aGPCR拮抗剂

agpcr拮抗剂
技术领域
1.本发明属于agpcr拮抗剂设计技术领域，具体涉及agpcr拮抗剂。


背景技术：

2.黏附类g蛋白偶联受体(adhesion g protein-coupled receptors,agpcr)是g蛋白偶联受体超家族中的第二大家族，在组织发育和生殖、神经、心血管、内分泌等生理系统的许多方面发挥着关键作用。突变或异常表达agpcr与相当广泛的人类疾病直接相关，包括但不限于生育、神经发育或神经行为障碍，肿瘤，肌肉骨骼疾病，感觉和皮肤功能障碍。因此，为了靶向这些受体进行相关配体的研发，通过拮抗剂操纵其信号转导至关重要。
3.目前，agpcr还未有过如小分子、多肽类的拮抗剂相关的报道，因此没有拮抗剂可来研究agpcr在生长发育过程的生理功能，更无法进一步在临床上进行相关研究和应用。
4.agpcr的激活机制难以确定，且缺少有效的配体来调控agpcr的活性。虽然gpcr都有共同的7次跨膜结构，但若想通过靶向筛选拮抗剂会耗费大量的人力、物力、财力和时间才有可能取得一些进步。另外，对agpcr进行拮抗剂等配体的研究需要较高的技术支持和成熟的筛选体系，这也令诸多研究者望而却步。


技术实现要素：

5.本发明在通过冷冻电镜解析了多个agpcr的结构基础之上，进一步开发了多肽类的拮抗剂，并通过电生理等技术在生理作用上进行了相关验证，弥补了agpcr拮抗剂领域的长期空白。
6.一方面，本发明公开了一种多肽，具体为，agpcr的stachel序列的第三位氨基酸突变为酸性氨基酸，其他位点的氨基酸不变或者其他位点的氨基酸增减和/或替换。
7.进一步的，所述酸性氨基酸包括但不限于天冬氨酸和谷氨酸。
8.进一步的，所述stachel序列来源包括但不限于人、小鼠、大鼠。
9.进一步的，所述stachel序列选自：
10.adgrg2(m)：tsfgilldlsrtslp(seq id no.1)
11.adgrg2(h)：tsfgvlldlsrtsvl(seq id no.2)
12.adgrg1(h)：tyfavlmvssvevda(seq id no.3)
13.adgrg3(h)：tffalllrptldqst(seq id no.4)
14.adgrg4(h)：thfgvlmdlsrstvd(seq id no.5)
15.adgrg5(h)：tyfavlmqlspalvp(seq id no.6)
16.adgrg6(h)：thfgvlmdlprsasq(seq id no.7)
17.adgrg7(h)：tnfavlmtfkkdyqy(seq id no.8)
18.adgrl1(h)：tnfavlmahreiyqg(seq id no.9)
19.adgrl2(h)：tnfailmahreiayk(seq id no.10)
20.adgrl3(h)：tnfavlmahvevkhs(seq id no.11)
21.adgrl4(h)：thfailmssgpsigi(seq id no.12)
22.adgre1(h)：anlavimasgeltmd(seq id no.13)
23.adgre2(h)：ssfavlmahydvqee(seq id no.14)
24.adgre3(h)：ssfavlmaltsqeed(seq id no.15)
25.adgre4(h)：ssfavlvalapkedp(seq id no.16)
26.adgre5(h)：ssfailmahydvedw(seq id no.17)
27.adgra1(h)：mdlktvlslprypge(seq id no.18)
28.adgra2(h)：gnvavlmelsafpre(seq id no.19)
29.adgra3(h)：snyavlmdltgsely(seq id no.20)
30.adgrr1(h)：asfavlmdisrreng(seq id no.21)
31.adgrr2(h)：tsfavlmdvsrreng(seq id no.22)
32.adgrr3(h)：gtfgvlmdasprerl(seq id no.23)
33.adgrd1(h)：tnfailmqvvplela(seq id no.24)
34.adgrd2(h)：tsfaillqiyevqrg(seq id no.25)
35.adgrf1(h)：tsfsilmspfvpsti(seq id no.26)
36.adgrf2(h)：tsfsilmsphilesl(seq id no.27)
37.adgrf3(h)：tafsvlmsphtvpee(seq id no.28)
38.adgrf4(h)：msfsilmssksmtdk(seq id no.29)
39.adgrf5(h)：tsfsilmspdspdps(seq id no.30)
40.adgrb1(h)：stfailaqlsadanm(seq id no.31)
41.adgrb2(h)：stfavlaqppkdltl(seq id no.32)
42.adgrb3(h)：stfailaqqpreiim(seq id no.33)
43.adgrv1(h)：svyavyartdnlssy(seq id no.34)
44.括号内的字母指种属，其中“m”表示小鼠(mouse)，“h”代表人(human)。
45.进一步的，所述stachel序列第三位氨基酸突变为酸性氨基酸的基础上，其他位点的氨基酸的增减和/或替换。
46.进一步的，一种多肽，选自：
[0047][0048][0049]
另一方面，本发明公开了所述多肽作为agpcr拮抗剂的应用。
[0050]
进一步的，不同类型的agpcr在stachel序列的第三位氨基酸为酸性氨基酸为agpcr各自对应的拮抗剂。
[0051]
进一步的，ip15-f601d和ip15-f601e作为adgrg2拮抗剂的应用。
[0052]
进一步的，g4-p15-f2724d作为adgrg4拮抗剂的应用。
[0053]
进一步的，g5-p15-f229d作为adgrg5拮抗剂的应用。
[0054]
进一步的，g6-p15-f843d作为adgrg6拮抗剂的应用。
[0055]
另一方面，本发明公开了一种agpcr拮抗剂制备方法，具体为，将agpcr的stachel序列的第三位氨基酸突变为酸性氨基酸，其他位点的氨基酸不变或者其他位点的氨基酸增减和/或替换。
[0056]
进一步的，所述增减不多于3个氨基酸。优选：不多于2个氨基酸。
[0057]
进一步的，所述替换不多于5个氨基酸。优选：不多于3个氨基酸。
[0058]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0059]
1、本发明在通过冷冻电镜解析了多个agpcr的结构基础之上，进一步开发了多肽类的拮抗剂，通过camp assay、fluorescence-based binding assay等技术对短肽进行信号检测，确定多肽对agpcr的拮抗剂效果，弥补了agpcr拮抗剂领域的长期空白。
[0060]
2、本发明通过对adgrg2的7次跨膜和stachel结构的解析，发现adgrg2-β的stachel序列呈u型，并深深地插入到7tm束中，而且adgrg4-β的stachel序列同样呈u型，并深深地插入到7tm束中。agpcr的stachel序列对比并通过实验验证stachel序列的第3位氨基酸突变为酸性氨基酸后能够保持与受体的高亲和力，但由于失去作用而导致受体下游活力丧失。
[0061]
3、本发明通过camp assay、fluorescence-based binding assay等技术从多个角度证实了短肽拮抗剂效果。
附图说明
[0062]
图1：拮抗剂筛选技术路线。
[0063]
图2；adgrg2的7次跨膜和stachel结构。图中，ecl1/2/3分别表示跨膜区1、2、3(extracellular loop，ecl)；“tm”表示跨膜螺旋(transmembrane，tm)，分别为tm1-7；stachel序列显示为一个不对称的“u”型。
[0064]
图3：adgrg4的7次跨膜和stachel结构。图中，ecl1/2/3分别表示跨膜区1、2、3(extracellular loop，ecl)；“tm”表示跨膜螺旋(transmembrane，tm)，分别为tm1-7；stachel序列显示为一个不对称的“u”型。
[0065]
图4：通过camp assay检测各突变短肽引起的adgrg2的gs信号通路(ψ,代表4-mef)。
[0066]
图5：通过fluorescence-based binding assay检测各突变短肽与adgrg2的亲和力(ψ代表4-mef)。
[0067]
图6：通过camp assay检测ip15-f601d和ip15-f601e对adgrg2的拮抗能力。
[0068]
图7：flash bret assay设计示意图。
[0069]
图8：6个adgrg2 flash-bret传感器对ip15或ip15-f601d刺激的最大响应。
[0070]
图9：whole-cell patch-clamp recording技术检测ip15-f601d拮抗引起的细胞内氯离子电流。
[0071]
图10：adgrg2-β正构结合袋中栓系stachel序列区域内的单个残基的能量贡献。
[0072]
图11：agpcr的stachel序列对比，标记星号的氨基酸对应的是标记星号的氨基酸对应的是
[0073]
图12：camp assay检测设计的adgrg4、adgrg5、adgrg6的拮抗剂的活力。
具体实施方式
[0074]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。应该指出，本发明实施例是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0075]
实施例1：agpcr拮抗剂筛选技术路线：
[0076]
以adgrg2为例，agpcr拮抗剂筛选技术路线如图1所示，具体为：
[0077]
首先，通过sf9细胞表达重组adgrg2与下游gαs，gβγ复合物，将受体与g蛋白共感染sf9细胞，48h后收集细胞进行蛋白纯化，经分子筛纯化后取峰尖位置进行浓缩，并用sds-page电泳鉴定分析复合物的样品比例，确定样品的质量后，将浓缩后的蛋白进行冷冻制样，通过300kv冷冻电镜收集图片，拿到收集的图片后对收集到的图片颗粒进行处理，将颗粒进行二维平均和三维分类，最终拿到adgrg2信号转导复合物的高分辨率结构。通过分析复合物的结构去设计多肽，设计的多肽通过一系列实验去验证多肽的拮抗效果。
[0078]
粘附类g蛋白偶联受体(adhesion g protein-coupled receptors，agpcr)是一种进化历史悠久的受体家族，通常经过自身蛋白水解产生α和β亚基，β亚基的“stachel序列”介导的栓系激动作用已被认为在agpcr激活中发挥核心作用。adgrg2-β亚基与下游gαs，gβγ复合物的7次跨膜，如图2左图所示，adgrg2-β的stachel序列呈u型，并深深地插入到7个跨膜(7tm)束中，adgrg2-β由(代表疏水残基)motif组成，5个残基像手指一样伸展，介导与7tm结合和受体激活，如图2右图所示。在这之前通过adgrg2-fl-ip15-gs复合物验证了agpcr-β结构可以实现合理的肽配体的设计，因为adgrg2-fl-ip15-gs复合物结构为提高ip15的结合亲和力提供了结构基础，其中，ip15为外源性adgrg2 stachel序列衍生肽激动剂，adgrg2-fl为全长的adgrg2。对ip15序列进行氨基酸突变，通过camp assay、fluorescence-based binding assay等技术对短肽进行信号检测，确定多肽对adgrg2的拮抗剂效果。
[0079]
实施例2：多肽拮抗能力的确定
[0080]
1、通过camp assay检测各突变短肽引起的adgrg2的gs信号通路。
[0081]
adgrg2具有gs信号传导通路，可以通过检测细胞内的camp水平变化来验证各突变短肽的激动效果。将adgrg2-β-δs质粒(截去adgrg2的n端和stachel序列，pcdna3.1载体)和glosensor质粒在hek293细胞中瞬转，24h后将共转染的细胞接种到96孔板中，在96孔板中培育24h后，用包含glosensor camp底物(购至promega)的无血清培养基中孵育2h。将细胞用不同短肽孵育后用envision multimode plate reader(perkin elmer)进行读数。
[0082]
结果如图4所示，其中，control组不加短肽，第2行的tsfgilldlsrtslp短肽为野生型(wt)短肽(即经合成的adgrg2原始的stachel序列)，第3行的isψgilldlsrtslp(ψ,代表4-mef)是ip15的序列。以wt得到的数据作为100％，每组数据与wt进行比较。图中：***p《0.001；**p《0.01；*p《0.05；n.s.,no significant difference(无显著差别)。
[0083]
2、通过fluorescence-based binding assay检测各突变短肽与adgrg2的亲和力。
[0084]
fluorescence-based binding assay是通过检测荧光的方法鉴定配体与受体的结合能力。在ip15序列的c端连接上fitc(公司合成)做成ip15-fitc短肽。截去adgrg2的n端和stachel序列，并在tm1的n端插入nanoluc(nluc)序列(pcdna3.1载体)，将此质粒在hek293细胞中进行瞬转，96孔板中培养48h，然后用50μm ip15-fitc分别和对应的不同浓度的突变短肽在37℃孵育40min，之后加入终浓度为5μm的luciferase substrate coelenterazine h(购至promega)，用mithras lb 940multimode microplate reader进行读数。
[0085]
结果如图5所示，其中，激发波长为460nm，接收波长为535nm。每组数据与单独的ip15进行比较。图中：***p《0.001；**p《0.01；*p《0.05；n.s.,no significant difference(无显著差别)。
[0086]
图4结果为各突变短肽所引起的gs信号的区别，图5结果为突变短肽与adgrg2的亲和力检测，分析发现f601d/f601e这两个短肽几乎消除了adgrg2的gs活性，但与adgrg2依然保持很高的亲和力，综合这两个结果，短肽ip15-f601d(isdgilldlsrtslp)和ip15-f601e(isegilldlsrtslp)是adgrg2的拮抗剂。
[0087]
实施例3：ip15-f601d和ip15-f601e对adgrg2的拮抗能力。
[0088]
通过camp assay再次检测ip15-f601d和ip15-f601e对adgrg2的拮抗能力。将adgrg2-β-δs质粒(截去adgrg2的n端和stachel序列，pcdna3.1载体)和glosensor质粒在hek293细胞中瞬转，24h后将共转染的细胞接种到96孔板中，在96孔板中培育24h后，用包含glosensor camp底物(购至promega)的无血清培养基中孵育2h，之后将不同浓度的ip15-f601d和ip15-f601e分别与1μm的ip15孵育后用envision multimode plate reader(perkin elmer)进行读数。
[0089]
结果如图6所示，ip15是adgrg2的激动剂，能引起细胞内camp值升高。将ip15引起的数值作为100％，两个短肽引起的下降的窗口值即为其对应的拮抗能力。
[0090]
实施例4：ip15-f601d和ip15-f601e作用下受体构象的变化。
[0091]
通过flash bret assay检测在ip15-f601d和ip15-f601e作用下受体构象的变化。如图7示意图所示，将g蛋白偶联受体的受体的n端以及stachel序列截去，在tm1的n端插入nluc序列，并在胞外环(extracellular loop，ecl)的不同位置插入flash motifs(-ccpgcc-)序列(pcdna3.1载体)。将质粒瞬转到hek293细胞中，48h后用2.5μm flash-edt2在37℃孵育40min。用bret buffer(25mm hepes,ph 7.0,1mm cacl2,140mm nacl,2.7mm kcl,0.9mm mgcl2,0.37mm nah2po4,5.5mm d-glucose,12mm nahco3)buffer清洗后重悬细胞接种到白壁透明底96孔板中用mithras lb 940multimode microplate reader读数。
[0092]
如图8所示，其中，nluc波长为440-480nm；flash波长为525-585nm。星号表示在不同的ecl插入的flash motifs。从实验结果可以看到，adgrg2的s2和s4这两个位点，在激动剂作用下会引起n端与ecl1/ecl2的靠近，而拮抗剂ip15-f601d在这两个位点会导致n端与ecl1/ecl2的远离。这种构象变化效应的不同与激动剂ip15和拮抗剂ip15-f601d与adgrg2的结合有关。
[0093]
实施例5：ip15-f601d引起的细胞内电流变化。
[0094]
通过whole-cell patch-clamp recording技术检测ip15-f601d引起的细胞内电流变化，将野生型adgrg2和cftr单独瞬转或共同瞬转进hek293细胞中，48h后用电压钳记录
不同浓度的ip15-f601d引起的全细胞内cl-电流。实验时，细胞外液buffer为130mm nacl,5mm kcl,1mm mgcl2,2.5mm cacl2,20mm hepes，ph 7.4(含甘露糖，osmolarity，310)。ip15-f601d溶解在细胞内液：buffer为101mm cscl,10mm egta,10mm hepes,20mm teacl,2mm mgatp,2mm mgcl2,5.8mm glucose，ph 7.2(含甘露糖，osmolarity，310)。
[0095]
结果如图9所示，实验结果显示ip15-f601d能够剂量依赖性的减少共转adgrg2和cftr的细胞内氯离子电流，该实验表明拮抗剂ip15-f601d在细胞水平上能够发挥生理作用。
[0096]
综上所述，通过adgrg2的结构解析，推断出agpcr stachel序列中保守序列，这可能是其他agpcr成员的共同激活机制，stachel序列的多肽的具有治疗能力，对peptide进行设计，对stachel序列中关键活性残基的突变，将激动剂转化为peptide拮抗剂，并通过camp assay，fluorescence-based binding assay，flash bret assay，whole-cell patch-clamp recording方法验证了所开发的拮抗剂，于是通过agpcr的栓系序列对激活过程中涉及的关键残基进行修饰，从而开发出针对几个agpcr成员的肽拮抗剂具有广阔的应用前景。
[0097]
实施例6：agpcr的stachel序列对比。
[0098]
在adgrg4的研究中，如图3所示，adgrg4的7次跨膜(左图)和stachel结构(右图)，可以看出，adgrg4-β的stachel序列同样呈u型，并深深地插入到7tm束中。利用分子力学poisson-boltzmann表面积(mm-pbsa)方法计算了最佳估计的单个残基能量贡献，以评估哪些残基对7tm束中stachel序列的结合贡献最大。值得注意的是，在介导stachel序列与adgrg2-β或adgrg4-β的7tm束分子内相互作用的13个残基中，adgrg2-β的5个手指残基和adgrg4-β的4个手指残基贡献最大，如图10所示。对agpcr的stachel序列进行对比，这些手指残基编码疏水基(代表疏水残基)，在人的33个agpcr中有20个保守，序列比对结果如图11所示，其中第三位氨基酸的贡献最大，于是在stachel peptide序列的基础上将第三位氨基酸突变，猜想如果将第三位氨基酸突变为酸性的氨基酸有可能依然可以占住agpcr正构口袋pocket中的疏水坑，保持与受体的高亲和力，但由于失去作用而导致受体下游活力的丧失。
[0099]
实施例7：stachel序列的第3位氨基酸转化为酸性氨基酸的拮抗活性。
[0100]
通过camp assay检测设计的adgrg4、adgrg5、adgrg6的拮抗剂，将adgrg4/5/6-β-δs质粒(截去adgrg4/5/6的n端和stachel序列,pcdna3.1载体)和glosensor质粒在hek293细胞中瞬转，24h后将共转染的细胞接种到96孔板中，在96孔板中培育24h后，用包含glosensor camp底物(购至promega)的无血清培养基中孵育2h，之后将不同浓度的g4-p15-f2724d/g5-p15-f229d/g6-p15-f843d和对应的激动剂g4-p15(th(4-mef)gvlmdlsrstvd)/g5-p15(ty(4-mef)avlmqlspalvp)/g6-p15(th(4-mef)gvlmdlprsasq)孵育后用envision multimode plate reader(perkin elmer)进行读数。
[0101]
结果如图12所示，ip15是adgrg2的激动剂，能引起细胞内camp值升高。将激动剂引起的数值作为100％(control)，短肽引起的下降的窗口值即为其对应的拮抗能力。实验结果表明，根据转变stachel序列的第三位氨基酸为酸性氨基酸来设计agpcr各自对应的拮抗剂，这一理论具有通用性。
[0102]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技
术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。