一种漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体及其制备方法和应用

1.本发明涉及漆酶固定化载体领域，具体涉及一种漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，伴随着大量工业企业的搬迁与重建，有机污染土壤的修复成了人们密切关注的问题。与传统的物理和化学修复技术相比，微生物修复具有成本低，效果好，不会产生有害残留等多种优势。相对于微生物修复，酶修复受土壤环境因子的限制较小，对微生物间的竞争不敏感，即使在污染物浓度较低时酶也会表现出较高的催化降解活性。
3.其中，漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，在多种有机污染物降解方面表现出优异的性质，是一种高效的生物催化剂。然而游离漆酶不稳定，且难回收，酶固定化技术是用载体材料将酶束缚或限制在一定的空间内，从而可以保留漆酶的催化活性，增强稳定性，利于保存运输，同时达到重复利用，可长期持续参与催化反应的效果，载体材料的性质是影响固定化漆酶活性、稳定性及污染物去除效果的重要因素。
4.对酶固定化载体的研究具有十分重要的意义。近年来固定化酶的载体有多孔玻璃，碳纳米管，生物炭，纤维素等。虽然这些载体负载量较高，且固定化后较稳定，但也存在一些不足之处：(1)长期保存性差；(2)酶固定后易脱落；(3)无法实现重复使用等。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载量高，固定化后稳定性强，且可以长期重复使用的漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体及其制备方法和应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.发明人了解到，多孔二氧化硅材料具有比表面积大、生物相容性好、孔径可调节、机械强度高、易于功能化等优点，是一种理想的酶固定化载体材料。而多孔二氧化硅在实际应用中，由于其颗粒尺寸较小，回收重复利用成为当前亟待解决的问题。磁性纳米粒子，因其特殊的磁学性能，引起发明人的关注。核壳结构磁性多孔二氧化硅材料兼具多孔特性和磁学特性，具有毒性低、稳定性高、表面易修饰、方便分离、操作成本低等特点，非常适合作为固定化酶的载体。因此制备一种兼具多孔特性和磁学特性的载体，来调高漆酶的稳定性和催化活性具有十分重要的意义，进而提出如下方案：
8.本发明采用水热法合成磁性fe3o4微球作为前驱体，然后通过溶胶-凝胶法和模板法在其表面包覆双层sio2，得到具有核壳结构的磁性多孔fe3o4@d-sio2@p-sio2微球，并成功将其应用于漆酶的固定化。制备的固定化漆酶具有更好的稳定性，更高的催化活性，并实现了可重复使用的目的，具体方案为：
9.一种漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的制备方法，该方法包括以下
步骤：
10.fe3o4@d-sio2的制备：将磁性fe3o4分散在混合溶剂中，超声后得到悬浮液；
11.然后向悬浮液中逐滴加入原硅酸四乙酯(teos)，在水浴中连续搅拌反应，反应结束后，用磁铁分离产物，洗涤，干燥得到fe3o4@d-sio2；
12.fe3o4@d-sio2@p-sio2微球的制备：将fe3o4@d-sio2分散在含有十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的混合溶液中，搅拌形成均匀溶液；
13.在连续搅拌下，将teos滴加到均匀溶液中，在水浴中连续搅拌反应，反应结束后，用磁铁分离产物，多次洗涤去除非磁性产物；
14.然后将产物重新分散到丙酮中，回流去除ctab，重复提取3次，最后用磁铁分离产物，洗涤，干燥得磁性多孔fe3o4@d-sio2@p-sio2微球，即漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体。
15.进一步地，fe3o4@d-sio2制备时，所述的teos与fe3o4的质量比为(0.1-0.3):(0.05-0.15)；
16.所述的混合溶剂是体积比为(100-140):40:(3-5)的乙醇、去离子水和浓氨水(～28wt％)。
17.进一步地，所述的teos与fe3o4的质量比为0.2:0.1。
18.进一步地，fe3o4@d-sio2@p-sio2微球制备时，所述的teos与fe3o4@d-sio2的质量比为(0.3-0.5):(0.1-0.2)；
19.所述的混合溶液是用量比为0.3g:(50-80)ml:(70-90)ml:(0.5-2)ml的ctab、乙醇、去离子水和浓氨水(～28wt％)。
20.进一步地，所述的teos与fe3o4@d-sio2的质量比为0.4:0.15。
21.进一步地，所述超声的时间20-40min；所述搅拌反应的时间为5-7h；所述回流的温度为80-95℃，时间为40-50h。
22.一种上所述方法制备的漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体，该载体为核壳结构，尺寸为380-400nm，比表面积不低于270m2/g。
23.一种如上所述的漆酶固定化用磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的应用，该载体应用于漆酶的固定化，具体步骤包括：
24.将fe3o4@d-sio2@p-sio2载体分散于含有漆酶的柠檬酸盐缓冲液中，得到混合溶液，在生化培养箱中，摇动孵育；
25.然后用柠檬酸盐缓冲液洗涤以除去未结合的酶，将固定化漆酶fe3o4@d-sio2@p-sio
2-lac冷冻干燥后低温保存。
26.进一步地，所述的混合溶液中，漆酶的浓度为0.5-2.0mg/ml，柠檬酸盐缓冲液的浓度为0.1m，ph为3-10，孵育时间为4-12h。
27.进一步地，所述的混合溶液中，漆酶的浓度为1.5mg/ml，ph为6，孵育时间为8h。
28.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
29.(1)本发明通过简单的溶胶-凝胶法，以低成本的teos充当硅源，在室温条件下即可在fe3o4表面成功包覆sio2层，制备方法简单。所得fe3o4@d-sio2@p-sio2毒性低、稳定性高、兼具磁性和多孔特性，非常适合作为固定化漆酶的载体；
30.(2)该磁性核壳结构多孔二氧化硅载体在漆酶固定化方面表现出了优异的性能。
相比于游离漆酶，固定化漆酶表现出更宽的ph和温度适用范围，且重复使用10次后，活性仍保留58％，有望在生物修复中发挥重要的价值。
附图说明
31.图1为实施例1所得磁性核壳结构多孔二氧化硅载体在1μm倍数下的sem图；
32.图2为实施例1所得磁性核壳结构多孔二氧化硅载体在500nm倍数下的tem图；
33.图3为实施例1所得磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的ftir图；
34.图4为实施例1所得磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的xrd图；
35.图5为实施例1所得磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的氮气吸附/脱附等温曲线和孔径分布图；
36.图6为实施例1所得游离漆酶与固定化漆酶在不同ph值下的活性对比图；
37.图7为实施例1所得游离漆酶与固定化漆酶在不同温度下的活性对比图；
38.图8为实施例1所得固定化漆酶重复使用10次的活性对比图。
具体实施方式
39.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
40.一种核壳结构的磁性二氧化硅微球的制备方法，该方法包括以下步骤：
41.(1)将磁性fe3o4分散在由乙醇，去离子水和浓氨水组成的混合溶液中，超声30min得到悬浮液。然后向悬浮液中逐滴加入teos，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，洗涤，干燥得到fe3o4@d-sio2。teos与fe3o4的质量比为(0.1-0.3)g:(0.05-0.15)g。
42.(2)将fe3o4@d-sio2分散在含有ctab，乙醇，去离子水和浓氨水的混合溶液中，搅拌30min形成均匀溶液。在连续搅拌下，将teos滴加到上述溶液中，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，多次洗涤去除非磁性产物。然后，将产物重新分散到丙酮中，90℃回流48h去除ctab，重复提取3次。最后用磁铁分离产物，洗涤，干燥得磁性多孔fe3o4@d-sio2@p-sio2微球。teos与fe3o4@d-sio2的质量比为(0.3-0.5)g:(0.1-0.2)g。该载体为核壳结构，尺寸为380-400nm，比表面积不小于270m2/g。
43.磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的应用，该载体应用于漆酶的固定化中，具体步骤为：
44.将fe3o4@d-sio2@p-sio2载体分散于含有漆酶的0.1m柠檬酸盐缓冲液中，在生化培养箱中，200rpm摇动孵育一段时间，以达到吸附平衡。并用柠檬酸盐缓冲液洗涤两次以除去任何未结合的酶，固定化漆酶fe3o4@d-sio2@p-sio
2-lac冷冻干燥后于4℃保存备用。混合溶液中漆酶浓度为0.5-2.0mg/ml，柠檬酸盐缓冲液的ph为3-10，孵育时间为4-12h。
45.选择abts作为漆酶活性测定的底物。在含有最终浓度为1mm abts的柠檬酸盐缓冲液中加入游离漆酶或固定化漆酶，使总体积为1ml并混匀。用紫外分光光度计测定混合溶液在420nm波长下的吸光度，连续测定10min，记录吸光度变化值。
46.实施例1
47.一种磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的制备方法，该方法包括以下步骤：
48.(1)将0.1g磁性fe3o4分散在由120ml乙醇，40ml去离子水和4ml浓氨水组成的混合溶液中，超声30min得到悬浮液。然后向悬浮液中逐滴加入0.2g teos，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，洗涤，干燥得到fe3o4@d-sio2。
49.(2)将0.15g fe3o4@d-sio2分散在含有0.3g ctab，60ml乙醇，80ml去离子水和1ml浓氨水的混合溶液中，搅拌30min形成均匀溶液。在连续搅拌下，将0.4g teos滴加到上述溶液中，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，多次洗涤去除非磁性产物。然后，将产物重新分散到丙酮中，90℃回流48h去除ctab，重复提取3次。最后用磁铁分离产物，洗涤，干燥得磁性多孔fe3o4@d-sio2@p-sio2微球。
50.由图1可见，该磁性多孔微球分散性良好，尺寸相对均一，约为380nm。由图2可见，该载体具有核壳结构。由图3可见，在1090cm-1
处附近出现了si-o-si的反对称伸缩振动峰，说明了二氧化硅的成功包覆。由图4可见，谱线在2θ＝30.1
°
，35.4
°
，43.1
°
，57.0
°
，62.6
°
的位置均出现了明显的衍射峰，可归属为fe3o4的(220)，(311)，(400)(511)，(440)晶面，说明在整个制备过程中，fe3o4都得到了完好的保留，从而保证了材料的磁性。在2θ＝22
°
附近出现了一个微弱的宽峰，为无定形sio2的(101)特征衍射峰，表明sio2已成功包覆在fe3o4表面。由图5可见，该载体具有多孔结构，计算得出比表面积为275.17m2/g。
51.载体对漆酶的固定化，包括以下方案：
52.取实施例1所得磁性核壳结构多孔二氧化硅载体分散在含有1.5mg/ml漆酶的0.1m，ph为6的柠檬酸盐缓冲液中，在生化培养箱中，200rpm摇动孵育8h，以达到吸附平衡。并用柠檬酸盐缓冲液洗涤两次以除去任何未结合的酶，固定化漆酶fe3o4@d-sio2@p-sio
2-lac冷冻干燥后于4℃保存备用。
53.取所得固定化漆酶分散在0.1m，ph为3-10的柠檬酸盐缓冲液中，25℃下保存12h后测定其活性，并取等量游离漆酶重复上述操作，进行对比。如图6所示，随着ph的增大，游离漆酶和固定化漆酶的活性均先升高后降低，在ph为5时固定化漆酶活性达到最大。此外，固定化漆酶比游离漆酶具有更高的酶活力，且ph适用范围较宽，特别是在酸性条件下表现出更明显的优势。
54.取所得固定化漆酶分散在0.1m，ph为5的柠檬酸盐缓冲液中，分别在20，25，30，40，50和60℃下保温30min后测定其活性，并取等量游离漆酶重复上述操作，进行对比。如图7所示，固定化漆酶和游离漆酶分别在25℃和30℃表现出较高的活性，温度大于30℃时，活性均降低，但固定化漆酶的活性略高于游离漆酶，说明固定化漆酶具有更好的耐热性。
55.取所得固定化漆酶分散在0.1m，ph为5的柠檬酸盐缓冲液中，以abts为底物，使用固定化漆酶连续10次进行催化反应。如图8所示，重复使用10次后，固定化漆酶活性仍保留58％，因此，固定化漆酶的操作稳定性较高，虽然核心磁性fe3o4极不稳定，容易被氧化和腐蚀，但壳层d-sio2@p-sio2的包覆不仅提高了载体材料的稳定性，还提供了较高的比表面积来吸附漆酶并保持其构象，使固定化漆酶在重复使用过程中保持较高的稳定性。
56.实施例2
57.一种磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的制备方法，该方法包括以下步骤：
58.(1)将0.05g磁性fe3o4分散在由120ml乙醇，40ml去离子水和4ml浓氨水组成的混合溶液中，超声30min得到悬浮液。然后向悬浮液中逐滴加入0.1g teos，在30℃水浴中连续搅
拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，洗涤，干燥得到fe3o4@d-sio2。
59.(2)将0.1g fe3o4@d-sio2分散在含有0.3g ctab，60ml乙醇，80ml去离子水和1ml浓氨水的混合溶液中，搅拌30min形成均匀溶液。在连续搅拌下，将0.3g teos滴加到上述溶液中，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，多次洗涤去除非磁性产物。然后，将产物重新分散到丙酮中，90℃回流48h去除ctab，重复提取3次。最后用磁铁分离产物，洗涤，干燥得磁性多孔fe3o4@d-sio2@p-sio2微球。
60.该磁性多孔微球具有核壳结构，尺寸约为380nm。
61.实施例3
62.一种磁性核壳结构多孔二氧化硅载体的制备方法，该方法包括以下步骤：
63.(1)将0.15g磁性fe3o4分散在由120ml乙醇，40ml去离子水和4ml浓氨水组成的混合溶液中，超声30min得到悬浮液。然后向悬浮液中逐滴加入0.3g teos，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，洗涤，干燥得到fe3o4@d-sio2。
64.(2)将0.2g fe3o4@d-sio2分散在含有0.3g ctab，60ml乙醇，80ml去离子水和1ml浓氨水的混合溶液中，搅拌30min形成均匀溶液。在连续搅拌下，将0.5g teos滴加到上述溶液中，在30℃水浴中连续搅拌6h。反应结束后，用磁铁分离产物，多次洗涤去除非磁性产物。然后，将产物重新分散到丙酮中，90℃回流48h去除ctab，重复提取3次。最后用磁铁分离产物，洗涤，干燥得磁性多孔fe3o4@d-sio2@p-sio2微球。
65.该磁性多孔微球具有核壳结构，尺寸约为400nm。
66.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。