一种恶臭假单胞菌及其应用

1.本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一株对病原真菌和细菌具有良好拮抗活性的生防细菌菌株的分离鉴定。


背景技术：

2.水稻纹枯病、稻瘟病、白叶枯病、小麦赤霉病是生产中频繁爆发的病害种类。黄单胞菌是一类重要的植物病原细菌，能侵染400多种植物，包括许多重要的农作物和经济作物，如水稻、棉花、大豆、十字花科植物、柑橘、香蕉和木薯等。稻黄单胞菌包括两个致病变种，水稻白叶枯病菌（xanthomonas oryzae pv. oryzae）和水稻细菌性条斑病菌（xanthomonas oryzae pv. oryzicola），其中水稻白叶枯病菌在全球前十位最重要的植物病原细菌中排在第四位。水稻恶苗病是由多种镰孢菌复合侵染引起的真菌性病害，包括藤仓镰孢菌（fusarium fujikuroi）、层出镰孢菌（f. proliferatum）、拟轮枝镰孢菌（f. verticillioides）和f. andiyazi，主要表现为幼苗细高徒长，造成严重的产量损失。稻瘟病菌（magnaporthe oryzae）能在水稻营养生长期侵染叶片，发展为叶瘟，也能在生殖生长期侵染穗部，发展为穗瘟，其中穗颈瘟严重危害水稻产量和品质。目前，生产中对稻瘟病害的防治主要依靠抗病品种和化学防治。化学防治所用的农药包括三环唑、咪鲜胺、戊唑醇等，化学防治容易对环境造成污染，新型、高效的环境友好型生防制剂亟待开发，这也是符合“两减“政策的措施。
3.假单胞菌（pseudomonas spp.）属于γ-变形菌门，假单胞科，假单胞属。假单胞菌是一类专性需氧的革兰氏染色阴性细菌，无芽胞，有荚膜，呈杆状或略弯，可产生荧光色素或红、蓝、黄、绿等水溶性色素。该属很多菌株能合成多种次生代谢产物，可用于植物病害的生物防治和污染物降解。因此，分离鉴定对病原菌具有拮抗作用的假单胞菌株，从中获得其合成的特异性抗菌活性物质，可为新型农用抗生素的开发和病害防治提供新的手段和途径。
4.如现有技术，中国发明专利，申请号：cn201610102640.2，公开号：cn105543152b，公开了一种恶臭假单胞菌及其在促进连香树生长中的应用，其技术方案如下：“2013年4月从山西省历山自然保护区连香树根际土壤中，筛选获得了一株促进连香树生长的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)，菌株号为lwpzf，已保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctcc no：m 2016008，保藏日期为2016年1月5日。
5.cctcc no：m 2016008菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，淡黄色，圆形、表面凸起、边缘整齐，菌落表面湿润，光滑，有光泽；菌体杆状，革兰氏染色阴性，大小约0.5～0.9μm
×
1.5～2.5μm，单生三鞭毛；好氧，氧化酶反应阳性，接触酶试验阳性，3％氢氧化钾试验阳性，淀粉水解试验阴性，明胶水解阴性，硝酸还原试验阳性，甲基红、vp阴性，吲哚阴性。
6.cctcc no：m 2016008菌株16s rdna基因序列，见seq id no.1所示。
7.将所测16s rdna序列与genbank数据库中的序列进行blast比对。结果表明，lwpzf菌株与pseudomonas putida的相似度为99％。结合形态、生理生化特征及16s rdna序列分析，鉴定为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。
8.上述恶臭假单胞菌lwpzf在促进连香树实生苗生长中的应用也在本发明的保护范围之内。cctcc no：m 2016008菌株菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂明显促进了连香树的生长发育。
9.上述恶臭假单胞菌lwpzf在促进黄瓜种子生长中的应用也在本发明的保护范围之内。
10.上述恶臭假单胞菌lwpzf对植物病原菌拮抗中的应用也在本发明的保护范围之内。
11.其中，所述的植物病原菌为尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)、丝核菌(rhizoctonia sp.)和水稻瘟病菌(magnaporth grisea)“。
12.但上述专利存在以下问题：并不能有效应用于黄单胞、茎点霉等常见植物病原细菌，同时，其使用浓度较高。


技术实现要素：

13.1、要解决的问题针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种恶臭假单胞菌，本发明利用稀释涂布的方法，以稻瘟菌作为靶标菌，从植物根际土壤中筛选到一株生防菌株ah，经形态学、16s rdna等方法鉴定为恶臭假单胞菌（pseudomonas putida），同时恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）编号为ah，2022年03月04日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.24466。经测试，该菌对稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、黄单胞菌等植物病原菌具有广谱抑菌活性。
14.2、技术方案为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
15.一种恶臭假单胞菌，所述的恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）编号为ah，2022年03月04日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.24466。
16.一种恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用。
17.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，所述的植物病原真菌包括稻瘟病菌（magnaporthe oryzae）、茎点霉（phomasp.）、水稻纹枯病菌（rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）、层出镰孢菌（f. proliferatum），植物病原细菌包括短小杆菌（curtobacteriumsp.）、水稻黄单胞菌（xanthomonas oryzae）。
18.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，所述的恶臭假单胞菌的剂型是药学上可接受的剂型。
19.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，所述的恶臭假单胞菌的剂型为菌悬液。
20.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，
所述的恶臭假单胞菌的菌悬液的浓度为2*10
8 cfu/ml。
21.3、有益效果相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明利用稀释涂布的方法，以稻瘟菌作为靶标菌，从植物根际土壤中筛选到一株生防菌株ah，经形态学、16s rdna等方法鉴定为恶臭假单胞菌（pseudomonas putida），同时恶臭假单胞菌（p. putida）编号为ah，2022年03月04日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.24466。经测试，该菌对稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、黄单胞菌等具有广谱拮抗活性。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中p. putida ah在培养基上的菌落形态，其中a、b为pda培养基，其中c、d为lb培养基。
23.图2为本发明实施例1中p. putida ah的电镜观察图片，其中a为5.0 μm比例尺，其中b为500 nm比例尺。
24.图3为本发明实施例1中p. putida ah与病原菌的平板对峙试验的拮抗效果图，其中a为稻瘟病菌，其中b为茎点霉，其中c为水稻纹枯病菌，其中d为尖孢镰刀菌，其中e为层出镰孢菌，f为短小杆菌，其中g为水稻黄单胞菌，h为平板样品模式图。
25.图4为本发明实施例1中p. putida ah及近缘物种gyrb基因的系统发育树。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
27.本文所使用的术语“包括“和“包含“应被理解为包含性的和开放式的，而不具有排他性。具体而言，当在说明书和权力要求书中使用术语“包括“和“包含“及其同义词时，是表示包括指定的特征、步骤或组成部分。这些术语不能被理解为排除其他特征、步骤或组成部分的存在。
28.一种恶臭假单胞菌，所述的恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）编号为ah，2022年03月04日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为cgmcc no.24466。
29.一种恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用。
30.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，所述的植物病原真菌包括稻瘟病菌（magnaporthe oryzae）、茎点霉（phomasp.）、水稻纹枯病菌（rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）、层出镰孢菌（f. proliferatum），植物病原细菌包括短小杆菌（curtobacterium spp.）、水稻黄单胞菌（xanthomonas oryzae）。
31.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，所述的恶臭假单胞菌的剂型是药学上可接受的剂型。
32.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，所述的恶臭假单胞菌的剂型为菌悬液。
33.上述所述的恶臭假单胞菌在防治植物病原菌中的应用中，
所述的恶臭假单胞菌的菌悬液的浓度为2*10
8 cfu/ml。
34.实施例11 材料和方法1.1试验菌株、培养基试验菌株：恶臭假单胞菌ah（p. putida ah）、稻稻瘟病菌（magnaporthe oryzae）、茎点霉（phomasp.）、水稻纹枯病菌（rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）、层出镰孢菌（f. proliferatum）、短小杆菌（curtobacteriumsp.）、水稻黄单胞菌（xanthomonas oryzae）。
35.培养基：pda培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g，水1000 ml，ph为自然值，其中土豆需切小块煮沸20 min后取滤液作为培养基组分。
36.lb培养基：tryptone 10 g，nacl 10 g，yeast extract 5 g/l，加水溶解后定容至1l，ph=7.0-7.2，分装后另加琼脂粉1.5 g/100 ml。
37.1.2叶瘟病斑区域细菌的分离取叶瘟发病组织10份，用无菌剪刀剪成小块后泡于2 ml无菌水的离心管中，浸泡30 min后以10倍梯度稀释5次。吸取稀释液20μl于lb平板上涂布，每个稀释度重复涂布于3块平板，28℃培养2天。稀释度以每个平板上菌落数30-100个为宜，挑取不同菌落形态的单菌落于lb平板进行纯化，纯化三次后-70℃保存。
38.1.3生防细菌筛选挑取上述纯化得到的细菌单克隆在lb液体培养基中培养24h，获得od
600
=1.0的细菌菌液。以稻瘟病菌作为生防细菌筛选的靶标菌，制备稻瘟病菌孢子液，浓度为100倍显微镜下孢子数为30-50个为宜，取50μl孢子液均匀涂布于pda平板，吹干后28℃培养1天。吸取2μl细菌菌液（od
600
=1.0）滴于含有稻瘟菌孢子液的平板上，三次重复，以水溶剂作为对照。28℃培养约3d，周围出现抑菌圈的细菌菌落即为目标菌株，将其进一步纯化并保存。
39.1.4生防细菌对病原细菌的拮抗活性测定病原细菌液体培养至od
600
=1.0，取适量菌液稀释100倍，将稀释菌液均匀地铺在lb平板，多余液体吸出，吹干待用。2μl细菌菌液（2*10
8 cfu/ml）滴于上述平板，三次重复，以水溶剂作为对照。28℃培养约3d，观察并记录试验结果。
40.1.5生防细菌对病原真菌的拮抗活性测定病原真菌平板培养至活力较好的状态，打孔器取新鲜菌饼至新pda平板，28℃培养1天。2μl细菌菌液（2*10
8 cfu/ml）滴于上述平板，三次重复，以水溶剂作为对照。28℃培养约3，观察并记录试验结果。
41.1.6生防细菌菌株的鉴定1.6.1菌落形态观察与电镜观察菌落形态：取假单胞ah菌液3μl分别点于lb、pda培养基中央，28℃培养2d，观察形态。如图1所示，在lb培养基上，菌落呈米白色，边缘不光滑，呈细小锯齿状，中间凹陷。在pda上，菌落形态与lb平板上相似，但菌落更为疏松湿润。
42.电镜观察（如图2所示）：（1）将ah菌液划线于lb培养基（菌龄不能过大），在菌落生长新鲜处，用少量灭菌
水，冲洗菌落，并轻轻晃动培养皿，使灭菌水在新鲜菌落周围反复冲洗，配制成菌悬液。
43.（2）在石蜡板上滴加1~2滴新鲜的pta负染液。
44.（3）取新的铜网片吸附菌悬液，置于干净的滤纸上晾干。
45.（4）待铜网片上的菌悬液七八成干时，将铜网片吸附菌悬液的一面接触负染液，漂浮染色15s。
46.（5）从负染液中取出铜网片，用滤纸吸干多余的负染液，日光灯下烤45s，使其干燥。
47.（6）将制作好的样品，放置于透射电镜日立h-650中，在80千伏下观察细胞形态。如图2所示，ah细菌菌体呈短杆状，菌体大小约为0.5μm
×ꢀ
1μm，无细胞核，不形成芽孢。
48.1.6.2 生防细菌对病原细菌、病原真菌的拮抗活性测定如图3所示，ah菌株对参试的七种病原真菌和细菌均具有抑菌作用，其中对稻瘟病菌、茎点霉菌、黄单胞菌和短小杆菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径均在1.5cm以上，对水稻纹枯病菌、尖孢镰刀菌和层出镰孢菌的抑菌圈直径低于0.8cm。
49.1.6.3 16s rdna与gyrb鉴定细菌种属利用tiangen细菌基因组dna提取试剂盒提取的ah菌株dna作为pcr模板，利用通用引物27f（5
’‑
agagtttgatcatggctcag-3’）和1492r（5
’‑
acggttaccttgttacgactt-3’）扩增16s rdna，目的条带约1500bp。pcr反应体系（25μl）：10
×
buffer 2.5 l；mg
2
（25 mm）2 l；dntp（1.25 mm）2 l；正向引物（20 pmol/l）0.5 l；反向引物（20 pmol/l）0.5 l；trans-taq聚合酶0.3 l；gdna（10 ng/l）0.5 l；ddh2o 16.7 l。pcr反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸90s、30个循环，72℃后延伸8min。pcr反应产物经1%琼脂糖凝聚电泳检测，与dl2000bp marker比较，片段约1500bp。含有目的片段的pcr产物利用axygen pcr clean up试剂盒进行纯化回收，将纯化产物送往上海生工公司测序，所得序列长度为1405bp。
50.将所得序列与ncbi核酸数据库进行同源性比对分析，如图4所示，结果显示，与该菌株16s rdna序列相近的菌株多为已知的假单胞菌株，ah菌株与p.putida pc2、p.wayambapalatensis、p.muyukensis菌株的16s rdna序列相似性均高达99.93%，还需进一步确定菌株ah的种属。
51.利用gyrb通用引物进一步测序得到gyrb序列，挑选部分相似性较高的菌株与ah菌株的gyrb序列进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，结果表明ah与p.putida遗传距离最近，根据同源性比对和系统发育分析结果表明，ah菌株为恶臭假单胞菌。
52.p. putida ah的16s rdna序列，长度为1405bp，如下。
53.agtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacaga
gggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtcatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggttaccacggtgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgcggctggatcacctcctt。
54.p. putida ah的gyrb序列，长度为708bp，如下。
55.gagcagacctacgtccacggtgtgccacaagctccgatggcagtggtcggtgaaagcgaaaccaccggtactcacatccacttcaaaccttcggccgagaccttcaagaatattcacttcagctgggacatcctggccaagcgaattcgtgagctgtctttcctcaactcgggcgttggtatcctgctgaaggacgagcgctccggcaaggaagagttcttcaagtacgaaggtggtttgcgcgcattcgtcgagtacctgaacaccaacaagaccccggtgaactcccaggtcttccacttcaacgtccaacgtgacgatggcgtgggtgtcgaagttgccctgcaatggaacgacagcttcaacgaaaacctgctgtgcttcaccaacaacattccgcagcgcgacggcggtactcacttggtgggcttccgttcctcgctgacccgcagcctgaacagctacattgagcaggaaggcctggccaagaagaacaaggtcgcgaccacaggtgacgatgcccgtgaaggcctgaccgcgatcatctcggtgaaggtgccggatccgaagttcagctcgcagaccaaggacaagctggtttcctcggaggtgaagaccgccgtggagcaggagatgaacaagtacttcgccgacttcctgttggaaaaccccaacgaagccaaggcggtcgttggcaagatgatcgac。
56.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆因属本发明的涵盖范围。