一种基于单粒子上转换发光的二硫苏糖醇检测方法

1.本发明属于微流控传感技术，具体涉及一种基于单粒子上转换发光的二硫苏糖醇检测方法。


背景技术：

2.随着单分子/单粒子测量技术的快速发展，单粒子传感技术为探测个体行为和过程提供了一种独特的工具，并在dna、蛋白质、气体等检测领域引起了广泛的兴趣。单粒子传感通过改善与目标物的接触表面，排除集合纳米粒子的统计效应、重吸收、非均匀展宽等现象，可以实现超高灵敏度和极低检测限。但是该方法也存在着单个发光粒子的检测困难，光谱的不均匀位移和变形以及传统荧光探针的闪烁等局限性。为了克服这些问题，迫切需要开发一种具有亮度稳定、发光强度高等优点，可以实现超高灵敏度和极低检测限的单粒子传感。
3.镧系离子掺杂上转换纳米粒子(ucnps)可以吸收两个或多个低能光子并将其转化为一个高能量光子。利用大的斯托克斯位移和近红外光作为泵浦源，镧系离子掺杂上转换纳米粒子具有无光漂白和背景荧光的优点，在生物成像和传感等方面得到了广泛的研究，作为荧光探针在体外检测疾病生物标志物和神经毒剂等方面得到了广泛的探索。随着制备技术的发展，目前可以获得大小和形态高度均匀的ucnps。同时，上转换发射来自于4f-4f轨道跃迁，不均匀的光谱位移和变形以及ucnps的闪烁很少发生。因此，ucnps被认为是最有前途的单粒子传感发光探针。然而，目前基于ucnps的传感主要以溶液、粉末或薄膜形式存在。以往的研究表明，ucnps在集合光谱和单粒子光谱测量中的发光现象有着明显的不同。并且基于集成纳米粒子的传感器的灵敏度容易受到统计效应的干扰，这必然导致器件的低灵敏度和高检测限。对于目前的单粒子传感系统，其主要局限性在于ucnps发光效率的性质导致单个上转换纳米颗粒的荧光信号较弱，需要较高的泵浦阈值。因此能够实现基于单个上转换纳米颗粒的荧光传感仍然是一个挑战。
4.二硫苏糖醇(dtt)作为一种小分子，可以完全还原二硫化物，保护巯基不被氧化，在生物学、生物化学和生物医学中发挥着重要作用[dunaway-mariano,d.；holden,h.m.；raushel,f.m.w.w."mo"cleland:a catalytic life.biochemistry2013,52,9092-9096]。但过量的dtt是有毒的，会对某些生物分子造成不可逆的氧化损伤[charrier,j.g.；anastasio,c.on dithiothreitol(dtt)as a measure of oxidative potential for ambient particles:evidence for the importance of soluble transition metals.atmospheric chem.and phys.2012,12,(19),9321-9333]。因此，有必要开发一种高效、准确的实时检测dtt的方法。因此，人们采用了多种不同的分析方法以实现对二硫苏糖醇的选择性检测，整理如下：
[0005]
(一)电泳-电化学法：1993年，美国堪萨斯大学的lunte等人使用金/汞汞合金作微电极，采用毛细管电泳-电化学法实现了对游离的硫醇(谷胱甘肽)的检测，检测限低至0.53fm。虽然该方法具有极低的检测限，但是该探测装置制备过程复杂，并且在制备完成后
要在环境下稳定12h后才可以用于进一步检测实验，严重浪费了时间和资源[thomas j.o’shea,susan m.lunte.selective detection of free thiols by capillary electrophoresis-electrochemistry using a gold/mercury amalgam microelectrode.anal.chem.1993,65,247-250]；
[0006]
(二)比率荧光探针法：2010年，tan等人使用比率荧光探针实现了对dtt的高选择性检测，检测限为5.0mm。这种比率荧光探针虽然可以缩短检测时间，但其检测限较高，并且存在缺乏实现荧光有效变化的设计策略。同时，如何使响应前后发射峰差异尽可能大，减少发射光谱之间的重叠，以提高探针响应的灵敏度也是其另一个缺点[baocun zhu,xiaoling zhang,hongying jia,yamin li,haipeng liu,weihong tan.a highly selective ratiometric fluorescent probe for 1,4-dithiothreitol(dtt)detection.org.biomol.chem.2010,8,1650-1654]；卢小泉等人发明公开了一种比率荧光探针用于检测1,4-二硫苏糖醇，该发明基于金属有机骨架，需先将cu-tcpp、zrcl4和甲苯酸超声溶解于dmf中，于100～120℃下反应45-50h，此后经过一系列操作过程才能得到基于金属有机骨架的比率荧光探针pta-nh2@pcn-224(cu)[卢小泉，王妮，阮晴，焦小梅，刘娟，张蓉芳，何耀荣，贾元琪，白蕾，韩振刚.基于金属有机骨架的比率荧光探针的制备和在检测1,4-二硫苏糖醇中的应用.发明专利.cn 113234437 a]。从制备流程可以看出，该方法极其繁冗复杂，并不适合快速检测dtt；
[0007]
(三)强度变化型荧光探针法：林伟英等人发明提供了一种基于氧杂蒽结构的检测细胞内二硫苏糖醇荧光探针，该探针的优点是廉价易得，使用简单，但检测灵敏度低，且在对客体物种进行定量检测方面具有明显的局限性[林伟英，张楠，董宝利，孔秀琪，王超，宋文辉.一种二硫苏糖醇荧光探针及其制备方法和应用.发明专利.cn 108003866 b]；2018年，sun等人制备了一种6-(methylsulfinyl)-2-phenyl-1h-benzo[de]iso-quinoline-1,3(2h)-dione(nc-dtt)荧光探针用以检测dtt，其检测限较低(140nm)，该探针属于荧光增强型探针。增强型荧光探针本身没有荧光或只发出很弱的荧光，荧光增强的信号变化更易于有效检测，因而探针的灵敏度较高。但sun等人采用的nc-dtt荧光探针所表现出的对dtt的特异性检测效果较差[tong sun,lili xia,jinxin huang,yueqing gu,peng wang.a highly selective fluorescent probe for fast recognization of dtt and its application in one-and two-photon imaging.talanta.2018,187,295-301]。
[0008]
(四)电化学法：肖琦等人发明公开了一种使用电化学法检测溶液中二硫苏糖醇浓度的方法，通过氨基化石墨烯量子点修饰电极进行dtt的检测，检测过程简单方便，但是检测灵敏度低、检测限低[肖琦，黄珊，冯萌萌，吴子华.检测溶液中二硫苏糖醇浓度的方法.发明专利.cn 107255660 b]。
[0009]
(五)比色型荧光探针：zhao等人利用基于dtt的两个近端巯基与单分散的银纳米颗粒交联，形成粒径较大的聚集银纳米颗粒，使其颜色和吸光度发生相应的变化，制备了一种比色型荧光探针。该探针的优点在于制备方法简单，成本较低。但目视比色法存在主观误差，其测量准确度很难把握，灵敏度低，20世纪30-60年代是比色法发展的旺盛时期，此后因其在检测上存在的限制，逐渐被其他荧光探针所代替。


技术实现要素：

[0010]
为了解决上述问题，本发明提供了一种微流控传感技术，利用光子晶体效应与局域表面等离子体共振效应协同调控单个上转换纳米颗粒光致上转换发光强度增强，通过mno2包裹使上转换纳米颗粒荧光强度大幅下降，用于体外检测二硫苏糖醇时，借助原子力显微镜以及原位的荧光寿命成像系统，通过逐渐增加二硫苏糖醇，使上转换发光逐渐恢复以实现对二硫苏糖醇的高灵敏度、高选择性的体外检测。本发明为生物医学传感提供了竞争策略，不仅适用于对二硫苏糖醇的检测，该单粒子传感系统针对其他检测也具有高度的普适性。
[0011]
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0012]
一种基于单粒子上转换发光的二硫苏糖醇检测方法，具体步骤如下：
[0013]
步骤1：用甲基丙烯酸甲酯(mma)、苯乙烯或二氧化硅(sio2)，作为制作光子晶体的微球，通过三维垂直自组装的方法，制备蛋白石光子晶体模板a。
[0014]
用具有强腐蚀性的强碱溶液氢氧化钠溶液清洗物质m，以去除聚合抑制剂，其中，物质m是mma、苯乙烯或sio2悬浮液，氢氧化钠溶液的浓度为10-100mg/ml，氢氧化钠溶液与物质m的体积比为(40-90)：1；sio2悬浮液的制备，由尺寸在200-600nm的sio2微球颗粒溶于乙醇中，得到体积分数为0.3％-2％的sio2悬浮液；
[0015]
然后将清洗后的物质m、去离子水和引发剂按照体积比(1-10)：(20-80)：1的比例混合，其中引发剂起到氧化还原使乳液聚合的作用；将混合溶液在90-220℃条件下，缓慢搅拌1-4h，制备得到聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)微球溶液、聚苯乙烯(ps)微球溶液或二氧化硅(sio2)微球溶液，记作a-微球溶液。
[0016]
本发明所涉及的上转换纳米颗粒(可以是nayf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
，kyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
，liyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
其中的一种)其激发光为980nm，因此opcs的光子禁带的位置应与激发光波长相匹配。因此，使用包覆的方法调节制备光子晶体模板的微球直径的大小，来获得光子禁带位置处于400-1600nm附近的蛋白石光子晶体。包覆时，将得到的a-微球溶液与去离子水和物质m混合，其中a-微球溶液、去离子水、物质m的体积比为(3-60)：(3-60)：1，在90-220℃条件下，缓慢搅拌0.5-2h，随后得到包裹后的a-微球溶液。
[0017]
包裹后的a-微球溶液用去离子水稀释，其中，a-微球溶液与去离子水的体积比为1：(20-80)，将载玻片垂直插入烧杯中，将烧杯整体转移至25-70℃的烘箱中静置24-144h，随后得到蛋白石光子晶体模板a，分别为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)蛋白石光子晶体模板、聚苯乙烯(ps)蛋白石光子晶体模板和二氧化硅(sio2)蛋白石光子晶体模板。
[0018]
所述的引发剂为过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铝、过硫酸铵或亚硫酸氢钠。
[0019]
步骤2：制备具有局域表面等离子体共振效应的半导体等离子体溶液b，包括钨酸铯(cs
x
wo3)半导体等离子体溶液、氧化钨(wo3)半导体等离子体溶液或硫化亚铜(cu2s)半导体等离子体溶液，具体步骤如下：
[0020]
cs
x
wo3半导体等离子体溶液的制备方法：将氯化铯、氯化钨、油酸和油胺按照摩尔比(22-45)：(1-3)：(1-3)：1的比例混合，在300-660℃温度条件下充分搅拌，直至混合物变成深蓝色，将混合物冷却至室温，得到钨酸铯溶液；向钨酸铯溶液中加入甲苯，并进行三次离心处理；第一次离心处理时，钨酸铯溶液与甲苯的体积比为1：(3-10)；离心后的产物溶解
10％er
3
(c＝na或k或li)@mno2溶液滴到a/b复合结构上，得到a/b/cyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
(c＝na或k或li)@mno2复合结构，得到微流控单粒子传感器。
[0028]
步骤5：二硫苏糖醇检测
[0029]
使用原子力显微镜与原位的荧光寿命成像系统，追踪步骤4制备得到的微流控单粒子传感器a/b/cyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
(c＝na或k或li)@mno2中单个上转换纳米颗粒的位置，记录其荧光光谱及寿命信息；将二硫苏糖醇(dtt)通过微量注射泵注入到步骤4制备得到的微流控单粒子传感器上，并再次记录其荧光光谱及寿命信息；调节微量注射泵，随着dtt浓度的增加，mno2包裹的上转换纳米材料的荧光光谱发生变化，即可获得二硫苏糖醇的浓度。
[0030]
检测原理：dtt分子对mno2纳米材料的解离具有较高的反应活性，因此随着dtt分子的加入，将a/b/cyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
(c＝na或k或li)@mno2复合结构的mn
4
还原为mn
2
，致使mno2逐渐分解，被猝灭的上转换荧光逐渐恢复，实现体外高灵敏度dtt检测。光子晶体效应与半导体等离子体共振效应协同调控的单个cyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
(c＝na或k或li)纳米颗粒的上转换荧光有助于微流控单粒子传感器灵敏度的提高。
[0031]
本发明的有益效果：
[0032]
(1)该单粒子传感器是基于a/b/单个cyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
(c＝na或k或li)@mno2复合结构的单粒子传感器。相比于基于集成纳米颗粒的传感器，单粒子传感器可以排除集成纳米颗粒的统计平均效应，获得更为精准的检测信息。
[0033]
(2)蛋白石光子晶体与半导体等离子体效应协同调控上转换纳米颗粒的荧光强度，使之上转换荧光强度增强1600倍，降低激光的泵浦阈值。更高的荧光强度将更有利于获得单粒子荧光信号，提高检测灵敏度。
[0034]
(3)mno2在200-1000nm之间具有很强烈的吸收光谱，因而是一种很优秀的荧光猝灭材料。mno2作为能量受体，有效地猝灭ucnps的上转换荧光，与dtt发生氧化还原反应后，可以分解为mn
2
离子。本发明的a/b/单个cyf4:10-60％yb
3
,1-10％er
3
(c＝na或k或li)@mno2的传感器属于强度变化型而非比例计量型或比色型传感器件。对目标检测物质dtt的响应来自于上转换发光强度的变化，具有操作简便，易于制备等优点。本发明所涉及的单粒子传感器本身没有荧光或具有极其微弱的荧光，在与目标检测对象作用后荧光得到增强，荧光增强后的信号变化更容易有效检测，器件微弱的荧光可以减少背景信号，提高器件的灵敏度。
附图说明
[0035]
图1为本发明的蛋白石光子晶体的扫描电镜图。
[0036]
图2为半导体等离子体cs
x
wo3溶液的透射电镜图。
[0037]
图3为nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2纳米颗粒透射电镜图。
[0038]
图4为nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2纳米颗粒x射线衍射图。
[0039]
图5为单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
，以及单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2的发射光谱示意图。
[0040]
图6为单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
与opcs/cs
x
wo3/单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
的发射光谱示意图。
[0041]
图7为单粒子传感器结构示意图。
[0042]
图8中，(a)为opcs/cs
x
wo3/单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
的原子力显微镜扫描图，(b)为(a)中单个上转换纳米颗粒位置对应的原位的荧光寿命成像图。
[0043]
图9为单粒子传感器在不同浓度的二硫苏糖醇条件下的发射光谱示意图。
[0044]
图10为单粒子传感器opcs/cs
x
wo3/单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
对dtt检测的响应范围图。
[0045]
图11为干扰物质对二硫苏糖醇测定的影响示意图。
具体实施方式
[0046]
下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
[0047]
实施例1：
[0048]
(1)取0.1g naoh溶于10ml去离子水中，制备naoh溶液，并在naoh溶液中加入2.5ml mma，剧烈搅拌混合溶液以起到清洗mma表面的聚合抑制剂的作用；取3ml上述混合溶液，与40mol去离子水和18mg的过硫酸钾混合，在90℃条件下，缓慢搅拌1h，反应完成后得到pmma微球；
[0049]
(2)通过包覆的方法调节pmma微球直径的大小，取20ml步骤(1)的pmma微球，20ml的去离子水，以及3ml mma，在90℃条件下，缓慢搅拌0.5h，随后得到包裹后的pmma微球。
[0050]
(3)取步骤(2)包裹后的3ml pmma微球，用60ml的去离子水稀释，向溶液中垂直插入清洗干净的载玻片，并将其整体移至25℃的烘箱中静置24h，随后得到蛋白石光子晶体，这一过程是为了增强三维蛋白石结构的稳定性。如图1所示，扫描电镜图像显示成功制备了三维蛋白石模板。
[0051]
(4)在三颈瓶中加入22mol氯化铯、1mol氯化钨、1mol油酸、1mol油胺，将三颈瓶移入加热套中，在温度为300℃的条件下充分搅拌，直至混合物变成深蓝色，将混合物冷却至室温，得到钨酸铯溶液。
[0052]
(5)将步骤(4)中得到钨酸铯溶液进行第一次离心处理，加入3mol甲苯，使用9000转/min，离心15min；离心后的沉淀充分溶解于3mol甲苯中，后加入3mol的丙酮，再次以9000转/min，15min的条件进行第二次离心处理；第三次离心处理的条件同第二次离心处理的条件相同。如图2所示，透射电镜图像显示成功制备了钨酸铯。
[0053]
(6)通过经典的溶剂热法合成上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
。取0.24g六水氯化钇粉末、0.08g六水氯化镱粉末、0.01g六水氯化铒粉末于三颈瓶中，加入6ml油酸及15ml十八烯溶液，固定油浴锅中，在160℃氮气保护下，以700-950rpm搅拌直至三颈瓶中的药品完全溶解，后冷却至30℃。
[0054]
(7)取0.1g氢氧化钠，0.148g氟化铵粉末溶于6ml甲醇溶液中。将该甲醇的混合溶液缓慢加入步骤(6)所得的混合溶液中，充分搅拌后(约1h)，温度由室温升至125℃。升温过程中三颈瓶中不断有泡沫冒出，直至三颈瓶中没有泡沫后接入冷凝管，将三颈瓶内溶液温度缓慢升温至300℃，并充分搅拌2h后，停止加热并降至30℃。
[0055]
(8)将步骤(7)所得的混合溶液分装在离心管中，向离心管中加入15ml的乙醇溶液，以10000rpm，离心20min后，倾倒出上清液，加入16ml的环己烷溶液，超声并溶解沉淀，后加入20ml的乙醇溶液再次离心，该步骤重复两次，得到nayf4:20％yb
3
,2％er
3
沉淀，将离心
管中的沉淀收集后加入5ml环己烷，超声后得到nayf4:yb
3
，er
3
环己烷溶液。
[0056]
(9)使用盐酸溶液清洗nayf4:20％yb
3
,2％er
3
纳米颗粒上的表面配体。取5ml步骤(8)中得到的nayf4:yb
3
，er
3
环己烷溶液，加入0.8mol盐酸，超声处理5min。
[0057]
(10)将步骤(9)中得到的混合溶液，使用乙醇离心处理两次。第一次离心处理，取步骤(9)所得得混合溶液5ml，加入15ml乙醇，以9000转/分钟，离心30min；得到得产物以相同条件再次离心一次，离心后的产物为nayf4:20％yb
3
,2％er
3
，随后溶解于5ml去离子水中，得到无配体的nayf4:20％yb
3
,2％er
3
溶液。
[0058]
(11)将步骤(10)得到的无配体的nayf4:20％yb
3
,2％er
3
溶液均匀分散于5ml高锰酸钾与5ml盐酸中，得到的混合溶液在室温下静置12h，期间混合物的颜色由深紫色逐渐变至红黑色，得到nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2溶液。如图3所示，透射电镜图像显示成功制备了nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2上转换纳米颗粒，平均尺寸约44.2
±
9.2nm。透射电镜的测定：透射电镜是使用hitachi h-8100iv透射电子显微镜在200kv的加速电压下进行测试的。如图4所示，x射线衍射图显示成功制备了六方相的nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2上转换纳米颗粒，并且在2θ＝36.5
°
，66.7
°
处观察到两个清晰的峰分别属于mno2的110和020晶面。x射线衍射图的测试：x射线衍射图是使用α辐射(λ＝1.54178)在bruker axs d8衍射仪上以薄膜形式记录x射线衍射图案。薄膜的制备是采用旋涂的方式覆盖在硅片衬底表面。
[0059]
(12)取5ml步骤(11)得到的nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2溶液加入15ml去离子水离心，以9000转/min，离心处理15min；所得产物再次溶解于15ml的去离子水中，以相同的条件再次离心一次。
[0060]
(13)将步骤(12)得到的沉淀，稀释于300ml去离子水中，制备单粒子nayf4:20％yb
3
,2％er
3
。样品。使用980nm的激光照射纳米颗粒，其上转换荧光发生猝灭，表明获得nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2溶液。如图5所示，为单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
与单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2的荧光强度对比图。可以看出，在包裹mno2后，单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2的荧光发生了明显的猝灭。荧光光谱的测试：是在室温环境下，连续的980nm光源照射下，使用普林斯顿sp2300光谱仪记录所有样品的发射光谱。
[0061]
(14)将步骤(3)得到的光子晶体(opcs)一边垫高2mm(整个玻璃片一端垫高)，步骤(5)所得的钨酸铯(cs
x
wo3)溶液沿着光子晶体的一端滴下，得到opcs/cs
x
wo3复合结构。
[0062]
(15)将步骤(13)得到的稀释后的nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2溶液滴到步骤(14)得到的opcs/cs
x
wo3复合结构上，制备opcs/cs
x
wo3/nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2复合结构，至此一种微流控单粒子传感器制备完成。如图6所示，为单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
与以及opcs光子晶体效应与cs
x
wo3半导体等离子共振效应协同调控的单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
的荧光强度对比图。可以看出，得益于opcs/cs
x
wo3复合结构的级联光场放大效应，单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
的上转换荧光提高了1600倍。
[0063]
(16)微流控单粒子传感器用于体外检测dtt，工作过程包括(结构如图7所示)：使用原子力显微镜与原位的荧光寿命成像系统，追踪单颗粒的位置，记录其荧光光谱及寿命信息。如图8所示，为使用原子力显微镜探针扫描出的opcs/cs
x
wo3/单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2的图像(a)，及其原位的荧光寿命图像(b)。可以看出，利用原
子力扫描图及荧光寿命成像图可以精准地确认单个上转换纳米颗粒的位置，同时也可以证明本发明涉及到的一种传感器是建立在单颗粒的尺度上的。
[0064]
dtt分子对mno2纳米材料的解离具有较高的反应活性，因此随着dtt分子的加入，将opcs/cs
x
wo3/nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2复合结构的mn
4
还原为mn
2
，致使mno2逐渐分解，被猝灭的上转换荧光逐渐恢复，实现体外高灵敏度dtt检测。如图9所示，为发射光谱随着二硫苏糖醇的增加逐渐变强直至恢复。级联光场调控的单个nayf4:20％yb
3
,2％er
3
纳米颗粒的上转换荧光增强有助于器件灵敏度的提高。如图10所示，为单粒子传感器opcs/cs
x
wo3/单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
对dtt检测的线性相应范围图，可以看出在0-5nmol时，本发明所涉及的单粒子传感器对dtt具有很好的线性响应，并且最低检测极限为0.05nmol。
[0065]
本发明方法具有良好的特异性检测能力，如图11所示，基于opcs/cs
x
wo3/单个上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2的单粒子传感器在加入葡萄糖，果糖，乳糖，谷氨酸，甘氨酸，高半胱氨酸，氯化钾，硫酸镁，氯化锰后，上转换纳米颗粒nayf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2的荧光强度并没有显著的提高。
[0066]
实施例2：
[0067]
(1)取0.1g naoh溶于10ml去离子水中，制备naoh溶液，并在naoh溶液中加入30ml ps，剧烈搅拌混合溶液以起到清洗ps表面的聚合抑制剂的作用；取6ml上述混合溶液，与70mol去离子水和30mg的过硫酸钾混合，在150℃条件下，缓慢搅拌2h，反应完成后得到ps微球；
[0068]
(2)通过包覆的方法调节ps微球直径的大小，取6ml步骤(1)的ps微球溶液，50mol的去离子水，以及50ml ps，在150℃条件下，缓慢搅拌1.2h，随后得到包裹后的ps微球。
[0069]
(3)取步骤(2)包裹后的4ml ps微球，用50mol的去离子水稀释，向溶液中垂直插入清洗干净的载玻片，并将其整体移至45℃的烘箱中静置72h，随后得到蛋白石光子晶体模板。
[0070]
(4)在三颈瓶中加入10mol钨酸钠、22.5mol丙二酸、1mol去离子水，在温度为30℃的条件下充分搅拌0.5h，后向上述混合溶液中加入5mol硝酸，再次在温度为30℃的条件下充分搅拌0.5h直到生成黄色悬浊液。
[0071]
(5)将步骤(4)中得到黄色悬浊液倒入反应釜中，密封放置于干燥箱中，温度设置为200℃，反应时间为5h，反应结束后自然冷却至30℃。得到的混合溶液用去离子水和乙醇清洗3遍以去除其中的可溶性杂质，其中混合溶液、去离子水、乙醇的体积比为1：3：3，最后得到的氧化钨(wo3)沉淀分散在乙醇中，得到wo3半导体等离子体溶液。
[0072]
(6)通过经典的溶剂热法合成上转换纳米颗粒kyf4:40％yb
3
,5％er
3
。取0.167g六水氯化钇粉末、0.155g六水氯化镱粉末、0.019g六水氯化铒粉末于三颈瓶中，加入9ml油酸及22.5ml十八烯溶液，固定油浴锅中，在160℃氮气保护下，以700-950rpm搅拌直至三颈瓶中的药品完全溶解，后冷却至30℃。
[0073]
(7)取0.15g氢氧化钾，0.222g氟化铵粉末溶于9ml甲醇溶液中。将该甲醇的混合溶液缓慢加入步骤(6)所得的混合溶液中，充分搅拌后(约1h)，温度由室温升至125℃。升温过程中三颈瓶中不断有泡沫冒出，直至三颈瓶中没有泡沫后接入冷凝管，将三颈瓶内溶液温度缓慢升温至300℃，并充分搅拌2h后，停止加热并降至30℃。
[0074]
(8)将步骤(7)所得的混合溶液分装在离心管中，向离心管中加入27ml的乙醇溶液，以10000rpm，离心20min后，倾倒出上清液，加入27ml的环己烷溶液，超声并溶解沉淀，后加入27ml的乙醇溶液再次离心，该步骤重复两次，得到kyf4:40％yb
3
，5％er
3
沉淀，将离心管中的沉淀收集后加入7.5ml环己烷，超声后得到kyf4:yb
3
，er
3
环己烷溶液。
[0075]
(9)使用盐酸溶液清洗kyf4:40％yb
3
,5％er
3
纳米颗粒上的表面配体。取5ml步骤(8)中得到的kyf4:40％yb
3
,5％er
3
环己烷溶液，加入8mol盐酸，超声处理5min。
[0076]
(10)将步骤(9)中得到的混合溶液，使用乙醇离心处理两次。第一次离心处理，取步骤(9)所得得混合溶液7.5ml，加入30ml乙醇，以9000转/分钟，离心30min；得到得产物以相同条件再次离心一次，离心后的产物为kyf4:40％yb
3
,5％er
3
，随后溶解于11.25ml去离子水中，得到无配体的kyf4:40％yb
3
,5％er
3
溶液。
[0077]
(11)将步骤(10)得到的无配体的kyf4:40％yb
3
,5％er
3
溶液均匀分散于13.5ml高锰酸钾与9ml盐酸中，得到的混合溶液在室温下静置36h，期间混合物的颜色由深紫色逐渐变至红黑色，得到kyf4:40％yb
3
,5％er
3
@mno2溶液。
[0078]
(12)取7.5ml步骤(11)得到的kyf4:40％yb
3
,5％er
3
@mno2溶液加入22.5ml去离子水离心，以9000转/min，离心处理15min；所得产物再次溶解于30ml的去离子水中，以相同的条件再次离心一次。使用980nm的激光照射纳米颗粒，其上转换荧光发生猝灭，表明获得kyf4:40％yb
3
,5％er
3
@mno2溶液。
[0079]
(13)将步骤(12)得到的沉淀，稀释于600ml去离子水中，留作单粒子样品使用。
[0080]
(14)将步骤(3)得到的光子晶体(ps)一边垫高2mm(整个玻璃片一端垫高)，步骤(5)所得的wo3溶液沿着光子晶体的一端滴下，得到ps/wo3复合结构。
[0081]
(15)将步骤(13)得到的稀释后的kyf4:40％yb
3
,5％er
3
@mno2溶液滴到步骤(14)得到的ps/wo3复合结构上，制备ps/wo3/kyf4:40％yb
3
,5％er
3
@mno2复合结构，至此微流控单粒子传感器制备完成，然后可以用于dtt检测。
[0082]
实施例3：
[0083]
(1)取0.1g naoh溶于10ml去离子水中，制备naoh溶液，并在naoh溶液中加入体积分数为1％的sio2悬浮液，剧烈搅拌混合溶液以起到清洗sio2悬浮液表面的聚合抑制剂的作用；取8ml上述混合溶液，与80mol去离子水和46mg的过硫酸钾混合，在220℃条件下，缓慢搅拌4h，反应完成后得到sio2微球；
[0084]
(2)通过包覆的方法调节sio2微球直径的大小，取7ml步骤(1)的sio2微球，80ml的去离子水，以及80ml sio2，在220℃条件下，缓慢搅拌2h，随后得到包裹后的sio2微球。
[0085]
(3)取步骤(2)包裹后的7ml sio2微球，用80ml的去离子水稀释，向溶液中垂直插入清洗干净的载玻片，并将其整体移至70℃的烘箱中静置144h，随后得到蛋白石光子晶体模板。
[0086]
(4)制备铜前驱体，在三颈瓶中加入1mol氯化铜、2.5mol油酸、1.8mol油胺，氮气保护下混合搅拌0.5h；制备硫前驱体，将1mol硫粉末与2.5mol十八烯混合，后将硫前驱体溶液加热至200℃,，然后迅速注入铜前驱体溶液，硫前驱体溶液与铜前驱体溶液的体积比为1:1，保持搅拌30min后停止加热并冷却至30℃。
[0087]
(5)将步骤(4)中得到硫化亚铜溶液用丙酮和甲苯清洗3遍，其中混合溶液、丙酮、甲苯的体积比为1：6：6，使用11000转/min，离心30min；离心后的沉淀充分溶解于10mol甲苯
中，后加入10mol的丙酮，再次以11000转/min，30min的条件进行第二次离心处理；第三次离心处理的条件同第二次离心处理的条件相同，最后得到的硫化亚铜沉淀分散在甲苯中，得到硫化亚铜(cu2s)半导体等离子体溶液。
[0088]
(6)通过经典的溶剂热法合成上转换纳米颗粒liyf4:60％yb
3
,10％er
3
。取0.038g六水氯化钇粉末、0.232g六水氯化镱粉末、0.091g六水氯化铒粉末于三颈瓶中，加入12ml油酸及30ml十八烯溶液，固定油浴锅中，在160℃氮气保护下，以700-950rpm搅拌直至三颈瓶中的药品完全溶解，后冷却至30℃。
[0089]
(7)取0.2g氢氧化锂，0.296g氟化铵粉末溶于12ml甲醇溶液中。将该甲醇的混合溶液缓慢加入步骤(6)所得的混合溶液中，充分搅拌后(约1h)，温度由室温升至125℃。升温过程中三颈瓶中不断有泡沫冒出，直至三颈瓶中没有泡沫后接入冷凝管，将三颈瓶内溶液温度缓慢升温至300℃，并充分搅拌2h后，停止加热并降至30℃。
[0090]
(8)将步骤(7)所得的混合溶液分装在离心管中，向离心管中加入40ml的乙醇溶液，以10000rpm，离心20min后，倾倒出上清液，加入40ml的环己烷溶液，超声并溶解沉淀，后加入20ml的乙醇溶液再次离心，该步骤重复两次，得到liyf4:60％yb
3
,10％er
3
沉淀，将离心管中的沉淀收集后加入10ml环己烷，超声后得到liyf4:yb
3
，er
3
环己烷溶液。
[0091]
(9)使用盐酸溶液清洗liyf4:60％yb
3
,10％er
3
纳米颗粒上的表面配体。取8ml步骤(8)中得到的liyf4:yb
3
，er
3
环己烷溶液，加入4.8mol盐酸，超声处理5min。
[0092]
(10)将步骤(9)中得到的混合溶液，使用乙醇离心处理两次。第一次离心处理，取步骤(9)所得得混合溶液16ml，加入80ml乙醇，以9000转/分钟，离心30min；得到得产物以相同条件再次离心一次，离心后的产物为liyf4:20％yb
3
,2％er
3
，随后溶解于30ml去离子水中，得到无配体的liyf4:60％yb
3
,10％er
3
溶液。
[0093]
(11)将步骤(10)得到的无配体的liyf4:60％yb
3
,10％er
3
溶液均匀分散于30ml高锰酸钾与20ml盐酸中，得到的混合溶液在室温下静置48h，期间混合物的颜色由深紫色逐渐变至红黑色，得到liyf4:60％yb
3
,10％er
3
@mno2溶液。
[0094]
(12)取5ml步骤(11)得到的liyf4:20％yb
3
,2％er
3
@mno2溶液加入80ml去离子水离心，以9000转/min，离心处理15min；所得产物再次溶解于80ml的去离子水中，以相同的条件再次离心一次。使用980nm的激光照射纳米颗粒，其上转换荧光发生猝灭，表明获得liyf4:60％yb
3
,10％er
3
@mno2溶液。
[0095]
(13)将步骤(12)得到的沉淀，稀释于1000ml去离子水中，留作单粒子样品使用。
[0096]
(14)将步骤(3)得到的光子晶体(sio2)一边垫高2mm(整个玻璃片一端垫高)，步骤(5)所得的cu2s溶液沿着光子晶体的一端滴下，得到sio2/cu2s复合结构。
[0097]
(15)将步骤(13)得到的稀释后的liyf4:60％yb
3
,10％er
3
@mno2溶液滴到步骤(14)得到的sio2/cu2s复合结构上，制备sio2/cu2s/liyf4:60％yb
3
,10％er
3
@mno2复合结构，至此微流控单粒子传感器制备完成，然后可以用于dtt检测。