代谢改造提升异源多杀菌素菌株发酵产量的方法

1.本发明属于合成生物学领域，具体涉及通过代谢改造提升异源多杀菌素菌株发酵产量的方法。


背景技术：

2.聚酮化合物具有多种生理活性，可作为抗生素、抗肿瘤药物等，该类化合物大多数都有放线菌产生。但放线菌种类众多，很多放线菌难以实现遗传改造或者发酵放大，因此，常使用模式菌株作为异源宿主对聚酮化合物进行发酵生产，即将聚酮化合物基因簇转入模式菌株中，构建异源表达菌株，以期推进其产业化进程，但往往在异源菌株中得到的聚酮化合物的产量较低。
3.以聚酮化合物中的多杀菌素为例，多杀菌素作为仅次于阿维菌素的第二大杀虫剂，是目前被广泛使用的具有广谱杀虫活性的抗生素。因其具有高效、无残留、对人畜无害等优点而获得三次美国“总统绿色化学品挑战奖”，也是少数被欧盟批准可在有机作物上使用的杀虫剂。多杀菌素是一种被叫做刺糖多孢菌(saccharopolyspora spinosa)的放线菌所产生，该菌株于上世纪八十年代在维尔京群岛上一座甘蔗酿酒厂附近的土壤中首次被人们分离获得。然而，该菌遗传操作极其困难，发酵从种子到发酵周期长达22天，而且在发酵过程中极易发生污染，因此，为了规避该品种野生型菌种面临的遗传操作困难，发酵工艺不成熟的问题，申请人在前期已经进行了“多杀菌素异源表达”。多杀菌素的基因簇约90kb，按照功能可分为四部分：1)pks基因：spna、spnb、spnc、spnd、spne，其中spnabc位于一个操纵子(operon)，spnde位于一个操纵子；2)催化pks环内c-c键形成的基因：spnf、spnj、spnl、spnm；3)福乐糖胺合成与加载：spnn、spno、spnp、spnq、spnr、spns；4)鼠李糖基配体的加载与修饰：spnh、spni、spnk、spng。此外，还包括位于基因簇外的鼠李糖合成基因gtt、epi、gdh、kre。
4.申请人在前期研究中已经将多杀菌素在模式链霉菌streptomyces albus j1074中实现异源表达，并将整个基因簇中表达较低的聚酮合酶spne、鼠李糖合成相关基因(gtt，epi，gdh，kre，spni)和福乐糖胺合成相关基因(spno，spnn，spinq，spnr，spns)用强启动子进行过表达，得到多杀菌素异源菌株oe3，但摇瓶产量仅达到～1mg/l(tan g y,deng k,liu x,et al.2017.heterologous biosynthesis of spinosad:an omics-guided large polyketide synthase gene cluster reconstitution in streptomyces[j].acs synth biol,6(6):995-1005.)。其余也有研究同样将多杀菌素的基因簇转入异源模式链霉菌s.albus j1074中，并且对基因簇进行了重排(song c,luan j,cui q,et al.2019.enhanced heterologous spinosad production from a 79-kb synthetic multioperon assembly[j].acs synth biol,8(1):137-147.)，该研究中的重排方式是将多杀菌素的基因簇划分为5个组，包括pks聚合酶(spna-spne)、聚酮交叉桥接基因(spnj，spnm，spnf，spni)、鼠李糖合成基因(gtt，gdh，epi，kre)、鼠李糖甲基化(spni，spnk，spnh)和福乐糖胺转移酶(spnp)、福乐糖胺合成基因(spno，spnn，spnq，spnr)和甲基化基因
(spns)，在每个组的基因上都替换了一个强组成型的启动子，但得到的菌株的摇瓶发酵产量也仍然在1mg/l上下，离产业化尚有很长距离。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法。本发明的另一目的在于提供一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法。本发明的再一目的在于提供一种高产多杀菌素的菌株。
[0006]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007]
一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，为利用在聚酮化合物异源表达菌株中可识别的强启动子替换聚酮合酶的启动子。所述的聚酮化合物异源表达菌株为转有聚酮化合物基因簇的链霉菌。该方法中，启动子替换不是随意替换，以不破坏聚酮化合物基因簇的原操纵子(operon)为优；但如果某个聚酮合酶表达量过少，可以破坏原操纵子，用强启动子进行该基因的单独过表达。
[0008]
一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，为增加聚酮化合物前体的供应。所述的聚酮化合物前体包括丙二酰辅酶a、甲基丙二酰辅酶a、乙酰辅酶a和丙酰辅酶a等。增加聚酮化合物亲体的供应采用过表达乙酰辅酶a羧化酶(acc)、丙酰辅酶a羧化酶(pcc)和乙酰辅酶a合成酶(acsa2)基因，可以增加丙二酰辅酶a、甲基丙二酰辅酶a、乙酰辅酶a和丙酰辅酶a的供应。
[0009]
上述聚酮化合物包括多杀菌素。
[0010]
一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法，为将多杀菌素的聚酮合酶的启动子用组成型强启动子进行替换。所述的多杀菌素的聚酮合酶的启动子包括spna、spnb、spnc、spnd、spne的启动子；所述的组成型强启动子包括rpslp-cf、rpslp-tp、kasop、kasop-rpslp-cf、spl44、srl39、spl42、srl23、spl39、srl37、srl15、ksaop-kinase等。
[0011]
一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法，为在多杀菌素异源表达链霉菌中过表达乙酰辅酶a羧化酶、丙酰辅酶a羧化酶和乙酰辅酶a合成酶基因中的一种或多种。
[0012]
一种高产多杀菌素的菌株，为下述菌株中的一种：
[0013]
(1)将多杀菌素异源表达链霉菌spna基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0014]
(2)将多杀菌素异源表达链霉菌spna基因和spnd基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0015]
(3)将多杀菌素异源表达链霉菌spna基因、spnd基因和spnc基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0016]
(4)将多杀菌素异源表达链霉菌spna基因、spnd基因、spnc基因和spnb基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0017]
(5)过表达丙酰辅酶a羧化酶、乙酰辅酶a合成酶的菌株(2)；
[0018]
(6)过表达丙酰辅酶a羧化酶、乙酰辅酶a羧化酶和乙酰辅酶a合成酶的菌株(2)。
[0019]
上述多杀菌素异源表达链霉菌优选为转有多杀菌素基因簇的白色链霉菌。
[0020]
进一步地，所述的高产多杀菌素的菌株，为下述菌株中的一种：
[0021]
(1)将链霉菌oe3菌株spna基因的启动子替换为强启动子rpslp-cf得到的菌株a；
l,zhou y,et al.2016.development of streptomyces sp.fr-008as an emerging chassis[j].synth syst biotechnol,1(3):207-214)，如图1所示，获得了一系列在s.albus中表达强度不同的启动子。另外，申请人前期研究中(tan g y,deng k,liu x,et al.2017.heterologous biosynthesis of spinosad:an omics-guided large polyketide synthase gene cluster reconstitution in streptomyces[j].acs synth biol,6(6):995-1005.)，已经将多杀菌素约90kb的基因簇转在模式链霉菌s.albus j1074中实现异源表达，并也利用kasop实现鼠李糖合成基因gtt、epi的过表达，kasop实现鼠李糖合成基因gdh、kre的过表达，强启动子rpslp-cf实现spni的过表达，kasop实现spnq、spnn的过表达，强启动子rpslp-cf实现spnq、spnr的过表达，强启动子rpslp-tp实现spns的过表达，以及kasop实现聚酮合酶spne的过表达，得到多杀菌素异源菌株oe3。下述实施例将在申请人前期构建的oe3菌株的基础上利用已经表征过的启动子构建新的多杀菌素异源菌株。
[0050]
实施例1
[0051]
本实施例所用引物信息见表1。
[0052]
表1
[0053]
[0054][0055]
(一)替换oe3菌株多杀菌素聚酮合酶的启动子，改造链霉菌
[0056]
(1)替换spna的启动子
[0057]
首先，构建pjtu1278-spna质粒。该质粒构建的目的是以强启动子rpslp-cf替换原spna的启动子。使用引物对rpslp-cf-f和rpslp-cf-r以plh8质粒(liu q,xiao l,zhou y,et al.2016.development of streptomyces sp.fr-008 as an emerging chassis[j].synth syst biotechnol,1(3):207-214)为模板扩增启动子rpslp-cf，使用引物对spna-ur和spna-xbai-uf以oe3的基因组dna为模板扩增上游同源臂2138bp，使用引物对spna-df和spna-hindiii-dr以oe3的基因组dna为模板扩增下游同源臂2154bp。将扩增得到的三片段使用oe-pcr连接三片段，然后使用hindiii和xbai酶切酶连到pjtu1278载体，得到质粒pjtu1278-spna(见图2)。
[0058]
质粒构建完后经过酶切验证，并最终通过测序验证得到正确的质粒。其中，
pjtu1278质粒是个广泛应用的穿梭载体，可以在大肠杆菌和链霉菌内复制，并含有接合转移元件可以进行接合转移，另外还有硫链丝菌素抗性筛选标记可以用来筛选。
[0059]
通过三亲本接合转移方法(tan g y,deng k,liu x,et al.2017.heterologous biosynthesis of spinosad:an omics-guided large polyketide synthase gene cluster reconstitution in streptomyces[j].acs synth biol,6(6):995-1005.)将目的质粒pjtu1278-spna转入链霉菌oe3中。先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。设计引物进行pcr验证。pcr验证引物设计为同源臂的基因上设计的验证引物。使用primer primer5设计，引物设计为：上下游引物设计在左右同源臂的基因上，包含插入的启动子rpslp-cf或原始启动子。利用设计引物spna_cpf和spna_cpr，进行pcr验证。双交换示意图如图3，改造后的菌株，可以pcr扩增得到目的片段1284bp，而对应的片段在改造前的菌株中只能扩增得到954bp。通过pcr可以说明菌株发生了双交换(如图4中的160、168)，即得到了所要的目的菌株a。
[0060]
(2)替换spnd的启动子
[0061]
该质粒构建的目的是以强启动子rpslp-tp替换原spnd的启动子。通过设计引物spnd-uha-f和spnd-uha-r以oe3的基因组dna为模板扩增上游同源臂1873bp，spnd-dha-f和spnd-dha-kpni-r以oe3的基因组dna为模板扩增下游同源臂2146bp，spnd-rpstp-d和spnd-rpstp-f以plh11质粒(liu q,xiao l,zhou y,et al.2016.development of streptomyces sp.fr-008as an emerging chassis[j].synth syst biotechnol,1(3):207-214)为模板扩增启动子rpslp-tp。使用oe-pcr连接三片段，然后使用kpni和xbai酶切酶连到pjtu1278载体，得到质粒pjtu1278-spnd(见图5)。质粒进行酶切验证，并最终经过测序验证得到正确的质粒。
[0062]
将质粒pjtu1278-spnd通过结合转移转化到a菌株中，按照(1)中的方法进行筛选，先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。使用引物进行pcr验证，使用primer primer 5设计，引物设计为：上下游引物设计在左右同源臂的基因上，包含插入的启动子rpslp-tp或原始启动子。设计引物d-f和d-r进行pcr验证。双交换示意图见图6，改造后的菌株，可以pcr扩增得到1118bp的目的片段，改造前的菌株扩增得到的片段为727bp。通过pcr可以说明菌株发生了双交换(如图7中的7、9、13)，即得到目的菌株ad。
[0063]
(3)替换spnc的启动子
[0064]
该质粒构建的目的是以强启动子kasop替换原spnc的启动子。通过设计引物c-uha-f和c-uha-r以oe3的基因组dna为模板扩增上游同源臂2216bp，c-dha-f和c-dha-r-bamhi以oe3的基因组dna为模板扩增下游同源臂2220bp，c-kasop-r和c-kasop-f以plh10质粒(liu q,xiao l,zhou y,et al.2016.development of streptomyces sp.fr-008 as an emerging chassis[j].synth syst biotechnol,1(3):207-214)扩增启动子kasop。使用oe-pcr连接三片段，然后使用bamhi和xbai酶切酶连到pjtu1278载体，得到质粒pjtu1278-spnc(见图8)。质粒进行酶切验证，并最终经过测序验证得到正确的质粒。
[0065]
将质粒pjtu1278-spnc通过结合转移转化到ad菌株中，按照(1)中的方法进行筛选，先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。设计引物进行pcr验证。使用primer primer 5设计引物，引物设计为：上游引物设计为扩增左同源臂的部分基因和插入的启动子kasop部分片段，下游引物设计为扩增右同源臂的部分基因和插入的启动子
kasop*部分片段。选取引物对c-u-f/902un-r-new和c-d-f/c-d-r进行pcr条件的摸索，最后选取进行pcr验证。双交换示意图见图9，突变株上游理论pcr产物大小962bp，下游1357bp。而对应的片段在改造前的菌株中并不能扩增得到，说明菌株发生了双交换，即得到目的菌株adc(如图10中的3、4)。
[0066]
(4)替换spnb的启动子
[0067]
该质粒构建的目的是以强启动子kasop-rpslp-cf替换原spnb的启动子。通过设计引物b-uha-f-saci和b-uha-r以oe3的基因组dna为模板扩增上游同源臂2175bp，b-dha-f和b-dha-r-ecori以oe3的基因组dna为模板扩增下游同源臂2144bp，b-korl-f和b-korl-r以plh9质粒(liu q,xiao l,zhou y,et al.2016.development of streptomyces sp.fr-008as an emerging chassis[j].synth syst biotechnol,1(3):207-214)为模板扩增启动子kasop-rpslp-cf。使用oe-pcr连接三片段，然后使用scai和ecori酶切酶连到pjtu1278载体，得到质粒pjtu1278-spnb(图11)。质粒进行酶切验证，并最终经过测序验证得到正确的质粒。
[0068]
将质粒pjtu1278-spnb通过结合转移转化到ad菌株和adc菌株中，按照(1)中的方法进行筛选，先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。设计引物进行pcr验证。使用primer 5设计引物，引物设计为：上游引物设计为扩增左同源臂的基因和插入的启动子kasop，下游引物设计为扩增右同源臂的基因和插入的启动子kasop。选取引物进行pcr条件的摸索，最后选取进行pcr验证。pjtu1278-spnb质粒与链霉菌基因组双交换示意图见图12，突变株上游理论pcr产物大小359bp，下游756bp。而对应的片段在改造前的菌株中并不能扩增得到，说明菌株发生了双交换，即得到目的菌株。如图13中的1、5、6、7、9、11、12为正确的adb菌株，图14中的1、4、6为正确的adcb菌株。
[0069]
(二)改造链霉菌的摇瓶发酵
[0070]
在白色链霉菌中s.albus j1074中异源表达多杀菌素，申请人前期发表的文献(tan g y,deng k,liu x,et al.2017.heterologous biosynthesis of spinosad:an omics-guided large polyketide synthase gene cluster reconstitution in streptomyces[j].acs synth biol,6(6):995-1005.)和别人做类似工作发表的文献(song c,luan j,cui q,et al.2019.enhanced heterologous spinosad production from a 79-kb synthetic multioperon assembly[j].acs synth biol,8(1):137-147.)中，均认为该发酵培养基(4％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)甘油，3％(w/v)可溶性淀粉，1.5％(w/v)difco大豆蛋白胨，1％(w/v)牛肉提取物，0.65％(w/v)蛋白胨，0.05％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)mgso4，0.2％(w/v)nacl，0.24％(w/v)caco3，调节ph至7.2)产量最高。培养方法为：划菌株的孢子琼脂块到装有10ml tsb的pa瓶中，培养约24h至菌的最佳生长状态(棒状菌丝体，不宜为爆炸团成球状)。按照5％-10％的转接量转接到二级种子液中继续培养，约24h后将二级发酵液吸取5ml菌液至装有40ml发酵培养基(4％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)甘油，3％(w/v)可溶性淀粉，1.5％(w/v)difco大豆蛋白胨，1％(w/v)牛肉提取物，0.65％(w/v)蛋白胨，0.05％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)mgso4，0.2％(w/v)nacl，0.24％(w/v)caco3，调节ph至7.2)。发酵条件为温度30℃、转速220rpm，发酵周期为7-11d。使用乙腈提取法进行产物萃取。即取1ml发酵液，离心(8000rpm，10min)收集菌体，弃去菌液，加入1ml乙腈，vortex 5min，超声10min(常温)，12000rpm离心10min后吸取上清液，过滤后用于后续的分析检测。
[0071]
将(一)中得到的各突变株按上述方法进行发酵，结果如图15所示。
[0072]
由于spnabc位于一个操纵子，所以当将spna用强启动子表达时，实际上是将spnabc一起过表达，得到的a菌株产量比原始oe3菌株提升7倍。而虽然spnde位于一个操纵子上，但是原始最初得到的异源表达菌株中spne表达太弱，因此最开始的oe3菌株已经将其单独高表达(tan g y,deng k,liu x,et al.2017.heterologous biosynthesis of spinosad:an omics-guided large polyketide synthase gene cluster reconstitution in streptomyces[j].acs synth biol,6(6):995-1005.)，所以本发明得到的ad菌株，即已经按照spnabc操作子将三个基因过表达，并单独又将spnd基因和spne基因分别过表达，也就是一个完成将多杀菌素聚酮合酶基因都换成s.albus j1074的组成型强启动子表达的改造菌株，其产量高达36.67mg/l。
[0073]
而在此基础上如果破坏其原始操纵子结构，比如将spnb、spnc基因单独过表达，得到的adc、adcb的菌株产量虽然比oe3更高，但是adc、adb、adcb菌株产量明显都比ad更低。说明启动子替换不是随意替换，以不破坏原操纵子(operon)为优。但如果某个聚酮合酶表达量过少(比如spne)，才可以破坏原操纵子，用强启动子进行该基因的单独过表达。
[0074]
实施例2
[0075]
(一)oe-ad-603菌株和oe-ad-603-209菌株的构建
[0076]
(1)oe-ad-603菌株的构建
[0077]
所用引物信息见表2。
[0078]
表2
[0079][0080][0081]
在改造聚酮合酶的启动子后，聚酮合酶的前体供应将变得关键。聚酮合酶的前体一般包括丙二酰辅酶a(malonyl-coa)、甲基丙二酰辅酶a(methylmalonyl-coa)、丙酰辅酶a(propionyl-coa)等。其中丙二酰辅酶a的合成是由乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-coa carboxylase，简称acc)催化乙酰辅酶a(acetyl-coa)形成，而甲基丙二酰辅酶a的合成是由丙酰辅酶a羧化酶(propionyl-coa carboxylase，简称pcc)催化丙酰辅酶a(propionyl-coa)合成。另外，乙酰辅酶a合成酶(acetyl-coa synthetase，acsa2)为acetyl-coa和
propionyl-coa合成酶。因此，要增加聚酮合酶的前体，需要将acc、pcc和acsa2一起过表达。
[0082]
由于s.albus j1074中的acc和pcc没有文献报道，所以选用s.coelicolor ch999的acc和pcc，其中，acc包含acca2和accbe亚基，而pcc包含acca2和pccbe亚基，也就是说acc和pcc共用acca2亚基。因此设计质粒pht603用于表达acsa2和pccbe。设计使用一个强启动子kasop控制三个基因(acsa、pccb、pcce)的表达，由于pccbe在基因组上是连在一起的，默认两个基因之间有rbs，因此在acsa/pccb分别加了rbs：gtatctgaaaggggatacgc。插入位点选择中断candicidin的pks基因canp2的启动子以及5’端的2495bp。
[0083]
质粒pht603通过酵母组装的方式构建，通过设计引物61u-fnew和63u-r以oe3的基因组dna为模板扩增上游同源臂2481bp，61d-f和61d-rnew以oe3的基因组dna为模板扩增下游同源臂2474bp，利用63kasop-f/61kasop-r以plh10质粒为模板扩增启动子kasop，scoasca-f/scoasca-r以s.coelicolor ch999的基因组dna为模板扩增acsa2基因，scopccb-f和scopcce-r以s.coelicolor ch999的基因组dna为模板扩增pccbe基因，426-1-f/f7-426-2-r以质粒prs426为模板扩增酵母组装所需的酵母helper片段，再利用三对引物f8-1278-1-f/f8-1278-1-r、f9-1278-2-f/f9-1278-2-r、f10-1278-3-f/f10-1278-3-r扩增pjtu1278质粒。使用酵母组装这些片段，得到质粒pht603。质粒进行酶切验证，并最终经过测序验证得到正确的质粒。
[0084]
将质粒pht603通过结合转移转化到实施例1中构建的ad菌株中，按照实施例1中的方法进行筛选，先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。设计引物进行pcr验证。使用primer primer 5设计引物，引物设计为：上游引物(603-up-f和603-up-r)设计为扩增左同源臂的基因至acsa2基因的部分片段，下游引物(603-down-f和603-down-r)设计为扩增右同源臂的基因至acsbe基因的部分片段。选取引物进行pcr条件的摸索，最后选取进行pcr验证。双交换示意图见图16，突变株上游理论pcr产物大小703bp，下游852bp，而对应的片段在改造前的菌株中并不能扩增得到，说明菌株发生了双交换，即得到目的菌株oe-ad-603(如图17)。
[0085]
(2)oe-ad-603-209菌株的构建
[0086]
所用引物信息见表3。
[0087]
表3
[0088][0089][0090]
设计使用一个启动子rpslp-cf控制acca2、accb和acce三个基因的表达，由于accbe在基因组上是连在一起的，默认量基因之间有rbs，因此，在acca2/accb加了rbs：gtatctgaaaggggatacgc。插入位点插入到j1074基因组的两个基因之间，不破坏任何基因结构。
[0091]
通过设计引物209-larm-f和209-larm-r以oe3的基因组dna为模板扩增上游同源臂2452bp，209-rarm-f和209-rarm-r以oe3的基因组dna为模板扩增下游同源臂2500bp，利用209-rps-f/209-rps-r以plh8质粒为模板扩增启动子rpslp-cf，scoacca2-f/scoacca2-r以s.coelicolor ch999的基因组dna为模板扩增acca2基因，scoaccb-f和scoaccb-r以s.coelicolor ch999的基因组dna为模板扩增accbe基因，利用三对引物209-1-f/209-1-r、209-2-f/209-2-r、209-3-f/209-3-r以pht603为模板扩增质粒骨架。使用酵母组装这些片
段，得到质粒pff209。质粒进行酶切验证，并最终经过测序验证得到正确的质粒。
[0092]
将质粒pff209通过结合转移转化到ad-603菌株中，按照实施例1的方法进行筛选，先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。设计引物进行pcr验证。使用primer 5设计引物，引物设计为：上游引物设计为扩增左同源臂的基因至acca2基因的部分片段，下游引物设计为扩增右同源臂的基因至accb基因的部分片段。选取引物进行pcr条件的摸索，最后选取进行pcr验证。双交换示意图见图18，突变株上游理论pcr产物大小1494bp(209-yz-f和209-yz-r)，下游1083bp(209-down-f和209-down-r)。而对应的片段在改造前的菌株中并不能扩增得到，说明菌株发生了双交换，即得到目的菌株。如图19可以看出1为正确的oe-ad-603-209菌株。
[0093]
(二)oe-ad-603、oe-ad-603-209菌株的摇瓶发酵
[0094]
按照实施例1中的方法将ad-603、ad-603-209菌株进行发酵，结果显示(图20)所示，ad-603、ad-603-209菌株的多杀菌素产量均高于ad菌株，说明增加聚酮合酶前体供应有助于提升聚酮化合物产量。
[0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。