwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0042]
qvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnknlawyqqkpgqppklliyeastlasgvssrfkgsgsgtqftltisgvqcddaatyycqgefdcssadcfafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0043]
qsveesggrlvtpgtpltltctasgfslsddamswvrqapgkglewigiigrrgktwyanwakgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargyvssdwniygmdlwgpgtlvtvsa(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0044]
qvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnknlawyqqksgqppklliyeasklasgvpsrfkgsgsgtqftltisgvqcddaatyycqgefscssadcftfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0045]
qsveesggrlvtpgtpltltctasgsdinkytmgwvrqapgkglewvgaigatgrtvyanwakgrftisktsttvdliitspttedtatyfcarnvvdasdsdgmiafdpwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0046]
qvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnknlawyqqkpgqppklliykastlasgvpsrfagsgsgtevtltisdlecddaatyycqgefscssgdcvafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0047]
qsleesggrlvtpggsltltctvsgidlssnamgwvrqapgeglewigsiyasgntyyaswakgrfaisktsttvdlkmtsltaadtatyfcarlfniwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0048]
adivltqtpasvssvvggtvtincqasqsvfdnknlswfqqkpgqppkqliygastldsgvpsrfkgsgsgtqftltisdmqcddaatyycggrdsgniydfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0049]
qelkesggrlvtpggsltlsctasgidlsgsamgwvrqapgqglewigsiyvsgntyyaswakgrfaisrtsttvdlkmtsltaadtatyfcarllniwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0050]
adivltqtpspvsiavggtvtincqasqsvydnknlawfqqkpgqppkqliygastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisgmqcddaatyycggrdsdniydfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0051]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgidlsnnamgwvrqapgeglewigtiyasgntyyaswakgrfaisktsttvdlkmtsltaadtatyfcarlfniwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0052]
adivltqspasvssavggtvtincqasqsvydnknlswfqqkpgqppkqliyaastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisgmqcddaatyycggrdsgniydfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0053]
qsleesggrlvtpgtpltltctvsgidlssnamgwvrqapgeglqwigsiyssgntyyaswargrfaisrtsttvdlkmtsltaadtatyfcarlfniwgpgtlvtvss(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0054]
adivvtqtpasvsadvggtvtincqasqsvydnknlawfqqkpgqppkqliygastvasgvpsrfkgsgsgtqftltisdvqcddaatyycggrdndniydfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0055]
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgidlssnavgwvrqapgeglewigsiyssgnsyyaswakgrfaisrtsttvdlkmtrltaadtatyfcarlfniwgpgtlvtvs(seq id no:[])的vh，和具有氨基酸序列
[0056]
adivltqtpasvssvvggtvaincqasqsvydnknlswfqqkpgqtpkqliygastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisgvqcddaatyycggrdddniydfgggtevvvk(seq id no:[])的vl；具有氨基酸序列
[0057]
qsleesggrlvtpggsltltctvsgfslsthdiswvrqapgkglewigviarrgwtyyaswakgrftisktsttvdlkitsptiedtatyfcareefdfwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh；具有氨基酸序列
[0058]
qsleesggrlvtpggsltltctvsgfslsthdiswvrqapgkglewigviarrgwtyyaswakkrftisktsttvdlkitsptiedtatyfcareefdfwgqgtlvtvss(seq id no:[])的vh；65d3-1 lv1具有氨基酸序列
[0059]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlatgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk(seq id no:[])的vl；
[0060]
在实施方案中，将单克隆抗体缀合至或固定至固相支持物。例如，固相支持物是珠、柱、柱基质、多孔板、颗粒或管。例如，颗粒可以是微粒或纳米颗粒。此类示例性固相支持物可用于本文所述的任何固相富集方法。
[0061]
本发明的方面还涉及一种免疫颗粒，该免疫颗粒包括本文所述的抗体。例如，免疫颗粒可以包括与固相支持物(例如珠、柱、柱基质、多孔板、颗粒或管)缀合的抗体。例如，颗粒可以是微粒或纳米颗粒。例如，珠可以是玻璃珠、磁珠、琼脂糖珠、琼脂糖凝胶(sepharose)珠、二氧化硅珠、玻璃珠或塑料珠。
[0062]
在另一方面，本发明提供了通过使样品与本文所述的单克隆抗体接触来检测样品中存在cfp-10或其片段，并且检测存在或不存在抗体-抗原复合物，从而检测样品中存在cfp-10的的方法。
[0063]
在另一方面，本发明提供了检测存在属于结核分枝杆菌复合群的细菌的方法，该结核分枝杆菌复合群是一组可以引起结核病的相关分枝杆菌属。例如，本发明提供了检测存在结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、非洲分枝杆菌(m.africanum)、牛分枝杆菌(m.bovis)、卡内蒂分枝杆菌(m.canetti)、山羊分枝杆菌(m.caprae)、田鼠分枝杆菌(m.microti)、带状猫鼬分枝杆菌(m.mungi)、羚羊分枝杆菌(m.orygis)、海豹分枝杆菌(m.pinnipedii)或猫鼬分枝杆菌(m.suricattae)的方法。例如，该方法可以包括使样品与本文所述的抗体或免疫颗粒接触并且检测存在或不存在抗体-抗原复合物，从而检测样品中存在属于结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌属，例如结核分枝杆菌。
[0064]
此外，本发明的一方面还涉及一种诊断受试者分枝杆菌感染的方法。例如，本发明提供了诊断感染结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、山羊分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、带状猫鼬分枝杆菌、羚羊分枝杆菌、海豹分枝杆菌或猫鼬分枝杆菌的受试者的方法。在实施方案中，该方法可以包括从受试者获得样品；使该样品与本文所述的抗体或免疫颗粒接触；以及检测存在或不存在抗体-抗原复合物，其中存在抗体-抗原复合物指示分枝杆菌感染。
[0065]
此外，本发明的一方面涉及一种监测受试者分枝杆菌感染的方法。例如，本发明提供了监测感染结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、山羊分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、带状猫鼬分枝杆菌、羚羊分枝杆菌、海豹分枝杆菌或猫鼬分枝杆菌的受试者的方法。在实施方案中，该方法可以包括从受试者获得样品；使样品与本文所述的抗体或免疫颗粒接触；以及检测存在或不存在抗体-抗原复合物，从而监测该受试者的感染。
[0066]
在实施方案中样品可以是全血、淋巴液、血清、血浆、尿液、唾液、痰、呼吸提取物(意指捕获在溶液中的呼出空气)、骨髓、抽吸物(鼻抽吸物、肺抽吸物、支气管抽吸物、气管抽吸物)、眼液(例如，眼内液)、羊水、粪便、其他体液和分泌物、细胞和组织标本以及它们的稀释物。在实施方案中，样品不是痰。
[0067]
在实施方案中，样品是食物样品或待由受试者食用的样品。
[0068]
在实施方案中，结核分枝杆菌包括肺结核或肺外结核。
[0069]
在实施方案中，受试者是成人受试者。在实施方案中，受试者是儿科受试者。在实施方案中，受试者呈hiv阳性。
[0070]
此外，本发明的方面涉及一种试剂盒，该试剂盒包括本文所述的抗体或免疫颗粒。
[0071]
在实施方案中，试剂盒可以还包括固相支持物、一种或多种消化化合物、洗涤缓冲液、移液器吸头、分装管、分装支架、样品识别标签、装置标签、磁体和使用说明。
[0072]
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的
方法和材料的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其全文并入本文。在存在冲突的情况下，将由说明书(包括定义)限定。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。
[0073]
本发明的其他特征和优点将通过以下具体实施方式和权利要求变得显而易见并且被涵盖其中。
附图说明
[0074]
图1显示了对cfp-10蛋白的反应性的间接elisa(100μl)。
[0075]
图2显示了对1593肽的反应性的间接elisa(100μl)。
[0076]
图3显示了对低浓度抗原的反应性的间接elisa(100μl)。
[0077]
图4显示了对1593肽的反应性的间接elisa(100μl)。
[0078]
图5显示了对1593肽的反应性的间接elisa(100μl)
[0079]
图6显示了对1593肽的反应性的间接elisa(100μl)。
[0080]
图7显示了对1593肽的反应性的竞争性间接elisa(n＝3)。
[0081]
图8显示了65d3抗体和肽1593结合的biacore
tm
分析。
[0082]
图9显示了对cfp-10蛋白的反应性的间接elisa(100μl)。
[0083]
图10显示了对1593肽的反应性的间接elisa(100μl)。
[0084]
图11显示了对1593肽的反应性的间接elisa(100μl)。
[0085]
图12显示了17e4-1的v(d)j连接的imgt分析。
[0086]
图13显示了21h3-1的v(d)j连接的imgt分析。
[0087]
图14显示了119c10-1的v(d)j连接的imgt分析。
[0088]
图15显示了65d3-1的v(d)j连接的imgt分析。
[0089]
图16显示了结核分枝杆菌复合菌属的cfp-10蛋白序列比对。
[0090]
图17显示了elisa数据，比较使用在重(h)或轻(l)链中的指定位置包含单个氨基酸取代的65d3-1抗体检测到的信号相比于由比较wt 65d3-1抗体孔产生的信号。
[0091]
图18显示了mab 65d3-1及其靶向突变体和mab 67g8-2的重链和轻链的信号肽、框架区(fr)和互补决定区(cdr)的蛋白序列比对。红色(斜体)和蓝色(下划线)文本表示每个比对中的fr和cdr序列。绿色突出显示的文本(粗体)表示引入野生型(wt)mab 65d3-1序列的靶向突变，以生成在65d3-1重链或轻链的第二个cdr中在一个(v1)或两个(v2)位置包含氨基酸取代的变体重(h)和轻(l)链。灰色突出显示的文本表示在第一mab筛选程序中分离的65d3-1和在第二mab筛选尝试中分离的67g8-2之间的氨基酸变异。
[0092]
图19显示了mab 65d3-1及其指示的靶向突变组合和mab 67g8-2的biacore
tm 8k数据。
[0093]
图20显示了用于分析mab 65d3-1及其靶向突变体和mab 67g8-2的biacore
tm 8k测定参数。
[0094]
图21显示了被发现以高亲和力识别靶标1593肽的杂交瘤克隆的重链(h)和轻链(l)的信号肽、框架区(fr)和互补决定区(cdr)的蛋白序列比对。红色(斜体)和蓝色(下划线)文本表示每个比对中的fr和cdr序列。灰色突出显示的文本表示与指定位置的共有序列不同的氨基酸，或者如果在突出显示的位置不存在共有序列，则表示可变区。粗体mab标识
符表示在两次mab分离尝试中检测到的具有最高亲和力的克隆。根据lc-ms/ms分析，五组mab克隆从最高亲和力到最低亲和力排序，由它们在胰蛋白酶消化后通过免疫沉淀从加标cfp-10的血清样品中回收靶肽的相对能力确定。
[0095]
图22显示了1593靶肽在用等量的所示mab进行免疫沉淀后的相对lc-ms/ms质谱信号分析。“文库”列表示1593的所示y离子的预期贡献，如它们各自的颜色所示。每列上方的点积(dotp)值表示在胰蛋白酶消化的血清样品的免疫沉淀过程中，从每个mab捕获的肽中检测到的靶离子与文库衍生的靶肽离子的相似性。
[0096]
图23显示了orycun igh和igl等位基因的候选分配，包括通过v(d)j连接的imgt分析确定的所示1593mab克隆的v
lcl
和vhc1区的vdj和vj区。当存在于多于一个mab中时，等位基因垂直排列。对于几个克隆，识别多于一个候选等位基因。
[0097]
图24显示了被发现以高亲和力识别靶标2004肽的杂交瘤克隆的重链(h)和轻链(l)的信号肽、框架区(fr)和互补决定区(cdr)的蛋白序列比对。红色和蓝色文本表示每个比对中的fr和cdr序列。灰色突出显示的文本表示与指定位置的共有序列不同的氨基酸，或者如果在突出显示的位置不存在共有序列，则表示可变区。所有mab克隆按其在间接elisa中检测2004靶肽的系列稀释液的能力分析后产生的信号从最高亲和力到最低亲和力排序进行分组。
[0098]
图25显示了与用2004靶肽的四倍系列稀释液(样品1-7：10,000、2,500、625、156、39、10或2.5pg)或在存在恒定量mab的情况下使用pbs(样品8)预温育的孔温育的样品孔的相对间接elisa信号。克隆按其在该稀释系列中的相对信号进行排序，如图标签旁边的红色文本所示。
[0099]
图26显示了orycun igh和igl等位基因的候选分配，包括通过v(d)j连接的imgt分析确定的所示2004mab克隆的v
lcl
和vhc1区的vdj和vj区。当存在于多于一个mab中时，等位基因垂直排列。
[0100]
图27显示了嵌合fab结合活性。
[0101]
图28显示了nnk文库elisa筛选结果。嵌合体标记为黄色；阴性对照标记为绿色；空白标记为蓝色。
[0102]
图29显示了纯化igg的sds-page结果。
[0103]
图30了显示抗体对肽1593的亲和力测量
[0104]
图31显示了组合诱变文库的菌落pcr结果。使用引物m13r-48和m13f-47通过pcr扩增95个随机挑取的文库克隆。具有～2400bp dna条带的克隆具有fab插入片段。
[0105]
图32显示了r1-r4的单克隆噬菌体elisa验证。阴性对照标记为绿色；空白标记为蓝色；od》0.5的克隆标记为红色。
[0106]
图33显示了r3-r6的单克隆抗体可溶性表达elisa验证。嵌合体标记为黄色；阴性对照标记为绿色；空白标记为蓝色；每块板的前10个克隆标记为红色。
[0107]
图34显示了22个命中的突变。
具体实施方式
[0108]
结核分枝杆菌主动分泌cfp-10(培养滤液抗原，10kda)以促进病理反应。该因子缺失显著降低毒力，这强烈表明cfp-10对毒性分枝杆菌具有特异性，因此是活动性tb病例的
理想诊断方法。本发明的方面提供了与cfp-10内的表位结合的抗体，以及利用该抗体检测cfp-10并诊断、预测或监测感染结核分枝杆菌的受试者的方法。很少有研究采用单克隆抗体来检测临床样品中的结核分枝杆菌蛋白用于tb直接诊断，并且这些表明相比于现有tb测定具有较差性能。参见，例如，feng,t.t.等人，“针对esat-6和cfp-10抗原的新型单克隆抗体用于基于elisa的胸膜结核诊断。”国际结核病和肺病杂志15.6(2011):804-810(feng,t.t.,et al."novel monoclonal antibodies to esat-6and cfp-10antigens for elisa-based diagnosis of pleural tuberculosis."the international journal of tuberculosis and lung disease 15.6(2011):804-810)，和wu,xiaoxin等人，“用于快速检测结核分枝杆菌早期分泌蛋白esat-6和培养滤液蛋白cfp-10的免疫层析条的制备。”医学96.51(2017)(wu,xiaoxin,et al."preparation of immunochromatographic strips for rapid detection of early secreted protein esat-6and culture filtrate protein cfp-10from mycobacterium tuberculosis."medicine 96.51(2017))。目前基于血液的tb诊断方法而非评价患者免疫细胞对重组结核分枝杆菌蛋白(包括cfp-10)的应答，作为tb暴露的衡量标准。参见，例如，lalvani，ajit和hilary s.whitworth.“干扰素-γ释放测定开发和应用的进展：转化研究的展现故事。”转化医学年鉴7.增刊3(2019)(lalvani,ajit,and hilary s.whitworth."progress in interferon-gamma release assay development and applications:an unfolding story of translational research."annals of translational medicine 7.suppl 3(2019))。
[0109]
抗体
[0110]
如本文所用，术语“抗体”可以指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫学活性部分，即包含特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。例如，“特异性结合”或“与其免疫反应”可以指抗体与抗原的一种或多种抗原决定簇反应并且不与其他多肽反应。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体
[0111]
通常，从人获得的抗体分子涉及任何类别的igg、igm、iga、ige和igd，它们因分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些类别还具有亚类，例如igg1、igg2、igg3、igg4。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子部分。抗原结合位点由重链(“h”)和轻链(“l”)的n-末端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的v区内的三个高度差异区段，称为“高变区”，插入在称为“框架区”或“fr”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“fr”是指天然存在于免疫球蛋白的高变区之间和相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对布置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链各自的三个高变区称为“互补决定区”或“cdr”。
[0112]
本文提供了抗cfp-10抗体的核酸和氨基酸序列：
[0113]
[0114][0115][0116]
[0117][0118]
[0119][0120]
[0121][0122]
[0123][0124][0125]
[0126][0127][0128]
[0129][0130][0131][0132]
[0133][0134]
[0135][0136][0137]
[0138][0139][0140]
[0141][0142][0143]
[0144][0145][0146][0147]
[0148][0149][0150]
cfp-10蛋白或其衍生物、片段、类似物、同源物或直系同源物可以在产生免疫特异性结合这些蛋白组分的抗体中用作免疫原。如本文所述，用于产生针对cfp-10的抗体的免疫原包括肽1593(tdaatlaqeagnferc；seq id no:[]；其也可称为肽1593.75或1594)和肽2004(tqidqvestagslqgqwrc；seq id no[])。靶肽，不包括由粗体和下划线表示的c-末端接头半胱氨酸，匹配cfp-10内的序列。具体地，肽1593匹配氨基酸6至20，并且肽2004匹配氨基酸27至44。肽免疫原的使用用于解决与使用天然cfp-10蛋白开发的抗体用于检测临床样品中的cfp-10相关的几个关键问题。首先，全长cfp-10表现出与相关分枝杆菌分泌的蛋白同源物具有显著同源性，其中许多还引起呼吸道感染，其表现出与活动性结核分枝杆菌感染相似的症状。然而，衍生自这些cfp-10蛋白的肽可能包含独特的氨基序列，这些独特的氨基酸序列实现特异性识别其来源种属。这些序列不一定需要展示为天然cfp-10蛋白上的可接近表位，并且当使用天然cfp-10蛋白作为免疫原时，识别这些线性表位的抗体不一定需要以可观的水平产生。其次，即使这些表位以可接近的方式展示在天然cfp-10的表面上，这些序列也可能通过与特定宿主抗体的相互作用或与其他宿主蛋白的相互作用而在临床样品中被阻断。不希望受理论束缚，当消化诊断样品以释放靶肽时，这些混杂效应被消除。因此，使用肽特异性抗体识别由特异性消化诊断样品产生的靶肽，具有协同效应以增加对靶生物标志物的检测灵敏度和特异性。
[0151]
本领域技术人员将认识到，可以通过确定单克隆抗体是否阻止本发明的单克隆抗体与cfp-10蛋白或其片段结合来确定前者是否具有与后者相同的特异性而无需过度实验。不希望受理论束缚，如果待测单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如本发明的单克隆
抗体的结合降低所示，那么这两种单克隆抗体可以与相同或密切相关的表位结合。竞争测定为本领域技术人员所熟知。
[0152]
另一种确定单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体特异性的方法是将本发明的单克隆抗体与通常与其反应的cfp-10多肽预温育，然后加入待测单克隆抗体以确定待测单克隆抗体与cfp-10结合的能力是否被抑制。如果待测单克隆抗体被抑制，则它具有与本发明的单克隆抗体相同或功能等同的表位特异性。
[0153]
如本文所用，术语“表位”可以包括可特异性结合免疫球蛋白、单链可变片段(scfv)或t细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇可以由分子的化学活性表面分组组成，例如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。例如，可以产生针对多肽的n-末端或c-末端肽的抗体。
[0154]
不希望受理论束缚，本文所述的抗体和片段结合不同的表位。如本文所述，肽在抗体产生中用作免疫原，因此表位可以在其中包括线性氨基酸序列。在实施方案中，线性氨基酸序列的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个氨基酸。在一些实施方案中，线性氨基酸序列的长度可以为11、12、13、14、15或20个氨基酸。在实施方案中，线性氨基酸序列的长度为5或6个氨基酸。在实施方案中，本文所述的抗体可以结合肽免疫原的相同或重叠区段。在其他实施方案中，本文所述的抗体可以结合不同的、不重叠的肽序列。
[0155]
如果两个或多个抗体与肽免疫原的相同或重叠区段结合，则可以认为它们相互竞争与肽免疫原的结合。当提到一对抗体时，术语“竞争”可以指在使用例如重组免疫原或细胞表面表达的免疫原的结合测定中可检测地与第二抗体(或其他分子)竞争的第一抗体。例如，如果第二抗体与与第一抗体结合的表位重叠的表位结合，则第一抗体可以阻断或减弱第二抗体的结合。此外，如果第二抗体的表位与第一抗体结合的表位直接相邻，则第一抗体可以通过空间排斥或空间效应阻断或减弱第二抗体的结合。
[0156]
如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”可以指发生在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(kd)表示，其中kd越小代表亲和力越大。可以使用本领域熟知的方法来定量所选多肽的免疫结合特性。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(k
on
)和“解离速率常数”(k
off
)均可以通过计算浓度以及实际结合和解离速率来确定。(参见自然361:186-87(1993)(nature 361:186-87(1993))。k
off
/k
on
比使得取消与亲和力无关的参数，并且等于解离常数kd。(通常参见davies等人(1990)生物化学年鉴59:439-473(davies et al.(1990)annual rev biochem 59:439-473))。如通过测定例如放射性配体结合测定或本领域技术人员已知的类似测定所测量的，当平衡结合常数(kd)为≤1μm、≤100nm、≤10nm或≤100pm至约1pm时，本发明的抗体被认为特异性结合cfp-10表位。
[0157]
如本文所述的单克隆抗体可以经历亲和力成熟，例如，以增加免疫结合的强度或亲和力。“亲和力成熟”可以指抗体从参考抗体(也称为亲本抗体)进化的过程，例如通过一个或多个氨基酸残基突变，以对靶抗原的活性比相应形式的参考抗体对相同靶抗原的活性更高。因此，与参考或模板抗体相比，进化的抗体经优化。
[0158]
提及亲和力成熟的抗体可以指相对于参考抗体对靶抗原具有增加的活性的抗体。
例如，与参考或亲本抗体相比，亲和力成熟的抗体可以表现出与靶抗原的结合增加。亲和力成熟的抗体可以与参考抗体结合相同的表位。
[0159]
优化的抗体可以指与参考抗体相比对靶蛋白或抗原具有提高的活性的抗体或其部分，例如提高的对靶蛋白的结合亲和力和/或提高的功能活性。与不含一种或多种氨基酸修饰的亲本抗体相比，可以通过一种或多种氨基酸修饰(氨基酸缺失、置换或插入)来优化抗体。与亲本抗体(例如不包含修饰的种系抗体)的活性相比，活性(例如结合亲和力)可以增加为或约1.5倍至1000倍，例如至少或约2倍至100倍，例如为或约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多。
[0160]
本领域已知的各种方法可用于产生针对本发明的蛋白或针对其衍生物、片段、类似物同源物或直系同源物的多克隆抗体或单克隆抗体。(参见，例如，抗体：实验室手册，harlow e和lane d，1988，冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，纽约(antibodies:a laboratory manual,harlow e,and lane d,1988,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny)，其通过引用并入本文)。
[0161]
可以通过熟知的技术纯化抗体，例如使用蛋白a或蛋白g的亲和层析，其主要提供免疫血清的igg级分。随后，或可选地，可以将作为所探索的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和层析纯化免疫特异性抗体。例如，d.wilkinson(科学家，由科学家公司出版，宾夕法尼亚州费城，第14卷，第8号(2000年4月17日)，第25-28页)(d.wilkinson(the scientist,published by the scientist,inc.,philadelphia pa,vol.14,no.8(april 17,2000),pp.25-28))讨论了免疫球蛋白的纯化。
[0162]
本文所述的抗体可以通过适当的测定(例如，常规类型的免疫测定)进行检测。例如，可以进行将cfp-10或其片段固定至固相的测定。保持温育足够长的时间以使样品中的抗体与固相上的固定多肽结合。在该首次温育之后，将固相从样品分离。洗涤固相以去除未结合的物质和干扰物质，例如也可能存在于样品中的非特异性蛋白。随后将含有与固定多肽结合的目标抗体的固相与第二标记抗体或与偶联剂(例如生物素或抗生物素蛋白)结合的抗体一起温育。该第二抗体可以是另一种抗cfp-10抗体或另一种抗体。抗体的标记是本领域熟知的并且包括放射性核素、酶(例如马来酸脱氢酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶)、荧光素(异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻蓝蛋白、fluorescarmine)、生物素等。标记的抗体与固体一起温育，并测量与固相结合的标记。本领域普通技术人员可以容易地进行这些和其他免疫测定。
[0163]
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mab”或“单克隆抗体组合物”可以指抗体分子群，其仅包含一种抗体分子的分子种类，其由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。例如，单克隆抗体的互补决定区(cdr)在群体分子中相同。mab包含可以与抗原的表位发生免疫反应的抗原结合位点，该抗原的表位的特点在于对其具有独特的结合亲和力。
[0164]
可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，例如由kohler和milstein，自然，256:495(1975)(kohler and milstein,nature,256:495(1975))描述的那些方法。在杂交瘤方法中，可以用免疫剂对小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物进行免疫以引发可以产生特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。可选地，淋巴细胞可以进行体外免疫。
[0165]
免疫剂可以包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。例如，如果本文所述的用途需要
人来源的细胞，则可以使用外周血淋巴细胞，或者如果本文所述的用途需要非人哺乳动物来源，则可以使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(goding，单克隆抗体：原理与实践，学术出版社，(1986)第59-103页(goding,monoclonal antibodies: principles and practice,academic press,(1986)pp.59-103))。永生化细胞系可以转化为哺乳动物细胞，例如啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。例如，可以采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，该培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt或hprt)，则杂交瘤的培养基可以包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“hat培养基”)，这些物质可以防止hgprt缺陷细胞生长。
[0166]
永生化细胞系可以是那些有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定地高水平表达抗体并且对培养基(hat培养基)敏感的细胞系。永生化细胞系可以是鼠骨髓瘤系，其可以获自，例如，加利福尼亚州圣地亚哥的salk研究所细胞分布中心和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心。人骨髓瘤和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体。(参见kozbor，免疫学杂志，133:3001(1984)(kozbor,j.immunol.,133:3001(1984))；brodeur等人，单克隆抗体产生技术及应用，marcel dekker公司，纽约，(1987)第51-63页(brodeur et al.,monoclonal antibody production techniques and applications,marcel dekker,inc.,new york,(1987)pp.51-63))。
[0167]
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中存在针对抗原的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外结合测定(例如放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))确定。这样的技术和测定是本领域已知的。
[0168]“亲和力”或“结合亲和力”可以指抗体分子或其部分与靶蛋白或抗原上的表位结合的强度。亲和力可以通过平衡结合常数(ka)或平衡解离常数(kd)进行测量。低亲和力的抗体-抗原相互作用弱，并且分子倾向于快速分离，而高亲和力的抗体-抗原结合力强，并且分子在较长时间内保持结合状态。例如，抗体对靶蛋白的亲和力(以平衡结合常数(ka)表示)为约106m-1
或更大、约107m-1
或更大、约108m-1
或更大，或约109m-1
、10
10
m-1
、10
11
m-1
或10
12
m-1
。此外，抗体可具有约10-4
m至10-5
m、约10-5
m至10-6
m、约10-6
m至10-7
m、约10-7
m至10-8
m、约10-8
m、约10-9
m、约10-10
m、约10-11
m、约10-12
m或约10-13
m或约大于10-13
m的平衡解离常数(kd)。还可以表征低解离常数。不希望受理论束缚，低解离常数可以是抗体的特征在于更高的结合亲和力。例如，解离常数为nm或nm或更小的抗体被认为是高亲和力抗体。这种亲和力是本领域已知的并且可以，例如，通过平衡透析来确定；根据生产商概述的一般程序，使用biacore仪器通过表面等离子共振(spr)；使用放射性标记的靶抗原进行放射免疫测定；或通过本领域技术人员已知的其他方法。亲和力数据，例如，在scatchard等人，美国纽约科学院年刊，可以使用scl的方法进行分析,51:660(1949)(scatchard et al.,ann n.y.acad.analysis can be performed using the method of scl,51:660(1949))中进行描述。此外，单克隆抗体的结合亲和力可以，例如，通过munson和pollard，分析生物化学，107:220(1980)(munson and pollard,anal.biochem.,107:220(1980))的scatchard分析进行确定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是识别对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体。
[0169]
识别杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法
生长。(参见goding，单克隆抗体：原理与实践，学术出版社，(1986)第59-103页(goding,monoclonal antibodies:principles and practice,academic press,(1986)pp.59-103))。用于此目的的合适培养基包括，例如，dulbecco改良的eagle培养基和rpmi-1640培养基。可选地，杂交瘤细胞可以作为哺乳动物的腹水在体内生长。
[0170]
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如，蛋白a-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从培养基或腹水中分离或纯化。
[0171]
单克隆抗体还可以通过重组dna方法(例如美国专利号4,816,567中描述的那些方法)进行制备。编码本发明的单克隆抗体的dna可以使用常规程序(例如，通过使用可以特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。本发明的杂交瘤细胞可以是这种dna的来源。一旦分离，可以将dna置于表达载体中，然后将其转染至宿主细胞，例如猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以对dna进行修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(参见美国专利号4,816,567；morrison，自然368,812-13(1994)(morrison,nature 368,812-13(1994)))或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本文所述抗体的恒定结构域或可以取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
[0172]
完全人抗体是其中轻链和重链的整个序列(包括cdr)来自人基因的抗体分子。这种抗体在本文中称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用trioma技术；人b细胞杂交瘤技术(参见kozbor等人，1983当代免疫4:72)(kozbor,et al.,1983immunol today 4:72))；和ebv杂交瘤技术(参见cole等人，1985见：单克隆抗体和癌症治疗，alan r.liss公司，第77-96页(cole,et al.,1985in:monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,inc.,pp.77-96))进行制备以产生人单克隆抗体。可以使用人单克隆抗体，并且可以通过使用人杂交瘤(参见cote等人，1983.美国科学院院刊80:2026-2030(cote,et al.,1983.proc natl acad sci usa80:2026-2030))或通过在体外用epstein barr病毒转化人b细胞(参见cole等人，1985见：单克隆抗体和癌症治疗，alan r.liss公司，第77-96页(cole,et al.,1985in:monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,inc.,pp.77-96))产生。
[0173]“人源化抗体”可以是来自非人物种(例如小鼠)的抗体，其氨基酸序列(例如，在cdr区中)已经修饰以增加它们与人天然产生的抗体变体的相似性。抗体可以通过本领域已知的方法(例如cdr移植)进行人源化。另见，safdari等人(2013)生物技术与基因工程评论；29:175-86(safdari et al.,(2013)biotechnol genet eng rev.；29:175-86)。此外，人源化抗体可以在转基因植物中产生，作为现有哺乳动物系统的低成本产生替代品。例如，转基因植物可以是烟草植物，即本氏烟草(nicotiania benthamiana)和普通烟草(nicotiana tabaccum)。抗体从植物叶中纯化。植物的稳定转化可以通过使用根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)或粒子轰击来实现。例如，至少含有重链和轻链序列的核酸表达载体通过转化在细菌培养物(即根癌农杆菌菌株bla4404)中表达。植物的渗透可以通过注射来完成。可溶性叶提取物可以通过在研钵中研磨叶组织并通过离心进行制备。可以通过本领域技术人员已知的许多方法容易地进行抗体的分离和纯化。在植物中产生抗体的
其他方法描述于，例如，fischer等人，疫苗，2003,21:820-5(fischer et al.,vaccine,2003,21:820-5)；和ko等人，微生物学和免疫学当前主题，第332卷，2009，第55-78页(ko et al,current topics in microbiology and immunology,vol.332,2009,pp.55-78)。因此，本发明还提供了包括编码本文所述的抗体或产生本发明的抗体的载体的任何细胞或植物。
[0174]
此外，人抗体还可以使用其他技术(包括噬菌体展示文库)产生。(参见hoogenboom和winter，分子生物学杂志，227:381(1991)；marks等人，分子生物学杂志，222:581(1991)(hoogenboom and winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks et al.,j.mol.biol.,222:581(1991)))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。激发后，观察到人抗体产生，这与在人体中见到的非常相似，包括基因重排、组装和抗体库。该方法描述于，例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及marks等人，生物技术10,779-783(1992)(marks et al.,bio/technology 10,779-783(1992))；lonberg等人，自然368 856-859(1994)(lonberg et al.,nature 368 856-859(1994))；morrison，自然368,812-13(1994)(morrison,nature 368,812-13(1994))；fishwild等人，自然生物技术14,845-51(1996)(fishwild et al,nature biotechnology 14,845-51(1996))；neuberger，自然生物技术14,826(1996)(neuberger,nature biotechnology 14,826(1996))；和lonberg和huszar，国际免疫学评论13 65-93(1995)(lonberg and huszar,intern.rev.immunol.13 65-93(1995))。
[0175]
人抗体可以另外使用转基因非人动物产生，该动物经修饰以产生完全人抗体，而不是响应抗原激发的动物的内源性抗体。(参见pct公开wo94/02602)。非人宿主中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因已经失去功能，并且编码人免疫球蛋白重链和轻链的活性基因座被插入宿主基因组。例如，使用包含必需的人dna区段的酵母人工染色体掺入人基因。然后，通过杂交包含少于修饰的全部补体的中间转基因动物获得提供修饰的动物作为后代。这种非人动物的实施方案可以是小鼠，并且如pct公开wo 96/33735和wo 96/34096中所公开的被称为xenomouse
tm
。这种动物产生的b细胞可分泌完全人免疫球蛋白。抗体可以在用目标免疫原免疫后直接从动物获得，例如，多克隆抗体的制备物，或可选地从动物衍生的永生化b细胞获得，例如产生单克隆抗体的杂交瘤。此外，可以回收和表达编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因以直接获得抗体，或可以进一步修饰以获得抗体的类似物，例如单链fv(scfv)分子。
[0176]
美国专利号5,939,598中公开了产生缺乏内源性免疫球蛋白重链表达的非人宿主(例如小鼠)的方法的实例。它可以通过以下方法获得，该方法包括从胚胎干细胞中的至少一个内源重链基因座使j区段基因缺失以防止基因座重排和防止重排免疫球蛋白重链基因座的转录物形成，通过包含编码选择标志物的基因的靶向载体实现缺失；并且从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包含编码选择标志物的基因。
[0177]
在美国专利号5,916,771中公开了一种用于产生目标抗体(例如人抗体)的方法。该方法包括将包含编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养中的一个哺乳动物宿主细胞中，将包含编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一个哺乳动物宿主细胞中，并将两个细胞融合以形成杂交细胞。杂交细胞表达包含重链和轻链的抗体。
[0178]
在该程序的进一步改进中，pct公开wo 99/53049中公开了用于识别免疫原上临床
相关表位的方法和用于选择以高亲和力免疫特异性结合相关表位的抗体的相关方法。
[0179]
抗体可以通过包含编码本文所述的单链抗体的dna区段的载体来表达。载体可以指可以携带外源基因并且可以在宿主细胞中呈现的系统。这些包括质粒载体、重组病毒载体、重组细菌载体、假病毒体、病毒样颗粒等。
[0180]
这些可以包括载体、脂质体、裸dna、佐剂辅助dna、基因枪、导管等。载体包括如wo 93/64701中所述的化学缀合物，其具有靶向部分(例如细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)、病毒载体(例如，dna或rna病毒载体)、融合蛋白(例如pct/us 95/02140(wo 95/22618)中描述的融合蛋白，其是包含靶部分(例如对靶细胞特异的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白)、质粒、噬菌体等。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。
[0181]“重组病毒载体”可以指能够携带基于重组病毒的外源基因的载体，例如，包括重组腺病毒载体、重组痘病毒载体、杆状病毒载体等。
[0182]“重组细菌载体”可以指能够携带基于重组细菌(例如包括李斯特菌载体、减毒沙门氏菌载体等)构建的外来基因的载体。
[0183]
载体可以包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。可以使用dna病毒载体。这些载体包括痘载体(例如正痘或禽痘载体)、疱疹病毒载体(例如单纯疱疹病毒(hsv)载体)(参见geller,a.i.等人，神经化学杂志，64:487(1995)(geller,a.i.et al.,j.neurochem,64:487(1995))；lim,f.等人，见dna克隆：哺乳动物系统，d.glover编辑(牛津大学出版社，英国牛津)(1995)(lim,f.,et al.,in dna cloning:mammalian systems,d.glover,ed.(oxford univ.press,oxford england)(1995))；geller,a.i.等人，美国科学院院刊90:7603(1993)(geller,a.i.et al.,proc natl.acad.sci.:u.s.a.90:7603(1993))；geller,a.i.等人，美国科学院院刊87:1149(1990)(geller,a.i.,et al.,proc natl.acad.sci usa 87:1149(1990)))、腺病毒载体(参见legal lasalle等人，科学，259:988(1993)(legal lasalle et al.,science,259:988(1993))；davidson等人，自然遗传学3:219(1993)(davidson,et al.,nat.genet 3:219(1993))；yang等人，病毒学杂志69:2004(1995)(yang,et al.,j.virol.69:2004(1995)))和腺相关病毒载体(参见kaplitt,m.g.等人，自然遗传学8:148(1994)(kaplitt,m.g.et al.,nat.genet.8:148(1994)))。
[0184]
痘病毒载体将基因引入细胞的细胞质中。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(hsv)载体可用于将核酸引入神经细胞。与腺相关病毒(约4个月)相比，腺病毒载体的表达时间更短(约2个月)，而腺相关病毒的表达时间又比hsv载体更短。选择的载体将取决于靶细胞。引入可以通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如裸dna、capo4沉淀、deae葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞显微注射和病毒载体。
[0185]
该载体可用于基本上靶向任何靶细胞。例如，立体定向注射可用于将载体(例如腺病毒、hsv)引导至本文所述的用途所需的位置。此外，可以使用微型泵输注系统，例如synchromed输注系统，通过脑室内(icv)输注来递送颗粒。一种基于整体流动(称为对流)的方法也已被证明可有效地将大分子递送至大脑的扩展区域，并可用于将载体递送至靶细胞。(参见bobo等人，美国科学院院刊91:2076-2080(1994)(bobo et al.,
proc.natl.acad.sci.usa 91:2076-2080(1994))；morrison等人，美国生理学杂志266:292-305(1994)(morrison et al.,am.j.physiol.266:292-305(1994)))。
[0186]
这些载体可用于表达可用于多种方式的大量抗体。例如，用于检测样品中存在cfp1-。该抗体还可用于尝试结合和破坏cfp-10的功能。
[0187]
在实施方案中，本发明的抗体是全长抗体，包含与结合fc受体的野生型fc区相似的fc区。
[0188]
异源缀合抗体也在本发明的范围内。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。可以使用合成蛋白化学中的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸酯以及例如在美国专利号4,676,980中公开的那些。
[0189]
在一些实施方案中，本文所述的抗体可以在效应子功能方面进行修饰，以增强例如抗体在中和或预防分枝杆菌感染中的有效性。例如，可以将半胱氨酸残基引入fc区，从而使得在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同源二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(adcc)。(参见caron等人，实验医学杂志，176:1191-1195(1992)(caron et al.,j.exp med.,176:1191-1195(1992))和shopes，免疫学杂志，148:2918-2922(1992)(shopes,j.immunol.,148:2918-2922(1992)))。可选地，可以设计具有双fc区的抗体，从而可以增强补体裂解和adcc能力。(参见stevenson等人，抗癌药物设计，3:219-230(1989)(stevenson et al.,anti-cancer drug design,3:219-230(1989)))。在实施方案中，本发明的抗体具有对fc区的修饰，使得fc区不与fc受体结合。在实施方案中，fc受体是fcγ受体。在实施方案中，抗体具有对fc区的修饰，使得fc区不与fcγ结合，但仍与新生儿fc受体结合。
[0190]
本发明还涉及包括与细胞毒剂例如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)缀合的抗体的免疫缀合物。免疫缀合物还可以包括与标记缀合的抗体。在一些实施方案中，标记包括色原。列出的每个色原均与相应的酶发生反应，以产生报告存在免疫缀合物的信号。上标符号(*)表示色原发出荧光，而不是产生颜色变化。本文列出了色原及其相应酶的非限制性实例。
[0191][0192]
在一些实施方案中，标记包括结合部分(例如，生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉抗生物素蛋白或糖-凝集素、myc标签、his标签等)。在一些实施方案中，标记包括有色染料化合物，例如荧光染料。荧光染料化合物的非限制性实例包括荧光素、溴化乙锭、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白(rpe)和花青。在一些实施方案中，标记包括荧光化合物(例如，gfp、rfp、yfp、bfp等)。在一些实施方案中，标记由纳米颗粒组成，其中颗粒的尺寸、组成和几何形状可以确定纳米颗粒的吸收和发射特性，其可以通过与可以经历其他相互作用(例如等离子体共振)的具有重叠发射和吸收光谱的其他颗粒相互作用而改变。在一些实施方案中，标记包括化学发光化合物(例如，n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺、4-氨基苯二甲酰肼、2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5-氯三环[3.3.1.13.7]癸])-4-基]-1-苯基磷酸二钠)。在一些实施方案中，标记包括酶化合物(例如，β-d-半乳糖苷酶或过氧化物酶)。
[0193]
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒
素a链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。多种放射性核素可用于产生放射性缀合的抗体。实例包括
212
bi、
131
i、
131
in、
90
y和
186
re。
[0194]
抗体和细胞毒剂的缀合物使用多种双功能蛋白偶联剂制成，例如n-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(spdp)、亚氨基硫醇(it)、亚胺酯的双功能衍生物(例如己二酸二甲酯hcl)、活性酯类(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如vitetta等人，科学238:1098(1987)(vitetta et al.,science 238:1098(1987))中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。(参见wo94/11026)。
[0195]
本领域普通技术人员将认识到多种部分可以与本发明的所得抗体或其他分子偶联。(参见，例如，“缀合疫苗”，对微生物学和免疫学的贡献，j.m.cruse和r.e.lewis,jr(编辑)，carger出版社，纽约，(1989)("conjugate vaccines",contributions to microbiology and immunology,j.m.cruse and r.e.lewis,jr(eds),carger press,new york,(1989))，其全部内容通过引用并入本文)。
[0196]
例如，可以将抗体偶联(即物理连接)至可检测物质以检测cfp-10或其片段。可检测物质的非限制性实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性材料的实例包括
125
i、
131
i、
35
s或3h。
[0197]
只要抗体和其他部分保留它们各自的活性，偶联可以通过将结合两个分子的任何化学反应来完成。这种连接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。可以使用共价结合，并且例如，通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子来实现共价结合。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子(例如本发明的抗体)与其他分子偶联。例如，代表性偶联剂可以包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列表并非旨在穷尽本领域已知的各种类型的偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例。(参见killen和lindstrom，免疫学杂志133:1335-2549(1984)(killen and lindstrom,jour.immun.133:1335-2549(1984))；jansen等人，免疫学评论62:185-216(1982)(jansen et al.,immunological reviews 62:185-216(1982))；和vitetta等人，科学238:1098(1987)(vitetta et al.,science 238:1098(1987)))。接头在文献中描述。(参见，例如，ramakrishnan,s.等人，癌症研究44:201-208(1984)(ramakrishnan,s.et al.,cancer res.44:201-208(1984))，描述了mbs(m-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯的用途)。另见，美国专利号5,030,719，描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤代乙酰酰肼衍生物的用途。接头可以包括：(i)edc(1-乙基-3-(3-二
甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)smpt(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(pierce chem.co.，货号(21558g)；(iii)spdp(琥珀酰亚胺-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(pierce chem.co.，货号21651g)；(iv)磺基-lc-spdp(磺基琥珀酰亚胺6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯(pierce chem.co.货号2165-g)；(v)与edc缀合的磺基-nhs(n-羟基磺基-琥珀酰亚胺:pierce chem.co.，货号24510)。
[0198]
本文所述的接头包含具有不同属性的组分，从而产生具有不同物理化学性质的缀合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-nhs酯比芳族羧酸酯的磺基-nhs酯更稳定。包含nhs酯的接头比磺基-nhs酯的溶解度更低。此外，接头smpt包含空间位阻二硫键，并且可以形成稳定性更高的缀合物。二硫键通常比其他键更不稳定，因为二硫键在体外容易被破坏，导致可获得的缀合物更少。例如，磺基-nhs可以提高碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-nhs结合使用时，碳二亚胺偶联(例如edc)形成比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。
[0199]
本文公开的抗体也可以配制成免疫脂质体。包含抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如描述于epstein等人，美国科学院院刊，82:3688(1985)(epstein et al.,proc.natl.acad.sci.usa,82:3688(1985))；hwang等人，美国科学院院刊，77:4030(1980)(hwang et al.,proc.natl acad.sci.usa,77:4030(1980))；以及美国专利号4,485,045和4,544,545。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
[0200]
有用的脂质体可以通过反相蒸发法产生，脂质组合物包括磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)。脂质体通过限定孔径的过滤器被挤出以产生具有本文所述的用途所需直径的脂质体。本发明的抗体的fab'片段可以通过二硫化物交换反应与如martin等人，生物化学杂质，257:286-288(1982)(martin et al.,j.biol.chem.,257:286-288(1982))所述的脂质体缀合。
[0201]
抗cfp-10的抗体的用途
[0202]
针对cfp-10或其片段的抗体可用于本领域已知的与cfp-10或其片段的检测、定位和/或定量相关的方法中(例如，用于测量在合适的生理样品中cfp-10蛋白的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等)。在给定的实施方案中，包含抗体衍生的抗原结合结构域的cfp-10或其衍生物、片段、类似物或同源物的特异性抗体可用作活性化合物或抗原结合剂。
[0203]
cfp-10特异性抗体可用于通过标准技术(例如免疫亲和、层析或免疫沉淀)分离cfp-10多肽。针对cfp-10蛋白(或其片段)的抗体可用于诊断性监测生物样品(例如组织或体液)中的蛋白水平，作为临床检测程序的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的疗效或诊断给定疾病或感染。
[0204]
在其他实施方案中，针对cfp-10蛋白(或其片段)的抗体可用于检测将被受试者摄入的组合物中的分枝杆菌属(即出于食品安全目的)。在一些实施方案中，针对cfp-10蛋白(或其片段)的抗体可用于检测从动物收集的样品中的分枝杆菌属(例如，作为牲畜或野生动物管理工作或兽医护理的一部分)。例如，此类组合物可用于识别感染分枝杆菌的动物，从而饲养或猎杀这些动物以获取肉类或用于生产乳制品。
[0205]
在实施方案中，可以通过将抗体与可检测物质偶联(即物理连接)来促进检测。可检测物质的实例包括本文所述的那些。
[0206]
本发明的抗体(包括多克隆、单克隆、人源化和完全人抗体)可以用作诊断剂。此类试剂可用于诊断受试者的cfp-10相关疾病或病理学，例如分枝杆菌感染。
[0207]
本发明的抗体的有效量可以指达到目的所需的量，例如检测cfp-10蛋白或诊断分枝杆菌感染。如本文所述，这可能是由于抗体与其靶抗原之间的结合相互作用。所需的有效量还取决于抗体对其特定抗原的结合亲和力。
[0208]
根据本发明的抗体可以用作检测样品中存在cfp-10(或其蛋白或蛋白片段)的试剂。例如，抗体包含可检测的标记。抗体可以是多克隆或单克隆的。在实施方案中，抗体是完整抗体。关于探针或抗体，术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)来直接标记探针或抗体，以及通过与另一种直接标记的试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗和用生物素的dna探针末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。
[0209]
本发明的检测方法可用于在体外以及体内检测生物样品中的分析物。例如，用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(elisa)、western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。进行免疫测定的程序描述于，例如，“elisa：理论与实践：分子生物学方法”，第42卷，j.r.crowther(编辑)human出版社，托托瓦，新泽西州，1995(“elisa:theory and practice:methods in molecular biology”,vol.42,j.r.crowther(ed.)human press,totowa,nj,1995)；“免疫测定”，e.diamandis和t.christopoulus，学术出版社公司，圣地亚哥，加利福尼亚,1996(“immunoassay”,e.diamandis and t.christopoulus,academic press,inc.,san diego,ca,1996)；和“酶免疫测定的实践与理论”，p.tijssen，elsevier科学出版社，阿姆斯特丹，1985(“practice and theory of enzyme immunoassays”,p.tijssen,elsevier science publishers,amsterdam,1985)。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入受试者。例如，抗体可以用放射性标志物标记，其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
[0210]
筛选测定和方法
[0211]
本发明提供了用于识别治疗剂和/或预防剂，即可用于预防或治疗分枝杆菌感染的候选或测试化合物或试剂(例如，肽、肽模拟物、小分子或其他药物)的筛选测定和方法。本发明还涵盖使用本文所述的筛选测定识别的候选物和/或化合物。
[0212]
术语“筛选”可以指确定候选和/或测试化合物是否具有预防或减缓(减轻)本文所述的靶向病理状况(例如分枝杆菌感染，即结核分枝杆菌感染或其任何并发症)的能力或特征。在一些实施方案中，本文所述的肽抗体可用于免疫测定以评价特异性抑制cfp-10毒力因子的表达或分泌的方法。例如，该抗体可用于利用变性蛋白的测定(例如western印迹)。在其他实施方案中，本文所述的肽抗体可用于临床前研究以评价候选药物的疗效，因为它可以快速定量指示少量血液样品中疾病中活动性tb的毒力因子的水平。不希望受理论束缚，可以在人tb的大多数临床前动物模型(例如豚鼠、兔和非人灵长类动物)中在tb治疗期间连续分析cfp-10的水平。检查同一动物对治疗的纵向反应的能力可能非常有价值，但其他测试所需的用于此类分析的样品(例如，支气管肺泡灌洗液或组织活检)可能难以获得，并且无法以相同的频率收集作为血液样品。这种能力在旨在评价剂量效应和治疗间隔的研究中非常有用。
[0213]
本发明的候选和/或测试化合物可以使用本领域已知的组合文库方法中的众多方法中的任何一种来获得，包括：生物文库；空间可寻址平行固相或溶液相文库；需要反卷积的合成文库方法；“一株一化合物(one-bead-one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择
的合成文库方法。生物文库方法仅限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库。(参见，例如，lam,1997.抗癌药物设计12:145(lam,1997.anticancer drug design12:145))。
[0214]
如本文所用，“小分子”意指具有小于约5kda并且例如小于约4kda的分子量的组合物。小分子可以是，例如，核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或其他有机或无机分子。化学和/或生物混合物(例如真菌、细菌或藻类提取物)的文库是本领域已知的并且可以用本发明的任何测定进行筛选。
[0215]
用于合成分子文库的方法的实例可见于本领域，例如，见：dewitt等人，1993.美国国家科学院院刊90:6909(dewitt,et al.,1993.proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6909)；erb,et al.,1994.美国国家科学院院刊91:11422(erb,et al.,1994.proc.natl.acad.sci.u.s.a.91:11422)；zuckermann等人，1994.药物化学杂志37:2678(zuckermann,et al.,1994.j.med.chem.37:2678)；cho等人，1993.科学261:1303(cho,et al.,1993.science 261:1303)；carrell等人，1994.应用化学国际英文版33:2059(carrell,et al.,1994.angew.chem.int.ed.engl.33:2059)；carell等人，1994.应用化学国际英文版33:2061(carell,et al.,1994.angew.chem.int.ed.engl.33:2061)；和gallop等人，1994.药物化学杂志37:1233(gallop,et al.,1994.j.med.chem.37:1233)。
[0216]
化合物文库可以在溶液中(参见例如，houghten,1992.生物技术13:412-421(houghten,1992.biotechniques 13:412-421))、或珠上(参见lam,1991.自然354:82-84(lam,1991.nature 354:82-84))、芯片上(参见fodor,1993.自然364:555-556(fodor,1993.nature 364:555-556))、细菌(参见美国专利号5,223,409)、孢子(参见美国专利5,233,409)、质粒(参见cull等人，1992.美国国家科学院院刊89:1865-1869(cull,et al.,1992.proc.natl.acad.sci.usa 89:1865-1869))或噬菌体上(参见scott和smith，1990.科学249:386-390(scott and smith,1990.science 249:386-390)；devlin,1990.科学249:404-406(devlin,1990.science 249:404-406)；cwirla等人，1990.美国国家科学院院刊87:6378-6382(cwirla,et al.,1990.proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:6378-6382)；felici,1991.分子生物学杂志222:301-310(felici,1991.j.mol.biol.222:301-310)；和美国专利号5,233,409)提供。
[0217]
本领域技术人员将认识到，在本文公开的任何筛选方法中，抗体可以是cfp-10特异性抗体，例如单克隆抗体17e4-1、21h3-1、119c10-1或65d3-1或其任何变体。此外，抗原可以是cfp-10蛋白，或其部分或片段。
[0218]
本文公开的筛选方法可以作为基于细胞的测定或作为无细胞测定进行。本发明的无细胞测定适用于使用蛋白及其片段的可溶形式或膜结合形式。在包括蛋白的膜结合形式的无细胞测定的情况下，可能需要使用增溶剂使得蛋白的膜结合形式保持在溶液中。这种增溶剂的实例包括非离子去污剂，例如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-n-甲基葡糖酰胺、癸酰基-n-甲基葡糖酰胺、x-100、x-114、异十三烷基聚(乙二醇醚)n,n-十二烷基-n,n-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐、3-(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸盐(chaps)或3-(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基醇-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)。
[0219]
本发明还涉及通过任何上述筛选测定识别的新试剂及其用于如本文所述治疗的
用途。
[0220]
诊断测定和方法
[0221]
本发明的方面还涉及用于检测样品中存在或不存在cfp-10，从而诊断、预测或监测分枝杆菌属感染的诊断测定和方法。例如，本发明提供了检测样品中存在结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、山羊分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、带状猫鼬分枝杆菌、羚羊分枝杆菌、海豹分枝杆菌或猫鼬分枝杆菌的方法。
[0222]
术语“诊断”可以指确定存在或不存在疾病或病况，例如感染，例如分枝杆菌感染。此外，该术语可以指确定疾病或病况的水平或严重程度，以及监测疾病或病况以确定其对治疗方案的反应。
[0223]
术语“监测”可以指疾病的随时间观察。可以通过连续测量某些参数和/或通过重复进行医学检测来监测受试者的疾病状态。在本发明的一些实施方案中，通过重复从受试者获得样品、使用本文公开的方法测定样品并将测定结果与彼此和/或与参考值进行比较以识别受试者的疾病状态的任何变化来监测受试者的疾病状态。
[0224]
术语“预后”可以指评估疾病(例如分枝杆菌感染)的未来结局，或发生疾病的可能性。预后可以包括从疾病恢复的可能性的预测，或发展疾病的可能性的预测。
[0225]
术语“结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)”、“tb”、“mtb”、“结核分枝杆菌(m.tuberculosis)”和“致病性结核分枝杆菌”可以互换使用。术语结核分枝杆菌可以指分枝杆菌科中的致病性(例如毒性)菌属和结核病(tb)的病原体。本领域技术人员理解存在相同细菌的多个分离株并且存在多个结核分枝杆菌菌株(分离株)。可以使用本文所述的系统和方法检测结核分枝杆菌的各种分离株中的每一种。
[0226]
牛分枝杆菌是可导致人tb病的另一种分枝杆菌，并且也存在于牛和其他动物(例如野牛、麋鹿和鹿)中。人们可能通过食用或饮用受污染的、未经巴氏消毒的乳制品感染牛分枝杆菌。巴氏杀菌工艺通过快速加热然后冷却牛奶来破坏牛奶中的致病微生物，从而消除奶制品中的牛分枝杆菌。
[0227]
感染也可能因直接接触伤口而发生，例如在屠宰或狩猎期间发生的情况，或通过吸入感染牛分枝杆菌的动物呼出的空气中的细菌。通过空气从动物直接传播给人的情况很少见，但当肺部患有这种疾病的人咳嗽或打喷嚏时，牛分枝杆菌可以直接在人与人之间传播。
[0228]
非洲分枝杆菌是在西非国家发现的一种分枝杆菌，据估计其导致高达40％的肺结核。
[0229]
作为人和动物结核病的病原体的其他种属包括但不限于卡内蒂分枝杆菌、山羊分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、带状猫鼬分枝杆菌、羚羊分枝杆菌、海豹分枝杆菌或猫鼬分枝杆菌。本文所述的分枝杆菌属共同构成了结核分枝杆菌复合群(mtc或mtbc)，其是可在人和其他动物中引起结核病的一组遗传相关的分枝杆菌。
[0230]
术语“致病性”可以指可以在宿主中引起疾病的细菌。如果治疗不当，tb病可能是致命的。引起tb病的细菌可以攻击肺部，但也可以攻击身体的任何部位，例如肾脏、脊柱和大脑。根据疾病控制中心(cdc)，“肺外tb”是指除肺部以外的身体任何部位(例如肾脏、脊柱、大脑或淋巴结)的tb病。“肺tb”可以指发生在肺部的tb病，并且可以引起持续3周或更长时间的咳嗽。大多数tb病是肺部疾病。
[0231]“潜伏性”tb病感染发生在个体持续感染引起tb的分枝杆菌，但未发展为病原体复制和传播导致组织损伤的活动性tb病。在一些实施方案中，本文所述的诊断测定和方法可用于检测tb感染(例如在样品中存在或不存在cfp-10的情况下)，但感染不是潜伏性tb。
[0232]
一些方面涉及使用基于质谱的方法检测样品中存在或不存在cfp-10的方法。
[0233]
用于检测样品中存在或不存在cfp-10的方法的一个实施方案包括从受试者获得样品并将样品与根据本发明的单克隆抗体接触，从而检测样品中存在cfp-10。
[0234]
术语“检测”可以指识别样品中存在或不存在物质(例如，抗原，例如cfp-10)，定量样品中物质(例如，抗原，例如cfp-10)的量，限定物质的类型；和/或定量样品中物质的活性水平。该术语还可以指识别样品中存在或不存在微生物，例如食物样品或从受试者获得的样品中的致病性分枝杆菌。
[0235]
术语“患者”、“宿主”或“受试者”可以指可以从本文所述的实施方案中获益的任何实体。例如，受试者是脊椎动物，其可以表示任何动物物种(例如，哺乳动物物种，例如人类)。在实施方案中，“患者”可以指任何动物宿主，包括但不限于任何哺乳动物宿主。例如，该术语可以指任何哺乳动物宿主，后者包括但不限于人和非人灵长类动物、牛科动物、犬科动物、山羊科动物、cavines、鸦科动物、epines、马科动物、猫科动物、hircines、lapines、leporines、lupines、鼠科动物、绵羊科动物、猪科动物、ranines、racines、狐狸科动物等，包括家畜、动物标本、外来动物，以及伴侣动物、宠物和兽医护理下的任何动物。患者可以是患有或疑似患有分枝杆菌感染(例如结核分枝杆菌)的任何年龄的患者。因此，术语“受试者”可以指哺乳动物，例如人，但也可以是另一种动物，例如家畜(例如，犬、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马、鸡、鸭等)或实验动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。受试者包括患有或疑似患有分枝杆菌感染(例如结核分枝杆菌)的受试者。
[0236]
在实施方案中，受试者患有或疑似患有分枝杆菌感染以及hiv感染。根据疾病控制中心(cdc)，“hiv感染”是指感染人类免疫缺陷病毒，这种病毒导致aids(获得性免疫缺陷综合征)。患有潜伏性tb感染和hiv感染的人患tb病的风险非常高。根据世界卫生组织(who)，hiv感染者患活动性tb病的可能性是未感染hiv的人的19倍。hiv和tb形成致命的组合，其各自加速对方的进程。2018年，约251,000人死于hiv相关的tb。2018年，hiv阳性者中估计有862,000例新发tb病例，其中72％生活在非洲。不希望受理论束缚，本文所述的抗体可以在存在hiv的情况下检测结核分枝杆菌。在分析从hiv受累个体获得的标本时，传统tb诊断表现出灵敏度降低，这可能是由于mtb感染病灶处形成的肉芽肿中免疫细胞的患病率、类型和活性失调所致。肉芽肿是tb的标志，它们可以在限制和抑制mtb杆菌增殖方面发挥关键作用。这些结构由响应mtb感染而形成的有组织的免疫细胞集合组成，并由mtb感染的巨噬细胞、募集的巨噬细胞和被一层淋巴细胞包围的分化上皮样细胞组成。hiv感染可以通过使t细胞和巨噬细胞功能失调导致肉芽肿稳态，导致肉芽肿解体和这些结构抑制相关mtb感染的能力降低。这可能使得播散性tb的发展，其中mtb杆菌已经扩散至肺外组织，因此肺组织中mtb杆菌的减少可以解释使用痰样品诊断hiv患者遇到的困难。参见，例如，diedrich,c.r.,j.o'hern和r.j.wilkinson.“hiv-1和结核分枝杆菌肉芽肿：系统回顾和荟萃分析。”结核病98(2016):62-76(diedrich,c.r.,j.o'hern,and r.j.wilkinson."hiv-1and the mycobacterium tuberculosis granuloma:asystematic review and meta-analysis."tuberculosis 98(2016):62-76)。
[0237]
在实施方案中，患有或疑似患有分枝杆菌感染的受试者是儿科受试者。儿科受试者可以指从出生至青春期之间的受试者(stedman’医学词典，第27版(stedman’s medical dictionary,27
th edition))。儿童的tb诊断可能具有挑战性，因为每年有100万例儿童患上tb病，并且239,000例死于tb相关原因，其中估计80％的死亡病例发生在《5岁的儿童中，并且估计96％发生在未接受tb治疗的儿童中。参见，例如，dodd,peter j.等人“儿童结核病死亡率的全球负担：一项数学模型研究。”柳叶刀全球健康5.9(2017):e898-e906(dodd,peter j.,et al."the global burden of tuberculosis mortality in children:a mathematical modelling study."the lancet global health 5.9(2017):e898-e906)。漏诊可能导致治疗不足，因为患有tb的儿童(例如同时感染hiv的儿童)经常表现出非特异性症状；最初患有少杆菌病，诊断样品中几乎没有杆菌；并且可能出现播散性tb(粟粒性tb或tb脑膜炎)，其中mtb杆菌已经逃逸肺部的免疫抑制，其在没有适当治疗的情况下可迅速进展，参见，例如，thomas,tania a.“儿童结核病。”儿科临床64.4(2017):893-909(thomas,tania a."tuberculosis in children."pediatric clinics 64.4(2017):893-909)；marais,ben j.等人“一种基于症状的精确诊断儿童肺结核的方法。”儿科学118.5(2006):e1350-e1359(marais,ben j.,et al."a refined symptom-based approach to diagnose pulmonary tuberculosis in children."pediatrics 118.5(2006):e1350-e1359)；edwards,d.j.,f.kitetele和a.van rie.“用于在hiv时代诊断儿科结核病的临床评分系统之间的协议。”国际结核病和肺病杂志11.3(2007):263-269(edwards,d.j.,f.kitetele,and a.van rie."agreement between clinical scoring systems used for the diagnosis of pediatric tuberculosis in the hiv era."the international journal of tuberculosis and lung disease 11.3(2007):263-269)；和zar,heather j.,tom g.connell和mark nicol.“儿童肺结核的诊断：新进展。”抗感染治疗专家综述8.3(2010):277-288(zar,heather j.,tom g.connell,and mark nicol."diagnosis of pulmonary tuberculosis in children:new advances."expert review of anti-infective therapy 8.3(2010):277-288)。这种临床表现，结合难以从幼儿获取呼吸道样品，使得诊断儿科tb和使用标准的基于痰的方法监测其治疗反应变得具有挑战性。参见，例如，nicol,mark p.和heather j.zar.“儿童肺tb的新标本和实验室诊断：进展和前景。”儿科呼吸系统评论12.1(2011):16-21(nicol,mark p.,and heather j.zar."new specimens and laboratory diagnostics for childhood pulmonary tb:progress and prospects."paediatric respiratory reviews 12.1(2011):16-21)；thomas,tania a.“儿童结核病。”儿科临床64.4(2017):893-909(thomas,tania a."tuberculosis in children."pediatric clinics 64.4(2017):893-909)；和zar,heather j.等人“诱导痰相对于洗胃用于婴幼儿肺结核的微生物学确认：一项前瞻性研究。”柳叶刀365.9454(2005):130-134(zar,heather j.,et al."induced sputum versus gastric lavage for microbiological confirmation of pulmonary tuberculosis in infants and young children:a prospective study."the lancet 365.9454(2005):130-134)。
[0238]
在某些实施方案中，抗体是标记的抗体。如本文所用，关于探针或抗体，术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)来直接标记探针或抗体，以及通过与另一种直接标记的试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用
荧光标记的二抗检测一抗和用生物素的dna探针末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。
[0239]
术语“样品”可以指任何可以包含目标分析物(例如cfp-10或其片段)的样品。样品可以是非生物样品或生物样品，并且涵盖临床标本(作为标准临床程序的一部分收集的诊断样品)。非生物样品包括体外制备的那些非生物样品，其包括在溶液中不同浓度的目标靶分子。生物样品包含但不限于全血、淋巴液、血清、血浆、尿液、唾液、痰、呼吸提取物(意指捕获在溶液中的呼出空气)、骨髓、抽吸物(鼻抽吸物、肺抽吸物、支气管抽吸物、气管抽吸物)、眼液、羊水、粪便、其他体液和分泌物、细胞和组织标本以及它们的稀释物。如本文所用，术语“体液”意指可以从个体的身体分离的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液等。在实施方案中，样品包括来自人的体液样品；例如血浆或血清。例如，体液可以获自脊椎哺乳动物，例如患有、疑似患有和/或有患感染风险的人。可以使用任何适合的生物样品。例如，生物样品可以是获自受试者或可以源自该受试者的样品。受试者可以提供多种生物样品，包括来自例如活检或组织的固体生物样品。在一些情况下，样品可以是被置于组织培养中或适于组织培养的组织切片或细胞。生物样品还可以是生物流体(例如尿液、血液、血浆、血清、唾液、泪液、或粘液)或吸收至纸或聚合物基底上的此种样品。例如，生物样品可以被进一步分级为包含特定细胞类型的级分。在一些实施方案中，样品可以是来自受试者的样品的组合(例如，组织和流体样品的组合)。在一些情况下，使用本领域已知的技术从受试者获得血清或血浆。
[0240]
术语“生物样品”可以指从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者内的组织、细胞和流体。因此，在术语“生物样品”的使用中包括血液以及血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴液。该定义还可以包括在获得后以任何方式处理过的样品，例如经试剂处理、溶解或某些组分(例如蛋白或多核苷酸)的富集。
[0241]
在实施方案中，生物样品可以从受试者分离或获得。如本文所用，短语“获得生物样品”或“分离生物样品”可以指用于直接或间接从受试者获取生物样品的任何过程。例如，生物样品可以通过从受试者获取组织或流体样品(例如，抽血、骨髓样品、脊髓抽液)获得。可选地，生物样品可以通过从直接从受试者获得样品的一个或多个人接收生物样品(例如，在实验室设施中)获得。此外，生物样品可以例如直接或间接从动物获得，例如用于牲畜或野生动物管理工作或兽医护理。
[0242]
在一个实施方案中，样品包含来自受试者的蛋白分子。在一个实施方案中，生物样品是通过常规方式从受试者分离的外周血白细胞样品。在另一个实施方案中，生物样品是通过常规方法从受试者分离的血清。
[0243]
在实施方案中，样品不是痰。痰是咳出的物质，特别是在气道疾病中咳出的粘液或粘液脓性物质(stedman医学词典，第27版)。目前，使用涂片检查痰中的tb菌，涂片是检查受试者痰中是否存在tb菌的检测。为了进行这项检测，实验室工作人员将痰涂在载玻片上，用特殊染色剂对载玻片进行染色，并在载玻片上寻找任何tb菌。该检测可能需要1天才能获得结果。部分痰也可以用来进行培养，在大多数实验室可能需要2至4周。基于痰的tb测定受所收集样品中mtb丰度的直接影响，并且可能难以从儿童、hiv感染者和肺外、播散性或少杆菌性tb患者中获得对诊断有用的痰样品。例如，仅30-62％的儿科tb病例的分枝杆菌培养呈阳性。参见，例如，zar,heather j.等人“诱导痰相对于洗胃用于婴幼儿肺结核的微生物学确
认：一项前瞻性研究。”柳叶刀365.9454(2005):130-134(zar,heather j.,et al."induced sputum versus gastric lavage for microbiological confirmation of pulmonary tuberculosis in infants and young children:a prospective study."the lancet 365.9454(2005):130-134)。利用痰样品的分子诊断(例如xpert rif/mtb和xpert ultra)能够实现快速诊断，但对儿童的灵敏度也较低。参见，例如，nemes,elisa等人“与quantiferon-tb gold in-tube相比，早期分泌抗原靶标6-游离干扰素-γ释放测定的诊断准确度。”临床感染性疾病69.10(2019):1724-1730(nemes,elisa,et al."diagnostic accuracy of early secretory antigenic target-6
–
free interferon-gamma release assay compared to quantiferon-tb gold in-tube."clinical infectious diseases 69.10(2019):1724-1730)。
[0244]
在实施方案中，样品是食物样品。“食品样品”可以指食品制品或食品制品的一部分。食品制品包括新鲜制品、气调储存制品、真空包装制品、冷冻制品、发酵制品、熏制制品和干制品。食物制品的实例包括肉类制品(包括牛肉、野牛肉、鹿肉、小牛肉、猪肉、马肉、羔羊肉(lamb meat)、羊肉(mutton meat,)、山羊肉(goat meat)、兔肉、火鸡肉、鸡肉、鸭肉、珍珠鸡肉(如香肠、切碎或磨碎)、鱼制品(包括鲑鱼、鳟鱼)、蔬菜制品(包括卷心菜、小黄瓜、豆、葡萄叶、柠檬、大蒜、瑞士莙荙菜、甜菜、胡萝卜、芹菜、蘑菇、黄瓜、西葫芦、蚕豆、萝卜、洋葱、豌豆、甜椒、南瓜、水萝卜、菊苣、番茄、橙子、橄榄或调拌菜例如泡菜)、谷物制品(包括大米、大豆、小麦)和奶制品(酸奶、奶酪、开菲尔)。
[0245]
许多主要的致病分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)以及非结核分枝杆菌(ntm)的鸟分枝杆菌复合群(mac)的成员生长缓慢。培养这些种属所需的时长可降低它们作为诊断检测的效用，因为这种延长的培养时间可增加疾病传播或疾病进展的风险，在没有适当治疗的情况下导致组织损伤。
[0246]
本文所述的检测方法可用于在体外和体内检测生物样品中的cfp-10或其片段。例如，用于检测cfp-10的体外技术包括酶联免疫吸附测定(elisa)、western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。此外，用于检测cfp-10的体内技术包括将标记的抗cfp-10抗体引入受试者。例如，抗体可以用放射性标志物标记，其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
[0247]
如本文所述，抗体可以连接至标记试剂(可选地称为“标记”)，例如荧光分子(例如荧光珠)、结合配偶体、固体支持物或本领域已知的其他试剂以促进分离。本文描述了此类试剂的非限制性实例。
[0248]
例如，肽特异性抗体可以固定在柱、珠或其他表面上，用作肽特异性亲和捕获试剂。在实施方案中，根据生产商的说明，将抗肽抗体固定在市售的蛋白a衍生的poros色谱介质(applied biosystems)上，并且通过与庚二酸二甲酯的共价交联将其共价固定在该支持物上。所得固相介质可以特异性结合来自肽混合物(例如，血清或血浆的胰蛋白酶消化物)的监测肽。
[0249]
如本文所用，术语“纯化(purification)”、“纯化(purifying)”和“富集”并不是指从样品中去除目标分析物以外的材料。相反，这些术语是指相对于样品中可能干扰目标分析物检测的其他组分，富集一种或多种目标分析物的量的程序。
[0250]
通过各种方式纯化样品可以使得一种或多种干扰物质相对减少，例如，能够或不
能干扰通过质谱检测所选分析物的一种或多种物质。使用该术语时，相对减少不需要通过纯化完全去除与目标分析物一起存在于待纯化材料中的任何物质。
[0251]
术语“免疫纯化(immunopurification或immunopurify)”可以指利用抗体(包括多克隆或单克隆抗体，例如本文所述的那些抗体)以富集一种或多种目标分析物的纯化程序。可以使用本领域熟知的任何免疫纯化方法进行免疫纯化。通常，免疫纯化程序利用结合、缀合或以其他方式附接至固体支持物(例如珠、柱、孔、管、凝胶、胶囊、颗粒等)的抗体。
[0252]
免疫纯化可以包括但不限于本领域中通常称为免疫沉淀的程序，以及本领域中通常称为亲和层析或免疫亲和层析的程序。
[0253]
术语“免疫颗粒”可以指具有结合、缀合或以其他方式附接至其表面(例如，在颗粒上和/或颗粒中)的抗体的胶囊、珠、凝胶颗粒等。在某些实施方案中，免疫颗粒是琼脂糖凝胶珠或琼脂糖珠。在可选的实施方案中，免疫颗粒包括玻璃珠、塑料珠或二氧化硅珠，或硅胶。
[0254]
如本文所用，术语“抗cfp-10抗体”可以指对cfp-10、其表位或其肽片段具有亲和力的任何多克隆或单克隆抗体。在各种实施方案中，抗体对cfp-10以外的化学物质的特异性可以变化；例如，在某些实施方案中，抗cfp-10抗体对cfp-10具有特异性，因此对cfp-10以外的化学物质具有很少或没有亲和力，而在其他实施方案中，抗cfp-10抗体是非特异性的，因此结合cfp-10以外的某些化学物质。
[0255]
如本文所述的抗体和片段可以与任何固相富集方法一起使用。术语“固相富集”或“固相提取”或“spe”可以指其中由于溶解或悬浮于溶液(即流动相)中的组分对溶液通过或围绕其通过的固体(即固相)的亲和力，化学混合物被分离成组分的过程。在一些实例中，当流动相通过或围绕固相时，流动相的非期望组分可能被固相保留，从而导致流动相中分析物的纯化。在其他实例中，分析物(例如cfp-10)可以被固相保留，从而使得流动相的非期望组分通过或围绕固相。在这些实例中，然后使用第二流动相将保留的分析物从固相洗脱，以进行进一步的处理或分析。spe(包括tflc)可以通过单一或混合模式机制运行。混合模式机制利用同一色谱柱中的离子交换和疏水保留；例如，混合模式spe柱的固相可以表现出强阴离子交换和疏水保留；或可以表现出强阳离子交换和疏水保留。
[0256]
为了促进抗体-蛋白复合物与样品中未结合的蛋白分离，抗体可以连接至促进分离的试剂，例如结合配偶体(例如，生物素、寡核苷酸、适体)、固体支持物(例如珠或基质，包括微阵列或多孔板)；或本领域已知的任何其他试剂。连接可以是共价的或非共价的，并且可以是直接的或间接的。将抗体与此类试剂连接的方法是本领域熟知的。参见，例如kennedy等人(1976)临床化学学报70:1-31(kennedy et al.(1976)clin.chim.acta 70:1-31)，和schurs等人(1977)临床化学学报81:1-40(schurs et al.(1977)clin.chim.acta 81:1-40)(描述偶联技术，包括戊二醛法、高碘酸盐法、二马来酰亚胺法、间马来酰亚胺苄基-n-羟基-琥珀酰亚胺酯法，这些方法中的每一种均通过引用并入本文)。
[0257]
用于从样品中分离抗体-蛋白复合物的方法是本领域已知的并且包括使用结合结合配偶体的捕获剂(例如，抗生物素蛋白以捕获与生物素连接的抗体；寡核苷酸以捕获与抗体连接的寡核苷酸)；还可以使用物理分离，例如沉降、过滤、facs(例如，使用带有光谱特征标记的珠)和磁分离(当抗体连接至具有磁性的基质上时，例如磁珠)。
[0258]
许多结合配偶体是本领域已知的(例如，二硝基苯基、地高辛、荧光团、俄勒冈绿染
料、alexa fluor 488(molecular probes)、荧光素、丹磺酰基、marina蓝(molecular probes)、四甲基罗丹明、德克萨斯红(molecular probes)、bodipy(4,4-二氟-4-硼酸-3a,4a-二氮杂-s-茚满；美国专利号4,774,339)染料等)，其可用于本发明。可用作捕获试剂的抗体可特异性结合结合剂，可从供应商例如molecular probes、eugene、oreg商购获得。这些抗体包括可以特异性结合二硝基苯基、地高辛、荧光团、俄勒冈绿染料、alexa fluor 488(molecular probes)、荧光素、丹磺酰基、marina蓝(molecular probes)、四甲基罗丹明、德克萨斯红(molecular probes)和bodipy染料(molecular probes)的抗体。还可以使用任何合适的配体和抗配体。
[0259]
寡核苷酸可用作结合配偶体和捕获试剂。寡核苷酸包括核酸，例如dna、rna和混合的rna/dna分子。用作亲和标记的寡核苷酸可以与捕获试剂上存在的寡核苷酸序列杂交。本领域技术人员将认识到可以设计许多不同的寡核苷酸序列，它们将相互杂交。设计此类寡核苷酸对的重要考虑因素包括实际核苷酸序列、寡核苷酸的长度、杂交条件(例如，温度、盐浓度、有机化学品的存在等)和寡核苷酸的解链温度。
[0260]
适用于固定(连接)来自样品的抗体或蛋白的固体支持物(以及使固体支持物适合固定抗体的修饰)是本领域熟知的。固体支持物的实例包括：珠(包括磁珠)、微孔板和蛋白微阵列(参见，例如，美国专利号6,365,418)。因此，例如，包封在二氧化硅壳中的cdse-cds核壳纳米晶体可以很容易地衍生化以与生物分子偶联。bruchez等人(1998)科学281:2013-2016(bruchez et al.(1998)science 281:2013-2016)。类似地，高荧光量子点(硫化锌封端的硒化镉)已与生物分子共价偶联，用于超灵敏的生物检测。warren和nie(1998)科学281:2016-2018(warren and nie(1998)science 281:2016-2018)。荧光标记的珠可从luminex和quantum dot商购获得。
[0261]
可以使用常规免疫亲和洗脱条件(例如酸性ph、离子强度、去污剂或其组合)从抗体-蛋白复合物中释放结合的蛋白(或在一些实施方案中，多肽片段)。在实施方案中，将肽或蛋白脱盐以用于随后的分级分离、表征或其他分析。
[0262]
在多于一个实施方案中，期望固定抗体或抗原，例如，以促进复合形式与非复合形式之一或两者的分离。可以在任何适合容纳反应物的容器中观察抗体-抗原复合物。这种容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供一种融合蛋白，该融合蛋白添加了使得蛋白中的一者或两者与基质结合的结构域。例如，可以将gst抗体融合蛋白或gst抗原融合蛋白吸附至谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(sigma chemical,st.louis,mo)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，并将混合物在有助于形成复合物的条件下(例如，在盐和ph的生理条件下)温育。温育后，洗涤珠或微量滴定板孔以去除任何未结合的组分，在珠的情况下固定基质，直接或间接测定复合物。可选地，复合物可以从基质中解离，并且抗体-抗原复合物形成的水平可以使用标准技术来确定。
[0263]
用于将蛋白固定在基质上的其他技术也可用于本发明的测定。例如，抗体或抗原(例如1593肽或65d3-1抗体)可以利用生物素和链霉抗生物素的缀合来固定。生物素化的抗体或抗原分子可以使用本领域熟知的技术(例如，生物素化试剂盒，pierce chemicals，rockford，il)从生物素nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)进行制备，并固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(pierce chemical)的孔中。可选地，与目标抗体或抗原反应但不干扰目标抗体-抗原复合物形成的其他抗体可以衍生至板的孔中，并且未结合的抗体或抗原通过抗体
spec.12-1435-144))和芯片毛细管电泳(chip-ce)-qqtof ms(li等人(2000)分析化学72:599-609(li et al.(2000)anal.chem.72:599-609))。质谱仪和在本发明的方法中使用它们的技术是本领域技术人员熟知的。本领域技术人员理解，质谱仪的任何部件(例如解吸源、质量分析器、检测器等)可以与本文所述的其他合适的部件或本领域已知的部件组合使用。关于质谱仪的另外信息，参见，例如，仪器分析原理，第3版，skoog，saunders学院出版，费城，1985(principles of instrumental analysis,3rd ed.,skoog,saunders college publishing,philadelphia,1985)；和kirk-othmer化学技术百科全书，第4版第15卷(john wiley&sons，纽约1995)，第1071-1094页(kirk-othmer encyclopedia of chemical technology,4th ed.vol.15(john wiley&sons,new york 1995),pp.1071-1094)。
[0270]
试剂盒
[0271]
本发明的抗体还可以包括在用于检测样品中存在cfp-10或其片段的试剂盒中。例如，该试剂盒可以包括用于从受试者获得样品的装置和/或用于将收集的样品储存一段时间的容器；可以检测样品中cfp-10的试剂(例如，抗cfp-10单克隆抗体)；用于确定样品中cfp-10的量的装置；以及用于将样品中cfp-10的量与标准品进行比较的装置。化合物或试剂可以包装在合适的容器中。该试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒检测样品中的cfp-10的说明。
[0272]
在实施方案中，该试剂盒可以与用于检测分枝杆菌属的固定设备(例如质谱仪)结合使用，例如，活动性肺结核或肺外结核，即使在hiv合并感染的情况下也是如此。测定试剂盒可以包括用于样品制备的试剂。这些试剂可以包括市售材料，例如但不限于：纳米颗粒、消化化合物和用于漂洗的洗涤缓冲液。试剂盒中的其他部件包括移液器吸头、分装管(有时称为“小瓶”或“eppendorf管”)、用于管管理的分装支架、样品识别标签和装置标签，例如使用说明(ifu)。该试剂盒可以进一步由可重复使用的固定部件组成，包括用于分离纳米颗粒的磁体和/或另外的一次性部件。
[0273]
实施例
[0274]
实施例1
[0275]
两组四只新西兰兔用通过添加至每个肽的c-末端的半胱氨酸残基与合成肽缀合的keyhole血蓝蛋白(klh)免疫，该合成肽包含对结核分枝杆菌的10kda培养滤液蛋白(cfp-10/esxb)特异的序列。
[0276]
肽1593(tdaatlaqeagnfer)
[0277]
用与靶肽tdaatlaqeagnferc(肽1593)缀合的klh蛋白对兔2884、2885、2886和2887进行免疫并加强两次，其与cfp-10的n-末端氨基酸序列(aa 6至20)相匹配(不包括c-末端接头半胱氨酸)。在使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)或健康人血清(血清)作为温育基质进行的间接elisa中，测定源自这些兔的血清与全长重组cfp-10蛋白和合成肽1593的反应性。来自兔2884-2887的血清在针对血清抗体浓度调整的elisa中表现出对重组cfp-10蛋白的亲和力差(图1)，但在肽1593用作靶抗原的elisa中表现出良好的反应性(图2)。然而，这些分析反映了血清对高浓度靶抗原的反应性远高于活动性tb病例患者血清样品中应遇到的那些。因此，使用连续稀释的靶抗原和恒定的抗体浓度进行间接elisa(图3)。所有四只兔的血清均表现出对全长cfp-10蛋白的弱反应性，但对减少量的肽1593的反应性不同。来自兔2884和2885的血清与来自兔2886和2887的血清相比，对连续稀释的肽1593的反应性更高，尽管所
有血清样品对本实验中测定的最低抗原浓度(1.56ng/ml；156pg总蛋白)表现出显著的反应性，其低于我们在从患有活动性结核(tb)个体病例中提取的大多数血清样品中检测到的水平。
[0278]
基于这些数据，我们选择兔2885来产生单克隆抗体。筛选克隆文库识别了四个克隆，其上清液显示出对肽1593的反应性。然而，间接elisa显示，这些克隆中仅有两个的上清液对100μg肽1593表现出良好的反应性，克隆65d3的上清液比克隆119c10的上清液表现更好(图4a)，并且调整这些克隆上清液中的抗体浓度并没有显著改变这些结果(图4b)。我们接下来分析了119c10和65d3对连续稀释的低浓度肽1593的反应，在抗原检测期间，在100μl健康人血清中温育100ng每种抗体。在这些条件下，仅65d3显示出合理的效应曲线(图5a)，因为119c10信号在1593肽系列稀释曲线早期下降至基线。使用我们的靶抗原生理范围的近似值重复此elisa，表明65d3抗体在整个预期抗原浓度范围内表现出良好的性能(图5a)，并且该结果在随后的测定中很大程度上被重复(图6)。
[0279]
通过间接elisa观察到的抗体结合行为代表了一种人为情况，因为目标抗原固定在限制其构象与结合抗体灵活性相互作用的表面上。抗体还与抗原的多个拷贝接近，这可能影响明显的结合行为，因为在抗原-抗体解离后，抗体将接近高局部浓度的其靶抗原，有利于快速形成新的抗原-抗体复合物。因此进行竞争性间接elisa以解决可溶性1593肽对65d3抗体的结合行为的影响。在这些测定中，测定孔用100μl的6nm浓度的肽1593包被，然后与含10nm至30pm的肽1593的100μl连续稀释液中的50ng/ml 65d3抗体一起温育(图7a)。在该测定中，在不存在可溶性肽1593(0pm)的情况下观察到的信号被增加浓度的可溶性肽1593逐渐阻断，在1nm和10nm浓度下分别获得40％和90％抑制(图7b)。
[0280]
接下来在biacore
tm 8k上测量65d3抗体与肽1593的结合亲和力，66d3固定水平为11390.5ru，并且缔合和解离接触时间分别为180和600秒，流速为30μl/min，肽1593浓度为7.8、15.6、31.2、62.5、125、250和500nm(图8)。该分析表明65d3抗体对肽1593的亲和力为1.72nm。
[0281]
肽2004(tqidqvestagslqgqwr)
[0282]
用与靶肽tqidqvestagslqgqwrc(肽2004)缀合的klh蛋白对兔2892、2898、2902和2903进行免疫并加强两次，其与cfp-10蛋白序列的氨基酸27至44相匹配(不包括c-末端接头半胱氨酸)。在使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)或健康人血清(血清)作为温育基质进行的间接elisa中，测定源自这些兔的血清与全长重组cfp-10蛋白和合成肽1593的反应性。在针对血清抗体浓度调整的间接elisa中，在pbs或血清中温育后，来自兔2892和2898的血清表现出对重组cfp-10蛋白的中等亲和力(图9)。当在pbs中测定时，来自兔2902和2903的血清对cfp-10的亲和力较差，而当在血清中进行测定时，这种性能进一步恶化。来自兔2892和2898(但不是2902和2903)的血清也显示出对肽2004的中等亲和力(图10)，尽管结合活性似乎与用全长cfp-10蛋白观察到的相比略有下降，并且在使用较低的抗体浓度测定时似乎下降得更快。
[0283]
接下来使用连续抗原稀释和恒定抗体浓度进行间接elisa(图11)。该分析的结果表明所有四个血清样品的抗原结合活性均较差。
[0284]
实施例2 65d3的亲和力测量
[0285]
样品：
[0286]
样品mw(kda)浓度(mg/ml)65d3150kd1.841肽22kd5
[0287]
仪器和试剂：
[0288]
·
biacore
tm 8k,29215379-2177839(ge healthcare)
[0289]
·
s系列传感器芯片cm5，货号br-1005-30(批号10270193)(ge healthcare)
[0290]
·
10mm乙酸钠，ph 4.5，货号br-1003-50，(批号20623)(ge healthcare)
[0291]
·
胺偶联试剂盒，货号br-1000-50(批号2087132)(ge healthcare)
[0292]
·
nhs：h2o中100mm n-羟基琥珀酰亚胺
[0293]
·
edc：h2o中400mm 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
[0294]
·
乙醇胺：1m乙醇胺盐酸盐，用naoh调节至ph 8.5
[0295]
·
hbs-ep

:10mm hepes,150mm nacl,3mm edta,0.05％tween 20,ph 7.4(批号bcbx4905)(ge healthcare)
[0296]
方法
[0297]
将65d3固定在cm5传感器芯片上
[0298]
65d3的固定在25摄氏度下进行，而hbs-ep

用作运行缓冲液。流通池1和2的传感器芯片表面用新鲜混合的50mmol/l n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和200mmol/l 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)活化420s(10μl/min)。然后，将在10mmol/l naac(ph 4.5)中稀释的65d3进样至流通池2中，分别实现max response unit的缀合，而流通池1设为空白。胺偶联反应后，芯片表面剩余的活性偶联位点用1mol/l乙醇胺盐酸盐进样420s封闭。
[0299]
亲和力测量
[0300]
该测定在25℃下进行，并且运行缓冲液为hbs-ep

。将稀释的肽作为缔合相进样至表面上方，然后进样运行缓冲液作为解离相。运行配置如下表所示。
[0301][0302]
结果
[0303]
所有数据均使用biacore
tm
评价软件版本1.1处理。每个循环中流通池1和缓冲液的空白进样用作response units消减的双重参考。
[0304]
有关65d3对肽2的亲和力测量见图8。
[0305]
在本实验中，65d3对肽2的亲和力为1.72e-09m。
[0306]
实施例3
–
65d3的亲和力成熟
[0307]
例如，根据nkk饱和诱变和噬菌体展示的策略，可以进行亲和力成熟以增强抗体对肽1593的亲和力。
[0308]
亲本抗体的氨基酸序列
[0309]
抗原：肽2(肽1593)和生物素-肽2
[0310]
·
sfii酶(neb，货号：r0123s)
[0311]
·
nhei-hf酶(neb，货号：r3131s)
[0312]
·
氨苄青霉素储备液，100mg/ml
[0313]
·
80％甘油
[0314]
·
20％葡萄糖
[0315]
·2×
yt：16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5g nacl，溶解于1l ddh2o中
[0316]
·
宿主菌株：大肠杆菌ss320，tg1
[0317]
·
m13ko7辅助噬菌体(neb，货号：n0315s)
[0318]
·
pcdna3.4表达载体和expi293f细胞(由genscript制备)
[0319]
·
生物安全柜(thermo scientific，型号1384)
[0320]
·
zhichu co2振荡培养箱(shanghai zhichu instrument，型号zczy-bs8)
[0321]
·
expi293f培养基(gibco，货号a14351-01)
[0322]
·
expifectamine293转染试剂盒(gibco，货号a14525)
[0323]
·
tpp tubespin生物反应器50(货号87050)
[0324]
·
125-ml摇瓶(corning，货号431143)
[0325]
·
500-ml摇瓶(corning，货号431145)
[0326]
·
蛋白-a树脂(genscript，货号l0443)
[0327]
·
结合缓冲液：0.15m nacl，20mm na2hpo4，ph 7.0
[0328]
·
洗脱缓冲液：0.1m甘氨酸-hcl，ph 2.5
[0329]
·
中和缓冲液：1m tris-hcl，ph 9.0
[0330]
·
iptg 0.1mm
[0331]
·
包被缓冲液：0.05m nahco3，ph 9.6
[0332]
·
pbs：137mm nacl，2.7mm kcl，4.3mm na2hpo4，1.4mm kh2po4，ph 7.4
·
elisa微量滴定板(corning，货号9018)
[0333]
·
封闭缓冲液(mpbs)：pbs缓冲液，ph 7.4，含3％脱脂牛奶
[0334]
·
洗涤缓冲液(pbst)：pbs缓冲液，ph 7.4，含0.05％tween20
[0335]
·
洗脱缓冲液：0.1m tea，三甲胺(用于噬菌体展示淘选)
[0336]
·
1m tris-hcl(ph7.4)
[0337]
·
hrp缀合的山羊抗人igg-f(ab')2抗体(jackson immunoresearch，货号：109-035-097)
[0338]
·
hrp缀合的抗m13单克隆抗体(sino biological，货号：11973-mm05t-h)
[0339]
·
四甲基联苯胺(tmb，genscript)；
[0340]
·
1m hcl(genscript)
[0341]
·
biacore t200/biacore 8k(ge healthcare)
[0342]
·
s系列传感器芯片cm5(ge healthcare，货号：br-1005-30)
[0343]
·
hbs-ep：10mm hepes，500mm nacl，3mm edta，0.05％tween 20，ph 7.4
[0344]
·
10mm甘氨酸-hcl
[0345]
方法
[0346]
3.1嵌合fab抗体的构建和产生
[0347]
合成编码抗体重链和轻链的dna序列并插入faseba载体，以构建fab嵌合体的表达质粒。然后将faseba载体转移到tg1感受态中，选择阳性克隆培养后，iptg诱导fab嵌合抗体表达。
[0348]
3.2嵌合fab抗体的结合确认
[0349]
使用elisa单独确定结合肽1593的嵌合fab抗体的亲和力。微量滴定elisa板用在100μl包被缓冲液中的10μg/ml bsa(表达检测)或1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.007813、0.003906、0.001953μg/ml抗原蛋白(结合评价)在4℃下包被过夜，随后用封闭缓冲液在37℃下温育1小时。然后将板用洗涤缓冲液洗涤，并与100μl含有抗体的上清液在rt下温育2小时。接下来用洗涤缓冲液洗涤板并与100μl二抗(0.1μg/ml山羊抗人igg f(ab')
2-hrp温育45分钟。洗涤后，在室温下用100μl tmb底物使反应显色10分钟，然后加入50μl的1m hcl终止反应。使用光谱仪在450nm处测量吸光度值。
[0350]
3.3nnk文库的构建
[0351]
共选择优化cdr区63个残基，通过nnk方法对其构象相邻残基进行限定和突变。基于faseba平台生成每个残基的各自单独nnk文库，理论多样性为20。从每个nnk文库中随机选择48个克隆用于在96孔深孔板中的大肠杆菌tg1中表达，对其进行选择用于测序。然后通过针对bsa和抗原蛋白的elisa分析培养基中分泌的粗蛋白的独特克隆，分别用于评估表达和结合特异性。增加抗体亲和力但不影响抗体表达的“有益突变体”再次通过elisa得到证实。选择具有提高亲和力的克隆用于igg构建。
[0352]
3.4faseba筛选
[0353]
该筛选过程从63个nnk文库的每个板中选择92个克隆，用于在96孔板中的大肠杆菌中表达。通过针对抗原蛋白的elisa分析培养基中分泌的粗蛋白以评估结合特异性。选择具有显著改善的elisa信号的克隆进行测序。并获得有益突变体。
[0354]
3.5igg的构建和产生
[0355]
合成编码亲本抗体及其亲和力成熟抗体的重链(vh)和轻链(vl)可变结构域，分别插入pcdna3.4载体构建全长igg表达载体。重链和轻链表达质粒用于转染。使用蛋白a亲和层析纯化分泌至培养基中的重组igg。最后，分别通过od280和sds-page评估浓度和纯化的抗体。
[0356]
3.6亲和力测量
[0357]
使用表面等离子共振(spr)生物传感器biacore(ge healthcare)测定抗体对抗原蛋白的亲和力。抗体通过胺偶联法固定在传感器芯片上。抗原被用作分析物。使用biacore评价软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数的数据。平衡解离常数(kd)由kd与ka的比率计算。
[0358]
3.7组合诱变噬菌体展示文库的构建
[0359]
组合诱变噬菌体展示文库由一组预定义的dna部分组成，这些部分在下游合成生
物学的特定排列中战略性地组装。变体槽使用先进的高通量平台合成。通过对20个随机菌落进行sanger测序，确保文库质量，并保证80％的最低阳性率。将递送10μg克隆质粒。组合诱变噬菌体展示文库的设计见表2。
[0360]
表2.组合诱变噬菌体展示文库的设计。
[0361][0362]
3.8噬菌体展示文库淘选选择
[0363]
噬菌体展示文库(大小：4.48
×
106)被拯救、扩增并用peg/nacl沉淀，并重悬于pbs中进行淘选。噬菌体淘选使用生物素-肽1593的可溶相淘选进行，并且淘选程序使用由genscript开发的标准程序进行。如下进行两种不同的淘选策略。
[0364]
3.8.1正常噬菌体淘选(r1-r4)
[0365]
噬菌体颗粒(输入2
×
1012pfu/池)和dynabeadstm m280链霉亲和素在5％bsa-pbs中稀释/封闭，缓慢旋转温育1小时。然后将生物素-肽2添加至封闭的文库中并缓慢旋转温育1小时。接下来，将抗原和抗体结合文库转移到dynabeads中并缓慢旋转温育30min。
[0366]
3.8.2竞争淘选(r5-r6)
[0367]
噬菌体颗粒(2
×
1011pfu/池)和m280链霉亲和素dynabeads
tm
在5％bsa-pbs中稀释/封闭，缓慢旋转温育1小时。然后将生物素-肽2(1593)添加至封闭的文库中并缓慢旋转温育1小时，将肽2添加至结合文库中并缓慢旋转温育30min。接下来，将抗原和抗体结合文库转移到dynabeads中并缓慢旋转温育30min。
[0368]
3.8.3结合噬菌体收集(步骤相同)
[0369]
捕获后，通过倾析和用0.05％pbst洗涤8-15次和用pbs洗涤3-5次来去除未结合/非特异性结合的噬菌体。结合的噬菌体用tea洗脱并用1m tris-hcl(ph7.4)中和。噬菌体洗脱液用于在37℃下感染10ml指数生长的大肠杆菌tg1。按照标准程序，通过使用m13k07辅助噬菌体进行扩增和拯救，制备噬菌体颗粒用于随后的几轮淘选。前一轮扩增的噬菌体用作下一轮淘选的输入噬菌体。在第1-6轮将感染的tg1接种在2yt-amp 板上。挑取单个菌落并通过单克隆elisa验证结合活性。
[0370]
3.9单克隆elisa筛选和dna测序
[0371]
3.9.1噬菌体elisa筛选
[0372]
单个菌落在96孔深孔板中生长，并在30℃下通过m13ko7辅助噬菌体拯救过夜。同时，96孔elisa微量滴定板在4℃下用包被缓冲液中的1μg/ml肽1593包被过夜。用3％mpbs封闭板。冲洗后，将来自每个过夜培养物深孔的50μl噬菌体上清液和50μl 0.1％pbst添加至板中，在rt下温育2小时。在用洗涤缓冲液冲洗板3次后，将hrp缀合的抗m13单克隆抗体添加至板中，在rt下持续45分钟。将板再洗涤6次并将底物溶液添加至孔中用于信号显色反应，并使用光谱仪在450nm处测量吸收。选择elisa信号显著改善的噬菌体结合物进行dna测序，
并获得有益突变体。
[0373]
3.9.2可溶性表达elisa筛选
[0374]
单个菌落在96孔深孔板中生长，并在30℃下诱导表达过夜。同时，96孔elisa微量滴定板在4℃下用在包被缓冲液中的0.015μg/ml肽1593包被过夜。这些板用3％mpbs封闭。冲洗后，将来自每个过夜培养深孔的50μl表达上清液和50μl 0.1％pbst添加至板中，在rt下温育2小时。在用洗涤缓冲液冲洗板3次后，将hrp缀合的山羊抗人igg-f(ab')2抗体添加至板中，在rt下持续45分钟。将板再洗涤6次并将底物溶液添加至孔中用于信号显像反应。使用光谱仪在450nm处测量吸收。选择elisa信号显著改善的克隆进行dna测序，并获得有益突变体。
[0375]
4.结果
[0376]
4.1通过elisa对嵌合fab抗体的结合确认
[0377]
结果表明嵌合fab抗体与ag结合。表3和图27中通过elisa验证的ab-ag结合活性。选择0.015μg/ml的肽1593浓度进行进一步检测。
[0378]
表3嵌合fab结合活性。
[0379]
ag浓度稀释(ug/ml)嵌合ab 01嵌合ab 0212.3012.3110.52.2722.2530.252.1842.2250.1251.9362.0350.06251.7081.8000.031251.2121.3670.0156250.7300.7890.00781250.3190.3410.003906250.1330.1470.009531250.0840.084空白0.0510.050nc0.0520.052
[0380]
有关嵌合fab结合活性见，例如，图27。
[0381]
4.2nnk文库构建
[0382]
总共选择63个残基进行cdr区优化，如表4和表5所示，从而构建63个nnk文库。基于faseba平台生成每个残基的各自单独nnk文库，理论多样性为20。结果示于下表5中。
[0383]
表4.选择用于nnk文库构建的残基。
[0384]
l-cdr1l-cdr2l-cdr3h-cdr1h-cdr2h-cdr3l1-l13l14-l20l21-32h1-h10h11-h26h27-h31
[0385]
表5. 63个nnk文库的qc结果
[0386]
[0387][0388]
4.3从nnk文库识别优化的结合物
[0389]
从每个nnk文库中，随机选择生长超过90个克隆，并通过elisa检测肽1593的结合活性。通过elisa筛选63个nnk文库以识别具有高亲和力的结合物，详细信息列于图28和表6。该数据用于选择用于产生纯化抗体的基因合成的最明显改进点(表7)。
[0390]
表6.通过elisa从63个nnk文库中选择命中。突变位点带有标记。
[0391][0392]
表7.抗体重链和轻链组合。
[0393][0394]
4.4潜在亲和力成熟抗体的igg产生
[0395]
根据序列分析，设计了两条重链和一条轻链。表达和纯化三种突变型igg和野生型igg。这些igg的sds-page数据如图29所示。
[0396]
4.5最终先导igg的亲和力测量
[0397]
biacore设置参数和肽1593对最终先导组合抗体和野生型抗体的亲和力数据总结在表8-9中，biacore数据曲线显示在图30中。
[0398]
表8：抗体亲和力验证的详细信息、参数。
[0399][0400]
表9：抗体对肽1593的亲和力测量
[0401][0402]
图30显示了抗体对肽1593的亲和力测量。
[0403]
4.6组合噬菌体文库qc
[0404]
表10.组合诱变文库的一般信息。
[0405][0406]
图31显示了组合诱变文库的菌落pcr结果。
[0407]
4.7淘选流程和结果总结
[0408]
表11：淘选流程和结果总结
[0409][0410]
4.8多克隆噬菌体elisa结果
[0411]
表12.r0-r2的多克隆噬菌体elisa验证
[0412][0413]
4.9单克隆噬菌体elisa结果
[0414]
在1-4轮淘选后，从每个池中挑取超过90个菌落，并通过单克隆噬菌体elisa进行验证。单克隆噬菌体elisa详细信息如图32所示。elisa板用1μg/ml生物素-肽1593(100ul/孔)包被，并在4℃下温育过夜。阴性对照：非相关噬菌体上清液。空白：2yt培养基。图32显示
了r1-r4的单克隆噬菌体elisa验证
[0415]
4.10单克隆可溶性表达elisa结果
[0416]
在3-6轮淘选后，从每个池中挑取超过90个菌落，并通过单克隆可溶性表达elisa进行验证。单克隆可溶性表达elisa详细信息如图33所示。elisa板用0.015μg/ml肽1593(100ul/孔)包被，并在4℃下温育过夜。阴性对照：非相关表达上清液。空白：2yt培养基。图33显示了r3-r6的单克隆可溶性表达elisa验证。
[0417]
抗体序列
[0418]
序列以'前导序列-vh/vl-riggch/rigkcl-终止密码子**'的格式显示。
[0419]
氨基酸序列
[0420]
重链：
[0421]
》u4568ek260-s55w&g64k-vh(seq id no:[])
[0422][0423]
》u4568ek260-s55w-vh(seq id no:[])
[0424][0425][0426]
轻链：
[0427]
》u4568ek260-s57t-vl(seq id no:[])
[0428][0429]
dna序列：
[0430]
重链：
[0431]
》u4568ek260-s55w&g64k-vh(seq id no:[])
[0432][0433][0434]
》u4568ek260-s55w-vh(seq id no:[])
[0435][0436][0437]
轻链：
[0438]
》u4568ek260-s57t-vl(seq id no:[])
[0439][0440]
实施例4
[0441]
表13
–
22次命中的elisa结果
[0442][0443]
另见，例如，图34。
[0444]
可变区氨基酸序列：
[0445]
重链：
[0446]
》u4568ek260-ahf05121-vh(seq id no:[])
[0447]
qsleesggrlvtpggsltltctvsgfslsthdiswvrqapgkglewigviarrgstyyaswargrftisktsttvdlkitsptiedtatyfcareefdfwgqgtlvtvss
[0448]
轻链：
[0449]
》u4568ek260-ahf05071-vl(seq id no:[])
[0450]
avltqtaspvsaavggtvtiscqgsqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0451]
》u4568ek260-ahf05072-vl(seq id no:[])
[0452]
avltqtaspvsaavggtvtiscqmsqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0453]
》u4568ek260-ahf05074-vl(seq id no:[])
[0454]
avltqtaspvsaavggtvtiscqtsqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0455]
》u4568ek260-ahf05078-vl(seq id no:[])
[0456]
avltqtaspvsaavggtvtiscqsaqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0457]
》u4568ek260-ahf05079-vl(seq id no:[])
[0458]
avltqtaspvsaavggtvtiscqsrqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0459]
》u4568ek260-ahf05080-vl(seq id no:[])
[0460]
avltqtaspvsaavggtvtiscqslqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0461]
》u4568ek260-ahf05081-vl(seq id no:[])
[0462]
avltqtaspvsaavggtvtiscqstqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0463]
》u4568ek260-ahf05082-vl(seq id no:[])
[0464]
avltqtaspvsaavggtvtiscqshqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0465]
》u4568ek260-ahf05083-vl(seq id no:[])
[0466]
avltqtaspvsaavggtvtiscqskqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0467]
》u4568ek260-ahf05087-vl(seq id no:[])
[0468]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqkvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0469]
》u4568ek260-ahf05090-vl(seq id no:[])
[0470]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqyvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0471]
》u4568ek260-ahf05091-vl(seq id no:[])
[0472]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqmvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0473]
》u4568ek260-ahf05092-vl(seq id no:[])
[0474]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqtvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0475]
》u4568ek260-ahf05093-vl(seq id no:[])
[0476]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqfvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0477]
》u4568ek260-ahf05094-vl(seq id no:[])
[0478]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqvvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0479]
》u4568ek260-ahf05098-vl(seq id no:[])
[0480]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvyknkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0481]
》u4568ek260-ahf05105-vl(seq id no:[])
[0482]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvyrnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0483]
》u4568ek260-ahf05106-vl(seq id no:[])
[0484]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvyhnkelswfqqkpgqppkllisyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0485]
》u4568ek260-ahf05108-vl(seq id no:[])
[0486]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastsasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0487]
》u4568ek260-ahf05109-vl(seq id no:[])
[0488]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastnasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0489]
》u4568ek260-ahf05111-vl(seq id no:[])
[0490]
avltqtaspvsaavggtvtiscqssqsvynnkelswfqqkpgqppkllisyastlahgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclggyastidmwafgggtevvvk
[0491]
可变区dna序列：
[0492]
重链：
[0493]
》u4568ek260-ahf05121-vh(seq id no:[])
[0494]
cagagcctggaggaaagcggtggtcgtctggtgaccccgggtggtagcctgaccctgacctgcaccgttagcggtttcagcctgagcacccacgacatcagctgggtgcgtcaagcgccgggcaagggtctggagtggatcggtgttattgcgcgtcgtggcagcacctactatgcgagctgggcgcggggccgtttcaccattagcaaaaccagcaccaccgtggacctgaaaatcaccagcccgaccattgaagataccgcgacctacttttgcgcgcgtgaggaattcgatttttggggtcagggcaccctggtgaccgttagcagc
[0495]
轻链：
[0496]
》u4568ek260-ahf05071-vl(seq id no:[])
[0497]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagggtagccaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0498]
》u4568ek260-ahf05072-vl(seq id no:[])
[0499]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagatgagccaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctga
ccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0500]
》u4568ek260-ahf05074-vl(seq id no:[])
[0501]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagactagccaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0502]
》u4568ek260-ahf05078-vl(seq id no:[])
[0503]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcgcgcaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0504]
》u4568ek260-ahf05079-vl(seq id no:[])
[0505]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcaggcaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0506]
》u4568ek260-ahf05080-vl(seq id no:[])
[0507]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcctgcaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0508]
》u4568ek260-ahf05081-vl(seq id no:[])
[0509]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcactcaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0510]
》u4568ek260-ahf05082-vl(seq id no:[])
[0511]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagccatcaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0512]
》u4568ek260-ahf05083-vl(seq id no:[])
[0513]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcaagcaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0514]
》u4568ek260-ahf05087-vl(seq id no:[])
[0515]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaaaggtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0516]
》u4568ek260-ahf05090-vl(seq id no:[])
[0517]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaatatgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0518]
》u4568ek260-ahf05091-vl(seq id no:[])
[0519]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaatggtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0520]
》u4568ek260-ahf05092-vl(seq id no:[])
[0521]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaacggtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0522]
》u4568ek260-ahf05093-vl(seq id no:[])
[0523]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaatttgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0524]
》u4568ek260-ahf05094-vl(seq id no:[])
[0525]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaagtggtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctga
ccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0526]
》u4568ek260-ahf05098-vl(seq id no:[])
[0527]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaagcgtttacaagaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0528]
》u4568ek260-ahf05105-vl(seq id no:[])
[0529]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaagcgtttaccggaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0530]
》u4568ek260-ahf05106-vl(seq id no:[])
[0531]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaagcgtttaccataacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0532]
》u4568ek260-ahf05108-vl(seq id no:[])
[0533]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccagtgcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0534]
》u4568ek260-ahf05109-vl(seq id no:[])
[0535]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccaatgcgagcggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0536]
》u4568ek260-ahf05111-vl(seq id no:[])
[0537]
gcggtgctgacccagaccgcgagcccggttagcgcggcggtgggtggcaccgttaccatcagctgccagagcagccaaagcgtttacaacaacaaggagctgagctggttccagcaaaagccgggtcagccgccgaaactgctgattagctatgcgagcaccctggcgcatggtgtgccgagccgtttcaaaggcagcggtagcggcacccaatttaccctgaccatcagcgacctggagtgcgacgatgcggcgacctactattgcctgggtggctacgcgagcaccattgatatgtgggcgtttggtggcggtaccgaagtggttgtgaag
[0538]
实施例5
[0539]
抗原名称：肽2(肽1593)
[0540]
抗原序列：tdaatlaqeagnferc
[0541]
免疫原：肽-klh缀合物
[0542]
宿主菌株：新西兰兔
[0543]
qc结果：
[0544]
·
间接elisa：
[0545]
·
包被抗原：tdaatlaqeagnferc(u5912ej300-1)
[0546]
·
包被浓度：1μg/ml，100μl/孔
[0547]
·
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液，ph 7.4
[0548]
·
二抗：抗兔igg fc单克隆二抗(min x hu,ms,rt,sh,bv,gt,camel)(hrp缀合物)(genscript，货号a01856)
[0549]
表14：上清液的elisa结果：
[0550][0551]
滴度是s/n(信号/阴性)》＝2.1的最高稀释度，阴性对照中的od450是两次技术重复的平均值。
[0552]
qc结果：
[0553]
·
间接elisa：
[0554]
·
包被抗原：tdaatlaqeagnferc
[0555]
·
包被浓度：1μg/ml，100μl/孔
[0556]
·
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液，ph 7.4
[0557]
·
二抗：抗兔igg fc单克隆二抗(min x hu,ms,rt,sh,bv,gt,camel)(hrp缀合物)(genscript，货号a01856)
[0558]
表15：重组monorab抗体的elisa结果：
[0559][0560]
滴度是s/b(信号/空白)》＝2.1的最高稀释度，空白中的od450是两次技术重复的平均值。1mg/ml的起始浓度和相应的稀释比基于实际浓度计算。
[0561]
其他实施方案
[0562]
尽管已经结合其具体实施方式对本发明进行描述，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。