一种树鼩脑部核团定位方法

1.本发明属于脑科学技术领域，具体涉及一种树鼩脑部核团定位方法。


背景技术：

2.脑立体定位技术是脑科学研究领域内经典、常规的技术方法。随着近年来脑科学和神经科学的快速发展，对深部脑成像、在体电生理、光遗传和神经环路追踪等技术的需求日盛，这些研究技术都是建立在对动物的脑部核团进行精准定位的基础之上。只有精确定位到目标核团，才能对此核团进行深部脑成像、脑内定点给药、在体电生理记录、光遗传控制和神经环路追踪等研究。
3.现有技术中常采用脑立体定位仪结合动物脑部坐标原点来对动物脑部核团进行精确导航和定位。而脑部坐标原点定位方法则是脑立体定位技术的关键。小鼠、大鼠和狨猴等模式动物都已经建立了成熟的脑部坐标原点定位方法。
4.树鼩(学名：tupaia belangeri)是树鼩科树鼩属动物，树鼩全基因组测序分析和国内外多项研究结果表明，其亲缘关系与灵长类最接近(约93.4％)，在组织解剖学、生理学、生物化学、神经系统(脑功能)、代谢系统和免疫系统等方面与人类近似，与灵长类动物比较，其自身具有体型小、繁殖周期短、易于实验操作、饲养成本低等特点，已广泛应用于生物医药研究领域，包括用于脑科学和神经科学的研究。
5.目前对树鼩脑部核团解剖及导航定位所知甚少，想要把它用于脑科学和神经科学的研究，这对神经科学家来说将是不小的挑战。目前所报道的树鼩脑立体定位坐标系统缺乏统一标准，tigges等(1969)著作的《a stereotaxic brain atlas of the tree shrew(tupaia glis)》图谱中采用horsley-clark坐标系：穿过耳杆和眼眶下边缘的平面来定义坐标零点平面；垂直零点平面穿过耳间线(耳杆连线)并与水平零点平面垂直。杨文光等(1990)著作的《中缅树鼩广西猕猴脑立体定位图谱》书中采用了如下坐标系：水平零点平面与穿过耳杆和门齿杆的面平行，并高于耳间线4毫米；垂直零点平面穿过耳间线(耳杆连线)并与水平零点平面垂直。这些树鼩的坐标系与其它模式动物的脑立体定位坐标系统的通用标准不一致，而且在实际应用中存在一些缺点，比如零点平面不易定位和校准，而且操作误差较大。而建立与其它模式动物的脑立体定位坐标系统的通用标准一致的树鼩脑部坐标系的困难在于：树鼩脑颅骨和脑解剖结构与大、小鼠和猴脑差异性较大，因此在树鼩脑部坐标系的建立过程中很难找到作为参考的其他物种，为其坐标系的构建提供参考。
6.总之，目前本领域急需建立一种树鼩的坐标系，使其脑科学的相关研究结果能够更好地与其他哺乳动物进行比较。


技术实现要素：

7.针对现有技术的困难，本发明提供一种树鼩脑部核团定位方法。
8.一种树鼩脑部核团定位方法，包括如下步骤：
9.步骤1，定义前囟或后囟点为坐标原点，获取以前囟-后囟坐标系统为参照的树鼩
脑部的全脑mri图谱；
10.所述前囟-后囟坐标系统包括：前囟、后囟、门齿杆和耳间线之间的位置关系；
11.步骤2，利用步骤1得到的全脑mri图谱，对树鼩脑染色图谱进行坐标校正，得到目标核团的三维坐标；
12.步骤3，利用步骤2得到的三维坐标对树鼩实验动物脑部的目标核团进行导航或定位。
13.优选的，步骤1中，所述前囟-后囟坐标系统包括：
14.首先初始化脑立体定位仪，使得门齿杆高度和耳杆高度相同，再将树鼩头部固定在脑立体定位仪上，使前囟和后囟的高度相同，此时门齿杆高度为5.01
±
0.01毫米，前囟和后囟的水平距离为9.00
±
0.12毫米，耳间线所在垂直面与前囟间的距离为7.65
±
0.11毫米，耳间线所在水平面与后囟间的距离为12.77
±
0.09毫米。
15.优选的，步骤1中，获取以前囟-后囟坐标系统为参照的树鼩脑部的全脑mri图谱的方法为：用注射针在树鼩大脑内标记参考针道后采集树鼩脑部的全脑mri图谱，所述参考针道的位置和方向根据所述前囟-后囟坐标系统获得。
16.优选的，所述参考针道的数量为4个。
17.优选的，步骤1中，所述全脑mri图谱为连续的垂直冠状面图像。
18.优选的，步骤2中，进行坐标校正的具体操作为利用边缘、脑白质纤维束、脑室和小脑作为参考，将所述全脑mri图谱和所述脑染色图谱，根据所述全脑mri图谱测算目标核团的三维坐标。mri图谱分辨率不够，且显示的是脑灰白质图，不能很好的识别目标核团；而显微镜扫描成像的染色图谱很容易识别目标核团的位置和脑区边界，但是染色图谱无法提供核团在颅骨内的空间位置和原位坐标信息。将二者进行结合能够得到准确的目标核团三维坐标。
19.优选的，步骤2中，所述目标核团为纹状体，所述纹状体包括尾核、壳核和伏核；
20.所述尾核的三维坐标为：距离前囟垂直面0.50毫米，距离大脑半球中央矢状面-2.60毫米，距离前囟水平面-3.65毫米；
21.所述壳核的三维坐标为：距离前囟垂直面0.50毫米，距离大脑半球中央矢状面-4.40毫米，距离前囟水平面-5.60毫米；
22.所述伏核的三维坐标为：距离前囟垂直面2.20毫米，距离大脑半球中央矢状面-1.90毫米，距离前囟水平面-7.50毫米。
23.优选的，所述树鼩为体重100～170克、年龄6～15月龄的成年树鼩。
24.本发明中，所用的“脑立体定位仪”是一种现有的装置，其包括几何规格标准相同的门齿杆和耳杆等部件，在不同的脑立体定位仪上可重复准确地测量门齿杆、耳杆的位置信息，从而得到门齿杆高度和耳间线与其他参考点的位置关系。所述“前囟水平面”是指通过前囟点的水平平面，所述“前囟垂直面”是指通过前囟点且垂直于水平面的冠状平面(横断面)，所述“大脑半球中央矢状面”是指通过大脑左右半球中间线且垂直于水平面的平面。所述“水平距离”是指二者投影到水平面上之后的距离，所述“垂直距离”是指二者投影到垂直面上之后的距离。
25.本发明基于树鼩的解剖结构，针对其脑部核团定位，提供了一种新的坐标原点定位系统。现有技术中，非人灵长类动物通常只能使用mri的核团定位方法，而大鼠、小鼠等小
动物通常只能使用染色图谱的核团定位方法。本发明通过将该坐标原点定位系统与核磁共振成像获取的树鼩全脑原位图片和经典组织染色技术结合的方式，能够获得全脑核团和脑区的精确坐标，获取的空间坐标可用于对实验动物的全脑核团和脑区进行导航定位。相比现有仅根据经典组织染色技术进行定位的方法，本发明的方法更加准确可靠，更加高效地利用每一只树鼩，能降低实验成本，且符合动物福利要求。
26.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
27.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
28.图1为树鼩脑颅骨示意图(顶视图)，黑点所示位置为坐标原点前囟(bregma)和后囟(lambda)。
29.图2为树鼩脑颅骨示意图(侧视图)，黑点所示位置为前囟(bregma)、后囟(lambda)、门齿杆(incisor bar)和耳杆(earbar)连线(耳间线)。
30.图3为树鼩全脑核磁共振成像(mri)，冠状面图像间距250微米，第四排和第六排的最后3张图像各显示了2条参考针道(图中2条平行的黑线)，标尺20毫米。
31.图4为树鼩脑矢状面(左上)、水平面(左下)和冠状面(右侧上下2幅图)核磁共振成像(mri)，其中4条参考针道的位置为箭头所示图中2条平行的黑线或黑点。
32.图5为坐标值校正后的树鼩脑立体定位图(冠状面)，左上是乙酰胆碱酯酶染色图，右上是与染色图相邻近的核磁共振成像(mri)图，下方是脑立体定位示意图，图中包含纹状体的尾核(cd)和壳核(pu)。
33.图6为坐标值校正后的树鼩脑立体定位图(冠状面)，左上是乙酰胆碱酯酶染色图，右上是与染色图相邻近的核磁共振成像(mri)图，下方是脑立体定位示意图，图中包含纹状体的伏核(acb)。
34.图7为树鼩尾核(cd)全脑输入网络示意图。(a1)逆行示踪剂荧光金的单侧注射位点cd，(a2-a21)荧光金标记的神经元(黑点表示)在全脑的分布情况。
35.图8为树鼩尾核(cd)全脑输入的阳性神经元(荧光金标记)在代表性脑区的分布情况。
36.图9为树鼩壳核(pu)全脑输入网络示意图。(a1)逆行示踪剂荧光金的单侧注射位点pu，(a2-a15)荧光金标记的神经元(黑点表示)在全脑的分布情况。
37.图10为树鼩壳核(pu)全脑输入的阳性神经元(荧光金标记)在代表性脑区的分布情况。
38.图11为树鼩伏核(acb)全脑输入网络示意图。(a1)逆行示踪剂荧光金的单侧注射位点acb，(a2-a17)荧光金标记的神经元(黑点表示)在全脑的分布情况。
39.图12为树鼩伏核(acb)全脑输入的阳性神经元(荧光金标记)在代表性脑区的分布情况。
40.图13为树鼩尾核(cd)、壳核(pu)和伏核(acb)在同侧和对侧全脑输入网络中的差
异分析。(a)热图表示荧光金(fg)标记的神经元密度在同侧和对侧脑区中的差异分析。(b)韦恩图和水平脑切片示意图表示投射到cd、pu和acb的脑区及其数量在同侧和对侧脑区中的差异分析。
具体实施方式
41.实施例1
42.本实施例提供了建立前囟-后囟坐标系统的过程以及将其应用于树鼩脑部核团定位的实例。需要说明的是，本实施例中对树鼩包括一定程度的介入性处置方法，例如剪开头皮、对颅骨消毒和用注射针标记参考针道等。但是这些处置方法并不会显著影响实验动物的生命体征，不会导致动物死亡或生存状态发生重大变化，对本发明定位方法和定位结果也没有影响。因此，本实施例中的各种实验方法是可重复实施的。
43.本实施例包括以下步骤：
44.步骤1、选择体重100～170克、年龄6～15月龄的成年树鼩26只，腹腔注射戊巴比妥钠(80毫克/千克)麻醉动物，待树鼩处于深度麻醉状态后，去除颅骨表皮的毛发。
45.步骤2、小心地将树鼩的头部固定在脑立体定位仪上。首先使左右卡槽内的两根耳杆对准动物的外耳道，调节左右耳杆(外耳道夹持点)保持高度相同与对中，以便动物的门齿正好对准前方的门齿杆的卡槽，固定好门齿杆。
46.步骤3、皮肤表面消毒处理后，剪开皮肤，暴露颅骨，再用蘸了30％过氧化氢的棉签擦拭颅骨表面，这时候在体视镜下根据树鼩颅骨解剖结构定义前囟(bregma)和后囟(lambda)两个坐标点(见图1)。在定位仪垂直臂的夹持器上安装注射针，测量前囟和后囟的高度，如果前囟高度值大于后囟时，下调门齿杆高度，反之则上调门齿杆高度。重新测量前囟和后囟的高度，重复上述操作直到前囟与后囟的高度值相同，此时树鼩的颅骨处于水平位置。
47.步骤4、当树鼩颅骨调至水平时，利用夹持器上的注射针逐一定位各坐标点(线)：前囟、后囟、门齿杆(incisor bar)和耳杆(earbar)连线(耳间线)，通过游标卡尺读取这4个坐标点之间的垂直距离和水平距离值。获取26只树鼩的各坐标点之间的距离参数，求平均值(见表1)，最终得到4个坐标点之间的垂直距离和水平距离均值(见图2)。
48.基于前囟、后囟和耳间线之间的距离参数可以实现3个坐标原点之间的自由转换(见表2)。
49.表1树鼩脑颅骨4个坐标点(前囟、后囟、门齿杆和耳间线)之间的垂直距离和水平距离参数
[0050][0051]
表2树鼩脑颅骨3个坐标原点前囟、后囟和耳间线之间的坐标自由转换方法
[0052] 前囟点坐标后囟点坐标耳间线坐标前囟点为原点(0，0，0)(-9，0，0)(-7.65，l，-12.77)后囟点为原点(9，0，0)(0，0，0)(1.35，l，-12.77)耳间线为原点(7.65，0，12.77)(-1.35，0，12.77)(0，l，0)
[0053]
注：坐标点(x，y，z)的绝对值是指各参考点之间在三维垂直面(冠状面、矢状面和水平面)
[0054]
上的距离值，
“‑”
表示该坐标点位于原点的后方或下方，反之为正数；l(interaural line)
[0055]
指耳间线在矢状面上的坐标值。
[0056]
步骤5、为了进一步测定各坐标原点和大脑核团和亚区的空间位置距离，选取其中的2只树鼩，在立体定位仪上标记前囟点，以前囟为零点坐标，用注射针在树鼩大脑内标记4条参考针道(reference needle tracks)，其空间坐标值见表3(背腹距离指下针的深度)。把麻醉的树鼩放到9.4t 40厘米大口径动物核磁共振成像(mri)平台上，先预扫描，直到观察冠状面图片上的针道呈现“11”形状为止，说明此时冠状面扫描的方向与针道方向相同，
获取的才是垂直冠状面图像。最后精细mri成像，得到连续的垂直冠状面图像，图像间距250微米(见图3)，其中4条参考针道的位置在矢状面、水平面和冠状面清晰可见(见图4)。
[0057]
表3树鼩大脑内标记4条参考针道(reference needle tracks)的空间坐标值(以前囟为坐标原点)
[0058][0059]
步骤6、基于新的前囟-后囟坐标系统获取的全脑mri图谱(步骤4和步骤5)，对树鼩脑染色图谱进行坐标校正，即可得到新的三维坐标点。
[0060]
步骤7、接下来，就以树鼩纹状体全脑投射环路为例，详细展示树鼩脑部坐标原点定位方法的应用。纹状体主要包含三个亚区：尾核(cd)、壳核(pu)和伏核(acb)，根据步骤6获得纹状体位置冠状切面新的空间坐标图(见图5和图6)，经过测量可得纹状体三个亚区的空间坐标值(见表4)。
[0061]
表4树鼩纹状体亚区(尾核、壳核和伏核)的空间坐标值(以前囟为坐标原点)
[0062][0063]
步骤8、重新选取体重100～170克、年龄6～15月龄的成年树鼩6只树鼩，经麻醉、立体定位仪固定颅骨、调节耳杆和门齿杆后，最终使得颅骨表面的前囟和后囟两个坐标原点的水平高度保持相同。根据表4所示的空间坐标值分别定位纹状体的尾核、壳核和伏核(每只动物单侧脑区注射1个目标核团，每个核团重复2只树鼩)，颅骨钻打开颅骨，微量注射80纳升荧光金(fg，逆行神经元示踪剂)，注射结束后等待10分钟，再缓慢拔出注射针，缝合头皮，把动物放回原来的笼子继续饲养。
[0064]
步骤9、恢复饲养7天后，麻醉树鼩，经心脏灌流4％多聚甲醛溶液后，剥离完整脑组织，再把脑组织转入梯度蔗糖溶液脱水，直到脑组织完全沉底，莱卡冰冻切片机(leica cm1950)切成40微米厚的冠状面切片。
[0065]
步骤10、首先鉴定荧光金示踪剂是否精准注射到目标核团(尾核、壳核和伏核)，只有注射定位准确的动物才会被选择，其脑切片经过免疫组化染色，鉴定脑片中被荧光金标记的神经元，观察这些被标记的神经元在全脑的分布情况(见图7、图8、图9、图10、图11、图12)，从而得到这些目标核团的全脑投射网络节点，并比较纹状体三个亚区(尾核、壳核和伏核)之间全脑投射网络的异同(见图13)。
[0066]
通过上述实施例可以看到，本发明提供了一种新的坐标原点定位系统，能够用于树鼩的相关研究，实现操作简单、准确和便于与其他动物进行比较的脑部核团定位和导航方法，具有很好的应用前景。