一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法与流程

1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法。


背景技术：

2.外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小囊泡，其直径在30-150nm。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用具有很大的潜力。
3.现有的外泌体提取方法主要通过对细胞进行平板培养，然后收获细胞并进行分离提纯来提取获得外泌体，上述方法中细胞培养量较低，因此提取获得的外泌体量较少，不利于进行外泌体工业化的大规模生产。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够实现外泌体持续大量产出，便于进行外泌体工业化大规模生产的外泌体制备方法。
5.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，包括以下步骤：1）细胞培养：获取组织块并将组织块置于平盘中进行细胞贴壁培养；2）系统环境改善：依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒进行预处理；3）接种细胞：分离平盘中培养完成的细胞，使用培养液对细胞进行重悬、浓缩，将中空纤维生物反应器内的完全培养基换成新鲜的完全培养基，然后将细胞浓缩液接种入培养筒的纤维外空间中；4）细胞扩大培养：将培养筒与双头泵连接，打开双头泵使得储液瓶中新鲜的完全培养基流入培养筒的纤维内管路中，并实时监测完全培养基中葡萄糖浓度，每当葡萄糖浓度消耗50%时，依次增大完全培养基体积和完全培养基流速；5）外泌体获取：收集纤维外空间中的溶液，对溶液进行分离、提纯获得外泌体。
6.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤2）中对培养筒预处理包括以下步骤：
①
、向储液瓶中加入pbs缓冲液，连接储液瓶与培养筒，打开培养筒的第一内阀门和第二内阀门，手动按压单向阀将pbs缓冲液打入纤维内管路中，观察到气泡冒出后关闭第一内阀门和第二内阀门；
②
、打开培养筒的第一外阀门和第二外阀门，向纤维外空间中加入pbs缓冲液使其充满培养筒；
③
、关闭第一外阀门和第二外阀门，打开第一内阀门和第二内阀门，将培养筒与双
头泵连接使得pbs缓冲液在纤维内管路循环，并将中空纤维生物反应器放入培养箱内，pbs缓冲液循环流速设定在80-90ml/min，循环时间设定在24-48h；
④
、将pbs缓冲液换成基础培养基，重复步骤
①‑③
；
⑤
、将基础培养基换成完全培养基，重复步骤
①‑③
。
7.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤3）中的培养液为步骤1）中平盘内培养过细胞的培养基。
8.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤3）中细胞浓缩液内细胞存活率大于90%，接种细胞后，细胞能够覆盖中空纤维柱表面积50%以上。
9.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤3）中将细胞浓缩液接种入培养筒的纤维外空间中包括：关闭第一内阀门和第二内阀门，打开第一外阀门和第二外阀门，使用两支针筒分别与第一外阀门和第二外阀门连通，针筒内含有细胞浓缩液；使用针筒对细胞浓缩液来回冲打，直至两支针筒内液体浑浊度一致。
10.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤4）中在将培养筒与双头泵连接前，将培养筒往下旋转180
°
，静置20-40min，再将培养筒转正，静置20-40min。
11.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤4）中细胞初代培养时，完全培养基体积为125ml，完全培养基流速为100ml/min。
12.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤4）中每当葡萄糖浓度消耗50%时，依次增大完全培养基体积和完全培养基流速分别设定为：完全培养基体积为250ml，完全培养基流速为100ml/min；完全培养基体积为500ml，完全培养基流速为120ml/min；完全培养基体积为1000ml，完全培养基流速为140ml/min。
13.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤5）中当葡萄糖消耗量大于1g/天时，收集纤维外空间溶液包括：关闭第一内阀门，打开第二内阀门，使用针筒从第一外阀门和/或第二外阀门吸取纤维外空间液体，使得储液瓶中液体通过第二内阀门回到纤维外空间。
14.上述基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，优选的，所述步骤5）中对溶液进行分离、提纯包括：将溶液至于离心管中，在2000-3000g、4℃下离心12-20min，收集上清液；将上清液在8000-10000g、4℃下离心15-20min，离心完成后继续收集上清液；将上清液经过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液；将过滤液在8000-10000g、4℃下离心60-70min，收获外泌体。
15.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中中空纤维生物反应器的中空纤维柱表面积更大，可容纳更多细胞生长，获得更多外泌体；通过依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒进行预处理可确保系统不会渗漏，并将系统建立为适于细胞生长的环境；通过细胞扩大培养可使得细胞数量大量增加，从而获取更多的外泌体。
附图说明
16.图1 为实施例1中中空纤维生物反应器的示意图。
17.图2 为实施例1中基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法的简易流程示意
图。
18.图例说明100、培养筒；110、中空纤维柱；120、纤维内管路；121、出液管；122、第一内阀门；123、第二内阀门；130、纤维外空间；131、第一外阀门；132、第二外阀门；200、储液瓶；210、瓶盖；220、不锈钢管；300、双头泵；400、连接管；500、单向阀。
具体实施方式
19.为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
20.需要特别说明的是，当某一元件被描述为“固定于、固接于、连接于或连通于”另一元件上时，它可以是直接固定、固接、连接或连通在另一元件上，也可以是通过其他中间连接件间接固定、固接、连接或连通在另一元件上。
21.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
22.实施例1本实施例公开了一种基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，上述方法中主要通过中空纤维生物反应器来进行细胞培养，从而获得大量细胞，进而进行分离提纯以获取外泌体。
23.如图1所示，本实施例中的中空纤维生物反应器包括培养筒100、储液瓶200和双头泵300，培养筒100的左右两端分别设置有一个出液管121，其中一个出液管121通过连接管400与双头泵300连接，另一个出液管121通过连接管400与储液瓶200中的一个不锈钢管220连接，储液瓶200中的另一个不锈钢管220与双头泵300连接，从而使得整个中空纤维生物反应器形成一个闭合液体回路，因此当开启双头泵300时，储液瓶200中的液体能够在闭合液体回路中进行循环。
24.如图1所示，本实施例中的培养筒100内设置有多个中空纤维柱110，中空纤维柱110将培养筒100内腔分割成了中空纤维柱110内的纤维内管路120（ics）和中空纤维柱110外的纤维外空间130（ecs），当使用中空纤维生物反应器对细胞进行培养时，细胞将生长在纤维外空间130内，培养基则在纤维内管路120流通。
25.如图1所示，本实施例中所有中空纤维柱110的纤维内管路120的左右两端最终会分别汇集于培养筒100两端的出液管121，其中与双头泵300连接的出液管121上设置有第一内阀门122，与储液瓶200连接的出液管121上设置有第二内阀门123，可通过分别控制第一内阀门122和第二内阀门123的启闭，控制纤维内管路120与双头泵300和储液瓶200的导通状态。本实施例中纤维内管路120通过出液管121与单向阀500连通，单向阀500可有助于管路中的气体排出，除此之外，当培养筒100与储液瓶200直接连接，而不与双头泵300连接时，通过手动按压单向阀500可以将储液瓶200中的液体打入纤维内管路120中。
26.如图1所示，本实施例中培养筒100顶部设置有第一外阀门131和第二外阀门132，可通过分别控制第一外阀门131和第二外阀门132的启闭，控制纤维外空间130与外界的导通状态，从而便于进行接种细胞和收集细胞等操作。
27.参考图1和图2，本实施例中的基于中空纤维生物反应器的外泌体制备方法，包括以下步骤：1）细胞培养：获取组织块并将组织块置于平盘中进行细胞贴壁培养。
28.具体的，本实施例中的组织块选取的是新鲜脐带组织，将新鲜脐带组织至于平盘中并添加培养基进行细胞贴壁培养后，便可获得脐带组织间充质干细胞。
29.2）系统环境改善：依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒100进行预处理。
30.具体的，本实施例中在使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒100进行预处理前还包括灭菌预处理，进行灭菌预处理具体包括：调整不锈钢管220在储液瓶200瓶盖210中的位置，使得不锈钢管220的下端管口在储液瓶200的125ml刻度以下，取出连接管400然后将连接管400以及不锈钢管220的两端用锡箔纸封住，将储液瓶200连同不锈钢管220和连接管400一起放入灭菌袋后进行灭菌处理，从而保证系统的无菌状态。
31.灭菌预处理完成后便依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒100进行预处理，以下为预处理的具体操作步骤：
①
、准备250ml pbs缓冲液，将40ml pbs缓冲液倒入50ml的离心管中，其余pbs缓冲液倒入储液瓶200内；将储液瓶200的不锈钢管220通过连接管400与培养筒100的出液管121连接，连接时连接管400的两端稍微反转在与不锈钢管220和出液管121连接，由此可避免接合后管路处于扭曲状态，并确保连接处接合紧密；打开培养筒100的第一内阀门122和第二内阀门123，此时第一外阀门131和第二外阀门132处于关闭状态，手动按压单向阀500将pbs缓冲液打入纤维内管路120中，观察到气泡冒出后，即可确认纤维内管路120通畅，然后关闭第一内阀门122和第二内阀门123。
32.②
、打开培养筒100的第一外阀门131和第二外阀门132，使用针筒吸取50ml离心管内的pbs缓冲液，然后将针筒与其中一个外阀门连接，从而将针筒内的pbs缓冲液打入纤维外空间130中使其充满培养筒100；在进行上述操作时，还可在另一个外阀门上连接一支空针筒，从而避免pbs缓冲液从培养筒100中溢出，同时保持培养筒100内气压平衡，使得pbs缓冲液能顺畅打入。
33.③
、关闭第一外阀门131和第二外阀门132，打开第一内阀门122和第二内阀门123，将培养筒100与双头泵300连接使得pbs缓冲液在纤维内管路120循环，并将中空纤维生物反应器放入培养箱内，pbs缓冲液循环流速设定在80-90ml/min，循环时间设定在24-48h。
34.④
、将pbs缓冲液换成基础培养基，重复步骤
①‑③
。
35.⑤
、将基础培养基换成完全培养基，重复步骤
①‑③
。
36.本实施例中通过依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒100进行预处理，可在预处理过程中观察系统工作状态，从而确保系统不会渗漏。
37.本实施例中所使用的pbs缓冲液主要成分包括na2hpo4、kh2po4、nacl、kcl，基础培养基主要成分包括氨基酸、维生素、葡萄糖等各种细胞生长所需的营养物质，在基础培养基中加入血清及抗生素即构成了完全培养基。其中pbs缓冲液使得系统平衡到适宜的酸碱度及渗透压，从而为细胞生长提供合适的酸碱度及渗透压；基础培养基使得系统充满细胞生长所需的营养物质；完全培养基使得系统充满细胞生长所需的生长因子，即本实施例中通过依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒100进行预处理，可将系统建立
为适于细胞生长的环境，除此之外，本实施例中采用逐步调节与直接使用完全培养基调节相比可以节约一定成本。
38.3）接种细胞：分离平盘中培养完成的细胞，使用培养液对细胞进行重悬、浓缩，本实施例中使用的培养液为步骤1）中平盘内培养过细胞的培养基，原来的培养基中含有许多生长因子，因此有利于细胞接种后生长；将中空纤维生物反应器内的完全培养基换成新鲜的完全培养基，然后将细胞浓缩液接种入培养筒100的纤维外空间130中，本实施例中在接种时细胞浓缩液内细胞存活率大于90%，接种细胞后，细胞能够覆盖中空纤维柱110表面积50%以上，例如：c2011中空纤维培养系统中中空纤维柱110的表面积为3000cm2，所需接种细胞数要能覆盖1500cm2以上，即接种细胞数大于108个；本实施例中将细胞浓缩液接种入培养筒100的纤维外空间130中包括：关闭第一内阀门122和第二内阀门123，打开第一外阀门131和第二外阀门132，使用两支针筒分别与第一外阀门131和第二外阀门132连通，针筒内含有细胞浓缩液；使用针筒对细胞浓缩液来回冲打，直至两支针筒内液体浑浊度一致，从而使得细胞混合均匀。
39.4）细胞扩大培养：接种细胞完成后，将培养筒100往下旋转180
°
，静置30min，再将培养筒100转正，静置30min，从而使得细胞均匀贴附在中空纤维柱110表面；将培养筒100与双头泵300连接，打开双头泵300使得储液瓶200中新鲜的完全培养基流入培养筒100的纤维内管路120中，本实施例中细胞接种后的初代培养，细胞初始数量较少，因此所需要的营养物质以及代谢所产生的废物较少，所以初代培养时完全培养基的体积为125ml，完全培养基流速为100ml/min；本实施例中细胞扩大培养过程中，细胞数量会大量增加，因此所需要的营养物质以及代谢所产生的废物也会相应增加，因此需要实时监测完全培养基中葡萄糖浓度，每当葡萄糖浓度消耗50%时，依次增大完全培养基体积和完全培养基流速分别设定为：完全培养基体积为250ml，完全培养基流速为100ml/min；完全培养基体积为500ml，完全培养基流速为120ml/min；完全培养基体积为1000ml，完全培养基流速为140ml/min，从而向细胞提供足够的营养物质，同时将细胞代谢所产生的代谢废物带离培养筒100。
40.本实施例中采用对细胞进行逐步扩大培养，初始接种细胞数量所需较少，并能够在较短时间内通过细胞扩大培养使得细胞数量迅速增长，因此与直接在系统外培养获得大量细胞再进行接种培养相比可以减少细胞培养所需的时间和成本。
41.5）外泌体获取：收集纤维外空间130中的溶液，本实施例中外泌体可按1次/天的频次收获，当葡萄糖消耗量大于1g/天时，此时表示培养筒100中细胞数量较多，因此需要取出更多的细胞，以腾出空间让细胞继续增殖生长，本实施例中通过关闭第一内阀门122，打开第二内阀门123，使用针筒从第一外阀门131和/或第二外阀门132吸取纤维外空间130液体，使得储液瓶200中液体通过第二内阀门123回到纤维外空间130，在液体从纤维内管路120穿过中空纤维柱110的孔洞回到纤维外空间130的过程中，液体可将附着于中空纤维柱110上的细胞冲洗下来，因此能够使得更多细胞从中空纤维柱110上脱落，从而收获更多的细胞；收集溶液完成后，便需要对溶液进行分离、提纯获得外泌体，本实施例中溶液进行分离、提纯包括：将溶液至于离心管中，在2000-3000g、4℃下离心12-20min，收集上清液；将上清液在8000-10000g、4℃下离心15-20min，离心完成后继续收集上清液；将上清液经过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液；
将过滤液在8000-10000g、4℃下离心60-70min，收获外泌体。
42.本实施例中中空纤维生物反应器的中空纤维柱110表面积更大，可容纳更多细胞生长，获得更多外泌体；通过依次使用pbs缓冲液、基础培养基和完全培养基对培养筒100进行预处理可确保系统不会渗漏，并将系统建立为适于细胞生长的环境；通过细胞扩大培养可使得细胞数量大量增加，从而获取更多的外泌体。