一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用

1.本发明涉及一种利用辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高其虫草素产量的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.蛹虫草(cordyceps militaris)是我国一种传统的药食两用真菌，为子囊菌纲肉座目麦角菌科虫草属，具有很高的药用价值和营养价值。研究表明，蛹虫草化学成分包括虫草素、腺苷、多糖、脂肪酸、氨基酸、麦角甾醇等多种活性成分，虫草素(cordycepin)是其主要活性成分之一，也是评价蛹虫草质量的重要指标。虫草素的药理活性包括抗肿瘤、抗突变、抗真菌、免疫调节等方面，美国已将虫草素作为抗癌抗白血病的新药进入临床试用。传统的虫草素是从天然蛹虫草中提取(但含量较低)，并且天然蛹虫草生长缓慢以及过度开发，无法满足市场需求，造成虫草素价格飞涨，目前售价已超过500000美元/kg。虫草素可以通过化学合成法和生物法获得。化学合成法原料成本高，工艺繁琐，收率低且副产物多，限制其工业应用；生物法合成虫草素主要采用液体发酵的方式，液体发酵较其他方法存在发酵过程容易控制，周期短等优势。目前提高虫草素产量的措施主要在菌种改良、过程工艺优化等方面积累了大量的工作，例如诱变育种、提高碳源利用效率、提高前体供应等。
3.辅因子代谢工程策略是通过调控细胞内关键酶的辅因子(nadph/nadp

、nadh/nad

、atp/adp等)种类和比例，增加目标产物代谢通路流量，提高目标代谢物产量的一种策略，已成功应用于酿酒酵母、黑曲霉等多种微生物。辅因子作为生物体内的基本调控子，涉及到多种生物过程(如能量代谢、抗氧化还原压力、细胞衰老/死亡等)，并且多种辅因子协同参与调控同一生物反应。nadp

/nadph是生物体内重要的辅因子之一，nadph作为还原力，影响氨基酸、脂质和核苷酸的合成反应。因此，充足的nadph供应对维持胞内氧化还原平衡和氨基酸生物合成十分必要。
4.磷酸戊糖途径对于维持胞内nadph的产生至关重要，调节磷酸戊糖途径通量是辅因子代谢工程的重要策略，通过提高葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6pgd)等参与nadph合成的关键酶的酶活调节胞内nadph/nadp

平衡，进而调控产物合成。g6pdh是磷酸戊糖途径第一步反应的关键调节酶，催化葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡糖酸内酯和nadph；6pgd催化磷酸戊糖途径第三步反应，催化6-磷酸葡萄糖酸反应生成核酮糖-5-磷酸和nadph。基于辅因子代谢工程策略，通过过表达g6pdh或6pgd的编码基因强化胞内nadph供应，提高蛹虫草菌内虫草素产量具有可行性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是基于辅因子代谢工程策略运用基因工程技术通过过表达参与nadph合成的关键酶编码基因改造蛹虫草菌，强化胞内nadph供应，获得高产虫草素的蛹虫草重组菌株。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明首要目的是请求保护过表达参与nadph合成的关键酶编码基因在提高虫草素产量中的应用，nadph合成关键酶(g6pdh或6pgd)编码基因gsda具有如seq id no.3所示序列，基因gnda具有如seq idno.4所示序列。
8.本发明提供了一种基于辅因子代谢工程策略提高虫草素产量的方法，所述提高虫草素产量的方法是通过基因工程手段构建目的基因过表达的蛹虫草突变菌株；所述目的基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)编码基因gsda或葡萄糖酸-6-磷酸脱氢酶(6pgd)编码基因gnda。
9.具体地，所述过表达gsda或gnda基因的蛹虫草重组菌株按下述方法构建：
10.(1)提取蛹虫草c.militaris的mrna，逆转录制备cdna，以cdna为模板克隆gsda或gnda基因；
11.(2)将线性化载体与目的基因gsda或gnda连接后转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，经pcr扩增、酶切和测序验证后筛选获得基因过表达质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda的大肠杆菌；
12.(3)将上述质粒转入根癌农杆菌agrobacterium tumefaciensagl1，通过yeb固体筛选培养基(含50-100μg/ml羧苄青霉素和50-100μg/ml卡那霉素)培养，经pcr验证及酶切验证后筛选获得含质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda的根癌农杆菌；
13.(4)根癌农杆菌(含有质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda)经im液体培养基诱导培养后，与野生型蛹虫草c.militaris孢子悬液共培养，使用m-100固体培养基(含头孢噻肟和苯菌灵)抗性筛选，获得蛹虫草重组菌株；
14.(5)将上述筛选获得的蛹虫草重组菌株提取基因组，pcr验证正确后，进行摇瓶液体发酵，经hplc检测发酵液中虫草素产量，筛选获得虫草素产量提高的蛹虫草重组菌株；
15.(6)经多次传代培养并经过液体发酵验证，最终获得高产虫草素且稳定遗传的蛹虫草重组菌株。
16.进一步，步骤(1)中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的基因符号为gsda，genebank核苷酸序列号ccm_06983；葡萄糖酸-6-磷酸脱氢酶基因的基因符号为gnda，genebank核苷酸序列号ccm_06873。所述目的基因gsda(或gnda)利用pcr技术从蛹虫草菌cdna扩增所得，所述蛹虫草菌为c.militaris cgmcc3.14242，所述gsda/gnda基因pcr扩增引物对分别为：
17.gsda-f：5
’‑
atgatgcacaagaccattaagaaca-3’；
18.gsda-r：5
’‑
ttacagcttgttgctagagttgttgt-3’；
19.gnda-f：5
’‑
atgtctggtcctgttgctcga-3’；
20.gnda-r：5
’‑
ttaagcctggtaggtagaggcag-3’。
21.进一步，步骤(2)所述线性化载体为pdht-sk-bena，bena基因序列如seq id no.5所示。
22.进一步，步骤(3)所述yeb固体培养基各组分(g/l)为：蛋白胨10、蔗糖5、酵母浸粉1、mgso4·
7h2o 0.5、琼脂粉20。
23.进一步，步骤(4)所述培养基各组分为：
24.im液体培养基(g/l)：400ml 2.5
×
mm盐、葡萄糖1.8g、甘油5ml(灭菌后冷却到50℃后添加40ml 1m mes及20ml 10mmas)。其中，mm盐(g/l)包括：kh2po43.625、k2hpo46.72、
mgso4·
7h2o 1.250、nacl 0.375、cacl20.125、feso4·
7h2o 0.0062、(nh4)2so41.250。
25.im固体培养基(g/l)：400ml 2.5
×
mm盐、葡萄糖0.9g、甘油5ml、琼脂14g(灭菌后冷却到50℃后添加40ml 1m mes及20ml 10mmas)。
26.进一步，步骤(5)所述蛹虫草重组菌株液体发酵培养基各组分为：
27.采用合成培养基(zl2020111857983)，该培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素b1；
28.具体包括：葡萄糖20-50g/l、硫酸铵5-10g/l、磷酸氢二钾0.5-1g/l、磷酸二氢钾0.5-1g/l、硫酸镁0.5-10g/l、硫酸锌0.5-15g/l、甘氨酸5-10g/l、天门氨酸0.5-1g/l、谷氨酰胺0.5-2g/l、酪氨酸0.1-0.5g/l、半胱氨酸0.05-0.2g/l、亮氨酸0.5-1g/l、赖氨酸0.5-2g/l、苯丙氨酸0.05-0.5g/l、维生素b10.1-1g/l。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：通过基因工程的技术手段构建gsda(或gnda)基因过表达蛹虫草菌株，重组菌株gsda-oe、gnda-oe与野生型菌株相比虫草素产量显著提高，液体深层发酵第20d虫草素产量分别达到了191.95
±
7.67mg/l及764.48
±
12.80mg/l，较野生型蛹虫草发酵产量分别提高150.86％及1034.02％，为高产虫草素的蛹虫草菌株的选育提供了新的方向。
附图说明
30.图1为本发明构建的过表达载体上启动子、终止子以及目的基因的pcr扩增结果。其中，(a)m:dl2000 dna marker，1-2：gpd promoter；(b)m:dl2000 dna marker，1-2:nos terminator；(c)m:dl5000 dna marker，1-2：gsda片段；(d)m:dl2000 dna marker，1-2：gnda片段；(e)m:dl10000 dna marker，1-2：pdht-sk-bena双酶切(spe
ⅰ‑
hf&ecor
ⅰ‑
hf)。
31.图2为本发明构建的gsda过表达载体的pcr阳性鉴定结果。其中，(a)m:dl5000 dna marker，1-2:pdht-sk-bena-gsda(e.coli dh5α)菌液pcr验证；(b)m:dl5000 dna marker，1：pdht-sk-bena-gsda(e.coli dh5α)质粒pcr验证；(c)m:dl15000 dna marker，1-3：pdht-sk-bena-gsda(e.coli dh5α)酶切验证；(d)m:dl5000 dna marker，1：pdht-sk-bena-gsda(根癌农杆菌agl1)菌液pcr验证；(e)m:dl2000 dna marker，1：pdht-sk-bena-gsda(根癌农杆菌agl1)质粒pcr验证；(f)m:dl15000 dna marker，1-3：pdht-sk-bena-gsda(根癌农杆菌agl1)酶切验证。
32.图3为本发明构建的gnda过表达载体的pcr阳性鉴定结果。其中，(a)m:dl5000 dna marker，1:pdht-sk-bena-gnda(e.coli dh5α)菌液pcr验证；(b)m:dl15000 dna marker，1-2:pdht-sk-bena-gnda(e.coli dh5α)质粒pcr验证；(c)m:dl15000 dna marker，1-3:pdht-sk-bena-gnda(e.coli dh5α)酶切验证；(d)m:dl5000 dna marker，1:pdht-sk-bena-gnda(根癌农杆菌agl1)菌液pcr验证；(e)m:dl10000 dna marker，1:pdh t-sk-bena-gnda(根癌农杆菌agl1)质粒pcr验证；(f)m:dl15000 dna marker，1-3:pdht-sk-bena-gnda(根癌农杆菌agl1)酶切验证。
33.图4为本发明构建的过表达载体转化蛹虫草菌的pcr阳性鉴定结果。其中，(a)m:dl2000 dna marker，1-4:提取gsda过表达转化子简易基因组dna为模板pcrbena片段(901bp)；(b)提取gsda过表达转化子基因组dna为模板pcr,m:dl2000 dna marker,1-5：gsda-bena(1980bp)；(c)m:dl2000 dna marker，1-3:提取gnda过表达转化子简易基因组
dna为模板pcr bena片段(901bp)；(d)提取gnda过表达转化子基因组dna为模板pcr,m:dl2000 dna marker,1-2：gnda-bena(1880bp)。
34.图5为本发明构建的过表达gsda/gnda基因的蛹虫草突变菌株液体发酵表型参数。其中，(a-c)：gsda过表达组和对照组的生物量(a)、残糖浓度(b)和虫草素浓度(c)变化曲线；(d-f)：gnda过表达组和对照组的生物量(d)、残糖浓度(e)和虫草素浓度(f)变化曲线。
35.图6为本发明构建的过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/葡萄糖酸-6-磷酸脱氢酶重组质粒流程。(a)pdht-sk-bena-gsda；(b)pdht-sk-bena-gnda。
具体实施方式
36.下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明保护范围并不局限于此，本发明保护范围以权利要求为准。本发明蛹虫草菌c.militaris和根癌农杆菌a.tumefaciensagl1均为本领域已知菌种，可从商业渠道获得。本实施例所用蛹虫草菌为c.militaris cgmcc 3.14242，由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。
37.实施例1：重组表达载体pdht-sk-bena-gsda/gnda的构建
38.以c.militaris cgmcc 3.14242的cdna为模板，使用表1中引物进行pcr扩增gsda/gnda基因、gpd启动子及nos终止子片段(图1)，使用dna胶回收试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)回收目的片段。胶收产物送华大基因科技有限公司进行基因测序，选取测序正确的pcr胶收产物进行后续实验。
39.将本实验室保存的pdht-sk-bena表达载体进行双酶切(spe
ⅰ‑
hf、ecor
ⅰ‑
hf)(图1)，运用clonexpress ultra one step cloning kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将gpd启动子片段、gsda/gnda基因片段、nos终止子片段连接到线性化表达载体pdht-sk-bena上，最终构建gsda/gnda过表达质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda。
40.表1本实验所用引物
[0041][0042][0043]
实施例2：根癌农杆菌agl1介导pdht-sk-bena-gsda/gnda转入蛹虫草菌
[0044]
利用化学转化法将重组质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda转入大肠杆菌dh5α中，获得大量重组表达质粒，经华大基因科技有限公司进行测序验证。进一步，利用化学转化法将重组质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda转入根癌农杆菌agl1中，经pcr验证以及酶切验证，获得含
pdht-sk-bena-gsda/gnda质粒的根癌农杆菌agl1。根癌农杆菌培养所用yeb培养基(g/l)：蛋白胨10，蔗糖5，酵母浸粉1，mgso4·
7h2o 0.5；固体培养基需添加琼脂粉20g。lb液体培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，nacl 10，ph 7.0；固体培养基需添加琼脂粉20g。
[0045]
利用农杆菌介导转化法将重组质粒pdht-sk-bena-gsda/gnda转入蛹虫草菌cordyceps militaris cgmcc 3.14242中，获得蛹虫草转化子。转化过程如下：将含重组表达质粒的根癌农杆菌agl1加入到液体yeb抗性培养基中(羧苄青霉素和卡那霉素)，28℃220rpm培养过夜后收集菌体，再加入适量的im液体培养基重悬菌体(od
600
约0.15)，进一步在28℃150rpm条件下诱导培养至od
600
＝0.5～0.8。取诱导后根癌农杆菌agl1菌液及新鲜制备的蛹虫草菌孢子悬液混合于1.5ml无菌ep管，取100μl上述混合液均匀涂布于im固体培养基，28℃倒置培养2-3d。随后向平板上添加适量m-100固体抗性培养基(含头孢噻肟和苯菌灵)，25℃继续培养至生长出单菌落。挑取上述菌落到新的m-100抗性培养基平板上进行二次筛选，用sdb液体培养基对二次筛选平板上的菌落在摇床培养，提取菌丝基因组进行pcr验证，所用引物如表1所示。
[0046]
实施例3：蛹虫草菌茄子瓶培养及孢子悬液的制备
[0047]
在茄子瓶中装入合适体积的天然固体培养基，灭菌待其凝固后，划线接种适量的蛹虫草重组菌株菌丝，25℃静置培养20-25d。向生长旺盛的蛹虫草菌丝茄子瓶中加入适量的生理盐水，用无菌玻璃棒搅拌，将瓶中液体用三层纱布过滤，获得孢子悬液，计算孢子浓度。
[0048]
实施例4：蛹虫草发酵液中虫草素含量测定
[0049]
发酵液中虫草素含量利用高效液相色谱进行检测，高效液相色谱条件如下：waters e2695，检测器为waters 2998，紫外检测器波长为260nm，色谱柱选用venusil mp c18(2)(4.6
×
250mm,5μm)，柱温设定室温，流动相条件为甲醇∶水，流速为0.8-1.0ml/min，进样量为10-20μl。
[0050]
实施例5：蛹虫草重组菌株液体发酵及虫草素含量测定
[0051]
选取蛹虫草菌c.militaris cgmcc 3.14242为对照组，开展过表达gsda/gnda的蛹虫草重组菌株的深层液体发酵。使用250ml锥形瓶进行液体深层发酵实验，按1％接种量接入蛹虫草孢子悬液，25-28℃，160-180r/min振荡培养20-30d，期间取样测定生物量浓度、残糖浓度及虫草素产量(图5)。
[0052]
当过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(gsda)时，前5天的葡萄糖消耗较对照组缓慢，在第5-10d残糖消耗速率明显高于野生型(对照组)，第10d两组的底物葡萄糖基本耗尽。生长曲线来看，gsda-oe组生长较对照组缓慢，发酵第10d其生物量浓度为13.13
±
0.32g/l，而对照组的生物量浓度达到14.73
±
0.42g/l；过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(gsda)增强虫草素的合成能力，第20d虫草素产量达到了191.95
±
7.67mg/l，较对照组提高150.86％。
[0053]
当过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnda)时，葡萄糖消耗曲线与gsda-oe组趋势相同。生长曲线来看，前5天野生型菌株生长速率高于gnda-oe组，而5-10d实验组生长速率大幅提高，发酵第10d其生物量浓度为13.78
±
1.14g/l，而对照组的生物量浓度达到13.63
±
0.62g/l；从虫草素合成曲线来看，第20d虫草素产量达到了764.48
±
12.80mg/l，较对照组提高1034.02％。
[0054]
结果表明，过表达gsda或gnda(编码nadph合成的关键酶g6pdh或6pgd)后，蛹虫草
重组菌株的虫草素合成能力较野生型菌株显著提高，表明强化辅因子nadph供应有助于虫草素的生物合成。