结合人和猴CD3的抗体及其应用的制作方法

结合人和猴cd3的抗体及其应用
发明领域
1.本技术涉及一种与人和猴cd3ε特异性结合的抗体或其抗原结合片段，以及该抗体或其抗原结合片段在治疗或缓解炎性疾病、自免疫疾病或移植物排斥中的用途。本技术还涉及一种包含本公开抗体或其抗原结合片段的双特异抗体，特别是靶向cd3和cd20的双特异抗体，及其在治疗肿瘤等疾病中的用途。


背景技术：

2.t细胞和cd3
3.人体的免疫系统由两个独立而相互关联的系统构成：细胞免疫系统和体液免疫系统。t细胞是细胞免疫系统的主力军，来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前t细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的t细胞。
4.研究表明，诱导t淋巴细胞活化、增殖及分化为效应细胞需要双信号刺激。第一信号来自抗原提呈细胞(apc)表面的抗原肽/mhc复合体，由t细胞受体(tcr)复合体转导。第二信号即为协同刺激信号，由apc表面的协同刺激分子，例如cd28，和t细胞的相应受体相互作用后产生。
5.tcr复合体由tcr与cd3分子组成。其中tcr由α和β链组成，或由γ和δ链组成。各链的可变区部分突出于胞外，负责抗原肽的结合，而恒定区锚定在细胞膜内，在两条链之间形成二硫键，并有一段很短的胞内域。该胞内域没有信号转导的功能，因此t细胞胞内信号通路完全由cd3蛋白负责，cd3也因此被认为是t细胞活化过程中必不可少的分子。cd3分子由一条γ链、一条δ链、两条ε和两条ζ链构成，在tcr/cd3复合体中形成为三个二聚体εγ、εδ、和ζζ。其中ε、γ和δ均为i型跨膜蛋白，具有类似免疫球蛋白胞外功能域。ε、γ、δ和ζ的胞内域共含有10个免疫受体酪氨酸活化基序(itam)，itam的磷酸化使得cd3链能够结合对t细胞信号通路十分重要的激酶zap70。由于cd3ε链上有一个物种间保守的表位，大部分cd3抗体都靶向于此，比如第一个抗人cd3单克隆抗体-莫罗单抗(okt3)(jones m et al.,(1993)journal of immunology 150(12):5429-5435)。
6.靶向cd3的抗体
7.基于cd3分子稳定tcr结构和传递活化信号的作用，已开发出一系列针对cd3分子的单克隆抗体，来调节t细胞的活化信号转导，阻断或至少调节免疫过程，从而治疗炎性疾病和/或自身免疫性疾病。比如，okt3就被用于器官移植以及自身免疫类疾病的治疗/缓解。
8.除此之外，cd3抗体还可以通过与靶向疾病相关抗原(如肿瘤相关抗原)的功能基团形成双特异性分子。通过双特异性cd3抗体建立t细胞与疾病相关抗原的物理连接，引起t细胞的活化和由t细胞介导的对疾病相关细胞的杀伤。通过t细胞的杀伤功能，从而实现对疾病相关细胞如肿瘤细胞的清除。例如，靶向cd3和肿瘤相关抗原的双特异性抗体在拉近t细胞与肿瘤细胞后，t细胞活化，向肿瘤细胞释放包含有280多种蛋白的超分子攻击粒子(smap)。在smap的核心区带有穿孔素和颗粒酶，穿孔素可以刺穿肿瘤细胞的外膜，而颗粒酶
会诱导肿瘤细胞凋亡(b
á
lint et al.,(2020)science 368(6493):897-901)。
9.cd3抗体引起的不良反应
10.在t细胞活化并杀伤肿瘤细胞的同时，双特异性抗体中的cd3结合部分还会激活t细胞的tcr复合体信号通路，释放il-2、ifn-r和tnf-α等细胞因子，激活t细胞的增殖和分化。t细胞的增殖和分化在肿瘤治疗中是一把双刃剑，一方面可以产生更多的t细胞来杀伤肿瘤细胞，但在另一方面也会在受试者体内产生很大的毒性反应，即细胞因子释放综合征(“crs”)。在临床上，被描述为与crs相关的副作用不仅包括疲劳、呕吐、心动过速、高血压、背痛，还包括如癫痫发作、脑病、脑水肿、无菌性脑膜炎和头痛的中枢神经系统(cns)反应。例如，在cd19/cd3 t细胞双特异性药剂博纳吐单抗的临床试验中，频繁观察到重度crs和cns毒性。在所有患者中，在大约50％的患者中发生神经学毒性。
11.在cd3双特异性抗体治疗中观察的crs也出现在cd3单特异性抗体如okt3的治疗中，且被认为是抗体在体内结合fc受体(fcr)时形成的抗体交联而引起的(herold kc et al.,(2003)j clin invest.111(3):409-418)。因此，在后续的抗体研发中，cd3抗体的fc区经改造而呈现弱的fcr结合力，比如tepizumab。
12.然而，对于cd3单特异性抗体的fc区改造，并不足以改善cd3双特异性抗体引起的crs，因为双特异性抗体中靶向疾病相关抗原的功能基团与靶细胞的结合会引起抗体的交联，并从而引起t细胞释放大量的细胞因子。因此，筛选出一种对于cd3有高亲和力、又能引起较少细胞因子释放的cd3抗体或其抗原结合片段，对于cd3双特异性抗体的开发和临床应用是极其重要的。
13.靶向cd3和cd20的双特异抗体
14.cd20是一种表达于几乎所有发育阶段的b细胞(除干细胞和浆细胞外)表面的蛋白，在b细胞发育、分化和b细胞受体信号通路等中发挥作用。cd20表达不仅限于正常的b细胞，也在几乎所有b细胞肿瘤细胞表面观察到。在与cd20抗体结合后，cd20没有明显的内吞或脱落现象，因而成为诊断和/或治疗b细胞淋巴瘤和b细胞白血病的理想靶抗原。
15.同时靶向cd3和cd20的双特异抗体，可以建立t细胞和cd20阳性肿瘤细胞如恶性b细胞的物理连接，引起t细胞活化和t细胞介导的cd20阳性恶性b细胞瘤的杀伤。
16.然而，如上所述，该类抗体的施用伴随着不可避免的副作用，即严重的毒性反应。在一项评估cd20
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cd3双特异性抗体mosunetuzumab的安全性和药代动力学的多中心、开放标签、剂量递增i/ib期的go29781研究(nct02500407)中，显示有28.9％的患者出现细胞因子释放综合征(crs)。在另一项评估另外一款cd20
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cd3双特异性抗体cd20-tcb治疗r/r b-nhl患者的疗效、安全性、耐受性和药代动力学的多中心、开放标签、剂量递增i/ib期试验中，出现最多的不良事件是细胞因子释放，在67.9％的患者身上出现。
17.因而，急需构建一种既有强大的肿瘤杀伤力、又引起较小的毒性反应的cd20
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cd3双特异性抗体。而这种双特异性抗体的构建，不仅需要对于cd3有高亲和力、又能引起较少细胞因子释放的cd3抗体或其抗原结合片段，还需要优化cd3结合抗体或抗原结合片段与cd20结合抗体或其抗原结合片段的组合，从而找到较好的治疗窗口。
18.对于本技术中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本技术的现有技术。


技术实现要素：

19.本技术的发明人通过研究，找到了一种能够与人以及猴的cd3ε特异结合的cd3抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段与现有的cd3抗体相比，具有相当或更高的人/猴cd3ε结合力，可以在治疗炎性疾病和/或自身免疫性疾病中发挥相当或更好的效果。更重要的是，与现有的cd3抗体相比，本技术的抗体或其抗原结合片段在保持相当或更高的人/猴cd3ε结合力的情况下，具有减弱的对于t细胞的激活能力，从而实现较低的毒副作用，尤其在用于双特异性抗体构建时，能够杀伤靶细胞，而毒副作用更低。
20.不愿受理论的束缚，本技术的发明人认为，本技术的cd3抗体之所有具有高cd3ε亲和性并引起减弱的细胞因子释放，与其和cd3ε亚基的结合表位、以及抗体-抗原-细胞三者之间形成的立体构象有着密切联系。而且，本技术cd3抗体在构建成靶向cd3ε和疾病相关抗原如cd20的双特异性抗体后，仍保留有这种特点，即，可以以较高的杀伤力特异性地杀伤疾病靶细胞，又引起较弱的细胞因子释放。
21.因而，在第一个方面，本技术提供一种分离的单克隆抗体(例如，鼠源、嵌合或人源化抗体)、或其抗原结合片段，其与cd3ε结合，可以含有(i)重链可变区，该重链可变区可以含有vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，其中，vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区可以分别包含如seq id nos:1(x1＝s或t)、2(x1＝d或i)和3(x1＝l,x2＝y；x1＝i,x2＝w；或x1＝i,x2＝y)所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中，vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含如seq id nos:4(x1＝d,x2＝s；x1＝q,x2＝n；x1＝k,x2＝s；或x1＝r,x2＝n)、5(x1＝q,x2＝r,x3＝s；x1＝k,x2＝q,x3＝r；x1＝n,x2＝l,x3＝h；或x1＝r,x2＝l,x3＝s)和6(x1＝v或a)所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
22.重链可变区的vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区可以分别包含如(1)seq id nos:1(x1＝s)、2(x1＝d)和3(x1＝l,x2＝y)；(2)seq id nos:1(x1＝t)、2(x1＝i)和3(x1＝l,x2＝y)；(3)seq id nos:1(x1＝t)、2(x1＝d)和3(x1＝i,x2＝w)；或(4)seq id nos:1(x1＝t)、2(x1＝i)和3(x1＝i,x2＝y)所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
23.轻链可变区的vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含如(1)seq id nos:4(x1＝d,x2＝s)、5(x1＝q,x2＝r,x3＝s)和6(x1＝v)；(2)seq id nos:4(x1＝q,x2＝n)、5(x1＝k,x2＝q,x3＝r)和6(x1＝v)；(3)seq id nos:4(x1＝k,x2＝s)、5(x1＝n,x2＝l,x3＝h)和6(x1＝a)；或(4)seq id nos:4(x1＝r,x2＝n)、5(x1＝r,x2＝l,x3＝s)和6(x1＝v)所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
24.在一些实施方式中，本技术抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，该轻链可变区包含vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中vh cdr1区、vh cdr2区、vh cdr3区、vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含如(1)seq id nos:1(x1＝s)、2(x1＝d)、3(x1＝l,x2＝y)、4(x1＝d,x2＝s)、5(x1＝q,x2＝r,x3＝s)和6(x1＝v)；(2)seq id nos:1(x1＝t)、2(x1＝i)、3(x1＝l,x2＝y)、4(x1＝q,x2＝n)、5(x1＝k,x2＝q,x3＝r)和6(x1＝v)；(3)seq id nos:1
(x1＝t)、2(x1＝d)、3(x1＝i,x2＝w)、4(x1＝k,x2＝s)、5(x1＝n,x2＝l,x3＝h)和6(x1＝a)；或(4)seq id nos:1(x1＝t)、2(x1＝i)、3(x1＝i,x2＝y)、4(x1＝r,x2＝n)、5(x1＝r,x2＝l,x3＝s)和6(x1＝v)所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
25.在一些实施方式中，本技术抗体或其抗原结合片段的重链可变区可以包含如seq id nos:7-14中任一项所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
26.在一些实施方式中，本技术抗体或其抗原结合片段的轻链可变区可以包含如seq id nos:15-21中任一项所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
27.在一些实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区可以分别包含如(1)seq id nos:7和15；(2)seq id nos:8和16；(3)seq id nos:9和17；(4)seq id nos:9和18；(5)seq id nos:10和17；(6)seq id nos:10和18；(7)seq id nos:11和19；(8)seq id nos:12和20；(9)seq id nos:13和20；或(10)seq id nos:14和21所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
28.本技术的抗体或其抗原结合片段可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合片段包含具有fcr弱结合的重链恒定区、和/或轻链恒定区。在一些实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合片段包含不结合fcr的重链恒定区、和/或轻链恒定区。弱结合或不结合fcr的重链恒定区可以是人igg1(n297a)、人igg1(l234a l235a)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝n,x4＝p)所示)、人igg1(l234a l235a p329g)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝n,x4＝g)所示)、人igg1(l234a l235a n297a)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝a,x4＝p)所示)、人igg1(l234a l235a n297a p329g)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝a,x4＝g)所示)、人igg2(v234a v237a)、人igg1(l234a v235e)的重链恒定区，或其片段。轻链恒定区可以是κ或λ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区，如seq id nos:23或32所示。
29.在一些实施方式中，本技术的抗体或其结合片段可以是scfv、fab、f(ab')2等片段。
30.本技术还提供含有本技术抗体或其抗原结合片段的双特异性分子，该抗体或其抗原结合片段连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本技术抗体或其结合部分的结合特异性，例如具有疾病相关抗原的结合特异性。
31.在一些实施方式中，该双特异性分子可以靶向cd3ε和疾病相关抗原。在一些实施方式中，疾病相关抗原为肿瘤相关抗原，例如cd20、cd19、cd22、cd4、cd24、cd38、cd123、cd228、cd138、bcma、gpc3、cea、cd276、gp100、5t4、gd2、egfr、muc-1、psma、epcam、mcsp、sm5-1、mica、micb、ulbp、和her-2。在一些实施方式中，疾病相关抗原为感染疾病相关抗原，例如cd4、hbsag、lmp-1和lmp2。在一些实施方式中，疾病相关抗原为炎性疾病相关抗原，例如il17r和cd6。在一个实施方式中，疾病相关抗原为cd20。
32.在一些实施方式中，该双特异性分子可以是两个抗原结合域经接头连接的融合蛋白。在一些实施方式中，该双特异性分子可以例如以scfv-scfv、fab-fab、scfv-fab等形式
存在的双特异性抗体，两个单特异性部分之间直接连接或通过接头等连接。
33.本技术的双特异性分子可以为靶向cd3和cd20的双特异抗体，包含cd3ε抗原结合域、和cd20抗原结合域。
34.该双特异抗体可以包含1个cd3ε抗原结合域、和1-5个cd20抗原结合域。在一个实施方式中，双特异抗体可以包含1个cd3ε抗原结合域、和2个cd20抗原结合域。在一个实施方式中，cd20抗原结合域是特异结合cd20的抗体或其抗原结合片段，如fv和/或scfv。在一个实施方式中，cd3抗原结合域为本技术中的cd3抗体或其抗原结合片段，如fv。包含在双特异抗体中的2个cd20抗原结合域可以结合相同或者不同的抗原表位，具有相同或不同的抗原结合片段的序列，和/或具有相同或不同的抗原结合片段的形式。
35.在一个实施方式中，cd3抗原结合域含有本技术cd3抗体的cdr区、重链可变区和轻链可变区。在一个实施方式中，cd20抗原结合域包含：1)含有seq id no:26的重链可变区、以及2)含有seq id no:27的轻链可变区。
36.本技术的靶向cd3和cd20的双特异抗体可以为igg样抗体。
37.在一个实施方式中，该双特异抗体可以包含：
38.i)第一多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区；
39.ii)第二多肽链，含有特异结合cd20的轻链可变区；
40.iii)第三多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及
41.iv)第四多肽链，含有特异结合cd3ε的轻链可变区，
42.其中第一多肽链中特异结合cd20的重链可变区和第二多肽链中特异结合cd20的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合cd20的重链可变区和特异结合cd20的轻链可变区形成能够特异结合cd20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合cd3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合cd3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd3ε的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。
43.第一多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构的重链恒定区，例如带有t366w突变的人igg1重链恒定区或其片段。第一多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构且弱结合或不结合fcr的重链恒定区，如具有seq id no:34的人igg1重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构的重链恒定区，例如带有t366s/l368a/y407v突变的人igg1重链恒定区或其片段。第三多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构且弱结合或不结合fcr的重链恒定区，如具有seq id no:33的人igg1重链恒定区。
44.或者，第一多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构的重链恒定区，例如带有t366s/l368a/y407v突变的人igg1重链恒定区或其片段。第一多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构且弱结合或不结合fcr的重链恒定区，如具有seq id no:33的人igg1重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构的重链恒定区，例如带有t366w突变的人igg1重链恒定区或其片段。第三多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构且弱结合或不结合fcr的重链恒定区，如具有seq id no:34的人igg1重链恒定区。
45.第三多肽链中特异结合cd20的重链可变区可以经接头与特异结合cd20的抗体轻链可变区连接。在一个实施方式中，接头可以是约5-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式
中，接头可以是约10-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，接头可以是约10-15氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，该接头可以是gs接头，例如包含seq id no:28的氨基酸序列的gs接头。
46.在第三多肽链中，特异结合cd20的轻链可变区或特异结合cd20的重链可变区可以经接头与特异结合cd3ε的重链可变区连接。在一个实施方式中，接头可以是约5-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，接头可以是约10-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，接头可以是约10-15氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，该接头可以是gs接头，例如包含seq id no:28的氨基酸序列的gs接头。
47.在一个实施方式中，第一多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区。第一多肽链的重链恒定区可以为带杵结构的重链恒定区。第三多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；或者特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带臼结构的重链恒定区。
48.在一个实施方式中，第三多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、接头、特异结合cd20的轻链可变区、接头、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区。第三多肽链可以包含seq id nos:29或30所示的氨基酸序列。
49.在另一实施方式中，双特异抗体可以包含：
50.i)第一多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区；
51.ii)第二多肽链，含有特异结合cd20的轻链可变区；
52.iii)第三多肽链，含有特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及
53.iv)第四多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异结合cd3ε的轻链可变区，
54.其中第一多肽链中特异结合cd20的重链可变区和第二多肽链中特异结合cd20的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合cd3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合cd3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd3ε的抗原结合片段，第四多肽链中特异结合cd20的重链可变区和特异结合cd20的轻链可变区形成能够特异结合cd20的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。
55.在一个实施方式中，第一多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区。第三多肽链从n端至c端含有特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区。第四多肽链从n端到c端包含特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异结合cd3ε的轻链可变区；特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd20的重链可变区、和特异结合cd3ε的轻链可变区；特异结合cd3ε的轻链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异结合cd20的重链可变区；或者特异结合cd3ε的轻链可变区、特异结合cd20的重链可变区、和特异结合cd20的轻链可变区。
56.第一多肽链的重链恒定区和第三多肽链的重链恒定区的其中之一可以为带有杵结构的重链恒定区，例如带有t366w突变的人igg1重链恒定区或其片段，如带有杵结构且弱结合或不结合fcr的重链恒定区，如具有seq id no:34的人igg1重链恒定区。第一多肽链的
重链恒定区和第三多肽链的重链恒定区的另一重链恒定区可以为带有臼结构的重链恒定区，例如带有t366s/l368a/y407v突变的人igg1重链恒定区或其片段，如带有臼结构且弱结合或不结合fcr的重链恒定区，如具有seq id no:33的人igg1重链恒定区。
57.第四多肽链中特异结合cd20的重链可变区可以经接头与特异结合cd20的轻链可变区连接。第四多肽链中特异结合cd20的重链可变区或特异结合cd20的抗体轻链可变区可以经接头与特异结合cd3ε的轻链可变区连接在一起。在一个实施方式中，接头可以是约5-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，接头可以是约10-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，接头可以是约10-15氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，该接头可以是gs接头，例如包含seq id no:28的氨基酸序列的gs接头。
58.本技术的双特异抗体可以含有在特异结合cd20的轻链可变区的c端的轻链恒定区、和/或在特异结合cd3ε的轻链可变区的c端的轻链恒定区。在特异结合cd20的轻链可变区的c端的轻链恒定区可以是人λ轻链恒定区，如含有seq id no:31的轻链恒定区。在特异结合cd3ε的轻链可变区的c端的轻链恒定区可以是人λ轻链恒定区，如含有seq id nos:32或23的轻链恒定区。
59.本技术的cd20
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cd3双特异性抗体，相比于现有技术抗体例如cd20-tcb，在具有更高cd3结合活性和相当疾病细胞杀伤力的情况下，引起更低的细胞因子释放。
60.本技术还包括编码本技术抗体或其抗原结合片段、或双特异性分子的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本技术还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备cd3抗体(包括双特异性抗体)的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。
61.本技术还提供药物组合物，其包含本技术的抗体或其抗原结合片段、双特异性分子、表达载体、或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
62.在第二个方面，提供本技术的抗体或其抗原结合片段在制备双特异性分子中的用途，该双特异性分子靶向cd3和疾病相关抗原。
63.在一些实施方式中，疾病相关抗原为肿瘤相关抗原，例如cd20、cd19、cd22、cd4、cd24、cd38、cd123、cd228、cd138、bcma、gpc3、cea、cd276、gp100、5t4、gd2、egfr、muc-1、psma、epcam、mcsp、sm5-1、mica、micb、ulbp、和her-2。在一些实施方式中，疾病相关抗原为感染疾病相关抗原，例如cd4、hbsag、lmp-1和lmp2。在一些实施方式中，疾病相关抗原为炎性疾病相关抗原，例如il17r和cd6。在一个实施方式中，疾病相关抗原为cd20。
64.在一些实施方式中，该双特异性分子可以是两个抗原结合域经接头连接的融合蛋白。在一些实施方式中，该双特异性分子可以例如以scfv-scfv、fab-fab、scfv-fab等形式存在的双特异性抗体。在一些实施方式中，该双特异性分子具有igg样结构。在一个实施方式中，该双特异性分子包含1个cd3ε抗原结合域、和2个cd20抗原结合域。在一个实施方式中，cd20抗原结合域可以为特异结合cd20的抗体或其抗原结合片段如fv和/或scfv。在一个实施方式中，cd3抗原结合域可以为特异结合cd3ε的抗体或其抗原结合片段如fv。
65.相应地，本技术提供制备上述双特异性分子的方法，包括(i)在含有编码上述双特异性分子或其功能基团的核酸分子的宿主细胞中表达该双特异性分子，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离双特异性分子。
66.在第三个方面，本技术提供在受试者中治疗或减缓炎性疾病、自身免疫疾病或移
植物排斥的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术cd3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，炎性疾病为多发性硬化症(ms)、和炎性肠道疾病(ibd)(如克罗恩病)。在一些实施方式中，自身免疫疾病为i型糖尿病。在一些实施方式中，通过经口方式向受试者施用本技术的抗体或其抗原结合片段。
67.在第四个方面，本技术提供使用本技术的cd3双特异性分子在受试者中治疗或减缓相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术的cd3双特异性分子。在一些实施方式中，该相关疾病为肿瘤。在一些实施方式中，该相关疾病为感染性疾病。在一些实施方式中，该相关疾病为炎性疾病或自免疫疾病。
68.在一个实施方式中，本技术提供使用本技术的靶向cd3和cd20的双特异抗体在受试者中治疗或减缓b细胞相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术的双特异抗体。在一些实施方式中，b细胞相关疾病为b细胞淋巴瘤、b细胞白血病、或b细胞介导的自免疫疾病。在一些实施方式中，b细胞淋巴瘤和b细胞白血病包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、和弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。在一个实施方式中，在双特异性分子施用前，向受试者施用cd20抗体。
69.在本技术中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本技术引用文件”)，在本技术引用文件中引用或提及的所有文件，以及本技术或任意本技术引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本技术，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本技术，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何genbank序列通过引用的方式并入本技术。
70.应当注意的是，在本技术中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由
……
组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。
附图说明
71.以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
72.图1示出嵌合cd3抗体cd3-19对人cd3ε(a)和猴cd3ε(b)的结合活性。
73.图2示出嵌合cd3抗体cd3-19对原代分离的人cd3 t细胞的结合活性。
74.图3示出亲和力成熟抗体对人cd3ε(a)和猴cd3ε(b)的结合活性。
75.图4示出亲和力成熟抗体对原代分离的人cd3 t细胞的结合活性。
76.图5示出嵌合cd3抗体cd3-19以及亲和力成熟抗体在经二抗结合而呈交联状态下(a)和未与二抗结合状态下(b)对原代分离人t细胞增殖的作用。
77.图6示出19-26人源化cd3抗体对人cd3ε(a)和猴cd3ε(b)的结合活性，以及19-15人源化cd3抗体对人cd3ε(c)和猴cd3ε(d)的结合活性。
78.图7示出19-26人源化抗体(a)以及19-15人源化抗体(b)对原代分离的人cd3 t细胞的结合活性。
79.图8示出人源化cd3抗体在经二抗结合而呈交联状态下对人原代分离的t细胞的活
化能力，其中交联后的抗体刺激t细胞干扰素γ的分泌(a)，并引起t细胞早期激活标志物cd69的表达(b)。
80.图9示出人源化cd3抗体在未与二抗结合状态下对人原代分离的t细胞的激活能力，其中抗体对t细胞干扰素γ的分泌没有刺激作用(a)，对t细胞早期激活标志物cd69的表达也没有作用(b)。
81.图10示出具有不同突变fc区的人源化cd3抗体对hek293a/人cd16a(a)、hek293a/人cd64(b)、hek293a/人cd32a(c)和hek293a/人cd32b(d)的结合活性。
82.图11示出具有不同突变fc区的人源化cd3抗体对jurkat细胞的结合活性。
83.图12示出具有不同突变fc区的人源化cd3抗体在未与二抗结合状态下对人原代分离pbmc细胞中干扰素γ分泌的刺激(a)，以及对t细胞激活标志物cd25(b)、cd69(c)、cd69和cd25双阳性表达(d)的作用。
84.图13示出具有不同突变fc的人源化cd3抗体在经二抗结合而呈交联状态下对人原代分离pbmc细胞中干扰素γ分泌的刺激(a)，以及对t细胞激活标志物cd25(b)、cd69(c)、cd69和cd25双阳性表达(d)的作用。
85.图14示出cd20
×
cd3双特异性抗体的结构图。
86.图15示出cd20
×
cd3双特异性抗体对人亚基(a)和猴亚基(b)的结合活性。
87.图16示出cd20
×
cd3双特异性抗体对hek293a/人cd20(a)、hek293a/猴cd20(b)、人t细胞系jurkat(c)、以及猴原代分离pbmc细胞(d)的结合活性。
88.图17示出cd20
×
cd3双特异性抗体在未与二抗结合状态下对人原代分离的pbmc细胞中干扰素γ(a)、tnf-α(b)分泌的刺激，以及对t细胞激活标志物cd69(c)、cd25(d)、以及cd69和cd25双阳性(e)表达的作用。
89.图18示出cd20
×
cd3双特异性抗体介导人原代分离pbmc对cd20阳性肿瘤细胞raji细胞的杀伤。
90.图19示出cd20
×
cd3双特异性抗体在介导人原代分离pbmc杀伤cd20阳性肿瘤细胞raji细胞的同时对肿瘤坏死因子α(tnf-α)(a)、干扰素γ(ifn-γ)(b)、以及白介素-2(c)分泌的刺激。
91.图20示出cd20
×
cd3双特异性抗体在介导人原代分离t细胞对cd20阳性肿瘤细胞hek293a/hcd20(a)和cd20阴性细胞hek293a(b)的杀伤效果。
92.图21示出cd20
×
cd3双特异性抗体在介导人原代分离t杀伤cd20阳性肿瘤细胞hek293a/hcd20细胞的同时对扰素γ(ifn-γ)(a)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)(c)分泌的刺激，以及cd20
×
cd3双特异性抗体在介导人原代分离t杀伤cd20阴性hek293a细胞的同时对扰素γ(ifn-γ)(b)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)(d)分泌的刺激。
93.图22示出经过或没有经过1μg/ml mil62预处理和共处理的情况下cd20
×
cd3双特异性抗体对人原代分离的pbmc细胞中白介素2(il-2)(a)、tnf-α(b)分泌的刺激，以及对t细胞激活标志物cd25(c)、cd69(d)、和cd69和cd25双阳性(e)的表达激活。
94.图23示出经过或没有经过1μg/ml mil62共处理的情况下mbs303-1(a)和mbs303-2(b)介导的t细胞对cd20阳性肿瘤细胞hek293a/hcd20的杀伤效果。
95.图24示出cd3
×
cd20双特异性抗体对pbmc人源化小鼠肿瘤的体内抑制效果，具体
示出施用本发明抗体mbs303-2或溶剂3、10、17天后肿瘤细胞总荧光值检测结果(a)，第10天和第17天小鼠活体肿瘤成像图像(b)、以及荷瘤小鼠的生存曲线(c)。
具体实施方式
96.为更好理解本技术，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
97.术语“cd3”是指分化簇3，包含γ链、δ链、ε链和ζ链等。术语“cd3ε”是指cd3的ε链。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人cd3(例如cd3ε)特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的cd3(例如cd3ε)蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人cd3(例如cd3ε)蛋白特异的抗体可以完全地对人cd3(例如cd3ε)蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的cd3(例如cd3ε)蛋白交叉反应。
98.术语“人cd3ε”是指具有人氨基酸序列的cd3ε蛋白，例如具有ncbi参考号为np_000724.1的氨基酸序列的cd3ε蛋白(wipa p et al.,(2020)immunology 159(3):298-308)，或由例如seq id no:24所示cdna所编码的cd3ε蛋白。术语“猴cd3ε”是指具有猴氨基酸序列的cd3ε蛋白，例如具有ncbi参考号为np_001244149.1的氨基酸序列的cd3蛋白(maudhoo md et al.,(2014)gigascience 3:14)。
99.术语“cd20”是指表达在各阶段b细胞(除干细胞和浆细胞外)表面的分子标记物。“人cd20”是指具有人氨基酸序列的cd20蛋白，例如具有seq id no:35所示的氨基酸序列。“猴cd20”是指具有猴氨基酸序列的cd20蛋白，例如具有seq id no:36所示的氨基酸序列。
100.本文中的术语“抗体”意在包括igg、iga、igd、ige和igm全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合片段)。全长抗体是包含至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即c
h1
、c
h2
和c
h3
。各轻链由轻链可变区(简称v
l
)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域c
l
构成。vh和v
l
区还可以划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的骨架区(fr)区分隔开。各vh和v
l
由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)。本技术的抗体恒定区被涉及成具有弱结合或不结合免疫系统细胞和补体系统蛋白。
101.本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，cd3蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由v
l
、vh、c
l
和c
h1
构成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和c
h1
构成的fd片段；(iv)由抗体单臂v
l
和vh构成的fv片段；(v)由vh构成的dab片段(ward et al.,(1989)nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域v
l
和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中v
l
和vh区配对形成单价分子(称为单链fc
(scfv)；参见例如bird et al.,(1988)science 242:423-426；and huston et al.,(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
102.术语“fcr”是指在一些细胞，如b淋巴细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞等表面表达的蛋白，可以被抗体的fc部分其结合，引发对靶细胞的吞噬和毒性等，在免疫系统中发挥重要作用。fcr包括fcα受体、fcε受体、和fcγ受体，其中fcγ受体术语免疫球蛋白超家族，是引发对微生物的吞噬作用的最重要的fcr，包括fcγri(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、和fcγriiia(cd16a)等。
103.本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与cd3蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合cd3蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人cd3蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的cd3蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
104.术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
105.术语“双特异性”或“双特异”分子是指特异性结合两个靶分子、或同一靶分子上两个不同表位的分子。双特异性分子包括本技术中特异结合cd3和一种疾病相关抗原的双特异抗体。相对而言，“单特异性”分子是指特异结合某一个靶分子，尤其是某一个靶分子上一个表位的分子，例如本技术中结合cd3的单克隆抗体。
106.术语“鼠源抗体”是指可变区骨架和cdr区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本技术的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的cdr序列的抗体。
107.术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
108.术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。
109.术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
110.在本文中，“特异结合人cd3”的抗体是指与人cd3(还可能是其他非人物种的cd3)结合但是基本不与非cd3蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人cd3蛋白，即kd值为1.0x10-8 m以下，优选为5.0x 10-9
m以下，更优选为1.0x10-9 m以下。
111.术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的kd为1.0x 10-6
m以上，更优选1.0x 10-5
m以上，更优选1.0x 10-4
m以上、1.0x 10-3
m以上，更优选1.0x 10-2
m以上。
112.术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指对于抗原的kd为1.0x 10-6
m以下，优选5.0x 10-8
m以下，更优选1.0x 10-8
m以下、5.0x 10-9
m以下，更优选1.0x 10-9
m以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，igm亚型的“高亲和性”结合是指kd为10-6
m以
下，优选10-7
m以下，更优选10-8
m以下。
113.术语“ec
50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
114.术语“ic
50”，又称为半抑制浓度，是指对指定的生物过程抑制一半时所需的药物或抑制剂的浓度。
115.本技术中的术语“交联”是指由抗体的fc区结合免疫细胞上的fcr而引起的抗体聚集或相互作用，或者由双特异性抗体上靶向疾病相关抗原的部分结合疾病相关抗原而引起的抗体聚集或相互作用。在体外实验中，可以通过抗体fc结合二抗而形成抗体交联。本技术的cd3抗体或其抗原结合片段仅有在交联状态下才具有t细胞激活活性。相对的，本技术中的术语“游离”是指抗体之间或者抗体与其他分子之间不会产生相互作用而产生二聚化或者多聚化。本技术的cd3抗体或其抗原结合片段在游离状态下不会激活t细胞。
116.术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
117.术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本技术抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
118.本技术的多个方面在以下更加具体地加以描述。
119.本技术的cd3抗体具有对人cd3的结合特异性以及其他有益的功能特征
120.本技术的抗体或其抗原结合片段可以与人和猴cd3特异性结合，且与现有的cd3抗体相比，具有相当或更高的人/猴cd3结合力。
121.本技术的抗体及其抗原结合片段在游离状态下能够结合cd3，但不激活t细胞；在交联状态下，能结合cd3，并激活t细胞。
122.因而，当本技术的抗体及其抗原结合片段制备成弱fcr结合或非fcr结合时，其可以在体内呈游离、或基本游离的状态，用于治疗炎性疾病和自免疫疾病。
123.另一方面，本技术的抗体或其抗原结合片段可以制备为靶向cd3和另一靶点(比如，肿瘤相关抗原或其他疾病如感染疾病或炎性疾病相关抗原)的非fcr结合的双特异抗体，当抗体因cd3外靶点的结合而呈现交联状态时，激活t细胞，通过释放smap等方式杀伤靶细胞。例如，本技术的抗体或其抗原结合片段可以制备为靶向cd3和肿瘤相关抗原的非fcr结合的双特异抗体，该双特异抗体只有在肿瘤处结合肿瘤相关抗原时才呈现交联状态，激活t细胞，达到杀伤肿瘤细胞的效果。更重要的是，与现有cd3抗体相比，交联状态的本技术抗体在引发细胞因子释放方面的活性更低，即，所引发的毒性较低。
124.cd3单克隆抗体
125.本技术的示例性抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。
126.本技术抗体或其抗原结合片段的重链可变区cdr和轻链可变区cdr通过kabat编号系统确定，且cdr区氨基酸序列的seq id no列于表1中。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区cdr可以通过例如chothia、imgt、abm或contact编号系统/方法确定。
127.本技术中示例性抗体或其抗原结合片段的重链/轻链可变区序列的seq id no也列于以下表1中，一些抗体具有相同的vh或v
l
。
128.本技术抗体可以具有重链恒定区，例如可以是弱结合或不结合fcr的重链恒定区，
例如人igg1(n297a)、人igg1(l234a l235a)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝n,x4＝p)所示)、人igg1(l234a l235a p329g)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝n,x4＝g)所示)、人igg1(l234a l235a n297a)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝a,x4＝p)所示)、人igg1(l234a l235a n297a p329g)(如seq id no:22(x1＝a,x2＝a,x3＝a,x4＝g)所示)、人igg2(v234a v237a)、人igg1(l234a v235e)的重链恒定区，或其片段。轻链恒定区可以是κ或λ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区，如具有seq id nos:23或32所示氨基酸序列的人λ轻链恒定区。
129.130.本技术的双特异性分子引发较高的靶细胞特异杀伤、以及较低的t细胞活化和细胞因子释放
131.本技术涉及包含一种或多种本技术抗体或其抗原结合片段与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子相结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
132.在本技术中，除cd3结合特异性外，双特异性分子还特异结合疾病相关抗原。在一些实施方式中，该双特异性分子可以靶向cd3和疾病相关抗原。优选疾病相关抗原在病灶区细胞上独特地表达，或在病灶区细胞上大量表达而在正常细胞上少量表达。
133.在一些实施方式中，疾病相关抗原为肿瘤相关抗原，例如cd20、cd19、cd22、cd4、cd24、cd38、cd123、cd228、cd138、bcma、gpc3、cea、cd276、gp100、5t4、gd2、egfr、muc-1、psma、epcam、mcsp、sm5-1、mica、micb、ulbp、和her-2。
134.在一些实施方式中，疾病相关抗原为感染疾病相关抗原，例如在病原体上的标记蛋白，或在感染细胞表面上的标记蛋白。感染疾病相关抗原为例如cd4、hbsag、lmp-1和lmp2。其中cd4为aids治疗的靶向蛋白。
135.在一些实施方式中，疾病相关抗原为炎性疾病相关抗原，例如在造成炎症的活化免疫细胞上表达的标记蛋白，例如il17r和cd6。
136.双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scfv)构成，称为bs(scfv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的f(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如kufer et al,cited supra；cao and suresh,bioconjugate chemistry,9(6),635-644(1998)；和van spriel et al.,immunology today,21(8),391-397(2000)。
137.cd3双特异分子上将t细胞与靶细胞拉近。多个cd3双特异分子因为结合疾病相关抗原而处于交联状态，从而激活t细胞，杀灭靶细胞。
138.本技术的cd20
×
cd3双特异抗体
139.在一些实施方式中，疾病相关抗原为cd20，其为各发育阶段b细胞(除干细胞和浆细胞外)表面表达的分子标记物，是诊断和/或治疗b细胞淋巴瘤和b细胞白血病的理想靶抗原。
140.该双特异抗体可以包含1个cd3ε抗原结合域、和1-5个cd20抗原结合域。在一个实施方式中，双特异抗体可以包含1个cd3ε抗原结合域、和2个cd20抗原结合域。在一个实施方式中，cd20抗原结合域是特异结合cd20的抗体或其抗原结合片段，如fv和/或scfv。在一个实施方式中，cd3抗原结合域为本技术中的cd3抗体或其抗原结合片段，如fv。包含在双特异抗体中的2个cd20抗原结合域可以相同或者不同，例如结合相同或不同的抗原表位、具有相同或不同的抗原结合片段的序列、和/或相同或不同的抗原结合片段的形式。
141.在一个实施方式中，双特异抗体包含1个特异结合cd3的fv、1个特异结合cd20的fv、和1个特异结合cd20的scfv。在一个实施方式中，特异结合cd20的fv和特异结合cd20的
scfv具有相同的重链可变区和轻链可变区。
142.本技术的cd20
×
cd3双特异抗体可以为igg样抗体。在一个实施方式中，该双特异抗体包含特异结合cd3的igg半抗体、特异结合cd20的igg半抗体、以及与特异结合cd3的igg半抗体的重链可变区或轻链可变区的n端连接的特异结合cd20的scfv。
143.在一个实施方式中，该双特异抗体可以包含：
144.i)第一多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区；
145.ii)第二多肽链，含有特异结合cd20的轻链可变区；
146.iii)第三多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及
147.iv)第四多肽链，含有特异结合cd3ε的轻链可变区，
148.其中第一多肽链中特异结合cd20的重链可变区和第二多肽链中特异结合cd20的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合cd20的重链可变区和特异结合cd20的轻链可变区形成能够特异结合cd20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合cd3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合cd3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd3ε的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。
149.在一个实施方式中，第一多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区。第一多肽链的重链恒定区可以为带杵结构的重链恒定区。第三多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；特异结合cd3ε的重链可变区、重链恒定区、特异结合cd20的重链可变区、和iv)特异结合cd20的轻链可变区；或者特异结合cd3ε的重链可变区、重链恒定区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异结合cd20的重链可变区。第三多肽链的重链恒定区可以为带臼结构的重链恒定区。
150.在另一实施方式中，双特异抗体可以包含：
151.i)第一多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区；
152.ii)第二多肽链，含有特异结合cd20的轻链可变区；
153.iii)第三多肽链，含有特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区；以及
154.iv)第四多肽链，含有特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异结合cd3ε的轻链可变区，
155.其中第一多肽链中特异结合cd20的重链可变区和第二多肽链中特异结合cd20的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd20的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合cd3ε的重链可变区与第四多肽链中特异结合cd3ε的轻链可变区结合形成能够特异地结合cd3ε的抗原结合片段，第四多肽链中特异结合cd20的重链可变区和特异结合cd20的轻链可变区形成能够特异结合cd20的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。
156.在一个实施方式中，第一多肽链从n端至c端含有特异结合cd20的重链可变区、和重链恒定区。第三多肽链从n端至c端含有特异结合cd3ε的重链可变区、和重链恒定区。第四多肽链从n端到c端包含特异结合cd20的重链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异
结合cd3ε的轻链可变区；特异结合cd20的轻链可变区、特异结合cd20的重链可变区、和特异结合cd3ε的轻链可变区；特异结合cd3ε的轻链可变区、特异结合cd20的轻链可变区、和特异结合cd20的重链可变区；或者特异结合cd3ε的轻链可变区、特异结合cd20的重链可变区、和特异结合cd20的轻链可变区。
157.接头
158.在双特异抗体中，特异结合cd20的重链可变区可以经接头与特异结合cd20的轻链可变区连接。特异结合cd20的重链可变区或特异结合cd20的轻链可变区可以经接头与特异结合cd3的抗体或抗原结合片段连接。
159.接头可以由肽键连接的氨基酸构成，优选肽键连接的5-30个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一种或多种可以糖基化，如本领域技术人员所了解的。在一个实施方式中，5-30个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，接头由大部分有空键位阻的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头为多聚甘氨酸，特别是多聚(gly-ala)、以及多聚丙氨酸。本技术中的示例性接头可以如seq id no:28所示。
160.接头也可以是非肽类接头。例如，可以使用烷基接头，例如-nh-、-(ch2)s-c(o)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以经任何非空间位阻基团例如低级烷基(例如c
1-6
低级酰基)、卤素(例如cl、br)、cn、nh2、苯基等进行取代。
161.保守修饰
162.在另一实施方式中，本技术的抗体，包括cd3抗体和cd20
×
cd3双特异抗体，包含与本技术抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，brummell et al.,(1993)biochem 32:1180-8；de wildt et al.,(1997)prot.eng.10:835-41；komissarov et al.,(1997)j.biol.chem.272:26864-26870；hall et al.,(1992)j.immunol.149:1605-12；kelley and o'connell(1993)biochem.32:6862-35；adib-conquy et al.,(1998)int.immunol.10:341-6and beers et al.,(2000)clin.can.res.6:2835-43。
163.本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和pcr介导的突变，将修饰引入本技术抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本技术抗体的cdr区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
164.基因修饰的抗体
165.本技术的抗体，包括cd3抗体和cd20
×
cd3双特异抗体，可以以具备本技术抗体的一个或多个vh/v
l
序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一
个或两个可变区(即，vh和/或v
l
)内(例如，在一个或多个cdr区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，骨架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
166.在某些实施方式中，cdr区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(cdr)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，cdr内的氨基酸残基比起cdr外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为cdr序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的cdr序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(riechmann et al.,(1998)nature 332:323-327；jones et al.,(1986)nature 321:522-525；queen et al.,(1989)proc.natl.acad；u.s.a.86:10029-10033；u.s.pat.nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
167.因此，本技术的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段、和/或双特异抗体，包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本技术序列的cdr1、cdr2和cdr3，轻链可变区包含具有本技术序列的cdr1、cdr2和cdr3。尽管这些抗体包含本技术抗体的vh和v
l
cdr序列，它们可以含有不同的骨架序列。
168.这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开dna数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及kabat et al.,(1991),同上；tomlinson et al.,(1992)j.mol.biol.227:776-798；和cox et al.,(1994)eur.j.immunol.24:827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在genbank数据库中得到。例如，下列hco7 humab小鼠中的重链种系序列的genbank登录号为1-69(ng
‑‑
0010109,nt
‑‑
024637&bc070333)、3-33(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)和3-7(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)。作为另一例子，以下来自hco12 humab小鼠的重链种系序列的genbank登录号为1-69(ng
‑‑
0010109,nt
‑‑
024637&bc070333)、5-51(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、4-34(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、3-30.3(caj556644)和3-23(aj406678)。
169.通过使用本领域公知的称为空格(gap)blast的序列相似性搜索方法之一(altschul et al.,(1997))，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
170.用于本技术抗体的优选骨架序列是结构上与本技术抗体所用的骨架序列相似的那些。v
h cdr1、cdr2、和cdr3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者cdr序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如u.s.pat.nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
171.另一类的可变区修饰是将vh和/或v
l
cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或pcr介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变cdr区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的
残基。
172.本技术的基因改造抗体包括在vh和/或v
l
的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
173.另一类的骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个cdr区的一个或多个残基进行突变，以去除t细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
174.此外，作为骨架或cdr区内修饰之外的另一种选择，本技术的抗体可以基因改造成在fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本技术的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
175.在一个实施方式中，c
h1
的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变c
h1
铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
176.在另一个实施方式中，对抗体的fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入fc铰链片段的c
h2-c
h3
连接区，从而抗体相对于天然fc-铰链结构域spa结合而言，具有减弱的spa结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
177.在另一实施方式中，将重链恒定区的氨基酸残基进行突变以减弱fcr或补体系统蛋白的结合力。氨基酸残基突变可以为例如人igg1(n297a)、人igg1(l234a l235a)、人igg1(l234a l235a p329g)、人igg1(l234a l235a n297a)、人igg1(l234a l235a n297a p329g)、人igg2(v234a v237a)、和人igg1(l234a v235e)。
178.在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
179.此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型glcnac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的adcc活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本技术重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系ms704、ms705和ms709缺少岩藻糖基转移酶基因fut8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，从而在ms704、ms705和ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。ms704、ms705和ms709 fut8-/-细胞系通过在cho/dg44细胞中使用两种替换载体定向破坏fut8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和yamane-ohnuki et al.,(2004)biotechnol bioeng 87:614-22)。作为另一个例子，ep 1,176,195
记载了fut8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1,6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。ep 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体fc区的n-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。wo 03/035835描述了cho变体细胞系，lec13细胞，其具有降低的向asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见shields et al.,(2002)j.biol.chem.277:26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如wo 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。wo 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰葡糖胺转移酶iii(gntiii))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型glcnac结构，其引起抗体增强的adcc活性(umana et al.,(1999)nat.biotech.17:176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-l-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(tarentino et al.,(1975)biochem.14:5516-23)。
180.本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(peg化)。抗体可以peg化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体peg化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(peg)，例如peg的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个peg基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，peg化通过与反应性peg分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的peg，例如单(c
1-c
10
)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要peg化的抗体是去糖基化的抗体。peg化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本技术的抗体。参见，例如epo 154 316和ep 0 401 384。
181.抗体的物理特性
182.本技术的抗体，包括cd3抗体和cd20
×
cd3双特异抗体，可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。
183.例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pk值(marshall et al.,(1972)annu rev biochem 41:673-702；gala and morrison(2004)jimmunol 172:5489-94；wallick et al.,(1988)j exp med 168:1099-109；spiro(2002)glycobiology 12:43r-56r；parekh et al.,(1985)nature 316:452-7；mimura et al.,(2000)mol immunol 37:697-706)。糖基化已知发生在含有n-x-s/t序列的基序中。在一些情况下，优选抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
184.在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在n-g或d-g序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
185.各抗体将具有独特的等电点(pi)，基本落在6-9.5的ph范围内。igg1抗体的pi通常落在7-9.5的ph范围内，而igg4抗体的pi基本落在6-8的ph范围内。推测pi在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选cd3抗体的pi值落在正常范围内。这可以通过选择pi在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
186.编码本技术抗体的核酸分子
187.在另一方面，本技术提供编码本技术cd3抗体或其抗原结合片段的重链/轻链可变区或cdr的核酸分子、以及编码本技术双特异抗体中如cd20重链可变区-接头-cd20轻链可变区-接头-cd3重链可变区、cd20轻链可变区-接头-cd20重链可变区-接头-cd3重链可变区等的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本技术的核酸可以为例如dna或rna，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cdna分子。
188.本技术的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
189.优选的本技术核酸分子包括编码cd3单克隆抗体的vh和v
l
序列或cdr的那些。一旦获得了编码vh和v
l
的dna片段，这些dna片段可以进一步通过标准的重组dna技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操作中，编码vh或v
l
的dna片段与编码另一蛋白的另一dna片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个dna片段连接在一起，从而两个dna片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
190.编码vh区的分离dna可以通过可操作地连接vh编码dna与编码重链恒定区(c
h1
、c
h2
和c
h3
)的另一dna分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是优选为igg1或igg4恒定区。对于fab片段重链基因，编码vh区的dna可以可操作地与仅编码重链c
h1
恒定区的另一dna分子连接。
191.编码v
l
区的分离dna可以通过可操作地连接v
l
编码dna与编码轻链恒定区c
l
的另一dna分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
192.为创建scfv基因，编码vh和v
l
的dna片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(gly4-ser)3的另一片段连接，从而vh和v
l
序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中vh和v
l
区域通过该柔性接头连接(参见，例如bird et al.,(1988)science 242:423-426；huston et al.,(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；mccafferty et al.,(1990)nature 348:552-554)。
193.对于本技术中的双特异抗体，可以先获得编码cd3抗体的cdr、vh和vl、cd20抗体的vh和vl、以及接头等的序列，然后根据所需的双特异抗体的形式来组合这些序列。例如，编码cd20重链可变区、接头、cd20轻链可变区、接头、和cd3重链可变区的序列可以按需可操作地连接在一起。
194.本技术抗体的制备
195.本技术的cd30抗体可以使用kohler and milstein(1975)nature 256:495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括b淋巴细胞的病毒或
致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。本技术的cd30抗体还可以使用例如重组dna技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如morrison,s.(1985)science 229:1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的dna插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
196.本技术的双特异抗体，特别是cd20
×
cd3双特异抗体，的制备可以通过i)将编码双特异抗体的各多肽链的序列插入一个或多个表达载体，其中一个或多个表达载体与转录和翻译调控序列可操作地连接；ii)用表达载体转导或转染宿主细胞，以及iii)表达多肽链以形成本技术的双特异抗体。
197.术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如goeddel(gene expression technology.methods in enzymology 185,academic press,san diego,calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(admlp)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如srα启动子系统，其包含来自sv40早期启动子的序列和人t细胞白血病i型病毒的长末端重复(takebe et al.,(1988)mol.cell.biol.8:466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
198.表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
199.除抗体链基因和调控序列外，本技术的表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如g418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于g418选择)。
200.编码cd3抗体重链和轻链、或双特异抗体不同多肽链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源dna导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本技术抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
201.本技术可用的表达载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、可转化人工染色体(tac)、哺乳动物人工染色体(mac)和人工附加染色体(haec)。
202.优选的用于表达本技术重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括与dhfr可选择标记物一起施用的dhfr-cho细胞，在urlaub and chasin,(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77:4216-4220中有过描述，dhfr可选择标记物在例如r.j.kaufman and p.a.sharp(1982)j.mol.biol.159:601-621中描述)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。特别在使用nso骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是gs基因表达系统，记载于wo 87/04462、wo 89/01036和ep 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
203.药物组合物
204.在另一方面，本技术提供一种药物组合物，其包含本技术的一种或多种抗体或其抗原结合片段、双特异抗体、和/或编码抗体或抗原结合片段的核酸分子，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、抗感染抗体、免疫增强抗体、或自身免疫疾病治疗抗体，或者非抗体类抗肿瘤剂、抗感染剂、免疫增强剂、或自身免疫疾病治疗剂。本技术的药学组合物可以与例如另一抗癌剂、另一抗感染剂、另一免疫增强剂、或另一自身免疫疾病治疗剂联合使用。
205.药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在gennaro,ed.,remington:the science and practice of pharmacy,20th ed.(lippincott williams&wilkins 2003)中有教导。
206.药物组合物适合于经口、静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本技术的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。优选地，本技术的药物组合物经口施用。
207.药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
208.与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。
209.给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用
频率降低。
210.对于本技术cd3抗体的施用，可以部分地参照okt3的fda批准剂量，但最终由医学工作者，如医生，根据受试者的具体情况，如性别、年龄、既往病史等进行确定。对于本技术cd20
×
cd3双特异抗体的施用，具体可以由医学工作者，如医生，根据受试者的具体情况，如性别、年龄、既往病史等进行确定。
[0211]“治疗有效量”的本技术cd3抗体、cd20
×
cd3双特异抗体，或引起疾病症状严重程度的降低、或无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于肿瘤患者，“治疗有效量”优选地，与对照受试者相比，将肿瘤减少至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，且更优选地至少约80％，甚至完全消除肿瘤。对于接受移植物的受试者，“治疗有效量”优选地，与对照受试者相比，将移植物排斥减少至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，且更优选地至少约80％，甚至完全消除对移植物的排斥。对于炎性疾病或自免疫疾病的受试者而言，“治疗有效量”优选地，与对照相比，将不适当的炎症减少至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，且更优选地至少约80％，甚至引起自身免疫疾病的彻底消失。
[0212]
药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，sustained and controlled release drug delivery systems,j.r.robinson,ed.,marcel dekker,inc.,new york,1978。
[0213]
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
[0214]
在某些实施方式中，本技术的抗体以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本技术的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29:685；umezawa et al.,(1988)biochem.biophys.res.commun.153:1038；bloeman et al.,(1995)febs lett.357:140；m.owais et al.,(1995)antimicrob.agents chemother.39:180；briscoe et al.,(1995)am.j.physiol.1233:134；schreier et al.,(1994)j.biol.chem.269:9090；keinanen and laukkanen(1994)febs lett.346:123；和killion and fidler(1994)immunomethods 4:273。
[0215]
本技术的用途和方法
[0216]
本技术的药物组合物具有多种体外和外内应用，例如可以用于炎性疾病、自免疫疾病和移植物排斥的治疗和缓解。
[0217]
在一个方面，本技术的与cd3抗体相关的药物组合物可以用于炎性疾病、自免疫疾病和移植物排斥的治疗和缓解中，其中药物组合物中包含治疗有效量的本技术cd3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合片段具有弱结合或不结合fcr的重链恒定区。在一些实施方式中，炎性疾病为多发性硬化症(ms)、和炎性肠道疾病(ibd)(如克罗恩病)。在一些实施方式中，自身免疫疾病为i型糖尿病。
[0218]
在另一方面，本技术的与双特异抗体相关的药物组合物可以用于治疗相关疾病，该药物组合物中包含治疗有效量的本技术双特异性分子，靶向cd3和疾病相关抗原，不具有fc区，或者具有fc区但弱结合或不结合fcr。根据疾病相关抗原的不同，该药物组合物可以治疗各种肿瘤，比如肠腺癌、乳腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤和胃癌，原发或转移的；感染性疾病，如aids；以及各种炎性疾病或自免疫疾病。
[0219]
在一个实施方式中，本技术的药物组合物包含cd20
×
cd3双特异抗体、和/或编码该双特异抗体的核酸分子。该药物组合物可以用于在受试者中治疗或减缓b细胞相关疾病，包括向受试者施用治疗有效量的本技术的双特异抗体。在一些实施方式中，b细胞相关疾病为b细胞淋巴瘤、b细胞白血病、或b细胞介导的自免疫疾病。在一些实施方式中，b细胞淋巴瘤和b细胞白血病包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、和弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。
[0220]
本技术提供本技术药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效治疗或减缓相关疾病。在一个实施方式中，在施用含有cd20
×
cd3双特异抗体、和/或编码该双特异抗体的核酸分子的药物组合物前，可以对有需要的受试者施用cd20抗体。在一个实施方式中，在施用含有cd20
×
cd3双特异抗体、和/或编码该双特异抗体的核酸分子的药物组合物前，以及在施用含有cd20
×
cd3双特异抗体、和/或编码该双特异抗体的核酸分子的药物组合物时，对有需要的受试者施用cd20抗体。cd20抗体可以率先杀伤cd20 b肿瘤细胞，以减少后期cd20
×
cd3双特异抗体的施用，进一步解决双特异抗体引发的毒副作用。
[0221]
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
[0222]
此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
[0223]
本技术的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。在本文中描述的所有文献通过引用的方式全部并入本文。尽管本技术已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本技术时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本技术的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本技术的宗旨和范围。
[0224]
实施例
[0225]
实施例1.cd3单克隆抗体的生成和筛选
[0226]
合成编码人cd3ε蛋白(ncbi参考序列：np_000724.1)的cdna(seq id no：24)，并通过ecori和bamhi酶切位点克隆到pcdna3.1载体中，构建hcd3ε-pcdna3.1。按照上述方法，构建表达载体hcd3δ-pcdna3.1，hcd3δ蛋白(ncbi参考序列：np_000723.1)的cdna如seq id no：25所示。对于每种表达载体的大规模制备，使用endofree plasmid giga试剂盒(qiagenn.v.)并按照厂家提供的使用方法进行质粒大提。
[0227]
用上述质粒免疫6周龄balb/c小鼠。首先，在每只小鼠的两只后部大腿处进行透明质酸酶处理。然后，在这些部位处肌内注射(25μl，1mg/ml)hcd3ε-pcdna3.1和(25μl，1mg/ml)hcd3δ-pcdna3.1表达载体。随后，使用ecm830(btx)和双针电极在这些部位进行体内电
穿孔。与上述相同的注射和体内电穿孔大约每三周重复一次，共进行4次免疫。待最后一次免疫后第4天，从小鼠中收获淋巴结或脾脏并且用于噬菌体库构建。
[0228]
为构建scfv噬菌体展示库，小鼠的脾脏总rna用trizol试剂盒(invitrogen)提取，并使用反转录试剂盒(invitrogen公司)按照厂商提供的使用方法合成cdna。使用上述cdna为模板，通过pcr进行基因扩增，scfv噬菌体库通过专用噬菌粒ptgs进行构建。简单而言，轻链可变区通过pcr扩增，用qiagen pcr/纯化试剂盒纯化，用限制性内切酶nhei和noti(neb)切割，并于16℃连入噬菌粒ptgs的(用相同限制性内切酶消化并用琼脂糖凝胶纯化的)nhei/noti限制性位点。在连接后，沉淀、洗涤重组dna，并将其溶解于蒸馏水。重组dna之后经电穿孔转化到大肠杆菌tg1细胞中。之后，细胞混悬在10ml soc培养基中，37℃轻摇培养1小时。细胞培养物在2yt琼脂/氨苄上铺板，数出氨苄抗性菌落的数量。对于重链可变片段的克隆，将pcr产物用ncoi和xhoi酶切，并连入轻链可变区库，并转化到大肠杆菌tg1中。从平板中刮出转化的大肠杆菌细胞，并接种到2ytag液体培养基中。将约10
12
pfu(噬菌斑形成蛋白)的辅助噬菌体加入含有scfv基因库的tg1样本中，并在震摇中于37℃孵育1小时。加入70μg/ml的卡那霉素，且培养物于30℃震摇过夜。细胞于4℃以4000rpm离心15分钟，所得的上清液与5ml 20％peg 8000/2.5m nacl混合，并在冰上孵育30分钟。之后噬菌体于4℃以8000rpm离心20分钟进行沉淀。噬菌体混悬于1.5ml含1％bsa的pbs，于涡旋混合器上震动，并以13000rpm离心5分钟，得到成团的碎片。上清液于4℃保存，或直接用于以下的生物筛选。
[0229]
为筛选同时识别人和猴cd3的抗体，使用人cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:10977-h08s)和猴cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:90047-c08h)进行双向生物筛选。简单而言，首先通过磁珠偶联的人cd3ε-his蛋白进行生物筛选。偶联了人cd3ε-his蛋白的珠子和噬菌体混合物在摇床上室温孵育2小时。未结合的噬菌体用pbs缓冲液洗掉，然后加入0.1m甘氨酸-hcl(ph 2.2)用于洗脱抗原结合的噬菌体。洗脱的噬菌体使用1.5m tris-hc1(ph 8.8)中和至ph 7.0。上述中和的噬菌体用于侵染10ml的大肠杆菌tg1细胞，然后在37℃培养直至od450达到0.6。细菌培养物通过离心成团，将团状物重新混悬在培养基中，并包被于2ytag板，用于下一步结合猴cd3蛋白的生物筛选。下一步筛选是选用偶联猴cd3ε-his蛋白的珠子和上述经过人cd3结合筛选过的阳性噬菌体混合物在摇床上室温孵育2小时。未结合的噬菌体用pbs缓冲液洗掉，然后加入0.1m甘氨酸-hcl(ph 2.2)用于洗脱抗原结合的噬菌体。洗脱的噬菌体使用1.5m tris-hc1(ph 8.8)中和至ph 7.0。上述中和的噬菌体用于侵染10ml的大肠杆菌tg1细胞，然后在37℃培养直至od450达到0.6。细菌培养物通过离心成团，将团状物重新混悬在培养基中，并包被于2ytag板。总共进行三轮这样的富集和筛选。
[0230]
在3轮生物筛选后，选出高结合力克隆，收集并侵染细菌细胞。挑取细菌菌落并在96孔板上生长，然后使用elisa来识别与人cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:10977-h08s)和猴cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:90047-c08h)均有高结合力的强阳性克隆，并进行dna测序。从人和猴cd3交叉且高结合克隆中鉴定出1个有效的scfv序列cd3-19，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列id示于表1。
[0231]
实施例2.全长cd3抗体的表达和纯化
[0232]
将上述筛选出的cd3-19 scfv抗体以全长单克隆抗体的形式表达在hek293f细胞(cobioer,中国)中，进行进一步表征研究。简单而言，将重链/轻链可变区分别加上人igg1/
λ恒定区(分别示于seq id nos.:22(x1＝l,x2＝l,x3＝n,x4＝p)和23)克隆到pcdna3.1(invitrogen，carlsbad，usa)的ecori/bamhi限制性内切酶位点中，构建表达载体。
[0233]
根据生产商的说明，使用pei转染，在hek-293f细胞中瞬时表达嵌合cd3抗体。简单而言，使用聚乙烯亚胺(pei)，用所得的载体转染hek293f细胞，dna：pei比为1:3。用于转染的总dna为1.5μg/ml。转染的hek293f细胞在37℃、5％co2的培养箱中以120rpm转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，用0.22μm胶囊过滤除去细胞残骸，以纯化抗体。之后，抗体使用预平衡的protein-a(ge；usa；cat#：17040501；lot#：10252250)进行纯化，并用洗脱缓冲液(20mm柠檬酸,ph3.0-ph3.5)洗脱。在缓冲液交换外，抗体保存在pbs缓冲液中(ph 7.0)，其浓度通过nanodrop仪确定。纯化的单克隆抗体进行进一步表征。
[0234]
实施例3.嵌合cd3抗体的结合力检测
[0235]
纯化的嵌合cd3-19抗体首先通过elisa检测来确定其与重组人或猴cd3ε蛋白的结合力。
[0236]
elisa板用100μl 500ng/ml人cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:10977-h08s)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(pbs 1％bsa 1％山羊血清 0.05％吐温20)室温封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的cd3抗体(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。elisa板用pbst(pbs 0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗人igg-hrp二抗(sigma，美国，cat#:a0170-1ml)，室温孵育1小时。elisa板用新鲜配制的ultra-tmb(bd，美国，cat#no.:555214)室温显色5分钟。之后用spectramaxr i3x(molecular devies，美国)在450nm读值。
[0237]
嵌合cd3-19抗体对猴的cd3ε物种交叉反应性通过直接elisa进行测试。具体地，将100μl 500ng/ml猴cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:90047-c08h)包被在96孔elisa板中，4℃过夜。各孔用200μl封闭液(pbs 1％bsa 1％山羊血清 0.05％吐温20)，室温封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的cd3抗体(最高浓度40μg/ml)共同孵育1小时。之后加入hrp-山羊抗人igg二抗(sigma，美国，cat#:a0170-1ml)，室温孵育1小时。elisa板用新鲜配制的ultra-tmb(bd，美国，cat#no.:555214)室温显色5分钟。之后用spectramaxr i3x(molecular devies，美国)在450nm读值。hel抗体(cat#:lt12031，lifetein，美国)用作阴性对照。结果显示在图1中。
[0238]
为进一步确定嵌合cd3-19抗体是否与人t细胞表面的tcr/cd3复合体结合，使用从人体分离的cd4 t细胞进行facs细胞结合检测。简单而言，通过梯度密度离心收集健康人供体血样中的pbmc，重悬于rpmi1640培养基中。使用invitrogen dynabeads不接触人cd4 t细胞分离试剂盒(cat#:11346d，thermal fisher scientific，美国)从pbmc中分离出cd4 t细胞，将105个t细胞在96孔板上铺板，并加入100μl梯度稀释的cd3-19抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用pbst清洗3遍。之后，加入500倍稀释的pe-山羊抗人igg(thermo，美国，cat#:pa1-86078)。4℃孵育1小时后，96孔板用pbs清洗3遍，然后使用facs检测仪(bd)检测细胞荧光。hel抗体(cat#:lt12031，lifetein，美国)用作阴性对照。结果显示在图2中。
[0239]
如图1所示，cd3-19嵌合抗体能够特异性结合人以及猴的cd3ε亚基。
[0240]
同时，如图2所示，cd3-19抗体能够高效特异地结合人cd4 t细胞。
[0241]
实施例4.通过噬菌体筛选的方式进行cd3-19抗体的亲和力成熟
[0242]
为进一步改善结合亲和力，通过噬菌体展示技术对cd3-19进行亲和力成熟改造。简单而言，进行3d结构建模模拟来识别cd3-19重链和轻链cdr中可能对结合亲和力重要的
氨基酸残基。识别出的cdr残基通过pcr进行突变，使用针对点突变特别设计的引物和标准方法步骤构建出噬菌体展示库。通过珠子偶联的人cd3ε-his蛋白进行生物筛选。具体筛选步骤与实施例1中完全一致。
[0243]
在3轮生物筛选后，选出高结合力克隆，收集并侵染细菌细胞。挑取细菌菌落并在96孔板上生长，然后使用elisa来识别高结合力克隆，并进行测序。识别出重链和轻链cdr中的有益突变，综合所有的有益突变信息构建新的噬菌体展示库，再进行3轮生物筛选和富集，经过单克隆elisa验证后对高结合的克隆及进行测序。
[0244]
识别出3种与母克隆cd3-19相比呈现更高结合力的scfv抗体，即19-15、19-26和19-37，其可变区的氨基酸序列id示于表1。
[0245]
实施例5.亲和力成熟抗体的表达、纯化和结合力表征
[0246]
将上述筛选出的三种scfv抗体，以全长igg1/λ抗体的形式在hek293f细胞中进行表达，igg1/λ恒定区序列分别如seq id nos.:22(x1＝l、x2＝l、x3＝n、x4＝p)和23所示。表达纯化步骤按照实施例2进行。
[0247]
cd3-19、19-15、19-26和19-37与人cd3ε-his以及猴cd3ε-his的结合力按照实施例3通过elisa检测。结果显示在图3中。抗体对人原代分离t细胞表面的人tcr/cd3复合体的结合力按照实施例3中facs的方法进行检测。结果显示在图4中。
[0248]
如图3所示，所有亲和力成熟抗体与人和猴的cd3结合力均强于其母本cd3-19。
[0249]
此外，如图4所示，细胞水平的实验也证实了亲和力成熟抗体19-15、19-26和19-37与人原代分离的人t细胞的结合力较母本更强。
[0250]
实施例6.通过spr检测cd3抗体的结合亲和力
[0251]
通过biacore
tm 8k(ge life sciences，美国)来定量测定嵌合cd3抗体对人和猴cd3ε的结合亲和力。
[0252]
具体地，将100-200ru(反应单位)的人cd3ε-his蛋白(义翘神州，中国，cat#:10977-h08s)或猴cd3ε-his蛋白(cat#:90047-c08h，义翘神州，中国)耦联到cm5生物芯片(cat#:br-1005-30,ge life sciences，美国)上，随后用1m氨基乙醇封闭芯片未反应基团。梯度稀释(浓度从0.3μm到10μm)的抗体注入到spr反应液(hbs-epbuffer,ph7.4,cat#:br-1006-69,ge life sciences，美国)中，速度控制在30μl/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的ru。结合速率(ka)和解离速率(kd)使用bia评估软件中的1:1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数kd通过kd/ka计算得到。macrogenics公司的mab2抗体作为阳性对照抗体，根据专利申请公开cn107827985a中的可变区序列加上人igg1/λ恒定区(seq id nos.:22(x1＝l、x2＝l、x3＝n、x4＝p)和23)制备而成。
[0253]
根据spr确定的抗体结合解离曲线，总结出cd3抗体与人以及猴cd3ε亚基的结合亲和力数据，分别示于表2和表3。
[0254]
从表2和表3可知，亲和力成熟抗体的结合亲和力高于其母本抗体，且本技术的抗体与阳性对照mab2相比，显示出相当或者更强的人/猴cd3ε结合活性。其中，抗体19-37的结合亲和性表现为最佳。
[0255]
表2.cd3抗体对人cd3ε的结合亲和力
[0256][0257]
表3.cd3抗体对猴cd3ε的结合亲和力
[0258] mab2cd3-1919-1519-2619-37ka7.67e 051.08e 053.16e 052.69e 051.23e 06kd9.80e-053.76e-057.32e-056.38e-054.68e-06kd1.28e-103.47e-102.32e-102.37e-103.79e-12
[0259]
实施例7.嵌合cd3抗体对t细胞活性的调控
[0260]
为进一步确定本技术嵌合cd3抗体在交联状态下对cd3/tcr信号通路的激动性，进行人原代t细胞激活检测。简单而言，将96孔细胞培养板通过100μl 5μg/ml的fab
‘2山羊抗人fc的二抗(invitrogen，美国，cat#:31163)4度包被过夜。pbs洗2遍后加入100μl不同浓度的cd3抗体，37度孵育2小时。同时通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，cd4 t细胞通过invitrogen dynabeads untouched人cd4

t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。cd4

t细胞用完全rpmi培养基重悬，调整细胞密度为1.0
×
106/ml，细胞用2.5μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse,cat#:c34554i，invitrogen,美国)进行标记，37℃孵育10分钟。标记后，将细胞重悬于rpmi完全培养基(rpmi 10％fbs)中，并将细胞密度调整成2.5
×
105活细胞/ml。将200μl上述t细胞悬液加入包被好cd3抗体的细胞培养板中，37℃、5％co2孵育72小时后，通过facs检测其csfe信号，确定其细胞增殖情况。macrogenics公司的mab2抗体用作阳性对照。结果显示在图5(a)中。
[0261]
此外，还确定了嵌合cd3抗体在游离状态下对t细胞的激活功能。简单而言，通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，cd4

t细胞通过invitrogen dynabeads untouched人cd4

t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。cd4

t细胞用完全rpmi培养基重悬，调整细胞密度为1.0
×
106/ml,细胞用2.5μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse,cat#:c34554i，invitrogen,美国)进行标记，37℃孵育10分钟。标记后，将细胞重悬于rpmi完全培养基(rpmi 10％fbs)中，并将细胞密度调整成5
×
105活细胞/ml。将100μl上述t细胞悬液加入96孔细胞培养板，并加入100μl不同浓度cd3抗体，37℃，5％co2孵育72小时后，通过facs检测其csfe信号，确定其细胞增殖情况。macrogenics公司的mab2抗体用作阳性对照。结果显示在图5(b)中。
[0262]
如图5(a)所示，经与包被于板上的二抗结合而呈交联状态的cd3抗体均能够激活t细胞的增殖，并以剂量依赖的方式增加t细胞的增殖，亲和力成熟抗体更是表现出高于母本的t细胞增殖促进作用。但是，本技术cd3抗体对于t细胞的激活作用均低于阳性对照抗体mab2，表明在与阳性抗体具备相当或者更高的结合活性/亲和力情况下，更少地激活cd3信号通路。换言之，本技术的cd3抗体在与cd3阳性t细胞高结合力的前提下，不会过度激活cd3
信号通路，减少t细胞激活引起的过度细胞因子释放等潜在毒性。
[0263]
此外，如图5(b)显示，在游离状态下，所有cd3抗体均对t细胞的增殖没有任何作用。
[0264]
实施例8.cd3抗体的人源化改造
[0265]
基于上述功能试验，选择19-15和19-26抗体进行人源化改造和进一步研究。人源化改造通过互补决定区(cdr)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。
[0266]
为选出抗体19-15的人源化受体框架，将19-15的轻链和重链可变区序列与ncbi网站的人免疫球蛋白基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与19-15同源度最高的人种系igvh和igvλ作为人源化改造的框架。所选择的轻链种系受体序列是人iglv7-43*01，所选择的重链种系受体序列是人ighv3-23*05.
[0267]
为选出抗体19-26的人源化受体框架，将19-26的轻链和重链可变区序列与ncbi网站的人免疫球蛋白基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与19-26同源度最高的人种系igvh和igvλ作为人源化改造的框架。所选择的轻链种系受体序列是人iglv7-43*01，所选择的重链种系受体序列是人ighv3-23*05.
[0268]
对19-15和19-26抗体的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持cdr环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。简单来说，所选结构模板分别与19-15和19-26具有相同类型的l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3、h-cdr1、h-cdr2、和h-cdr3环状结构。利用所选择的结构模板，通过用人种系重链和轻链框架序列代替小鼠框架而构建人源化19-15和19-26的结构模型。随后进行三维结构建模，以鉴定出可能对维持cdr环状结构或重链和轻链连接起重要作用的关键框架氨基酸残基。当鼠源抗体框架与人种系受体框架在某一位点上拥有相同的氨基酸残基时，保留人种系氨基酸残基。另一方面，当鼠源框架与人种系受体框架在某一位点上拥有不同的氨基酸残基时，通过结构模拟来评价该残基的重要性。如果发现人种系受体框架内的某一氨基酸残基与cdr区残基相互作用并对cdr残基产生影响，那么该残基就会回复突变为鼠源残基。
[0269]
表4.抗体结构模拟模板
[0270][0271]
在上述结构建模的基础上，19-15重链鉴定出5个潜在的回复突变(s49a、a99v、n76d、v95m、和k100r)，轻链鉴定出7个潜在的回复突变(f38v、y51g、t2a、q44h、p46f、a48g、和t60v)。19-26重链鉴定出5个潜在的回复突变(s49a、a99v、n76d、v95m、和k100r)，轻链鉴定出7个潜在的回复突变(f38v、y51g、t2a、q44h、p46f、a48g、和t60v)。
[0272]
随后，如表1所示，针对19-15，设计出两个人源化重链可变区和两个人源化轻链可变区，得到4个示例性人源化抗体；针对19-26，设计出两个人源化重链可变区和一个人源化轻链可变区，得到2个示例性人源化抗体。
dynabeads untouched人cd4 t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。将细胞密度调整成2.5
×
105活细胞/ml。将200μl上述t细胞悬液加入包被好cd3抗体的细胞培养板中，37℃、5％co2孵育24小时后，吸取50μl细胞培养基上清用于ifn-γ分泌量检测。使用制造商的方法步骤，经elisa(cat#:sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度。细胞继续培养48小时后，收集细胞，经过pbs洗3次，加入2μl pe鼠抗人cd69抗体(bd，美国，cat#:555531)以及2μl fitc鼠抗人cd4抗体(bd，美国，cat#:561842)，常温孵育30分钟后，离心，pbs洗3次。通过流式检测cd4 t细胞中cd69 t细胞的比例，来确定交联的人源化cd3抗体对t细胞激活的作用。macrogenics公司的mab2抗体用作阳性对照。结果显示在图8中。
[0287]
进一步确定人源化cd3抗体在游离状态下对t细胞的激活功能。简单而言，通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，cd4 t细胞通过invitrogen dynabeads untouched人cd4 t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。cd4 t细胞用完全rpmi培养基重悬，调整细胞密度为5
×
105/ml。将100μl上述t细胞悬液加入细胞培养板中，同时加入100μl不同浓度的cd3抗体，实验设置三个重复。37℃、5％co2孵育24小时后，吸取50μl细胞培养基上清用于ifn-γ分泌量检测。使用制造商的方法步骤，经elisa(cat#:sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度。细胞继续培养48小时后，收集细胞，经过pbs洗3次，加入2μl pe鼠抗人cd69抗体(bd，美国，cat#:555531)以及2μlfitc鼠抗人cd4抗体(bd，美国，cat#:561842)，常温孵育30分钟后，离心，pbs洗3次。通过流式检测cd4 t细胞中cd69 的t细胞的比例，来确定游离cd3人源化抗体对t细胞激活的作用。macrogenics公司的mab2抗体用作阳性对照。结果显示在图9中。
[0288]
图8示出，交联状态下的所有人源化cd3抗体均能激活t细胞，促进干扰素γ的分泌，并上调cd69在t细胞表面的表达。而图9显示，在游离状态下，所有的cd3抗体均对t细胞的活性没有任何作用，既不能影响干扰素γ的分泌，也不能改变cd69在t细胞表面的表达。以上结果表明，所有人源化抗体对t细胞的激活都依赖于cd3抗体的交联，且筛选得到的所有人源化cd3抗体所引起的t细胞激活和细胞因子释放均显著低于阳性对照。
[0289]
实施例11.稳转细胞系构建
[0290]
使用hek293a细胞来构建稳定过表达人或猴cd20的细胞系，以及稳定过表达人cd16a、人cd32a、人cd32b或人cd64的细胞系。简单而言，合成编码人cd20、猴cd20、人cd16a、人cd32a、人cd32b、和人cd64(分别如seq id nos:35、36、37、38、39和40所示)的序列，并经酶切克隆到plv-egfp(2a)-puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)的ecori/bamhi位点之间。将得到的表达载体质粒与pspax和pmd2.g质粒通过脂质体转染的方式转染到hek293t细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与lipofectamine 3000试剂盒(thermo fisher scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从hek293t细胞的细胞培养基(dmem培养基(cat#：sh30022.01,gibco美国)，补充有10％fbs(cat#：fnd500,excell，中国))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染hek293a细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人cd20、猴cd20、人cd16a、人cd32a、人cd32b、或人cd64的hek293a细胞(分别称为hek293a/人cd20、hek293a/猴cd20、hek293a/人cd16a、hek293a/人cd32a、hek293a/人cd32b、和hek293a/人cd64)。转染的hek293a细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素
(cat#：a11138-03,gibco)的dmem 10％fbs培养基中7天。这些细胞表达人或猴cd20、人cd16a、人cd32a、人cd32b、人cd64的情况通过商品化抗体经过流式分析仪经facs分析确证，用到的商品化抗体分别为：人和猴cd20商品化抗体(pe抗人cd20抗体，cat#：e-ab-f1045d，伊莱瑞特，中国)、人cd16a抗体(pe抗人cd16抗体，cat#：e-ab-f1005d，伊莱瑞特，中国)、人cd32a抗体(鼠抗-cd32b cd32a抗体(pe)，cat#：ab30357，abcam，美国)、人cd32b抗体(鼠抗-cd32b cd32a抗体(pe)，cat#：ab30357，abcam，美国)、人cd64抗体(pe抗-cd64抗体，cat#：ab192338，abcam，美国)。
[0291]
实施例12.cd3抗体的fc区功能改造
[0292]
为降低cd3抗体由于fc恒定区与fcr相互作用造成的cd3信号激活和t细胞活化，对fc区进行改造，降低其与各亚型fcr的结合力。
[0293]
取cd3抗体15h3l3，使其采用野生型重链igg1恒定区(seq id no:22，x1＝l、x2＝l、x3＝n、x4＝p)、l234a/l235a突变的igg1恒定区(seq id no:22，x1＝a、x2＝a、x3＝n、x4＝p)、l234a/l235a/p329g突变的igg1恒定区(seq id no:22，x1＝a、x2＝a、x3＝n、x4＝g)、l234a/l235a/n297a突变的igg1恒定区(seq id no:22，x1＝a、x2＝a、x3＝a、x4＝p)、或l234a/l235a/n297a/p329g突变的igg1恒定区(seq id no:22，x1＝a、x2＝a、x3＝a、x4＝g)，以及seq id:32所示的人λ轻链恒定区，得到的全长抗体分为称为15h3l3-wt、15h3l3-ll、15h3l3-llp、15h3l3-lln、和15h3l3-llnp。
[0294]
通过将编码可变区和恒定区的序列插入到pcdna3.1(invitrogen，美国)的限制性酶切位点xhoi/bamhi之间来构建表达载体。将上述获得的表达载体通过pei转染hek-293f细胞(cobioer,中国)。具体而言，hek-293f细胞在free styletm 293表达培养基(cat#:12338-018，gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(pei)转染的方式将各表达载体转染至细胞，dna与pei的比例是1:3，每毫升细胞培养液中加入dna的量是1.5μg。转染后的hek-293f细胞在37℃、5％co2的培养箱中以120rpm转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-a亲和柱(cat#:17040501，ge，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mm柠檬酸，ph3.0-ph3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在pbs(ph 7.0)中，并通过nanodrop检测抗体浓度。
[0295]
纯化的单克隆抗体与cd16a、cd32a、cd32b、或cd64蛋白的结合亲和力分别使用实施例11构建的稳定过表达人cd16a、cd32a、cd32b、或cd64的hek293a细胞进行facs细胞结合实验进行检测。简单而言，将在50μl培养液中的105个hek293a细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的各15h3l3抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用pbst清洗3遍。之后，加入500倍稀释的pe-f(ab’)2抗-higg fc(cat#:h10104，life technologies，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用pbs清洗3遍，然后使用facs检测仪(bd)检测细胞荧光。结果示于图10。
[0296]
纯化的单克隆抗体与cd3复合体的结合力使用jurkat细胞(cat#：cbp60520，南京科佰，中国)经facs细胞结合实验进行检测。简单而言，将在50μl培养液中的105个jurkat细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的各15h3l3抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用pbst清洗3遍。之后，加入500倍稀释的pe-山羊抗人igg(thermo，美国，cat#:pa1-86078)。4℃孵育1小时后，96孔板用pbs清洗3遍，然后使用facs检测仪(bd)检测细胞荧光。结果示于图11。
[0297]
游离的15h3l3抗体对pbmc混合细胞中t细胞的活化通过细胞因子释放和t细胞活
化标志物的表达进行检测。通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，pbmc细胞用完全rpmi培养基(rpmi1640 10％fbs)重悬，调整细胞密度为2.5
×
105/ml,将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板(200μl/孔)，并加入50μl不同浓度的待评测的15h3l3抗体，37℃、5％co2孵育48小时后，收集上清，按照制造商的方法步骤，经elisa(cat#:sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度。收集pbmc细胞，经过pbs洗3次，加入2μl pe-鼠抗人cd69抗体(bd，美国，cat#:555531)、2μl bv605鼠抗人cd25抗体(bd，美国，cat#:562660)、以及2μl fitc鼠抗人cd4抗体(bd，美国，cat#:561842)，常温孵育30分钟后，离心，pbs洗3次，通过流式检测cd4阳性t细胞中cd69阳性t细胞、cd25阳性t细胞、以及cd69和cd25双阳性t细胞的比例。结果示于图12。
[0298]
交联后的15h3l3抗体对cd4阳性t细胞的活化也通过细胞因子释放和t细胞活性标志物的表达进行检测。简单而言，将96孔细胞培养板用100μl 5μg/ml的fab
‘
2抗人fc的二抗(invitrogen，美国，cat#:31163)4℃包被过夜，pbs洗2遍后加入100μl不同浓度的15h3l3抗体，37℃包被2个小时，实验设置三个重复。同时通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，cd4阳性t细胞通过invitrogen dynabeads untouched人cd4 t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。将细胞用完全rpmi培养基(rpmi1640 10％fbs)重悬，密度调整成2.5
×
105活细胞/ml。将上述t细胞悬液加入包被好cd3抗体的细胞培养板中(200μl/孔)，37℃、5％co2孵育48小时后，吸取50μl细胞培养基上清，按照制造商的方法步骤，经elisa(cat#:sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度。收集细胞，经过pbs洗3次，加入2μl pe鼠抗人cd69抗体(bd，美国，cat#:555531)、2μl bv605鼠抗人cd25抗体(bd，美国，cat#:562660)、和2μl fitc鼠抗人cd4抗体(bd，美国，cat#:561842)，常温孵育30分钟后，离心，pbs洗3次。通过流式检测cd4阳性t细胞中cd69阳性t细胞、cd25阳性t细胞、以及cd69和cd25双阳性t细胞的比例。结果示于图13。
[0299]
如图10所示，所有具有fc突变体的抗体，与具有野生型fc的抗体相比，与四种fcr的结合力都显著降低。其中，15h3l3-llpn和15h3l3-lln与cd16a、cd32a、cd32b以及cd64的结合力基本检测不到，而15h3l3-llp与cd32a和cd32b还是保持有微弱的结合力，15h3l3-ll与其他突变体相比跟cd64、cd32a和cd32b都保留有较强的亲和力。
[0300]
如图11所示，所有fc段的突变均不影响cd3抗体可变区与cd3的结合力。
[0301]
如图12所示，所有含突变fc的抗体，与含有野生型fc的抗体相比，均显著降低ifn-γ的释放和t细胞成熟标志物cd69和cd25的表达，其中经15h3l3-llp、15h3l3-llpn和15h3l3-lln处理的pbmc中基本检测不到细胞因子(ifn-γ)释放和t细胞成熟标志物cd69和cd25的表达，而15h3l3-ll与含有其他fc突变体的抗体相比还能在一定程度上诱导细胞因子(ifn-γ)释放和t细胞成熟标志物cd69和cd25的表达。
[0302]
如图13所示，所有fc段的突变均不影响cd3抗体交联后对t细胞的激活和活化。即，在抗体通过fc段实现交联以后，所有含fc突变体的抗体，与含野生型fc的抗体，对细胞因子(ifn-γ)释放和t细胞成熟标志物cd69和cd25表达的诱导能力是一致的。
[0303]
实施例13.cd3
×
cd20双特异性抗体的构建和表达
[0304]
本发明采用不对称(cd20:cd3为2：1)的全抗体组装形式进行双特异性抗体构建，具体双抗结构如图14所示。其中靶向cd20的抗体采用如seq id nos:26和27所示的重链和
轻链可变区(cd20抗体mil62的信息也可参见cn108138186b)，靶向cd3的抗体采用15h2l3和15h3l3的重链和轻链可变区。以gs载体(具体信息见zl200510064335.0)为表达载体，构建cd3
×
cd20双特异性抗体的三个半抗体mil220(含有seq id no:26所示的cd20抗体重链可变区、seq id no:33所示的带臼重链恒定区、seq id no:27所示的cd20抗体轻链可变区、和seq id no:31所示的轻链恒定区)、mil221-1(含有seq id no:29所示的cd20抗体vh-接头-cd20抗体vl-接头-15h2l3 vh、seq id no:34所示的带杵重链恒定区、seq id no:18所示的15h2l3轻链可变区、和seq id no:32所示的轻链恒定区)、和mil221-2(含有seq id no:30所示的cd20抗体vh-接头-cd20抗体vl-接头-15h3l3 vh、seq id no:34所示的带杵重链恒定区、seq id no:18所示的15h3l3轻链可变区、和seq id no:32所示的轻链恒定区)。
[0305]
全基因合成mil220、mil221-1和mil221-2三个半抗体的轻重链可变区dna序列，利用限制性内切酶ecori和nhe i分别对三个半抗体mil220 vh的基因片段、mil221-1和mil221-2的scfv-接头-vh的基因片段进行双酶切，并将酶切后的基因片段克隆至含重链恒定区的载体中，完成两个半抗重链全长基因的装配。全基因合成三个半抗轻链可变区基因,利用限制性内切酶cla i和bsiw i分别对两个半抗体的vl基因片段进行双酶切，并将vl基因片段克隆至含轻链恒定区的载体中，完成半抗轻链全长基因的装配。分别采用cla i和hind iii酶切半抗轻链全长基因；采用ecori和xhoi酶切半抗重链全长基因；hindiii和ecor i酶切pcmv-cofragment质粒。采用clai和xhoi酶切gs-vecto。将回收的4个dna片段进行连接、转化并挑取单克隆进行测序，获得含有正确序列的半抗表达载体，分别命名为：gs-mil220、gs-mil221-1、和gs-mil221-2。将上述获得的表达载体通过pei转染hek-293f细胞(cobioer,中国)，具体实验方法参考实施例12。转染后的hek-293f细胞在37℃、5％co2的培养箱中以120rpm转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-a亲和柱(cat#:17040501，ge，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mm柠檬酸，ph3.0-ph3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在pbs(ph 7.0)中，并通过nanodrop检测抗体浓度。
[0306]
实施例14.cd3
×
cd20双特异性抗体的组装
[0307]
将纯化的半抗体进一步通过体外方式进行组装，分别将mil220和mil221-1半抗体、以及mil220和mil221-2半抗体以1:1的摩尔比混合，用tris碱缓冲溶液调节至ph 8.0，添加一定量的还原型谷胱甘肽溶液，在25℃反应并低速搅拌过夜。反应结束后用2m醋酸溶液调节ph值至5.5。通过超滤去除还原剂，终止反应。装配后的抗体首先进行阴离子纯化：通过将装配后的样品调至低盐tris缓冲溶液(ph 8.0)中，用0.2μm的过滤膜过滤。首先采用低盐tris缓冲溶液(ph8.0)平衡阴离子层析柱，然后将样品装载到阴离子层析柱，收集流穿组分，随后使用低盐tris缓冲溶液(ph8.0)进行冲洗直至uv280趋向于基线。用醋酸溶液将收集的流穿样品ph调至5.5。将阴离子收集的样品用30kda超滤管浓缩至1ml，用0.2μm的过滤膜过滤。采用低浓度乙酸盐缓冲溶液(ph 5.5)平衡阳离子层析柱，将样品上样到阳离子层析柱中。上样完毕后，再用低浓度乙酸盐缓冲溶液(ph5.5)平衡柱子，然后进行线性梯度洗脱，0-100％高浓度醋酸盐(ph 5.5)，20cv，收集洗脱组分。随后双抗通过阳离子进行进一步的纯化：将阴离子收集的样品用30kda超滤管浓缩至1ml，用0.2μm的过滤膜过滤。采用低浓度乙酸盐缓冲溶液(ph5.5)平衡阳离子层析柱，将样品上样到阳离子层析柱中。上样完毕后，再用低浓度乙酸盐缓冲溶液(ph5.5)平衡柱子，然后进行线性梯度洗脱，0-100％高浓度
醋酸盐(ph 5.5)，20cv，收集洗脱组分。
[0308]
由mil220和mil221-1组装好的双抗命名为mbs303-1，由mil220和mil221-2组装好的双抗命名为mbs303-2。纯化后的抗体经过质谱鉴定纯度高于90％，用于后续功能检测。
[0309]
实施例15.cd3
×
cd20双特异性抗体与人cd3、猴cd3、以及cd20的结合力检测
[0310]
纯化的双特异性抗体首先通过elisa检测来确定其与重组人和猴蛋白的结合力，按照实施例3中的步骤进行。cd3
×
cd20抗体regn1979(根据公开专利us 2014/0088295a1中的氨基酸序列进行制备，也可参照http://www.imgt.org/3dstructure-db/cgi/details.cgi？pdbcode＝11035中的序列inn11035_h、inn 11035_l和inn 11035_m进行制备)、和cd20-tcb(根据公开专利wo2018220099a1的氨基酸序列进行制备，也可参照http://www.imgt.org/3dstructure-db/cgi/details.cgi？pdbcode＝11145中的序列inn11145_h、inn 11145_l、inn 11145_m和inn 11145_n进行制备)用作参照。对照抗体hel(cat#:lt12031，lifetein，美国)作为阴性对照。结果示于图15(a和b)
[0311]
为进一步确定双特异性抗体是否与hek293a细胞表达的人和猴cd20结合，分别使用实施例11构建的稳定过表达人或猴cd20的hek293a细胞进行facs细胞结合检测。facs的具体方法步骤参照实施例12。结果示于图16(a和b)。
[0312]
为进一步确定双特异性抗体是否与人和猴cd3结合，分别使用jurkat细胞和猴的pbmc细胞进行facs细胞结合检测。通过梯度密度离心的方式获得健康猴供体血样中的pbmc。其他步骤与实施例12完全一致。结果示于图16(c和d)。
[0313]
如图15所示，mbs303-1、mbs303-2和cd20-tcb与人和猴的亚基都能特异性结合，但是regn1979不能结合人和猴的亚基。
[0314]
如图16(a和b)所示，所有检测的双特异性抗体都能结合细胞表面表达的人和猴cd20抗原，但是mbs303-1、mbs303-2和cd20-tcb对cd20的结合活性显著高于regn1979。而图16(c和d)显示出，所有检测的双特异性抗体都能结合细胞表面表达的人和猴cd3复合体，但mbs303-1、mbs303-2、和regn1979对cd3的结合活性显著高于cd20-tcb。
[0315]
实施例16.通过spr检测cd3
×
cd20双特异性抗体对人和猴cd3的亲和力
[0316]
通过biacore
tm 8k(ge life sciences，美国)，按照实施例6的方法步骤，定量测定双特异性抗体对人和猴的结合亲和力。
[0317]
通过biacore
tm
测量的双特异性抗体的结合亲和力显示在表7中，regn1979与人和猴亚基检测不到亲和力，其他双抗与人和猴亚基的亲和力都在nm级别。跟facs检测结果一致，mbs-303-1和mbs303-2与人和猴的亲和力高于cd20-tcb。
[0318]
表7.双特异性抗体对人/猴的结合亲和力
[0319]
[0320]
实施例17.cd3
×
cd20双特异性抗体对人pbmc的中t细胞的活化
[0321]
为进一步确定游离的cd3
×
cd20双特异性抗体对pbmc中cd3/tcr信号通路的激动性，按照实施例12进行人原代pbmc细胞激活检测。实验方法略作修改，48小时收集上清后，同时用于ifn-γ和tnf-α分泌量检测。使用制造商的方法步骤，经elisa试剂盒(cat：430107，biolegend，美国；cat：430207，biolegend，美国)分别确定ifn-γ浓度和tnf-α浓度。
[0322]
实验结果如图17(a和b)所示，regn1979诱导产生的ifn-γ和tnf-α均显著低于cd20-tcb、mbs303-1和mbs303-2，cd20-tcb诱导的细胞因子释放的水平最高。图17(c、d、e)显示出t细胞活化标志物的表达水平，其结果与细胞因子释放的诱导水平是一致的，regn1979诱导t细胞活化的水平显著低于cd20-tcb、mbs303-1和mbs303-2，而cd20-tcb诱导t细胞活化的水平最高。
[0323]
实施例18.cd3
×
cd20双特异性抗体介导pbmc杀伤cd20阳性肿瘤细胞以及杀伤体系下对t细胞的活化
[0324]
对双特异性抗体进一步分析其诱导人pbmc对cd20阳性raji细胞的杀伤能力。其中，raji细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯进行标记，带有绿色荧光。具体方法是，raji细胞用完全rpmi培养基重悬，调整细胞密度为1.0
×
106/ml,细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse,cat#:c34554i，invitrogen,美国)进行标记，标记的实验方法按照说明书进行略有改进进行，改动之处在于使用2.5μm的cfse，并于37℃孵育10分钟。标记后，将细胞重悬于rpmi完全培养基(rpmi 10％fbs)中，并将细胞密度调整成2.5
×
105活细胞/ml。人pbmc使用淋巴分离液通过密度梯度离心而获得，细胞密度调整成5
×
105活细胞/ml重悬于完全培养基(ripm1640 10％fbs)中。将上述细胞各100μl加入96孔板(效应细胞和靶细胞比例2：1)，并加入100μl不同浓度的双特异性抗体。细胞和抗体的混合物在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时。
[0325]
之后，各吸取50μl细胞培养基上清，按照制造商的方法步骤，经三个试剂盒(cat:430107，biolegend，美国；cat#:s2050，r&d，美国；cat:430207，biolegend，美国)确定ifn-γ、il-2、和tnf-α的分泌浓度。结果示于图19。
[0326]
肿瘤细胞raji的杀伤效果经live/dead可固定死细胞染色试剂盒(thermo fisher,usa,cat#:l34964)检测。将上述培养的细胞混合物用pbs洗3遍，然后与live/dead可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用pbs洗3遍，用facs进行检测。计算出绿色荧光阳性细胞(raji细胞)的细胞死亡率。结果示于图18。
[0327]
如图18所示，所有双特异性抗体均能诱导pbmc中的t细胞杀伤raji细胞，其中regn1979的诱导杀伤能力最弱，mbs303-1和mbs303-2杀伤raji细胞的能力均高于regn1979，与cd20-tcb相当或者略弱。
[0328]
如图19所示，所有双特异性抗体都诱发t细胞分泌ifn-γ、il-2和tnf-α，其中cd20-tcb引起的细胞因子释放最为严重，mbs303-1和mbs303-2引起的细胞因子释放远远低于cd20-tcb，与regn1979相当或者略强。
[0329]
实施例19.cd20阳性肿瘤细胞通过cd3
×
cd20双特异性抗体特异性激活cd3阳性t细胞活性及细胞杀伤功能
[0330]
双特异性抗体对cd20阳性肿瘤细胞的特异性杀伤进一步通过t细胞靶向杀伤实验
进行验证。体系中用到的cd20阳性肿瘤细胞系(hek293a/hcd20)是实施例11中构建的稳转细胞系，cd20阴性肿瘤细胞系选用的是母本的hek293a细胞系。
[0331]
简单而言，通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，cd4阳性t细胞通过invitrogen dynabeads untouched人cd4 t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。hek293a/hcd20稳转细胞系因为通过plv-egfp(2a)-puro载体的侵染而得到，因此带有gfp过表达蛋白，具备绿色荧光标记。hek293a细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯进行标记，也带有绿色荧光，具体标记方法与实施例18中一致。靶细胞和效应细胞t细胞1200rpm离心5分钟。细胞用完全培养基(ripm1640培养基 10％fbs)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约95％。靶细胞密度调整成2.5x105/ml，t细胞密度调整成5x105/ml。各取100μl(效靶比2：1)加入各孔。在样品检测孔中加入50μl稀释好的各种检测抗体，抗体起始浓度10μg/ml，十倍稀释，8个浓度梯度。细胞和抗体的混合物在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时。去岩藻糖化、adcc效果增强的cd20单特异性抗体mil62(根据cn108138186b中公开的氨基酸序列和制备方法进行表达)、regn1979和cd20-tcb用作阳性参照。
[0332]
48小时后，各吸取50μl细胞培养基上清，按照制造商的方法步骤，经elisa(cat#:sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度,经试剂盒(cat：430207，biolegend，美国)确定tnf-α浓度。结果示于图21。
[0333]
肿瘤细胞的杀伤效果通过live/dead可固定死细胞染色试剂盒(thermo fisher,usa,cat#:l34964)进行。上述培养的细胞混合物用pbs洗3遍，然后与live/dead可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用pbs洗3遍，用facs进行检测。计算出绿色荧光阳性细胞(hek293a/hcd20细胞或hek293a细胞)的细胞死亡率。结果示于图20。
[0334]
如图20所示，所有双特异性抗体都能诱导t细胞特异性杀伤cd20阳性的肿瘤细胞，而对cd20阴性的细胞系没有任何杀伤效果。双特异性抗体对cd20阳性的肿瘤细胞系的杀伤效果均显著强于cd20单特异性抗体mil62。在双特异性抗体中，regn1979的诱导杀伤能力最弱，而mbs303-1和mbs303-2的杀伤力高于regn1979，与cd20-tcb相当或者略弱。
[0335]
如图21所示，双特异性抗体诱导t细胞分泌ifn-γ和tnf-α均由cd20阳性细胞介导，cd20阴性细胞无法介导双特异性抗体诱导t细胞细胞因子释放。其中cd20-tcb引起的细胞因子释放最为严重，mbs303-1和mbs303-2引起的细胞因子释放低于cd20-tcb。
[0336]
实施例20.mil62预处理减少cd3
×
cd20双特异性抗体引起的pbmc细胞因子释放
[0337]
进一步检测mil62与本发明中的cd3
×
cd20双特异性抗体的联用对双抗引起的pbmc细胞因子释放的抑制效果。简而言之，通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，并将细胞悬浮于rpmi完全培养基(rpmi1640 10％fbs)中，pbmc分为两份，一份加入终浓度为1μg/ml的mil62，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，另一份不添加任何抗体在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时。上述培养的pbmc细胞用pbs洗3遍，重悬于完全培养基(rpmi 1640 10％fbs)中，密度调节为5x105/ml。取200μl加入各孔，在mil62预处理过的pbmc中每孔加入终浓度为1μg/ml的mil62和不同浓度的mbs303-2或mbs303-1，在mil62未处理过的pbmc中只加入不同浓度的mbs303-2。上述pbmc细胞和抗体的混合物在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，各吸取50μl细胞培养基上清用于ifn-γ和tnfα分泌量的检测。使用制造商的方法步骤，经elisa(cat#:sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度,经试剂盒(cat：
430207，biolegend，美国)确定tnfα浓度。收集细胞，经过pbs洗3次，加入2μl pe鼠抗人cd69抗体(bd，美国，cat#:555531)、2μl bv605鼠抗人cd25抗体(bd，美国，cat#:562660)以及2μl fitc鼠抗人cd4抗体(bd，美国，cat#:561842)，常温孵育30分钟后，离心，pbs洗3次。通过流式检测cd4阳性t细胞中cd69阳性t细胞、cd25阳性t细胞、以及cd69和cd25双阳性t细胞的比例。
[0338]
结果如图22所示，直接用cd20
×
cd3双特异性抗体处理pbmc细胞会像实施例17中结果一样，导致较高的细胞因子(ifn-γ和tnf-α)释放和t细胞活化标志物cd69和cd25的表达；但是如果经mil62预处理，且mil62与双抗联合应用，可以完全阻断细胞因子的释放和t细胞活化标志物cd69和cd25的表达。实施例21.mil62与cd3
×
cd20双特异性抗体联用具有协同抗肿瘤效应
[0339]
mil62与本发明的cd20
×
cd3双特异性抗体的协同抗肿瘤作用通过t细胞介导的cd20阳性细胞(hek293a/hcd20)杀伤实验进行检测。简而言之，通过梯度密度离心的方式获得健康人供体血样中的pbmc，cd4阳性t细胞通过invitrogen dynabeads untouched人cd4 t细胞分离试剂盒(thermal fisher scientific，美国，cat#:11346d)从pbmc中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。hek293a/hcd20稳转细胞系因为通过plv-egfp(2a)-puro载体的侵染而得到，因此带有gfp过表达蛋白，具备绿色荧光标记。靶细胞和效应细胞t细胞1200rpm离心5分钟。细胞用完全培养基(ripm1640培养基 10％fbs)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约95％。靶细胞密度调整成2.5x105/ml，t细胞密度调整成5x105/ml。各取100μl(效靶比2：1)加入各孔。样品分为两份，其中一份在样品检测孔中加入50μl稀释好的双特异性抗体，抗体起始浓度10μg/ml，十倍稀释，8个浓度梯度，另外一份所有样品检测孔中加入终浓度为1μg/ml的mil62、以及50μl稀释好的双特异性抗体，抗体起始浓度10μg/ml，十倍稀释，8个浓度梯度。细胞和抗体的混合物在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时。细胞hek293a/hcd20的杀伤效果通过live/dead可固定死细胞染色试剂盒(thermo fisher,usa,cat#:l34964)进行。上述培养的细胞混合物用pbs洗3遍，然后与live/dead可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用pbs洗3遍，用facs进行检测。计算出绿色荧光阳性细胞(hek293a/hcd20细胞)的细胞死亡率。
[0340]
实验结果如图23所示，mil62与双特异性抗体有显著的协同抗肿瘤作用，单独mbs303-1杀伤肿瘤细胞的ec
50
为7.6ng/ml，而联合mil62后，其杀伤肿瘤细胞的ec
50
降低为3.2ng/ml。单独的mbs303-2杀伤肿瘤细胞的ec
50
为9.8ng/ml，而联合mil62后，其杀伤肿瘤细胞的ec
50
降低为3.9ng/ml.
[0341]
实施例22.cd3
×
cd20双特异性抗体的体内抗肿瘤药效
[0342]
对抗体mbs303-2的体内抗肿瘤效果进行研究，所使用的动物模型通过对pbmc人源化的免疫缺陷小鼠(gempharmatech co.ltd，中国)植入带荧光素转基因的raji人b细胞淋巴瘤细胞系(命名为raji-luc细胞，亦康(北京)医药科技有限公司，中国)而建立。将健康成年供者的pbmc浓度调整至5
×
107/ml，通过尾静脉接种于部分动物体内，100μl/只。完成pbmc接种后第三天，将raji-luc肿瘤细胞用pbs重悬，调整浓度为5
×
106/ml，通过尾静脉接种于所有接种或未接种pbmc的动物体内，100μl/只，这一天设定为第0天。将动物随机分成5组，每组8只，在第3、10和17天腹腔注射pbs或者mbs303-2，每次给药分别为0.05mg/kg、0.15mg/kg、和0.5mg/kg。
[0343]
随时间追踪肿瘤大小、小鼠生存状况和小鼠体重。每日观察小鼠健康状态，记录每只小鼠从接种raji-luc细胞到死亡或至安乐死终点时生存时间，设置安乐死的触发条件为：1)小鼠体重降低超过20％；2)小鼠不能自行摄食饮水；3)小鼠肿瘤负荷(生物发光值avg radiance[p/s/cm2/sr])达到5
×
107；4)兽医认为严重影响动物福利和/或实验正常进行的其它异常情况。计算各组荷瘤鼠生存期中位数(mst)和治疗组荷瘤鼠生存期的延长率(ils％)。ils％计算公式为：(治疗组中位生存天数/对照组中位生存天数-1)
×
100％。统计学有显著性差异判断为有效。分组后每周一次对小鼠腹腔注射荧光素底物(15mg/ml，10μl/g体重)，小鼠经异氟烷麻醉后，使用小动物活体成像仪(ivis lumina series iii，perkinelmer)采集发光信号，检测活体动物的肿瘤生长特性。应用单因素方差分析检验对生物发光信号值进行组间统计学分析，应用kaplan-meier分析及log rank检验，对各组荷瘤鼠生存期进行组间统计学分析，p《0.05认为有显著性差异。
[0344]
实验结果如图24(a和b)所示，无论从显像结果还是荧光强度分析，mbs303-2以剂量依赖的方式显著抑制肿瘤的生长。图24(c)显示，mbs303-2显著延长了荷瘤小鼠的生存曲线，具有显著的体内抗肿瘤活性。
[0345]
本技术的示例性序列如下所示。
[0346]
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]