一种融合蛋白及其制备与应用

技术特征：
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从n端到c端依次包括：sec2突变体、连接短肽和ingr，所述sec2突变体在如seq id no:18所示序列的第20、22、118和/或122位氨基酸残基发生突变，所述连接短肽的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述ingr的氨基酸序列如seq id no:5所示。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述sec2突变体在如seq id no:18所示序列上具有t20l、g22e、h118a、h122a中的4、3、2或1个氨基酸取代；较佳地，所述sec2突变体的氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:8或seq id no:11所示。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no:2、seq id no:7、seq id no:10所示；较佳地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中seq id no:1、seq id no:6、seq id no:9所示。4.一种融合基因，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的融合蛋白；较佳地，其核苷酸序列如序列表中seq id no:1、seq id no:6、seq id no:9所示。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含如权利要求4所述的融合基因；较佳地，所述重组表达载体的骨架载体为pet-28a-tev。6.一种转化体，其特征在于，其通过在宿主中导入如权利要求4所述的融合基因或者如权利要求5所述的重组表达载体即得；较佳地，所述宿主为大肠杆菌，优选为大肠杆菌e.colibl21(de3)细胞或者e.coli tg1。7.一种融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)获得如权利要求6所述的转化体；(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述融合蛋白。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纯化包括将所述表达所得的菌体经超声波破碎后离心收集上清液，经过两次ni亲合层析即可；较佳地，所述ni亲合层析包括以0.2-0.8ml/min的上样速度将样品上样于预先平衡好的ni亲合层析柱；使用8-12个柱体积的平衡缓冲液洗涤后用洗脱缓冲液洗脱即可，优选使用10个柱体积的平衡缓冲液洗涤；更佳地，所述平衡缓冲液为含有20-80mm咪唑的平衡缓冲液，其组成优选为：20-30mm tirs-hcl，800-1000mm nacl，20-80mm咪唑，和/或，所述平衡缓冲液的ph值为7.2～8.0；和/或，所述洗脱缓冲液为含有250-300mm咪唑的洗脱缓冲液，其组成优选为：20-30mm tirs-hcl，800-1000mm nacl，250-300mm咪唑；和/或，所述洗脱缓冲液的ph值为7.2～8.0。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述的两次ni亲合层析之间还包括超滤脱盐的步骤；较佳地，在所述超滤脱盐后还包括与tev蛋白酶混合酶切的步骤；更佳地，所述超滤脱盐后的产物与所述tev蛋白酶的摩尔比为1:5；和/或，所述酶切的时间为24h。10.一种如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白、如权利要求4所述的融合基因、如权
利要求5所述的重组表达载体、或如权利要求6所述的转化体在制备药物中的应用；优选在制备治疗肿瘤的药物中的应用，更优选在制备治疗肿瘤免疫的药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种融合蛋白，其从N端到C端依次包括：SEC2突变体、连接短肽和iNGR，所述SEC2突变体在如SEQ ID NO:18所示序列的第20、22、118和/或122位氨基酸残基发生突变，所述连接短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述iNGR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法和应用。本发明的靶向性融合蛋白可特异性靶向并浸润到肿瘤组织微环境，大幅度提升了超抗原的肿瘤特异性和血管通透性，提高了对肿瘤的杀伤效率，从而用于治疗患者时可有效提高患者的存活能力，具有良好的临床应用价值。有良好的临床应用价值。


技术研发人员：徐明恺 张成刚 张惠文
受保护的技术使用者：中国科学院沈阳应用生态研究所
技术研发日：2021.01.04
技术公布日：2022/7/9