Lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用的制作方法

技术特征：
1.lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用，其特征在于：所述的重组蛋白的结构如下：a-b-c；其中，a为分子伴侣，选自lpp或mlpp，m表示突变体；b为缺失或用于蛋白酶识别的连接肽；c为目的蛋白。2.根据权利要求1所述lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用，其特征在于：所述的lpp的氨基酸序列如下所示：mkatklvlgavilgstllagcssnakidqlssdvqtlnakvdqlsndvnamrsdvqaakddaaranqrldnmatkyrk。3.根据权利要求1所述lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用，其特征在于：所述的用于蛋白酶识别的连接肽为ddddk。4.根据权利要求1所述lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用，其特征在于：所述的目的蛋白是长度为20～50个氨基酸的目的蛋白；进一步是长度为27～31个氨基酸的目的蛋白；包括但不限于glp-1或其类似物、胰岛素类、蛋白酶类。5.一种用于大肠杆菌分泌表达的融合蛋白，其特征在于：是基于权利要求1～4任一项所述的应用设计得到；所述的融合蛋白的结构式如下：a-b-c；其中，a为分子伴侣，选自lpp或mlpp，m表示突变体；b为缺失或用于蛋白酶识别的连接肽；c为目的蛋白。6.一种大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获得编码权利要求5所述用于大肠杆菌分泌表达的融合蛋白的融合基因，将融合基因构建到表达载体，得到重组载体；(2)将重组载体转化宿主细胞；(3)将含有重组载体的宿主细胞发酵、纯化，获得融合蛋白。7.根据权利要求6所述的大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法，其特征在于还包括以下步骤：(4)对得到的融合蛋白进行脂肪酸侧链修饰；(5)蛋白酶酶切脂肪酸侧链修饰后的融合蛋白的连接肽，获得侧链修饰的融合蛋白；(6)如有必要，对侧链修饰的融合蛋白进行转肽，连接另外一段多肽。8.根据权利要求6或7所述的大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的融合基因通过直接合成法获得，或是通过片段拼接得到；步骤(1)中所述的表达载体选自大肠杆菌常用载体或将tac启动子替换pet载体中的t7启动子得到的载体；步骤(2)中所述的宿主细胞为野生型或改造型大肠杆菌；步骤(3)中所述的发酵是在发酵后期添加诱导剂，诱导表达。9.根据权利要求8所述的大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法，其特征在于：
所述的pet载体为pet-28a( )载体；所述的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)或其改造菌、大肠杆菌w3110或其改造菌；所述的诱导剂为iptg。10.根据权利要求7所述的大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的脂肪酸侧链修饰为使用利拉鲁肽或索玛鲁肽脂肪酸酰化剂进行修饰；步骤(5)中所述的蛋白酶为肠激酶、胰蛋白酶和赖氨酰内切酶中的至少一种。

技术总结
本发明公开了Lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用。本发明发明人意外发现Lpp作为目的蛋白的分子伴侣，有利于包含分子伴侣和目的蛋白的重组蛋白的分泌表达，产量高，且对大肠杆菌菌体生长的影响小，无显著的菌体裂解情况，易于实现高密度发酵，便于工业化生产。通过该应用，本发明还提供了一种用于大肠杆菌分泌表达的融合蛋白以及一种大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法。及一种大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法。及一种大肠杆菌分泌表达融合蛋白的方法。


技术研发人员：权利要求书2页说明书9页序列表6页附图4页
受保护的技术使用者：珠海联邦制药股份有限公司
技术研发日：2020.12.30
技术公布日：2022/6/30