一种芽孢杆菌HSY32、杀虫蛋白、cry-like杀虫基因及应用的制作方法

一种芽孢杆菌hsy32、杀虫蛋白、cry
‑
like杀虫基因及应用
技术领域
1.本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌hsy32、杀虫蛋白、 cry
‑
like杀虫基因及应用。


背景技术：

2.线虫对农作物的危害极大，可寄生在植物体各个部位，吸取寄主养分用于自身生长繁殖，不仅直接对寄主造成伤害，而且可导致外界病原如病毒、真菌、细菌的入侵，加重寄主植物的病害。寄生线虫种类达4,100多种，破坏程度最为严重的是根结线虫和囊肿线虫，严重影响全球粮食作物产量与品质。国际上公认的共有十大类毁灭性线虫，据美国一项研究机构调查显示，由于寄生线虫的危害，全球农林作物导致的损失高达800多亿美元。
3.线虫多是在植物的地下部分活动，破坏植物组织，已经造成了巨大的经济损失，其防治难度高于其他昆虫类的防治。植物寄生线虫的防治主要包括物理防治、化学防治和生物防治。物理防治主要包括旱季深翻土壤暴晒、对染病地块停耕消毒、作物播种前期拌药处理、利用大水漫灌土地等均起到一定的成效。然而，面对耕地减少、土地荒漠化、人口数量激增等现实问题，物理防治的操作空间有限，效果不明显，易反复发作，防治极其不彻底。化学防治主要是利用药剂，通过线虫表皮吸收或是直接进入肠道使线虫中毒死亡，如二溴氯丙烷、dtt等，土壤施药后对大多数地下害虫都有毒杀作用，但是对于有益的昆虫，比如蚯蚓同样致死。有些药品是麻痹线虫致死，比如克线磷、氯唑磷等，作物播种前期进行拌种处理或者穴施作物根际周围使用。化学杀虫剂的杀虫效力高，具有见效快，用药成本较低等特点，但是，农药的高毒和高残留影响了人们的身体健康，也极易导致无辜的动物中毒或死亡，污染水源河道，农产品的品质也得不到保障。随着人们绿色科学环保意识的提高，农田里化学农药的使用量正逐年递减，具有危害性农药将逐步退出田间舞台。
4.生物防治主要是利用线虫的一些自然天敌，比如杀线虫微生物和杀线虫植物，以及某些微生物或者植物所产生的杀线虫代谢物。1985年bone等人首次证实 bt的cry蛋白对线虫有活性以来，从有关bt对防治寄生线虫的研究引起了人们极大的关注。到目前为止，已经报道具有杀线虫活性的bt晶体蛋主要有cry1、 cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21与cry55共8大类。2003年wei 等发现杀线虫晶体蛋白cry5b、cry6a、cry21a和cry14a对多种线虫都表现有活性，而表现最为优异的是cry5b晶体蛋白。其中对秀丽隐杆线虫有活性的蛋白，对其它五种寄生线虫大多同样也有活性。但是，目前鲜有菌株和基因实际用于大田防治作物线虫，非常有必要挖掘更多可用于线虫生物防治的微生物资源和基因资源。


技术实现要素：

5.本发明提供一种芽孢杆菌hsy32，其特征在于，所述芽孢杆菌hsy32属于蕈状芽孢杆菌bacillus mycoides，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 cctcc no：m2021869。保藏日期为2021年7月12日。分类命名：蕈状芽孢杆菌 bacillus mycoides。保藏地址：中国武汉武汉大学
6.本发明的另一实施方案提供一种杀虫蛋白(cry
‑
like蛋白)，其特征在于所述杀虫蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的另一实施方案提供一种cry
‑
like杀虫基因，其特征在于所述cry
‑
like 杀虫基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明的另一实施方案提供上述芽孢杆菌hsy32在制备上述杀虫蛋白、 cry
‑
like杀虫基因中的应用。
9.本发明的另一实施方案提供上述杀虫蛋白和/或cry
‑
like杀虫基因在制备防治农业害虫药物中的应用。所述农业害虫优选线虫目昆虫，进一步优选秀丽隐杆线虫、南方根结线虫。
10.本发明的有益效果是：本发明提供一种新杀虫蛋白及其cry
‑
like杀虫基因，生物活性测定表明杀虫蛋白、cry
‑
like杀虫基因对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫具有很高的毒性。表明杀虫蛋白和cry
‑
like杀虫基因可用于农业害虫的防治。
附图说明
11.图1是菌株hsy32伴胞晶体蛋白扫描电镜观察图；
12.图2是cry
‑
like基因pcr扩增片段琼脂电泳分析图；注：m为核酸分子大小标准(bp)，lane1为cry
‑
like基因片段，分子大小2871bp；
13.图3是采用maximum parsimony(mp)方法mega x软件构建cry
‑
like和其它杀线虫蛋白的系统进化树图；
14.图4是cry
‑
like蛋白二级结构和三维结构预测图；注：a为cry
‑
like蛋白二级结构，蓝色：helix，红色：sheet，绿色：turn，紫色：coil。b为cry
‑
like的三维结构，α螺旋：紫色，β折叠：黄色，β转角：绿色
15.图5是cry
‑
like基因在大肠杆菌异源表达及其纯化sds
‑
page分析图；注： pm为蛋白分子量标准，lane1为pet
‑
30a质粒转入大肠杆菌bl21(de3)细胞iptg 诱导表达，lane2为cry
‑
like基因转入大肠杆菌bl21(de3)细胞iptg诱导表达，lane3为表达cry
‑
like蛋白纯化产物。
具体实施方式
16.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
17.实施例1菌株hsy32的筛选与鉴定
18.从海南岛的东南部吊罗山热带原始雨林采集土壤样品，然后，在实验室采用醋酸钠高温分离方法筛选土壤样品的芽孢杆菌，通过光学显微镜和扫描电镜观察鉴定出产伴胞晶体蛋白的芽孢杆菌。称取5g左右土壤放入20ml bpa(牛肉膏 0.3％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％)培养基中，充分振荡，30℃摇床培养4
‑
5h， 75℃水浴15min，取1ml上清稀释至10
‑3、10
‑4和10
‑5，各吸取200μl均匀涂布于nb(牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠3.4％)培养平板，30℃倒置培养3d，挑取形态各异的单菌落划平板。芽孢杆菌培养3
‑
5d形成芽孢后，进一步利用考马斯亮蓝染色和光学显微镜观察观察到无色芽孢和蓝色的伴胞晶体。
19.实施例2扫描电镜观察晶体蛋白
20.菌株hsy32在g
‑
tris培养基中28℃培养96h左右至芽孢完全形成，用牙签刮取约
soapdenovo短序列组装软件(网址及版本号： http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html；版本:1.05)对处理后的reads数据进行组装，经多次调整后主要参数k设置为75，得到最优的组装结果。
27.菌株hsy32基因大小为6,711,949bp，由798个scaffold组成，基因组的 g c含量为35.4％。基因组序列进一步使用rast软件(https://rast.nmpdr.org/) 和本地blast注释，hsy32基因组中共存在7,070个基因，发现1个新型的cry 杀虫蛋白，其开放阅读框(orf
‑
0018)大小为2,871bp(seq no.2)，编码956 个氨基酸(seq no.1)，命名为cry
‑
like蛋白。cry
‑
like蛋白与已知杀线虫蛋白 cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21和cry55氨基酸序列使用muscle 进行多重序列比对。利用mega x软件构建系统进化树，采用maximumparsimony(mp)方法，系统可信度检测采用自举法(bootstrapping)重复1000次进行。系统进化分析表明cry
‑
like独立为一个新分支，为一类新型毒素蛋白。
28.protparam(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质等电点为6.42、分子量大小为109kda、化学式为c
4861
h
7523
n
1307
o
1509
s
18
。sopma (http://npsa
‑
pbil.ibcp.fr/cgi
‑
bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)和 swiss
‑
model(http://swissmodel.expasy.org/)分别预测蛋白质的二级结构和三维结构。
29.实施例6 cry
‑
like基因克隆表达
30.hsy32基因dna为模板，利用cry
‑
like基因特异引物(0018f:
31.cgggatccatgaattcaaatcatcacaatgacta；0018r:
32.cggaattctcatttactgcttgttgagcttg)进行pcr扩增，退火温度为55℃，延伸时间为3min，反应进行35个循环，琼脂糖凝胶电泳检测cry
‑
like基因条带接近于3000bp，大小与预测基因大小2,871bp相符。为了方便pcr产物与表达载体pet
‑
28a连接，设计引物时引入了bamhⅰ和ecorⅰ的酶切位点(酶切位点为小写字母表示)。将已成功构建的表达重组质粒各自转入大肠杆菌 bl21(de3)中。为了可溶性蛋白能够成功的表达，逐步探索表达的最优条件。考虑加入iptg，iptg和温度都做梯度处理，iptg含量设置梯度0μl、50μl、 80μl，每个梯度做两个平行，温度设置28℃和37℃，每个温度设置6个平行。过夜活化表达菌株，第二天按1％的量转接，28℃、37℃200rpm振荡培养，约2h后菌体长至od
600
约为0.6时加入对应量的iptg，放入摇床振荡培养约 9h后开始收集菌体，在4℃，9000rpm下收集，收集完后开始清洗三次，nacl 或pbs缓冲液均可，菌体溶于适量预先冷冻的pbs缓冲液中，加入100mm pmsf使得最终工作浓度为1mm，超声波破碎仪(model vc
‑
130,sonics andmaterials inc，usa)破碎40min至溶液透明，4℃，12000rpm收集上清，每管上清离心三次左右以去除多余的菌体。用0.22μm的滤膜过滤蛋白上清，贴好标签于
‑
20℃保存。用sds
‑
page电泳检测是否表达成功。
33.实施例7制备纯化重组蛋白
34.4℃,12,000rmp离心10min收集iptg诱导表达的蛋白，充分悬浮于等体积的pbs溶液。表达的蛋白n端含有6
×
histidine(his)
‑
tagged标签，用ni
‑
nta 琼脂糖纯化树脂(氨基三乙酸)纯化，用ni柱在终浓度为250mm的咪唑下纯化蛋白，整个过程在冰上操作。装柱：在柱子下端加入蒸馏水，并关闭柱子的出口。将亲和层析填料混匀后取2ml加入到层析柱中，待其自然沉降；水洗层析柱：打开层析柱下方的塞子，等液体流干后盖上塞子，加入5ml的蒸馏水，待其沉降分层后流出液体，再清洗三次；平衡层析柱：加入5ml wash buffer平衡层析柱，待其沉降分层后流出液体，再平衡两三次；上样：将提前解冻的蛋白上清取 15ml加入
ni
‑
nta吸附粒中，轻轻混匀；将层析柱放于4℃200rpm振荡0.5
‑
2h；振荡完毕后，打开塞子收集流出的液体；漂洗：立即用2ml的20mm的咪唑清洗，清洗约10次；洗脱：用1.5ml的elution buffer洗脱四次，收集洗脱液；层析柱再生：20ml elution buffer清洗层析柱，5ml蒸馏水洗涤两次，加入5ml 20％乙醇，待其沉降后打开塞子，让20％乙醇流掉一半，盖好塞子和上面的盖子，将层析柱放入4℃保存。用sds
‑
page电泳检测纯化蛋白。bsa蛋白作为标准浓度，lowry方法用来测定表达蛋白的浓度。表达的蛋白溶于pbs缓冲液中，然后稀释成8个浓度进行生物活性测定。
35.实施例8 cry
‑
like蛋白对秀丽隐杆线虫毒性测定
36.将e.coli(op50)于37℃培养约9h后，均匀涂布于提前倒好已干燥的eng 固体培养平板上。用无菌的解剖刀割取1cm2的秀丽隐杆线虫培养基(eng培养基)于涂了op50的eng培养平板上，用封口膜封好，盖上湿毛巾，置于20℃培养3
‑
5天左右，可进行生物活性测定。
37.用m9缓冲液从线虫板上把线虫冲洗下来置于2mlep管中，待虫体沉降后吸取上清于新的ep管中，m9缓冲液清洗两遍，加入终浓度为0.1％的triton
‑
100 于m9缓冲液中重新悬浮。准备96孔的生测板。
38.将提前准备的已过滤的表达蛋白解冻，用pbs缓冲液调整表达的cry
‑
like 蛋白的浓度至500ng/ml，再设立pbs空白对照和cry5ba阳性对照，每个孔加约50头线虫，重复6次(生测的线虫总数约300头)。封口置于20℃培养，5d 后取出在显微镜下观察，根据线虫的活动性观察是否死亡，统计数据，计算致死率。几次触摸后无法响应的蠕虫标记为死亡。记录每孔死亡幼虫比例，利用校正死亡率＝[(处理组死亡率
‑
对照组死亡率)/(1
‑
对照率死亡率)]
×
100％，表达的 cry
‑
like蛋白对秀丽隐杆线幼虫的杀虫活性校正死亡率为100％。
[0039]
实施例9 cry
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like蛋白对南方根结线虫毒性测定
[0040]
从感染的番茄的根结收获南方根结线虫((meloidogyne incognita)的虫卵，通过用1％naclo处理5
‑
10分钟消毒，随后用无菌水洗涤。幼虫从18
‑
25℃的水饱和滤纸片上的卵孵化出来，南方根结线虫幼虫被单独放入96孔微量滴定板的每个孔。这些含有浓度为500ng/ml的cry
‑
like毒素以及四环素和氯霉素(每种 30μg/ml)。每个孔中的最终体积为200μl。用bsa(20μg/ml)作为对照。线虫在20℃潮湿的室中孵育5天，并在解剖显微镜下检查死亡线虫数量。得出 cry
‑
like蛋白同样对南方根结线虫幼虫有很好的杀虫活性，校正死亡率达到100％。
[0041]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。