一种人载脂蛋白A-I的高效纯化方法与流程

一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法。


背景技术：

2.载脂蛋白a-i(apolipoprotein a-i，apoa-i)是人血清或血浆中高密度脂蛋白(hdl，highdensity lipoprotein)的主要结构和功能蛋白，hdl主要参与胆固醇从外周组织到肝脏的逆向转运过程。apoa-i是卵磷脂胆固醇酰基转移酶的活化剂。目前国内外apoa-i测定试剂盒大多采用免疫透射比浊法(immunoturbidimetric assay,ita)，因其快速、准确的特点，适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用大批量标本的测定。为了满足临床检验需要，大批量制备高纯度apoa-i抗原用于开发试剂盒所需要的apoa-i抗体显得非常重要。
3.目前，apoa-i的传统纯化方法有超高速离心法、凝胶电泳分离纯化法、离子交换层析法、有机溶剂沉淀法、凝胶过滤层析和高效液相法等。现在apoa-i纯化方法一般为超速离心法、离子交换层析、凝胶过滤层析、有机溶剂沉淀法等几种方法相结合。处理步骤较为繁琐，使用的仪器设备较多，使得纯化规模小、成本较高、蛋白活性差和得率较低等问题，导致人载脂蛋白a-i的纯化效果不理想。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，提高人载脂蛋白a-i的纯化效果。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，包括以下步骤：
6.对获取的血清或血浆样本进行冻融处理，并将冻融后的所述样本经过离心过滤，得到澄清样本；
7.利用1.4％～2％的盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本；
8.对所述除脂样本进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化，得到含不同纯度目的蛋白的洗脱液；
9.将达到目标纯度的所述洗脱液进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品，其中，所述目标纯度为疏水层析纯度大于或等于25％，离子交换层析纯度大于或等于85％。
10.其中，对获取的血清或血浆样本进行冻融处理，并将冻融后的所述样本经过离心过滤，得到澄清样本，包括：
11.将获取的血清或血浆样本在-20℃～-80℃条件下，冰冻24小时或大于24小时；
12.将冰冻后的所述血清或血浆样本在2℃～8℃条件下进行解冻；
13.将冻融后的所述血清或血浆样本经过离心过滤，得到澄清样本。
14.其中，将冻融后的所述血清或血浆样本经过离心过滤，得到澄清样本，包括：
15.在8000rpm～10000rpm的转速下，将冻融后的所述血清或血浆样本离心20分钟～30分钟，弃沉淀，将离心后的上清过滤后，得到所述澄清样本。
16.其中，利用1.4％～2％的盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本，包括：
17.在所述澄清样本中加入1.4％～2％的盐类沉淀剂，并在搅拌混匀后，利用高速离心机以6000rpm～8000rpm离心5分钟～40分钟；
18.收集离心后的上清液，获得除脂样本。
19.其中，将达到目标纯度的所述洗脱液进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品，包括：
20.将所述含不同纯度目的蛋白洗脱液中达到目标纯度部分进行混合，并加入1.4％～2％的沉淀剂搅拌混匀；
21.用高速离心机以5000rpm～8000rpm离心5分钟～40分钟，并将得到的沉淀用含20mm～50mm tris，100mm～300mm nacl缓冲液进行溶解和透析；
22.对透析处理后的蛋白进行检测，并对检测合格的所述蛋白进行冷冻干燥，得到对应的载脂蛋白a-i。
23.其中，对透析处理后的蛋白进行检测，并对检测合格的所述蛋白进行冷冻干燥，得到对应的载脂蛋白a-i，包括：
24.利用对应的试剂盒测定透析后的蛋白浓度，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度；
25.将检测合格的所述蛋白进行冷冻干燥，得到对应的载脂蛋白a-i。
26.本发明的一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，将获取的血清或血浆样本在-20℃～-80℃条件下，冰冻至少24小时，然后在2℃～8℃条件下进行解冻，在8000rpm～10000rpm的转速下，将冻融后的所述血清或血浆样本离心20分钟～30分钟，将产生的沉淀过滤后，得到所述澄清样本；利用对应的1.4％～2％盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本；对所述除脂样本进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化，得到对应的含不同纯度目的蛋白的洗脱液；将所述含不同纯度目的蛋白的洗脱液的高纯部分进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品，提高人载脂蛋白a-i的纯化效率和得率。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是本发明第一实施例提供的一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法。
29.图2是本发明第二实施例提供的一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法。
30.图3是本发明第三实施例提供的一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法。
31.图4是本发明提供的第一实施例疏水层析部分样品电泳图。
32.图5是本发明提供的第一实施例阴离子交换层析部分样品电泳图。
33.图6是本发明提供的第一实施例用不同量的沉淀剂处理样品电泳图。
34.图7是本发明提供的第二实施例疏水层析部分样品电泳图。
35.图8是本发明提供的第二实施例阴离子交换层析部分样品电泳图。
36.图9是本发明提供的第二实施例用不同量的沉淀剂处理样品电泳图。
37.图10是本发明提供的第三实施例疏水层析部分样品电泳图。
38.图11是本发明提供的第三实施例阴离子交换层析部分样品电泳图。
39.图12是本发明提供的第三实施例用不同量的沉淀剂处理样品电泳图。
具体实施方式
40.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
41.在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
42.请参阅图1，本发明第一实施例提供一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，，包括以下步骤：
43.s101、对获取的血清或血浆样本进行冻融处理，并将冻融后的所述样本经过离心过滤，得到澄清样本。
44.具体的，将人血清或血浆置于-20℃～-40℃条件下放置24h以上。将冰冻后的人血清或血浆置于2℃～8℃解冻。取冻融后的血清或血浆，用高速离心机以8000rpm～9000rpm离心30分钟，弃沉淀，用定性滤纸过滤漂浮的脂类物质，得到澄清样本。
45.s102、利用1.5％的盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本。
46.具体的，在过滤好的澄清样本中加入1.5％的盐类沉淀剂(磷钨酸钠：七水硫酸镁，1：4)，搅拌混匀，用高速离心机以6000rpm离心15分钟，弃沉淀，留上清，获得除低密度脂蛋白(ldl)血清即除脂样本。
47.s103、对所述除脂样本进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化，得到含不同纯度目的蛋白的洗脱液。
48.具体的，疏水层析纯化
49.选用ge生产的型号为octyl sepharose 4 fast flow疏水层析填料，利用第一平衡缓冲液(50mm tris-hcl 150mm nacl)平衡疏水柱，用第一洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 100mm nacl)洗脱杂蛋白，用第二洗脱缓冲液(50mm tris-hcl)洗脱目的蛋白apoa-i，并分管收集对应的洗脱液。然后，利用聚丙烯酰胺(sds-page)凝胶电泳检测各管洗脱液蛋白纯度，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述洗脱液混合在一起，得到第一洗脱液。如图4所示，其中，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-7：疏水层析部分样品。
50.将疏水层析纯化后的所述第一洗脱液进行离子交换层析纯化，得到对应的第二洗脱液：
51.离子交换层析纯化
52.选用ge生产的型号为deae sepharose f.f.离子交换层析填料，利用第二平衡缓冲液(50mm tris-hcl 50mm nacl)平衡离子交换柱，用第三洗脱缓冲液(50mm tris-hcl
100mm nacl)洗脱杂蛋白，用第四洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 300mm nacl)洗脱目的蛋白apoa-i，分管收集洗脱液，得到含不同纯度目的蛋白的对应的第二洗脱液，如图5所示，其中，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-5：阴离子交换层析杂蛋白；6-7：阴离子交换层析apoa-i；8：阴离子交换层析杂蛋白。
53.s104、将达到目标纯度的所述洗脱液进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品。
54.具体的，在合在一起后的纯度较高洗脱液中加入2％的沉淀剂，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述第二洗脱液混合在一起，加入2％的沉淀剂搅拌混匀，用高速离心机以6000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用含20mm～50mm tris，150mm nacl缓冲液溶解并透析。如图6所示，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2：用沉淀剂处理前apoa-i；3-10：用不同量沉淀剂处理后的apoa-i。
55.在全自动生化分析仪上用apoa-i测定试剂盒测试透析好的apoa-i的蛋白浓度，用sds-page凝胶电泳检测蛋白纯度。
56.将纯化好的apoa-i冷冻干燥获得成品。
57.请参阅图2，本发明第二实施例提供一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，，包括以下步骤：
58.s201、对获取的血清或血浆样本进行冻融处理，并将冻融后的所述样本经过离心过滤，得到澄清样本。
59.具体的，将人血清或血浆置于-40℃～-80℃条件下放置24h以上。将冰冻后的人血清或血浆置于2℃～8℃解冻。取冻融后的血清或血浆，用高速离心机以9000rpm～10000rpm离心30分钟，弃沉淀，用定性滤纸过滤漂浮的脂类物质，得到澄清样本。
60.s202、利用2.0％的盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本。
61.具体的，在过滤好的澄清样本中加入2.0％的盐类沉淀剂(磷钨酸钠：七水硫酸镁，1：3)，搅拌混匀，用高速离心机以8000rpm离心15分钟，弃沉淀，留上清，获得除脂样本。
62.s203、对所述除脂样本进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化，得到含不同纯度目的蛋白的洗脱液。
63.具体的，疏水层析纯化
64.选用ge生产的型号为phenyl sepharose
tm
high performance疏水层析填料，利用第一平衡缓冲液(50mm tris-hcl 10mm nacl)平衡疏水柱，用第一洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 50mm nacl)洗脱杂蛋白，用第二洗脱缓冲液(20mm tris-hcl)洗脱目的蛋白apoa-i，并分管收集对应的洗脱液。然后，利用聚丙烯酰胺(sds-page)凝胶电泳检测各管洗脱液蛋白纯度，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述洗脱液混合在一起，得到第一洗脱液。如图7所示，其中，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-10：疏水层析杂蛋白；11-12：疏水层析较纯apoa-i。
65.将疏水层析纯化后的所述第一洗脱液进行离子交换层析纯化，得到对应的第二洗脱液：
66.离子交换层析纯化
67.选用ge生产的型号为deae sepharose f.f.离子交换层析填料，利用第二平衡缓冲液(50mm tris-hcl 50mm nacl)平衡离子交换柱，用第三洗脱缓冲液(50mm tris-hcl
50mm nacl)洗脱杂蛋白，用第四洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 150mm nacl)洗脱目的蛋白apoa-i，分管收集洗脱液，得到对应的第二洗脱液，如图8所示，其中，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-6：阴离子交换层析杂蛋白；7：阴离子交换层析apoa-i；8-9：阴离子交换层析杂蛋白。
68.s204、将达到目标纯度的所述洗脱液进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品。
69.具体的，在合在一起后的纯度较高洗脱液中加入2％的沉淀剂，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述第二洗脱液混合在一起，加入2％的沉淀剂搅拌混匀，用高速离心机以6000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用含20mm tris，150mm nacl缓冲液溶解并透析。如图9所示，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-8：杂蛋白；9：用沉淀剂处理阴离子交换层析样品离心后上清；3-10：用不同量沉淀剂处理阴离子交换层析样品离心后沉淀。
70.在全自动生化分析仪上用apoa-i测定试剂盒测试透析好的apoa-i的蛋白浓度，用sds-page凝胶电泳检测蛋白纯度。
71.将纯化好的apoa-i冷冻干燥获得成品。
72.请参阅图3，本发明第三实施例提供一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，，包括以下步骤：
73.s301、对获取的血清或血浆样本进行冻融处理，并将冻融后的所述样本经过离心过滤，得到澄清样本。
74.具体的，将人血清或血浆置于-40℃～-80℃条件下放置24h以上。将冰冻后的人血清或血浆置于2℃～8℃解冻。取冻融后的血清，用高速离心机以9000rpm～10000rpm离心30分钟，弃沉淀，用定性滤纸过滤漂浮的脂类物质，得到澄清样本。
75.s302、利用1.8％的盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本。
76.具体的，在过滤好的澄清样本中加入1.8％的盐类沉淀剂(磷钨酸钠：七水硫酸镁，1：4)，搅拌混匀，用高速离心机以8000rpm离心15分钟，弃沉淀，留上清，获得除低密度脂蛋白(ldl)血清。
77.s303、对所述除脂样本进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化，得到含不同纯度目的蛋白的洗脱液。
78.具体的，疏水层析纯化
79.选用ge生产的型号为butyl sepharose 4ff疏水层析填料，利用第一平衡缓冲液(50mm tris-hcl 100mm nacl)平衡疏水柱，用第一洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 50mm nacl)洗脱杂蛋白，用第二洗脱缓冲液(10mm tris-hcl)洗脱目的蛋白apoa-i，并分管收集对应的洗脱液。然后，利用聚丙烯酰胺(sds-page)凝胶电泳检测各管洗脱液蛋白纯度，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述洗脱液混合在一起，得到第一洗脱液。如图10所示，其中，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-3：疏水层析杂蛋白；4-9：疏水层析较纯apoa-i。
80.将疏水层析纯化后的所述第一洗脱液进行离子交换层析纯化，得到对应的第二洗脱液：
81.离子交换层析纯化
82.选用ge生产的型号为source 30q.离子交换层析填料，利用第二平衡缓冲液(50mm tris-hcl 50mm nacl)平衡离子交换柱，用第三洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 50mm nacl)洗脱杂蛋白，用第四洗脱缓冲液(50mm tris-hcl 200mm nacl)洗脱目的蛋白apoa-i，分管收集洗脱液，得到对应的第二洗脱液，如图11所示，其中，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-7：阴离子交换层析杂蛋白；8：阴离子交换层析apoa-i；9-10：阴离子交换层析杂蛋白。
83.s304、将达到目标纯度的所述洗脱液进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品。
84.具体的，在合在一起后的纯度较高洗脱液中加入2％的沉淀剂，将含量较多纯度较高的洗脱液合在一起，即将满足混合条件的所述第二洗脱液混合在一起，加入2％的沉淀剂搅拌混匀，用高速离心机以6000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用含20mm-50mm tris，150mm nacl缓冲液溶解并透析。如图12所示，目的蛋白在约28kd处，1：marker；2-6：用沉淀剂处理前样品；7-11：用不同量沉淀剂处理后样品。
85.在全自动生化分析仪上用apoa-i测定试剂盒测试透析好的apoa-i的蛋白浓度，用sds-page凝胶电泳检测蛋白纯度。
86.将纯化好的apoa-i冷冻干燥获得成品。
87.与现有技术相比具有以下效果：
88.1.在一般的实验室条件下就可以进行蛋白的纯化，无需昂贵的超高速离心机。
89.2.无需使用丙酮、乙醚等有毒有害的有机溶剂，保证操作人员的健康及实验室或生产车间的安全；
90.3.各纯化步骤apoa-i的损失较少，得率较高，原料利用率高；
91.4.无使用有机溶剂处理等影响蛋白活性的纯化步骤，蛋白活性高，有利于免疫动物后产生高效价的抗体；
92.5.纯化过程用到的仪器设备简单，原料处理量大，易于放大生产规模，提高apoa-i的产量。
93.本发明的有益效果：
94.1.通过-20℃～-80℃冷冻及2℃～8℃解冻后离心过滤处理，除去血浆中纤维蛋白原及容易析出的脂类蛋白，以利于后续的纯化及目的蛋白纯度的提高。
95.2.通过盐类沉淀剂将人血浆或血清样本中的绝大部分低密度脂蛋白(ldl)除去，获得含有较高浓度高密度脂蛋白(hdl)及apoa-i的血清，区别于其他用盐类沉淀剂将脂类的高密度脂蛋白(hdl)和低密度脂蛋白(ldl)全部沉淀再进行纯化的方法。本发明所使用盐类沉淀剂包括但不局限于磷钨酸-镁组合沉淀剂或磷钨酸盐和其他2价不同金属离子(mn2 、ca2 、ni2 、co2 )组合沉淀剂，在此不一一列举。
96.3.通过疏水层析方法纯化除低密度脂蛋白(ldl)而含有大部分高密度脂蛋白(hdl)和apoa-i的人血清或血浆原料，获得apoa-i粗提品。本发明所使用疏水填料包括但不局限于butyl sepharose 4fast flow、butyl sepharose 6fast flow、butyl sepharose high performance、octyl sepharose 4fast flow、phenyl sepharose 4fast flow、phenyl sepharose 6fast flow、phenyl sepharose
tm
high performance，在此不一一列举。
97.4.通过阴离子交换层析方法纯化apoa-i粗提品，获得高纯度apoa-i；本发明所使用阴离子交换填料包括但不局限于deae sepharose fast flow、source30q，在此不一一列
举。
98.5.通过盐类沉淀剂浓缩沉淀离子交换层析获得的高纯度目的蛋白(apoa-i)，起到去除残存的微量的杂蛋白(alb、igg等)，进一步提高目的蛋白纯度及浓缩目的蛋白的作用。
99.本发明的一种人载脂蛋白a-i的高效纯化方法，将获取的血清或血浆样本在-20℃～-80℃条件下，冰冻至少24小时，然后在2℃～8℃条件下进行解冻，在8000rpm～10000rpm的转速下，将冻融后的所述血清或血浆样本离心20分钟～30分钟，将产生的沉淀过滤后，得到所述澄清样本；利用对应的1.4％～2％盐类沉淀剂对所述澄清样本进行盐析纯化，得到除脂样本；对所述除脂样本进行疏水层析纯化和离子交换层析纯化，得到对应的含不同纯度目的蛋白的洗脱液；将所述含不同纯度目的蛋白的洗脱液的高纯部分进行混合，并将经过盐析沉淀浓缩、透析和离心过滤处理及检测合格后的蛋白进行冷冻干燥，得到载脂蛋白a-i纯品，提高人载脂蛋白a-i的纯化效率和得率。
100.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。