一种紫花地丁提取物的制备方法及应用

1.本发明涉及植物提取方法及植物提取物所能应用到的化妆品领域，具体为一种紫花地丁提取物的制备方法及应用。


背景技术：

2.皮肤颜色的差异与黑色素细胞的数量无关，而是由黑色素细胞的黑色素生成能力决定的。黑色素的数量、类型、分布对皮肤的颜色起着决定性的作用。黑色素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，存在于表皮基底层，通过合成黑素形成皮肤颜色。黑色素可吸收并消散99.9％紫外线，使机体免遭紫外线的损害。紫外线会导致皮肤产生ros活性氧自由基，诱导黑色素细胞产生更多的黑色素来抵御紫外线从而保护机体，最终导致皮肤变黑，影响肌肤美观性。
3.地处区域不同，海拔、紫外线、日照时间长短等因素造成了不同肤色的人种，主要有白种人、黄种人、黑种人。黄种人大多崇尚“以白为美”，特别是中国女性。众所周知，中国人自古有面若桃花，肤如凝脂的肤色追求，古代女性在脸上涂铅粉来获得靓丽白皙的皮肤。传统的美白剂如铅粉、重金属汞、氢醌等虽然都有极强的美白效果，但因具有毒性，伤害皮肤而被禁用。2013年，日本“杜鹃醇致白斑”的事件后，人们对美白剂的安全性担忧情绪日益加重。如前几年盛行的熊果苷，因分子中含有氢醌相似的结构，具有很好的酪氨酸酶抑制作用，起到美白作用。但后续研究表明α-熊果苷＞2％时会破坏细胞膜，具有一定的细胞毒性。其同分异构体β-熊果苷多为人工合成，底料之一为氢醌，不可避免残留氢醌，会带来更大的安全性问题。随着人们对天然植物提取物的护肤活性功能的研究与拓展，发现植物活性成分安全无毒的特性日益突显。如今，天然纯净的护肤理念更是盛行，天然来源的化妆品原料研究将成为国内外研究的热点之一，植物美白剂因其特殊的功能将具有更广阔的市场前景。
4.中国植物资源丰富，且有源远流长的使用植物的历史，其中的代表就是中药。天然植物提取物中含有大量的黄酮类、多酚类、有机酸类等物质，其作为天然成分应用到化妆品中，可以达到抗氧化、保湿、消炎、美白等功效。
5.紫花地丁是很常见的天然草药，在中药中有着很重要的地位，从古至今，其清热解毒的功效人们早已熟知，现如今，其在抗氧化方面的作用得到了科学界广泛的关注。黄酮类化合物是一类天然产物，它广泛存在于植物体内，具有2-苯基色原酮结构这个特殊结构让黄酮类化合物具备有丰富多样的生物活性，如心血管系统活性、提高机体性能、抗氧化自由基、抗衰老等；黄酮类活性化合物不仅能保护心血管系统，而且还有抗癌，抗病毒，治疗咳嗽、风湿、冠心病、肝脏及动脉硬化等作用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种紫花地丁提取物的制备方法及应用，因紫花地丁提取物具有较强的抗氧化和美白的性能，其可应用于抗衰老、美白等化妆品领域。
7.作为本发明的一个优选实施例，所述紫花地丁提取物可以是物理粉碎粉末、浸膏中的任意一种或几种的组合。
8.作为本发明的一个优选实施例，所述紫花地丁提取物可以是水提物、醇提物、油提物和超临界co2提取物中的任意一种或几种组合。
9.作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物优选为水提取物、乙醇提取物、丙醇提取物中的一种或几种组合。
10.本发明的第一个方面在于提供一种紫花地丁提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
11.步骤一：将紫花地丁在烘箱中彻底干燥后粉碎置于密封袋中，取粉碎后的紫花地丁粉末置于提取罐中，以溶剂∶紫花地丁粉末＝5-20ml∶1g的比例，提取1-10次，提取结束后混合每次的提取液，得到混合提取液。
12.步骤二：将步骤一过滤后的提取液在一定条件下进行离心，得到上清液。之后进行旋蒸，去除醇溶液，浓缩制备成所述紫花地丁提取物。经过真空冷冻干燥得到紫花地丁提取物冻干粉。
13.作为本发明的一个优选实施例，所述制备方法包括如下步骤：
14.步骤一：将紫花地丁在烘箱中彻底干燥后粉碎置于密封袋中，取粉碎后的紫花地丁粉末置于提取罐中，以溶剂∶紫花地丁粉末＝5-20ml∶1g，在45℃-90℃温度下提取1-10次，每次提取0.5h-10h，提取结束后混合每次的提取液，得到混合提取液。
15.步骤二：将步骤一过滤后的提取液在一定条件下进行离心，得到上清液。之后进行旋蒸，去除有机溶剂，浓缩制备成所述紫花地丁提取物。经过真空冷冻干燥得到紫花地丁提取物冻干粉。
16.作为本发明的一个优选实施例，步骤一中所述紫花地丁粉末为紫花地丁经过包含二氧化氢的清水清洗、消毒、干燥，并粉碎至40目。
17.作为本发明的一个优选实施例，步骤一中提取紫花地丁的溶剂为水、丙醇水溶液、乙醇水溶液等中的任意一种或几种组合。
18.作为本发明的一个优选实施例，所述丙醇水溶液的体积浓度为30％-100％，如40％、95％；优选为50％-90％，如60％、70％、80％等，其中体积浓度为100％时，所述溶剂即为无水丙醇。
19.作为本发明的一个优选实施例，所述乙醇水溶液的体积浓度为30％-100％，如40％、95％；优选为50％-90％，如60％、70％、80％等，其中体积浓度为100％时，所述溶剂即为无水乙醇。
20.作为本发明的一个优选实施例，提取方式为超声辅助提取法、超临界co2提取法中的任意一种或几种的组合，优选地，提取方式为超声辅助提取法。
21.作为本发明的一个优选实施例，所述紫花地丁粉末在功率为100w-500w超声提取，如100w、450w，优选为150w-350w，如200w。
22.作为本发明的一个优选实施例，步骤一中所述提取时间为0.5h-2.5h，如1h、2.3h，优选为1.6h-2.2h，如2h。
23.作为本发明的一个优选实施例，步骤二中所述离心机转速为1000r/min-6000r/min，如2000r/min、5000r/min，优选为2500r/min-4000r/min，如3000r/min。
24.作为本发明的一个优选实施例，步骤二中所述离心时间为1min-10min，如2min、8min，优选为3min-7min，如4min、5min、6min。
25.作为本发明的一个优选实施例，步骤二中所述旋蒸温度为30℃-50℃，如32℃、48℃，优选为35℃-45℃。如40℃。
26.作为本发明的一个优选实施例，步骤二中所述干燥方式为真空冷冻干燥。
27.本发明中采用超声波提取法对紫花地丁进行提取，其可以有效避免传统提取纯化工艺的制备周期长，活性成分提取不彻底，活性成分易氧化降解的问题，在较低的温度和较短的提取周期下获得纯度很高的紫花地丁提取物。
28.本发明的第二个方面在于提供上述任意一种紫花地丁提取物的应用。
29.所述紫花地丁提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备化妆品和/或护肤品。
30.其中，本发明所述紫花地丁提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品和/或护肤品。
31.作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品中紫花地丁提取物的含量为0.01％-60％，如0.03％，40％，优选为0.05％-30％，如5％、10％等。
32.本发明的第三个方面在于提供一种包含上述任意一种紫花地丁提取物的日化用品，优选为包含上述任意一种紫花地丁提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化妆品和/或护肤品中，优选为化妆品和/或护肤品中，还可以包括：营养添加剂、皮肤调理剂、保湿剂、防腐剂、抗氧剂、表面活性剂、紫外线吸收剂和螯合剂中的任意一种或几种组合。
33.其中，所述营养添加剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合：甲壳素、壳聚糖、丝肽、丝素、卵磷脂、表皮细胞生长因子、海藻糖、乳糖、珍珠粉、胶原蛋白、胶原水解物、透明质酸及其盐、蜂胶、蜂蜜、芦荟苷、维生素、壬二酸、柠檬烯、苏木素、橙皮素、植酸、l-天冬氨酸及其盐、l-胱氨酸及其盐。
34.其中，所述皮肤调理剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合：葡糖基芦丁、卤虫提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物、烟酰胺、酵母菌/川谷籽发酵产物滤液、二列酵母发酵产物溶胞物、动物脐带提取物、动物胎盘蛋白、动物胎盘酶。
35.其中，所述保湿剂可以是选自如下组分中的一种或任意几种组合：丁二醇、甘油聚醚-26、海藻糖、透明质酸钠、1，2-己二醇、尿酸、果胶酸、木糖醇。
36.其中，所述防腐剂可以是选自如下组分中的一种或任意几种组合：山梨酸及其盐、丙酸盐、苯丙醇、苯甲酸及其盐、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、异抗坏血酸及其盐、间苯二酚、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
37.其中，所述抗氧剂可以是选自如下组分中的一种或任意几种组合：sod、丁基羟基茴香醚、没食子酸酯、芦丁、抗坏血酸及其盐、生育酚。
38.其中，所述表面活性剂可以是选自如下组分中的一种或任意几种组合：烷基糖苷(apg)及衍生产品、n-脂肪酰基胺基酸盐、脂肪醇聚氧乙烯醚、水溶性油脂、聚甘油脂肪酸酯、烷基葡糖酰胺、椰油酰胺丙基pg-二甲基氯化铵磷酸酯钠(仿生磷脂)、三硬脂酸甘油酯、蔗糖硬脂酸酯、甲基葡萄糖苷硬脂酸酯。
39.其中，所述紫外线吸收剂可以是选自如下组分中的一种或任意几种组合：曲酸及其酯、芦丁、芦荟苷、咖啡氨酸、橙皮素、2-乙基己基水杨酸酯、2-乙基己基对二甲基氨基本
酸酯、水杨酸苯酯、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸、2-羟基-4-辛氧基二苯甲酮。
40.其中，所述螯合剂为edta-2na。
41.所述溶剂原料可以是下述基质原料中的任意一种或几种组合：水、乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇、乙二醇、环己烷、丙酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯。
42.本发明的有益效果在于：本发明的目的在于提供一种紫花地丁提取物的制备方法，该制备方法简单高效，操作控制方便，生产的产品质量高，成本低，利于工业化生产，同时制得紫花地丁提取物具有较强的抗氧化、美白功效，可应用于抗衰老、美白等化妆品领域。
43.本发明的目的在于提供一种紫花地丁提取物的应用，由于制得紫花地丁提取物具有较强的抗氧化和美白功效，可应用于抗衰老、美白等功能的化妆品领域。
附图说明
44.图1为紫花地丁提取物对abts自由基的清除效果
45.图2为紫花地丁提取物对dpph自由基的清除效果
46.图3为紫花地丁提取物对羟自由基的清除效果
47.图4为紫花地丁提取物对超氧阴离子自由基的清除效果
48.图5为紫花地丁提取物的总还原力效果
49.图6为紫花地丁提取物的酪氨酸酶活性抑制效果
具体实施方式
50.为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-6对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
51.紫花地丁提取物的制备方法
52.实施例1-9
53.将新采摘的紫花地丁，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为100ppm的二氧化氯，对紫花地丁清洗、杀菌，并用设置为60℃烘箱进行热风干燥，得到含水量在5％以下的干燥紫花地丁，并将制备的紫花地丁粉碎，备用。
54.取粉碎的紫花地丁粉末5g，并向其中加入50体积倍量的75％乙醇为提取溶剂，65℃、一定功率的提取条件下提取3次，每次1h-2.5h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在40℃条件下进行旋蒸，去除其中的乙醇，得到浓缩液。经过真空冷冻干燥得到紫花地丁提取物冻干粉。
55.表1、紫花地丁在不同提取条件下的提取结果
[0056][0057][0058]
由实例1-9可知，随着提取时间的增长、超声功率提高，紫花地丁的提取率增加，但提取物中的有效活性成分会因提取时间过长，功率过大而降解。因此最佳提取功率为200w，提取时间为1.5h，所得的紫花地丁提取物中含有14％的黄酮类化合物、7％总酚化合物和15％粗多糖。
[0059]
实施例10-18
[0060]
将新采摘的紫花地丁，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为100ppm的二氧化氯，对紫花地丁清洗、杀菌，并用设置为60℃烘箱进行热风干燥，得到含水量在5％以下的干燥紫花地丁，并将制备的紫花地丁粉碎，备用。
[0061]
取粉碎的紫花地丁粉末5g，并向其中加入50体积倍量、不同质量分数的溶剂为提取溶剂，65℃、200w提取3次，每次2h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在40℃条件下进行旋蒸，去除其中的醇溶液，得到浓缩液。经过真空冷冻干燥得到紫花地丁提取物冻干粉。
[0062]
表2、紫花地丁在不同种类、不同浓度溶剂下提取结果
[0063] 溶剂种类及体积浓度黄酮类物质含量总多酚的质量含量总多糖的含量实施例10无水丙醇7％4％4％实施例1190％丙醇水溶液9％4％5％实施例1275％丙醇水溶液11％8％9％实施例1330％丙醇水溶液12％6％7％实施例14去离子水9％5％6％实施例15无水乙醇10％7％8％实施例1690％乙醇水溶液11％6％9％实施例1775％乙醇水溶液14％9％11％实施例1830％乙醇水溶液13％8％10％
[0064]
由实例10-18可知，根据“相似相溶”的原理，紫花地丁中的黄酮类化合物、多酚类化合物和多糖类化合物更易溶于有机试剂中，使用75％的乙醇溶液可以提取出少量的水溶性活性成分。因此，最佳提取溶剂为乙醇，提取浓度为75％，所得的秦皮提取物中含有14％的黄酮、9％总酚和11％的多糖。
[0065]
以下为测试部分：
[0066]
测试样品由粉碎紫花地丁得到的粉末5g，并向其中加入50体积倍量、质量分数为75％的乙醇溶液，在65℃、200w提取2次，每次1.5h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在40℃条件下进行旋蒸，去除其中的醇溶液，得到浓缩液。经过真空冷冻干燥得到紫花地丁提取物冻干粉。
[0067]
1、抗氧化效果测试
[0068]
体内多余的自由基会和体内的不饱和脂肪酸反应，降低膜的柔软性。导致细胞膜的功能异常，使机体处于不正常状态。表现在皮肤上则是皮肤干燥，皱纹产生，胶原蛋白损失，皮肤弹性降低，还会造成皮肤色素堆积，形成黑斑。
[0069]
1)abts自由基清除能力测定
[0070]
abts自由基在被氧化后会变成绿色，通过添加抗氧化剂可以使颜色变浅。将abts溶液与过硫酸钾溶液混合放置12h，用pbs稀释至734nm处吸光度为0.7
±
0.05。从而得到abts溶液，再分别配制质量浓度为0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mg/ml的样品溶液，将800μl以上溶液与200μl的样液混合，在5min后测734nm处吸光度。将样液换成蒸馏水和vc，作为空白对照以及阳性对照。
[0071]
清除率(％)＝(1-ai/ao)
×
100
[0072]
式中：aj为空白组吸光度，ai为样品吸光度，ao为对照组吸光度
[0073]
2)dpph自由基清除能力测定
[0074]
dpph自由基在溶液中呈现深紫色，在有自由基清除剂存在时会使颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降。取dpph与无水乙醇配制得到0.1mmol/l的dpph乙醇溶液，再分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml的样品溶液，将1ml以上溶液与100μl的样液混合，避光处理30min后测517nm处吸光度。将样液换成蒸馏水和vc，作为空白对照以及阳性对照。
[0075]
清除率(％)＝(1-(a
i-aj)/ao)
×
100
[0076]
3)羟自由基清除能力测定
[0077]
过氧化氢与亚铁离子反应生成羟自由基，羟自由基具有较高反应活性，在加入水杨酸后，能快速捕捉羟自由基而产生紫色化合物。反应体系中若加入羟自由基清除剂后，被氧化的水杨酸减少，溶液颜色变浅甚至消失。分别配制质量浓度为1、2、3、4、5mg/ml的样品溶液，取100μl的样液与100μl硫酸亚铁溶液、100μl过氧化氢溶液在室温下静置10min后加入100μl水杨酸，37℃水浴加热30min后测510nm处吸光度值。将样液换成蒸馏水和vc，作为空白对照以及阳性对照。
[0078]
清除率(％)＝(1-(a
i-aj)/ao)
×
100
[0079]
4)超氧阴离子自由基清除能力测定
[0080]
在弱碱性条件下，邻苯三酚能发生自氧化反应，生成超氧阴离子和有色中间产物。当加入超氧阴离子清除剂时，它能迅速与超氧阴离子反应，从而阻止中间产物的积累。分别配制质量浓度为1、2、3、4、5mg/ml的样品溶液，再配置ph＝8.2的tris-hcl缓冲液，取5.2ml加入200μl的样液中，再加入100μl邻苯三酚溶液，25℃水浴加热6min后测320nm处吸光度值。将样液换成蒸馏水和vc，作为空白对照以及阳性对照。
[0081]
清除率(％)＝(1-(a
i-aj)/ao)
×
100
[0082]
5)总还原力测定
[0083]
抗氧化剂可以使铁氰化钾的三价铁离子还原成二价铁离子(亚铁氰化钾)，亚铁氰化钾再与三氯化铁反正生成普鲁士蓝(亚铁氰化铁)，测其吸光度值可反映还原能力。分别配制质量浓度为1、2、3、4、5mg/ml的样品溶液，取100μl的样液加入250μl ph＝6.6的pbs缓冲液、250μl铁氰化钾溶液后得到溶液
①
，50℃水浴加热20min后加入250μl三氯乙酸得到溶液
②
，取溶液
②
500μl加入500μl水、100μl三氯化铁溶液后测700nm处吸光度值。
[0084]
6)酪氨酸酶实验
[0085]
酪氨酸酶抑制剂通过自身与酪氨酸酶直接结合，竞争多巴的结合位点，加速黑色素的分解与排泄，从而有效地抑制皮肤中的酪氨酸酶活性，减少皮肤色素沉积。分别配置100、200、300、400、500μg/ml的样品溶液，取50μl的酪氨酸酶溶液(酪氨酸酶需要先37℃下水浴进行活化)，加入ph＝6.8的pbs缓冲液50μl，再加入不同浓度的样液。将样液和酶充分混合均匀，置于37℃水浴槽中孵育10min。再依次在各管中加入100μl0.5mmol/l左旋多巴溶液，控制每管反应时间5min后测475nm处吸光度值。将样液换成蒸馏水和曲酸，作为空白对照以及阳性对照。
[0086]
2、感官测试
[0087]
将含实施例17制备的紫花地丁保湿水液样品涂抹在手背，发现肤感舒适不黏腻，使用当下皮肤干燥情况有明显缓解，使用效果较好。
[0088]
由测试结果可知，紫花地丁提取物具有较强的抗氧化性，可以向化妆品中加入本发明提供的紫花地丁提取物，以起到美白、抗衰老功能。
[0089]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员丽言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。