利用枸杞作为烟草花叶病毒瞬时表达外源蛋白的生物反应器

1.本发明涉及生物技术领域中，利用枸杞作为烟草花叶病毒瞬时表达外源蛋白的生物反应器。


背景技术：

2.疫苗不仅用于预防曾肆虐人类的重要疾病(如卡介苗、脊髓灰质炎疫苗、百白破三联混合疫苗、麻疹疫苗和乙肝疫苗等)和年度流行性疾病(如人或禽畜流感等)，也是应对突发性瘟疫(如新型冠状肺炎covid-19)的有效措施，在人类健康和提高生活质量上具有重要意义。在常规疫苗(如流感疫苗)生产中大量使用动物性来源(如鸡胚)的病原体存在潜在的污染风险，以及因生产时限难以满足突发性的大量需求。近几年来，科学家使用植物病毒载体结合农杆菌瞬间表达(magnifection)技术进行医用蛋白和亚单位疫苗的生产，由于该系统具有外源蛋白表达量高、用时短、成本低、安全、可规模化生产等优势，目前已应用在欧美医药商业化生产，例如planet biotechnology,dowagroscience公司分别成功开发了anti-caries mab,newcastle virus药物，以及protalix，biolex，sembosys，medicago等公司分别开发了α-galactosidase a,human interferonα,human insulin,h5n1 influenza virus亚单位疫苗。magnifection技术的规模化应用推动疫苗产业进入一个植物生产疫苗的新时代！我国目前在该领域尚属赶超和填补空白阶段。
3.利用植物生产疫苗中涉及的植物病毒载体包括tobacco mosaic virus(tmv)，potato virus x(pvx)，alfalfa mosaic virus(amv),cowpea mosaic virus(cpmv)，以及dna病毒bean yellow dwarf virus(beydv)等多种表达载体，而目前唯有tmv载体成功应用于商业化生产。目前利用tmv病毒载体进行疫苗生产所使用的植物材料，即“疫苗加工车间”，均为本氏烟草(nicotianan benthamiana,nb)。由于烟草的非食用性，植物生产疫苗工艺流程需要从烟草中提纯外源蛋白，所使用的蛋白纯化层析柱因价格昂贵/或者重复利用等所构成的加工成本和蛋白产出率问题是生产中的限制因素。因此寻求一种可食用植物有可能为口服疫苗生产带来新突破，人们也曾报道在农杆菌瞬间表达系统中尝试应用蔬菜类植物，如莴苣(lactuca sativa),茄子(solanum melongena)等，但因蛋白表达量低、植物繁殖生产环节等原因仅局限于实验室研究阶段。
4.枸杞(lycium barbarum)是茄科(solanaceae)枸杞属(lycium)的多分枝灌木植物。枸杞全身是宝，明李时珍《本草纲目》记载：“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。枸杞种子是家喻户晓的养生食材和高免疫力药材，而枸杞嫩叶可供蔬食，其营养价值被人们日趋重视，并有大叶枸杞相关品种的培育与应用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何通过非转基因技术在可食用植物中瞬时高效表达可医用或食用的外源蛋白质。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种在植物中表达外源蛋白质的方法，
所述植物为枸杞，所述方法包括：将含有外源蛋白质的编码基因的重组烟草花叶病毒表达载体导入农杆菌中，得到重组农杆菌；利用所述重组农杆菌感染枸杞，实现在植物中表达外源蛋白质。
7.上述方法中，所述重组烟草花叶病毒表达载体可由将所述外源蛋白质的编码基因插入至烟草花叶病毒载体中得到。
8.上述方法中，所述烟草花叶病毒载体可为p35s-30b。
9.上述方法中，所述农杆菌可为农杆菌菌株gv3101。
10.上述方法中，所述枸杞可为枸杞属(lycium)植物。
11.所述枸杞属(lycium)植物可为宁夏枸杞(lycium barbarum l)、枸杞(lycium chinense mill)、黑果枸杞(lycium ruthenicum murr)、新疆枸杞(lycium dasystemum pojark)、截萼枸杞(l.truncatum y.c.wang)、柱筒枸杞(l.cylindricum kuang)或云南枸杞(l.yunnanense kuang)。
12.在本发明的一个实施例中，所述宁夏枸杞(lycium barbarum l)为宁夏枸杞9号。
13.本发明还提供了一种成套产品，所述成套产品包括所述烟草花叶病毒载体与所述农杆菌。
14.所述成套产品还可包括所述枸杞。
15.所述成套产品可由所述烟草花叶病毒载体与所述农杆菌组成，还可由所述烟草花叶病毒载体、所述农杆菌与所述枸杞组成。
16.所述成套产品可用于在植物中表达外源蛋白质，或制备在植物中表达外源蛋白质产品，或生产医用蛋白、疫苗或营养蛋白，或制备用于生产医用蛋白、疫苗或营养蛋白的产品。
17.所述成套产品的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
18.x1、在植物中表达外源蛋白质；
19.x2、制备用于在植物中表达外源蛋白质的产品；
20.x3、生产医用蛋白、疫苗或营养蛋白；
21.x4、制备用于生产医用蛋白、疫苗或营养蛋白的产品。
22.所述疫苗可为口服疫苗。
23.上述应用中，所述植物可为枸杞。所述枸杞可为枸杞属(lycium)植物。
24.所述枸杞属(lycium)植物可为宁夏枸杞(lycium barbarum l)、枸杞(lycium chinense mill)、黑果枸杞(lycium ruthenicum murr)、新疆枸杞(lycium dasystemum pojark)、截萼枸杞(l.truncatum y.c.wang)、柱筒枸杞(l.cylindricum kuang)或云南枸杞(l.yunnanense kuang)。
25.在本发明的一个实施例中，所述宁夏枸杞(lycium barbarum l)为宁夏枸杞9号。
26.在本发明的一个实施例中，所述外源蛋白质为绿色荧光蛋白。
27.本发明通过tmv病毒载体和农杆菌瞬间表达系统，在营养丰富并具有药用价值的枸杞叶片成功表达了gfp外源报告基因。由于枸杞属植物与广泛应用于植物生产疫苗的烟草同属茄科，大叶枸杞自身又拥有营养和药用价值，适于扦插、截桩等无性繁殖并保持基因型稳定一致，成本低、可规模化生产等优势。本发明无须高纯度高难度的制取步骤，即可提供安全的可食用的医用多肽和蛋白，如疫苗的口服制剂。本发明可以创造外源营养蛋白、医
用多肽和蛋白(如疫苗)的新制剂(如口服制剂)，将推动人们通过食用含有疫苗成分的功能化食品“日常口服疫苗”提高大众群体免疫力和国民健康，将是植物生产疫苗产业的重要补充，具有重要社会意义和应用前景。
附图说明
28.图1.通过农杆菌瞬时表达系统在枸杞叶片上表达gfp报告基因的荧光检测。
29.在枸杞种子播种后30，35，80d苗龄的伸展叶片上分别注射含有外源报告基因的tmv病毒载体(pat-his-egfp)和植物表达载体(130-gfp)的农杆菌gv3101，其中注射mma缓冲液的为mock阴性对照。农杆菌注射后分别继续培养3,5,7和10dpa(days post agroinfiltration)时进行荧光观察。图中，p130-gfp表示130-gfp。
30.图2.在枸杞叶片中表达his-egfp的蛋白检测。
31.提取注射pat-his-egfp农杆菌的枸杞叶片的总可溶性蛋白，进行his-egfp蛋白表达检测。(a)考马斯亮蓝染色分析his-egfp的表达情况，m：蛋白marker；mma：为mock阴性对照；#1、#2和#3表示不同枸杞植株；泳道上样量均为4.5mg鲜重叶片的总可溶性蛋白。红色箭头表示his-egfp。
32.(b)利用his-tag抗体进行蛋白western blot分析。泳道上样量均为2.7mg鲜重的总可溶性蛋白。
具体实施方式
33.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
34.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
35.实施例1、
36.1.材料与方法
37.1.1材料：
38.枸杞种子(lycium barbarum)(宁夏枸杞9号)；农杆菌菌株gv3101。
39.1.2方法：
40.(1)载体与重组菌构建：
41.将农杆菌-tmv病毒表达载体p35s-30b(参考文献hongge jia,yongqi pang,rongxiang fang,agroinoculation as a simple way to deliver a tobacco mosaic virus-based expression vector,acta botanica sinica 2003,45:770-773；在植物基因组学国家重点实验室中国科学院微生物研究所保存，公众可从中国科学院微生物研究所获得)通过paci和kpni酶切后结合重组系统插入带有标签的his-egfp报告基因片段，获得的重组质粒命名为(pat-his-egfp)。pat-his-egfp为将p35s-30b的paci和kpni识别序列间的
dna片段替换为序列表中序列1所示的dna片段得到的重组载体。
42.其中，序列1的第76-807位为egfp基因序列。
43.另外，实验中也应用了参考植物表达载体130-gfp[即p
35s
:egfp，参考文献wang h,zhang y,xiao n,zhang g,wang f,chen x,and fang r(2020)rice germin-like protein 2-1functions in seed dormancy under the control of abscisic acid and gibberellic acid signaling pathways.plant physiology,183:1157-1170，公众可从中国科学院微生物研究所获得]。
[0044]
将pat-his-egfp导入农杆菌菌株gv3101，得到重组菌gv3101/pat-his-egfp；将参考植物表达载体130-gfp导入农杆菌菌株gv3101，得到重组菌gv3101/130-gfp。
[0045]
(2)枸杞幼苗培养：
[0046]
将枸杞种子在水中浸泡一天后，直接播种于蛭石：营养土(1:1)的培养基质中，在植物温室(光照16h/黑暗8h)，22℃培养10d后进行幼苗移栽，在植物温室继续培养至30d、35d和80d苗龄时分别进行农杆菌瞬间表达实验。
[0047]
(3)农杆菌注射：
[0048]
参照已发表文章并稍微改进[wang h,zhang y,xiao n,zhang g,wang f,chen x,and fang r(2020)rice germin-like protein 2-1 functions in seed dormancy under the control of abscisic acid and gibberellic acid signaling pathways.plant physiology,183:1157-1170]。具体步骤如下：
[0049]
将重组菌gv3101/pat-his-egfp或重组菌gv3101/130-gfp接种至含有50μg/ml卡那霉素(kanamycin,kan)和50μg/ml利福平(rifampicin,rif)抗生素的lb液体培养基中，220rpm/28℃震荡培养过夜后，按照1/100比例稀释转接至lb液体培养基(含50μg/ml kan,10mm mes,20μm as)，继续培养至od 600＝1.0后，12,000rpm离心30sec，弃上清液，收集沉淀。用mma缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度分别为10mm mgcl2、10mm mes和100μm as)重悬漂洗后再次离心，用mma缓冲液重悬细胞至od600＝0.8。室温静置2-3h。最后用无针头的1ml注射器将含有pat-his-egfp或130-gfp的重组农杆菌分别注射入枸杞叶片背面，每个菌分别注射3株枸杞，共计9片叶子。继续光照培养3-10天后，进行外源基因的分析检测。实验中以注射用于悬浮菌液的mma缓冲液作为mock阴性对照。
[0050]
(4)外源报告基因的检测分析：
[0051]
1)egfp荧光检测：将注射过的整株植物在黑暗条件下，用紫外灯(uvp upland ca91786,u.s.a.)照射，观察egfp蛋白表达情况。正常无表达对照叶片显示为红色，而egfp高表达的注射叶片显示绿色荧光。
[0052]
2)egfp的western blot蛋白检测：用液氮收集冷冻注射含有pat-his-egfp或130-gfp的重组农杆菌的枸杞叶片，于-80℃保存备用。在预冷的研钵中充分研磨样品成粉末状，按照1g鲜重添加2ml的蛋白提取缓冲液[溶剂为ddh2o，溶质及其浓度分别为50mm tris(ph 7.5),150mm nacl,10％glycerol，0.5％triton x-100和complete protease inhibitor cocktail。其中，蛋白酶抑制剂complete protease inhibitor cocktail(roche，mini protease inhibitor cocktail，货号：11836153001)的工作浓度为1个药丸/10ml蛋白提取缓冲液]，于4℃旋转30min后，4℃，12,000rpm离心15min两次，取上清分别进行蛋白sds-page和western blot分析。
test)。
[0065]
上述结果表明，由于不同植物叶片的细胞结构不同，细胞与病毒载体的亲和性差别大，并不是所有植物都适用于某病毒载体瞬间表达外源蛋白，本发明中的枸杞作为烟草花叶病毒瞬时表达外源蛋白的生物反应器，是从多种植物筛选成功获得的新材料，如表1中的多种植物材料，只有枸杞叶片兼具成功进行农杆菌注射和高效表达。
[0066]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。