一种从枸杞子中提取枸杞红素类成分的方法

1.本发明属于化合物萃取分离技术领域，具体涉及一种从枸杞子中提取枸杞红素类成分的方法。


背景技术：

2.枸杞(lycium l.)属于茄科(solanaceae)茄族(solaneae)枸杞亚族(lyciinae)，在我国有7个种和3个变种。
3.成熟枸杞子中含有大量的类胡萝卜素类物质，是新鲜和制干枸杞子外观呈现橙色或橙红色的基础，国内枸杞研究学者又将其称为枸杞红素类成分。枸杞红素类成分主要包含有类胡萝卜素糖苷化衍生物、游离型类胡萝卜素和类胡萝卜素酯化衍生物3大类，其中玉米黄质二棕榈酸酯(zeaxanthin dipalmitate)的含量最为丰富，约占枸杞红素类成分的50％以上。
4.枸杞红素类成分是枸杞子发挥药理和生理活性的物质基础之一，其含量是评价枸杞子优质优价的主要指标。目前，用石油醚、乙醚、正己烷等单一或混合溶剂萃取是枸杞红素类成分测定的主要前处理方法，但已有方法存在有机溶剂燃点低，易挥发等缺点。因此，亟需研究并开发快速、便捷、绿色的枸杞红素类成分萃取方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种从枸杞子中提取枸杞红素类成分的方法，可应用于枸杞或相关制品中枸杞红素类成分的提取纯化，从而弥补现有技术的不足。
6.本发明所提供的从枸杞子中萃取枸杞红素类成分的方法，包括如下的步骤：
7.1)将薄荷醇和正辛醇混合后，加热搅拌制成提取溶剂；
8.其中，薄荷醇和正辛醇的摩尔比为1:1～1:5；
9.2)将枸杞子粉碎，过50目筛网得枸杞粉末，加入步骤1)中制备的提取溶剂，室温下开启高速剪切辅助萃取，萃取结束后，萃取液进行离心，收集上清液，即得枸杞红素类成分的萃取液。
10.所述的枸杞红素类成分包含有玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯；
11.其中枸杞粉末和提取溶剂的料液比为1:20～1:25，
12.高速剪切的转速为10000r/min，萃取时间为5min；
13.离心时的转速为6000r/min，离心时间为10min。
14.本发明的方法通过对提取溶剂的选择，克服了现有方法中有机溶剂燃点低，易挥发等缺点，所使用的提取溶剂中的薄荷醇和正辛醇粘度低，提取的产物可以直接进入高效液相色谱仪进行测定分析。本发明的方法的萃取过程均在室温下进行，也不会产生热敏性枸杞红素类成分遇热分解的问题，为分析枸杞子及其制品中枸杞红素类成分的真实含量提供了保证。
附图说明
15.图1：6种疏水des枸杞红素萃取液在不同温度下的形态，其中a为25℃的des；b为0℃的des；c为25℃枸杞红素的des萃取液；d为0℃枸杞红素的des萃取液；
16.图2：不同des对枸杞红素类成分的萃取能力影响图；
17.图3：不同料液比对枸杞红素类成分的萃取能力影响图；
18.图4：不同转速对枸杞红素类成分的萃取能力影响图；
19.图5：不同提取方法对枸杞红素类成分的萃取能力影响图；
20.图6：玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯及实际枸杞子萃取液样品色谱图；
21.图7：不同产区枸杞样品中枸杞红素类成分的色谱图。
具体实施方式
22.本发明所使用的仪器与试剂的信息记载如下：高效液相色谱仪(agilent 1260，配dad检测器)；电子分析天平(bsa224s-cw，赛多利斯sartorius公司，德国)；高速剪切机(t25，ika公司，德国)；离心机(h15650，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；磁力搅拌器(rch-1000，东京理化器械株式会社，日本)。薄荷醇(分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司)；辛醇、甲基叔丁基醚(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；甲醇、正己烷(色谱纯，mreda technology inc.，美国)；玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯均由中国科学院大学巩媛博士制备；枸杞子由宁夏中杞生态农业科技有限公司馈赠，经中国科学院兰州化学物理研究所邸多隆研究员鉴定为宁夏枸杞的成熟果实，低温储存于中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室冰柜中。
23.下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
24.实施例1：萃取剂的筛选
25.溶剂的凝固点对于其萃取的操作窗口选择至关重要，只有液体的溶剂才能用于萃取。而目前所报道的绝大多数疏水性溶剂，其凝固点接近于室温，在低温下极易从液态变成固态，不利用萃取行为的发生，并对进一步的检测带来困难。而高粘度的萃取溶剂往往会对目标化合物的扩散产生负面影响，使其应用有一定的局限性；因此，从不同的氢键受体和氢键供体溶剂中筛选最有效的萃取剂组合。
26.按照表1称取一定摩尔比的氢键受体和氢键供体，置于500ml圆底烧瓶中，加入磁子搅拌，在60～80℃沙浴中反应至形成均一的透明液体，待液体温度降至室温，即得待筛选的提取液，分别命名为des-1～des-6。
27.表1：拟合成的6种dess的原料及其比例表
[0028][0029]
将枸杞子粉碎，过50目筛网后，精密称取2.0g，置于圆底烧瓶中，加入1.2 项下合成的des，料液比为1：20，在室温下用高速剪切以10000r/min剪切提取处理5min，将所得溶液转移至50ml容量瓶中，用相应的des定容至刻度，取出部分溶液，置于离心管中，6000r/min离心10min，过0.45μm有机滤膜，测定枸杞红素类成分的含量，计算转移率。
[0030]
如图1所示，合成的6种疏水dess在25℃时均为不同粘度的液体，但在0℃时，des-2和des-5凝结为固体，虽然des-2在加热后迅速变为液体，并且萃取枸杞红素类成分的能力较强，但在低温下不利用萃取行为的发生，并对进一步的检测带来困难。
[0031]
其次，des-1、des-3和des-5都具有较大的粘度，而des-4具有低的熔点和粘度，对玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯的萃取能力显著高于其他dess，其转移率分别为95.7％，97.0％和94％，是萃取枸杞红素类成分的首选溶剂(图2)。
[0032]
精密称取5摩尔的薄荷醇和10摩尔的正辛醇，置于圆底烧瓶中，加入磁子搅拌，在80℃沙浴中反应至形成均一的透明液体，待液体温度降至室温，即得提取用的溶剂。
[0033]
本发明所使用的萃取液在0℃以下依旧是流动性良好的液体，具有低的熔点和粘度，对玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯的萃取能力优异，其转移率分别为95.7％，97.0％和94.0％。
[0034]
同时，本发明还考察了薄荷醇和正辛醇摩尔比分别为1:1，1:2，1:3，1:4和 1:5时，构成的萃取剂对枸杞红素类成分的萃取效果，结果发现不同摩尔比的薄荷醇和正辛醇构成的萃取剂萃取能力几乎一致。
[0035]
实施例2：萃取条件优化
[0036]
将枸杞子粉碎，过50目筛网后，精密称取2.0g，置于圆底烧瓶中，以萃取剂为萃取剂，以枸杞红素类成分主要化合物玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯为分析物，考察不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)，萃取次数(1次，2次，3次)，高速剪切转速(6000、8000、10000、12000、14000 r/min)对萃取效率的影响。将所得萃取剂的枸杞红素萃取液转移至50ml容量瓶中，用相应的萃取剂定容至刻度，取出部分溶液，置于离心管中，6000r/min 离心10min，过0.45μm有机滤膜，测定枸杞红素类成分的含量，计算转移率。
[0037]
料液比和萃取次数影响萃取效率的主要参数。适宜的料液比和萃取次数能够确保目标分析物从复杂体系中萃取完全，并获得良好的回收率。但过大的料液比和过多的萃取次数往往会导致萃取效率的下降，同时造成萃取成本的上升。本发明考察了不同料液比和萃取次数对玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯萃取效果的影响。结果
如图3所示，当料液比从1:10增加到1:20 时，3种分析物的转移率呈急剧上升趋势，分别为94.6％，92.7％和96.8％。当料液比从1:20继续增加到1:30时，3种分析物的转移率明显下降，同时，料液比的增大为分析工作的操作也带来了麻烦，会导致误差的增加。因此，确定萃取剂的萃取料液比为1:20～25，优选为1:20。料液比1:20萃取1次时，3种分析物的转移率均大于94.0％，萃取2次只增加2.5％，第3次几乎没有萃取到目标分析物。因此，确定萃取次数为1次。
[0038]
适宜的转速可以加速萃取剂迅速通过细胞膜和目标分析物充分接触，而过高的转速则可能引起乳化现象，为萃取过程带来不利影响。本发明在料液比为1:20 时，考察了6000、8000、10000、12000和14000r/min对玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯萃取能力的影响。结果如图4所示，当转速为 6000r/min时，萃取剂从枸杞子中萃取得到的3种分析物的转移率仅为50.0％，当转速增加到10000r/min时，转移率最高，分别为94.6％，89.6％和92.6％。此后，进一步增加转速，3种分析物的萃取量成下降趋势，并且萃取液呈现浑浊，这可能是因为转速过高产生了乳化现象。因此，确定hsde的转速为10000r/min。
[0039]
实施例3：本发明萃取枸杞红素类成分方法与其他方法对比
[0040]
将枸杞子粉碎，过50目筛网后，精密称取2.0g，置于圆底烧瓶中，按照表 2所示的条件进行提取，并测定枸杞红素类成分的含量来计算转移率。
[0041]
表2：提取方法参数表
[0042][0043]
本发明对比了热回流辅助正已烷萃取、超声辅助正已烷萃取、超声辅助萃取剂萃取、hsde辅助正已烷萃取和hsde辅助萃取剂萃取法对玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯的萃取效果。结果如图5所示，不同萃取剂对3种分析物的萃取效率影响显著，正已烷作为萃取剂时，3种辅助提取方法对玉米黄质的萃取能力较弱，而萃取剂对玉米黄质的萃取能力更优，在超声辅助提取时转移率为82.3％，高速剪切辅助提取是转移率高到94.6％；超声辅助萃取剂萃取法萃取3种分析物能力高于超声辅助正已烷萃取法，说明萃取剂疏水萃取性能优于传统溶剂正已烷，表明本发明的萃取剂是萃取枸杞红素类成分更优的萃取剂；而hsde辅助萃取技术在5min的萃取能力，远高于超声辅助萃取60min的萃取能力，这可能是因为hsde技术能够通过气蚀、机械力、流体力三重作用力的联合效应快速打破植物细胞壁，使目标成分迅速溶出并分散至萃取剂中，同时，萃取剂具有一定的粘度，不易穿透细胞膜，借助heds技术可以迅速透过细胞膜和目标分析物接触。
[0044]
因此，本发明构建的hsde辅助疏水萃取剂萃取枸杞红素类成分的方法，优于其他4种方法，并且具有萃取效率高，快捷环保的特点。
[0045]
实施例4：高效液相色谱测定枸杞红素类成分的方法构建
[0046]
3.1对照品溶液的配制
[0047]
分别精密称取枸杞红素类成分的代表化合物玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯，置于10ml棕色量瓶中，加萃取剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯对照品储备溶液。
[0048]
3.2色谱条件
[0049]
色谱柱：ymc c30色谱柱(150
×
4.6mm，5μm)；流动相流速：0.5ml/min；检测器：dad检测器；进样量：20ul；柱温：25℃；检验波长：450nm；流动相a：甲醇:甲基叔丁基醚:水(92:4:4，v/v)；流动相b：甲基叔丁基-醚:甲醇: 水(90:6:4，v/v)；梯度洗脱条件：0～10min，90％～25％a，10～30min，25％a。
[0050]
3.3标准曲线的绘制
[0051]
精密吸取不同体积的玉米黄质储备液配成系列浓度的玉米黄质对照品溶液注入高效液相色谱仪进行分析。按照“3.2”项下色谱条件测定峰面积。以玉米黄质对照品的进样量x(μg)为横坐标，玉米黄质色谱峰的峰面积积分值y为纵坐标，绘制标准曲线。按照相同的方法，绘制玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯的标准曲线。由标注曲线可知，玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯分别在0.04～2.08，2.16～10.80和2.06～20.60μg范围内呈良好的线性关系范围内呈良好的线性关系，相关系数r2均大于0.995。
[0052]
3.4精密度和重复性考察
[0053]
将玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯储备液，按照“3.2”项下色谱条件连续进样6次，或连续进样6天，考察该方法的日内和日间精密度；
[0054]
分别精密称取玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯，每种对照品平行称量6份，用萃取剂溶解并定容至10ml容量瓶，按照“3.2”项下色谱条件连续进样6次，考察该方法的重复性。
[0055]
如表3所示，构建的玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯含量测定方法日间精密度、日内精密度和重复性均良好。
[0056]
按照上述构建的利用高效液相测定枸杞红素类成分的方法，测定的玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯及实际枸杞子萃取液样品的色谱图如图6所示。
[0057]
表3：高效液相色谱测定枸杞红素类成分的方法学验证参数表
[0058][0059][0060]
实施例5：不同产区枸杞子样品中枸杞红素类成分含量测定
[0061]
将来源于不同产区的枸杞子粉碎，过50目筛网后，精密称取枸杞粗粉2.0g，置于烧杯中，加入疏水萃取剂，料液比为1：20，在室温下用高速剪切以10000 r/min剪切提取处理5min，将所得溶液转移至50ml容量瓶中，用本发明的萃取剂(薄荷醇和正辛醇的摩尔比为1:2)定容至刻度，取出部分溶液，置于离心管中，6000r/min离心10min，过0.45μm有机滤膜，即
得待测溶液。利用本文建立的检测方法，对来源于不同产区的枸杞子样品中的枸杞红素类成分进行了定量检测，结果如表4和图7所示。
[0062]
表4：不同产区枸杞红素类成分的含量
[0063][0064]
结果表明，来源于青海格尔木和都兰样本中玉米黄质单棕榈酸酯和双棕榈酸酯含量显著高于其他产区，新疆精河样本中玉米黄质含量显著高于其他产区，甘肃玉门样本中枸杞红素类成分的含量均普遍偏低。以上结果可能与不同产区枸杞子种植的生态因子相关。