氨基葡萄糖及其衍生物作为抗新型冠状病毒药物的用途

氨基葡萄糖及其衍生物作为抗新型冠状病毒药物的用途
1.本发明是2020年10月26日提交的申请号为202011155916.6、发明名称为“氨基葡萄糖及其衍生物作为抗新型冠状病毒药物的用途”的分案申请。
技术领域
2.本发明属于医药领域，具体而言，涉及一类氨基葡萄糖化合物、其药学上可接受的盐，以及包含该氨基葡萄糖化合物的药物组合物在制备抗sars-cov-2病毒(新型冠状病毒)及其突变病毒株的药物中的用途。


背景技术：

3.氨基葡萄糖简称氨糖，是蛋白质或脂类糖基化反应中的重要前体，化学结构为葡萄糖的2位羟基被氨基取代后生成的一种氨基单糖。氨基葡萄糖衍生物n-乙酰氨基葡萄糖是甲壳素的单体。工业上通常采用水解甲壳类动物外骨骼制取氨基葡萄糖。氨基葡萄糖经常被用于骨关节炎的膳食辅助治疗。本发明的发明人在实验的过程中发现氨基葡萄糖及其衍生物对多种病毒具有明显的抑制作用，且具有良好的用药安全性，因此其作为抗病毒药物的开发具有广阔的前景。例如，在f.floc’h等人的文献(in vivo antiviral activity of d-glucosamine,archive of virology 52,169-173(1976))中已经报道了氨基葡萄糖可以降低劳斯肉瘤病毒在鹌鹑或雏鸡中诱发的肿瘤的生长速度，并增加接种人流感病毒的小鼠的存活率。然而在近半个世纪前还未出现诸如当今的各种冠状病毒的分类和亚型。
4.近来随着新型冠状病毒的疫情在全世界范围内的蔓延，人们已经意识到研发抗新型冠状病毒药物的紧迫性。国际病毒分类委员会声明，将新型冠状病毒命名为“sars-cov-2”。与此同时，肺炎则被命名为“covid-19”。
5.本技术的发明人对之前研发的化合物(中国专利cn201910192721.x)进行进一步研究发现氨基葡萄糖及其衍生物对sars-cov-2病毒也具有明显的疗效。
6.发明人经过进一步的研究发现式1表示的氨基葡萄糖化合物，化学名称为2-氨基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖，对sars-cov-2病毒具有明显的抑制作用。作为抗sars-cov-2病毒(新型冠状病毒)及其突变病毒株的药物具有良好的开发前景。


技术实现要素：

7.本发明的一方面，提供通式i所示的氨基葡萄糖化合物、其药学上可接受的盐在制备抗sars-cov-2病毒及其突变病毒株的药物中的用途：
8.9.其中，取代基r和r’相同或不同，各自独立地选自氢、取代的或未取代的c1-c8烷基、取代的或未取代的c1-c8烷基羰基、取代的或未取代的c6-c15芳基羰基、取代的或未取代的c6-c15芳氧基羰基以及取代的或含有选自n、o和s的1至3个杂原子的饱和或不饱和5元或6元杂环基氨基羰基；
10.其中，所述“取代的”是指所述取代基上还含有1或2个选自甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲酸甲酯基、甲酸乙酯基、甲酸丙酯基、氟和氯的取代基。
11.优选地，取代基r和r’相同或不同，各自独立地选自氢、取代的或未取代的c1-c6烷基、取代的或未取代的c1-c6烷基羰基、取代的或未取代的c6-c10芳基羰基、取代的或未取代的c6-c10芳氧基羰基。
12.进一步优选地，取代基r和r’相同或不同，各自独立地选自氢、取代的或未取代的c1-c4烷基、取代的或未取代的c1-c4烷基羰基、取代的或未取代的c6-c8芳基羰基、取代的或未取代的c6-c8芳氧基羰基。
13.进一步优选地，取代基r和r’各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、异丁基羰基、叔丁基羰基、苯基羰基、甲基苯基羰基、乙基苯基羰基、丙基苯基羰基、异丙基苯基羰基、正丁基苯基羰基、异丁基苯基羰基、叔丁基苯基羰基、萘基羰基、甲基萘基羰基、乙基萘基羰基、丙基萘基羰基、异丙基萘基羰基、正丁基萘基羰基、异丁基萘基羰基、叔丁基萘基羰基。
14.优选地，所述通式i所示的氨基葡萄糖化合物、其药学上可接受的盐选自以下化合物中的一种：
[0015][0016]
优选地，所述药学上可接受的盐为通式i化合物与无机酸或有机酸反应形成的常规的无毒盐。
[0017]
进一步优选地，所述无毒盐通过通式i化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸，以及所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、
乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸；或者通式i化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者通式i化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或者通式i化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸和乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
[0018]
本发明的另一方面，提供一种抗sars-cov-2病毒药物组合物，其含有作为活性成分的通式i所示化合物、其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或辅料。
[0019]
本发明的另一方面，提供所述药物组合物在制备抗sars-cov-2病毒及其突变病毒株的药物中的用途。
[0020]
优选地，所述药物组合物包括但不限于囊剂，片剂，注射剂，栓剂，输液剂，搽剂，乳剂。
[0021]
优选地，根据本发明的通式i所示的氨基葡萄糖化合物、其药学上可接受的盐，或者含有通式i所示化合物、其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物在制备sars-cov-2病毒及其突变病毒株的药物中的用途，所述药物用于治疗或预防哺乳动物中由sars-cov-2病毒及其突变病毒株引起的非典型性肺炎。
[0022]
优选地，所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，例如是人、猫、狗或猪。
[0023]
有益效果
[0024]
根据本发明的通式i所示的化合物具有良好的抗sars-cov-2病毒作用，可以用于制备抗sars-cov-2病毒药物。
附图说明
[0025]
图1为根据实施例1的小鼠感染实验的流程图。
[0026]
图2为根据实施例1的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织切片扫描对照分析图。
[0027]
图3为根据实施例1的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织的病毒rna载量的对照图。
[0028]
图4为根据实施例2的小鼠感染实验的流程图。
[0029]
图5为根据实施例2的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织的病毒rna载量的对照图。
[0030]
图6为根据实施例3的小鼠感染实验的流程图。
[0031]
图7为根据实施例3的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织的病毒rna载量的对照图。
[0032]
图8为根据实施例4的小鼠感染实验的流程图。
[0033]
图9为根据实施例4的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织的病毒rna载量的对照图。
[0034]
图10根据实施例5的小鼠感染实验的流程图。
[0035]
图11根据实施例5的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织的病毒rna载量的对照图。
[0036]
图12根据实施例6的小鼠感染实验的流程图。
[0037]
图13根据实施例6的给药组和对照组小鼠支气管和肺组织的病毒rna载量的对照图。
[0038]
使用荧光-定量实时pcr(qrt-pcr)方法评价测试实施例1-6中对照组小鼠和给药组小鼠支气管及肺组织中sars-cov-2病毒载量的差异。
具体实施方式
[0039]
以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
[0040]
2019新型冠状病毒(2019-ncov)是以前从未在人类中发现的冠状病毒新毒株。2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ictv)宣布，2019新型冠状病毒(2019-ncov)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)。同日，世界卫生组织(who)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为covid-19。sars-cov-2感染的症状主要以肺炎为主，依据病情的轻重程度可分为单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合症、脓毒症、脓毒症休克等。单纯性感染的患者可能有非特异性症状，例如发热、咳嗽、咽痛、鼻塞、乏力、头痛、肌肉疼痛或不适，老年人和免疫抑制者可能会出现非典型症状。轻症肺炎的患者主要以咳嗽、呼吸急促为主。重症肺炎可见于成人、青少年或儿童，主要症状为呼吸频率增加，严重的呼吸衰竭或呼吸困难，中心型发绀、嗜睡、意识不清或惊厥、抽气等。急性呼吸窘迫综合症的肺部影像为双侧磨玻璃影，但不能完全由积液、大叶渗出或者肺不张或者肺部块影解释，以肺水肿为主要症状。脓毒症患者往往有致命的器官功能障碍，脓毒性休克是最为危重的患者，死亡可能性较高。目前，针对新型冠状病毒感染，临床上以支持治疗为主，无特异抗病毒药物可用。
[0041]
本发明的发明人发现根据本发明的通式i所示的氨基葡萄糖化合物、其药学上可接受的盐或者溶剂合物可以有效抑制sars-cov-2病毒性相关疾病的发生。
[0042]
另外根据所述式i表示的化合物在制备抗sars-cov-2病毒及其突变病毒株的药物中的用途，本发明开发了新的药物组合物，其中含有作为活性成分的通式i所示化合物、其药学上可接受的盐或者溶剂合物，以及药学上可接受的载体或辅料。
[0043]
所述“药学上可接受的盐”为通式i的化合物与无机酸或有机酸反应形成的常规的无毒盐。例如，所述常规的无毒盐可通过通式i的化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，以及所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者
通式i的化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者通式i的化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或者通式i的化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸和乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
[0044]
术语“药学上可接受的载体或辅料”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考remington：the science和practice of pharmacy,21st ed.,lippincott,williams&wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
[0045]
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
[0046]
本发明的药物组合物可以为各种剂型，包括但不限于，囊剂，片剂，注射剂，栓剂，输液剂，搽剂，乳剂，固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂或复方制剂等。
[0047]
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位剂量中包含0.05-200mg通式(i)化合物，优选地，制剂配方的单位剂量中包含0.1mg-100mg通式(i)化合物。
[0048]
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
[0049]
以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。
[0050]
实验实施例1
[0051][0052]
市售cas:90-77-7
[0053]
实验实施例2
[0054][0055]
市售cas:10036-64-3
[0056]
实验实施例3
[0057][0058]
化合物的合成参考文献journal of biotechnology,115(2),157-166；2005
[0059]1h nmr(400mhz,d2o):0.95(3h,m),2.16(2h,m),3.29(1h,dd,),3.62(1h,dd),3.58(1h,dd),3.61
–
3.67(2h,m),3.72(1h,dd),4.99(1h,d,j＝3.5hz,h-1).esi-ms:236.5[m h]

[0060]
实验实施例4
[0061][0062]
化合物的合成参考文献journal of biotechnology,115(2),157-166；2005
[0063]1h nmr(400mhz,d2o):0.95(3h,m),1.32(2h,m),2.16(2h,m),3.29(1h,dd,),3.62(1h,dd),3.58(1h,dd),3.61
–
3.67(2h,m),3.72(1h,dd),4.99(1h,d,j＝3.5hz,h-1).esi-ms:250.1[m h]

[0064]
实验实施例5
[0065][0066]
参考文献huaxue yanjiu yu yingyong,20(3),290-294；2008制备得到；产率：96.0％。
[0067]1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ:7.95～7.54(m,5h,ar),7.45～7.42(m,1h,j
1,2
＝7.6hz,
h-1,β-),6.52(d,j
nh,2
＝4.8hz,1h,nh),5.04～4.57(m,4h,4oh),3.81～3.72(m,1h,h-4),3.73～3.71(m,1h,h-3),3.66～3.63(m,2h,h-6和h-6'),3.51～3.42(m,1h,h-5),3.20～3.16(m,1h,h-2)。esi-ms:284[m 1]

[0068]
实验实施例6
[0069][0070]
参考文献huaxue yanjiu yu yingyong,20(3),290-294；2008制备得到；产率：96.0％。
[0071]1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ:7.92～7.54(m,4h,ar),7.45～7.42(m,1h,j
1,2
＝7.6hz,h-1,β-),6.52(d,j
nh,2
＝4.8hz,1h,nh),5.04～4.57(m,4h,4oh),3.81～3.72(m,1h,h-4),3.73～3.71(m,1h,h-3),3.66～3.63(m,2h,h-6和h-6'),3.51～3.42(m,1h,h-5),3.20～3.16(m,1h,h-2)，2.35(s,3h)。esi-ms:298[m 1]

[0072]
实施例1：化合物1在动物水平上抗sars-cov-2病毒活性评价。
[0073]
1、小鼠感染实验：
[0074]
选取性别、体重一致的6—8周龄balb/c小鼠，把小鼠平均分为两组(对照组和给药组)，对照组小鼠喂食普通饲养鼠粮，给药组小鼠喂食含的化合物1的鼠粮(含量为2.5％(重量百分比))。喂食三天后，给两组小鼠滴鼻感染sars-cov-2鼠适应株病毒，病毒感染期间给药组小鼠持续喂食含式i的化合物的氨基葡萄糖的鼠粮。病毒感染三天后，安乐死处死小鼠，解剖取得小鼠的支气管和肺组织，实验流程图如图1所示。将获取的组织分成两份，一份立即置于4％多聚甲醛溶液进行固定备用，一份立即进行研磨，提取rna进行病毒核酸载量检测。
[0075]
2、病理染色步骤：
[0076]
①
固定：将肺组织置于4％多聚甲醛溶液中常温固定过夜，使组织、细胞的蛋白质变性凝固；
[0077]
②
修剪：将固定的组织修建成合适的大小，放入包埋盒中，流水冲洗30分钟(去除组织中的固定液)；
[0078]
③
浸蜡，包埋：将组织置于已溶化的石蜡中，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，所使用的包埋仪器(品牌：thermo,型号：histo star)冷却凝固成块即成；
[0079]
④
切片、展片、烤片：将包埋好的蜡块固定于切片机(品牌:thermo,型号:hm 340e)上，切成薄片，一般为5-8微米厚。将切下的薄片贴到载玻片上，放65℃恒温箱中烘干2小时以上；
[0080]
⑤
he染色：采用自动染色机(品牌：thermo,型号：gemini as)对切片进行he染色，先用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，再入蒸馏水，将切片进行苏木
精(品牌：北京蒂诺奥生物科技有限公司,货号：r20580)染色，之后采用流水冲洗，用1％盐酸-乙醇进行分化，进行伊红(品牌：中杉金桥生物科技有限公司，货号：zli-9613)染色；
[0081]
⑥
脱水，透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；
[0082]
⑦
将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，待树胶略干后，对切片进行标记待用；
[0083]
⑧
切片扫描：将切片用数字病理切片扫描仪(品牌：nanozooner,型号：2.0hj)进行扫描，采用ndp.view2 u12388-01数字病理切片浏览软件分析结果，结果如图2所示。3、核酸检测步骤：
[0084]
①
组织破碎：将需要检测的支气管和肺组织剪碎，加入一定量的trizol(品牌：ambion,货号:1559625)，使用组织破碎仪(品牌:scientz,型号:scientz-48)裂解组织，将破碎的组织进行离心(12000rpm,4℃离心15分钟)，取上清待用；
[0085]
②
提取rna:在上清中加入氯仿，充分震荡后静置5分钟，12000rpm,4℃离心15分钟，吸取上清；在上清中加入等量的异丙醇混匀，4℃静置10分钟，12000rpm,4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用75％的乙醇洗1-2遍，吸干上清，沉淀即为rna；用65℃的纯水溶解rna，-80℃保存待用；
[0086]
③
逆转录：取500ng的rna，用逆转录试剂盒(品牌：takara,货号：rr036a)进行逆转录，37℃孵育15-20分钟，85℃孵育15秒；
[0087]
④
荧光定量实时pcr：将逆转录的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，荧光定量pcr设备(品牌:applied biosystems,型号:step one plus)，所用引物及探针如下所示：
[0088]
cov-f3:tcctggtgattcttcttcaggt；
[0089]
cov-r3:tctgagagagggtcaagtgc；
[0090]
cov-探针:agctgcagcaccagctgtcca；
[0091]
sars-cov-2核酸rna拷贝数检测结果如图3所示。
[0092]
4、实验结果
[0093]
由图1的he染色结果可见，sars-cov-2病毒感染后小鼠发生了一定程度的间质性肺炎，由结果可见，给药组感染小鼠的肺组织中炎性细胞浸润程度相比对照组小鼠有所减轻，同时可见，对照组小鼠肺泡间隔发生了明显的增厚，血管损伤程度也较给药组小鼠具有明显的加重。实验结果证明化合物1氨基葡萄糖给药可以明显减轻sars-cov-2感染引发的肺部炎症，对sars-cov-2感染小鼠具有一定的保护作用。
[0094]
由图2的核酸检测结果可见，给药组小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数显著低于对照组小鼠，对照组小鼠数量为7只，给药组小鼠数量为8只，对照组小鼠感染三天后支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为1.6
×
109和2.4
×
10
10
，而给药组感染小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为1.2
×
108和1
×
109，两组结果具有显著性差异。上述结果证明化合物1对sars-cov-2病毒感染的小鼠具有良好的治疗效果，可作为抗sars-cov-2病毒的治疗手段。
[0095]
实施例2：化合物2在动物水平上抗sars-cov-2病毒活性评价。
[0096]
1.小鼠感染实验：
[0097]
选取性别、体重一致的6—8周龄balb/c小鼠，把小鼠平均分为两组(对照组和给药组)，给药组小鼠用含化合物2的溶液进行灌胃(给药剂量为350mg/kg体重)，对照组小鼠用
80℃保存待用；
[0111]
③
逆转录：取500ng的rna，用逆转录试剂盒(品牌：takara,货号：rr036a)进行逆转录，37℃孵育15-20分钟，85℃孵育15秒；
[0112]
④
荧光定量实时pcr：将逆转录的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，荧光定量pcr设备(品牌:applied biosystems,型号:step one plus)，所用引物及探针如实施例1所示，sars-cov-2核酸rna拷贝数检测结果如图7所示。
[0113]
3.实验结果：
[0114]
由图7的核酸检测结果可见，给药组小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数显著低于对照组小鼠，对照组小鼠数量为7只，给药组小鼠数量为5只，对照组小鼠感染三天后支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为1.6
×
109和2.4
×
10
10
，而给药组感染小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为2.24
×
108和3.7
×
109，两组结果具有显著性差异。上述结果证明化合物3对sars-cov-2病毒感染的小鼠具有良好的治疗效果，可作为抗sars-cov-2病毒的治疗手段。
[0115]
实施例4：化合物4在动物水平上抗sars-cov-2病毒活性评价。
[0116]
1.小鼠感染实验：
[0117]
选取性别、体重一致的6—8周龄balb/c小鼠，把小鼠平均分为两组(对照组和给药组)，给药组小鼠用含化合物4的溶液进行灌胃(给药剂量为500mg/kg体重)，对照组小鼠用相同体积的pbs进行灌胃。灌胃三天后，给两组小鼠滴鼻感染sars-cov-2鼠适应株病毒，病毒感染期间给药组小鼠持续进行给药。病毒感染三天后，安乐死处死小鼠，解剖取得小鼠的支气管和肺组织，实验流程图如图8所示。将获取的组织立即进行研磨，提取rna进行病毒核酸载量检测。
[0118]
2.核酸检测步骤：
[0119]
①
组织破碎：将需要检测的支气管和肺组织剪碎，加入一定量的trizol(品牌：ambion,货号:1559625)，使用组织破碎仪(品牌:scientz,型号:scientz-48)裂解组织，将破碎的组织进行离心(12000rpm,4℃离心15分钟)，取上清待用；
[0120]
②
提取rna:在上清中加入氯仿，充分震荡后静置5分钟，12000rpm,4℃离心15分钟，吸取上清；在上清中加入等量的异丙醇混匀，4℃静置10分钟，12000rpm,4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用75％的乙醇洗1-2遍，吸干上清，沉淀即为rna；用65℃的纯水溶解rna，-80℃保存待用；
[0121]
③
逆转录：取500ng的rna，用逆转录试剂盒(品牌：takara,货号：rr036a)进行逆转录，37℃孵育15-20分钟，85℃孵育15秒；
[0122]
④
荧光定量实时pcr：将逆转录的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，荧光定量pcr设备(品牌:applied biosystems,型号:step one plus)，所用引物及探针如实施例1所示，sars-cov-2核酸rna拷贝数检测结果如图9所示。
[0123]
3.实验结果：
[0124]
由图9的核酸检测结果可见，给药组小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数显著低于对照组小鼠，对照组小鼠和给药组小鼠数量均为4只，对照组小鼠感染三天后支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为8.4
×
108和8.6
×
109，而给药组感染小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为1.7
×
108和3.13
×
109。上述结果证明化合物4对sars-cov-2病毒感染的小鼠具有良好的治疗效果，可作为抗sars-cov-2病毒的治疗手段。
[0125]
实施例5：化合物5在动物水平上抗sars-cov-2病毒活性评价。
[0126]
1.小鼠感染实验：
[0127]
选取性别、体重一致的6—8周龄balb/c小鼠，把小鼠平均分为两组(对照组和给药组)，给药组小鼠用含化合物5的溶液进行灌胃(给药剂量为500mg/kg体重)，对照组小鼠用相同体积的pbs进行灌胃。灌胃三天后，给两组小鼠滴鼻感染sars-cov-2鼠适应株病毒，病毒感染期间给药组小鼠持续进行给药。病毒感染三天后，安乐死处死小鼠，解剖取得小鼠的支气管和肺组织，实验流程图如图10所示。将获取的组织立即进行研磨，提取rna进行病毒核酸载量检测。
[0128]
2.核酸检测步骤：
[0129]
①
组织破碎：将需要检测的支气管和肺组织剪碎，加入一定量的trizol(品牌：ambion,货号:1559625)，使用组织破碎仪(品牌:scientz,型号:scientz-48)裂解组织，将破碎的组织进行离心(12000rpm,4℃离心15分钟)，取上清待用；
[0130]
②
提取rna:在上清中加入氯仿，充分震荡后静置5分钟，12000rpm,4℃离心15分钟，吸取上清；在上清中加入等量的异丙醇混匀，4℃静置10分钟，12000rpm,4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用75％的乙醇洗1-2遍，吸干上清，沉淀即为rna；用65℃的纯水溶解rna，-80℃保存待用；
[0131]
③
逆转录：取500ng的rna，用逆转录试剂盒(品牌：takara,货号：rr036a)进行逆转录，37℃孵育15-20分钟，85℃孵育15秒；
[0132]
④
荧光定量实时pcr：将逆转录的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，荧光定量pcr设备(品牌:applied biosystems,型号:step one plus)，所用引物及探针如实施例1所示，sars-cov-2核酸rna拷贝数检测结果如图11所示。
[0133]
3.实验结果：
[0134]
由图11的核酸检测结果可见，给药组小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数显著低于对照组小鼠，对照组小鼠和给药组小鼠数量均为4只，对照组小鼠感染三天后支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为8.4
×
108和8.6
×
109，而给药组感染小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为3.4
×
108和4.44
×
109。上述结果证明化合物5对sars-cov-2病毒感染的小鼠具有良好的治疗效果，可作为抗sars-cov-2病毒的治疗手段。
[0135]
实施例6：化合物6在动物水平上抗sars-cov-2病毒活性评价。
[0136]
1.小鼠感染实验：
[0137]
选取性别、体重一致的6—8周龄balb/c小鼠，把小鼠平均分为两组(对照组和给药组)，给药组小鼠用含化合物6的溶液进行灌胃(给药剂量为500mg/kg体重)，对照组小鼠用相同体积的pbs进行灌胃。灌胃三天后，给两组小鼠滴鼻感染sars-cov-2鼠适应株病毒，病毒感染期间给药组小鼠持续进行给药。病毒感染三天后，安乐死处死小鼠，解剖取得小鼠的支气管和肺组织，实验流程图如图12所示。将获取的组织立即进行研磨，提取rna进行病毒核酸载量检测。
[0138]
2.核酸检测步骤：
[0139]
①
组织破碎：将需要检测的支气管和肺组织剪碎，加入一定量的trizol(品牌：ambion,货号:1559625)，使用组织破碎仪(品牌:scientz,型号:scientz-48)裂解组织，将破碎的组织进行离心(12000rpm,4℃离心15分钟)，取上清待用；
[0140]
②
提取rna:在上清中加入氯仿，充分震荡后静置5分钟，12000rpm,4℃离心15分钟，吸取上清；在上清中加入等量的异丙醇混匀，4℃静置10分钟，12000rpm,4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用75％的乙醇洗1-2遍，吸干上清，沉淀即为rna；用65℃的纯水溶解rna，-80℃保存待用；
[0141]
③
逆转录：取500ng的rna，用逆转录试剂盒(品牌：takara,货号：rr036a)进行逆转录，37℃孵育15-20分钟，85℃孵育15秒；
[0142]
④
荧光定量实时pcr：将逆转录的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，荧光定量pcr设备(品牌:applied biosystems,型号:step one plus)，所用引物及探针如实施例1所示，sars-cov-2核酸rna拷贝数检测结果如图13所示。
[0143]
3.实验结果：
[0144]
由图13的核酸检测结果可见，给药组小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数显著低于对照组小鼠，对照组小鼠和给药组小鼠数量均为4只，对照组小鼠感染三天后支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为8.4
×
108和8.6
×
109，而给药组感染小鼠支气管和肺组织中sars-cov-2病毒rna拷贝数平均值分别为4.01
×
108和5.24
×
109。上述结果证明化合物6对sars-cov-2病毒感染的小鼠具有良好的治疗效果，可作为抗sars-cov-2病毒的治疗手段。