SlJAZ2蛋白及其互作蛋白在提高番茄抗病性方面的应用

sljaz2蛋白及其互作蛋白在提高番茄抗病性方面的应用
技术领域
1.本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及sljaz2蛋白及其互作蛋白在提高番茄抗病性方面的应用。


背景技术：

2.番茄是茄科草本植物，是全球性广泛种植的果蔬类作物。细菌性叶斑病等病害的发生是导致番茄品质和产量降低的主要原因。通过干预其抗病基因提高番茄抗病性是获得优质植株，提高番茄产量和质量的重要手段。有研究认为，番茄sliws1基因在病原丁香假单胞菌接种时表达水平升高，参与番茄抗病防御应答(王莹莹，2021)。番茄slwdr141基因对盐胁迫和细菌侵染均起正调控作用(余佳等，2017)。领域中对于番茄抗病性基因的研究正在不断深入。
3.jaz(jasmonate zim-domain)蛋白是植物中一种重要的调控因子，为植物所特有，最初从模式植物拟南芥中分离鉴定。jaz广泛参与了植株的生长发育、胁迫响应的过程，但在不同植物中其功能作用存在差异。例如，巴西橡胶树hbjaz1对天然橡胶的合成有调节作用，拟南芥jaz7基因参与黑暗诱导叶片衰老，水稻osjaz1蛋白调控水稻抗旱性。研究表明，在番茄中，sljaz2基因在调控叶片发生速度、植株节间距离、表皮毛发育以及成花时间过程中发挥重要作用(于晓惠等，2018)。目前，关于番茄jaz蛋白对番茄抗病性的影响还未见报道。


技术实现要素：

4.鉴于以上现有技术的不足，本发明提出sljaz2蛋白及其互作蛋白在提高番茄抗病性方面的应用。
5.本发明技术方案主要包括以下内容：
6.一方面，本发明试验结果表明，过表达sljaz2的转基因番茄植株病菌数量低于野生型和敲除sljaz2的番茄植株的病菌数量。基于此，本发明提供了sljaz2蛋白及其编码基因在提高番茄抗病性方面的应用。
7.优选的，所述抗病性包括对丁香假单胞菌的抗性。
8.优选的，通过在番茄植株中过表达sljaz2蛋白的编码基因以提高番茄抗病性。
9.另一方面，本发明还获得sljaz2蛋白的互作蛋白，并试验证明sljaz2蛋白与其互作蛋白之间存在明确的互作关系。基于此，可以利用二者之间的互作关系实现对sljaz2基因的调控，提高sljaz2基因的表达，进而提高番茄的抗病性。因此，本发明还提供了sljaz2蛋白和其互作蛋白在提高番茄抗病性方面的应用。
10.优选的，所述互作蛋白包括jaz1蛋白或ein2蛋白。
11.本发明所取得的效果：
12.本发明首次试验证明了sljaz2蛋白可以提高番茄对丁香假单胞菌等病菌的抗性，还进一步筛选获得了sljaz2蛋白的互作蛋白，并通过试验证明了sljaz2蛋白与其互作蛋白
的互作关系。首次提出了sljaz2蛋白及其互作蛋白在提供番茄抗病性方面的应用。该成果的提出有效填补番茄抗病性研究及应用方面的空白。
附图说明
13.图1：sljaz2自激活检测结果图
14.图2：pstdc3000侵染番茄叶片4天后发病情况
15.图3：sljaz2过表达叶片的细菌计数
16.图4：sljaz2敲除叶片的细菌计数
17.图5：sljaz2互作蛋白的自激活检测结果图
18.图6：sljaz2互作蛋白的酵母双杂交验证结果图
具体实施方式
19.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
20.实验材料：
21.1.植物材料
22.番茄为野生型ac、过表达sljaz2株系，由本实验室保存。
23.2.主要菌株和载体
24.菌株：大肠杆菌trans5α感受态细胞，购自北京全式金公司(transgen biotech)；丁香假单胞菌番茄致病变种(pseudomonas syringae pv.tomato,pst dc3000)、y2h gold酵母菌株(bait菌株)；酵母菌株ah109由本实验室保存。
25.质粒：pgbkt7-jaz2 bait质粒；pgbkt7-53阳性对照bait质粒；pgbkt7-lam阴性对照bait质粒；pgadt7-t阳性对照prey质粒；pgbkt7 bait空白载体；
26.3.所用溶液及培养基
27.sd/
–
trp固体培养基；sd/
–
trp液体筛选培养基；sd/
–
leu/
–
trp液体筛选培养基；sd/
–
leu/
–
trp固体筛选培养基；sd/
–
trp/x-α-gal/aba固体筛选培养基；sd/
–
trp/x-α-gal固体筛选培养基；ypda液体培养基；ypda固体培养基；sd/-trp-leu-his-ade平板；sd/-trp-leu平板；sd/-leu平板；sd/-trp的培养液；2*ypda的培养液；0.5*ypda的培养液；kb 25mg/ml利福平固体培养基。
28.4.主要药品试剂
29.50mg/ml卡那抗生素、25mg/ml利福平、氯仿、异丙醇、75％乙醇(depc处理水配制)、rnase-free水(制备方法：使用rnase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入depc至终浓度0.1％(v/v)，过夜搅拌后，高温高压灭菌。)、反转录试剂盒(赛默飞公司)、tb premix ex taq
tm
(takara)。
30.5.主要设备
31.移液枪、移液枪头(灭菌、无rnase)、离心管架、1.5ml离心管(灭菌、无rnase)、50ml离心管(灭菌)、1l锥形瓶；铅笔、记号笔、研钵等。
32.试验例1sljaz2自激活检测
33.(1)植物表达载体构建
34.pcr扩增sljaz2基因，使用北京艾德莱公司的pcr产物纯化回收试剂盒回收扩增片
段，-20℃保存待用。使用neb公司限制性核酸内酶37℃双切割sljaz2片段和目的载体pgbk-t7、pgad-t7，纯化回收目的片段和载体片段，用t4连接酶连接sljaz2片段及载体骨架，形成重组质粒载体pgbk-t7-sljaz2和pgad-t7-sljaz2(简称bd-sljaz2和ad-sljaz2)。菌落pcr检测的阳性克隆送华大基因公司测序，测序结果无误后提质粒备用。
35.(2)sljaz2自激活检测
36.①
以质粒pgbkt7-lam control vector和pgadt7-t control vector为阴性对照，质粒pgbkt7-53 control vector和pgadt7-t control vector为阳性对照。将y2h gold酵母菌种在ypda平板上划线，30℃倒置培养3天左右，直到克隆大小为2-3mm；
37.②
挑取一个酵母克隆于5ml的ypda液体培养基中(50ml灭菌的离心管)；在30℃摇床振荡培养过夜；
38.③
分别吸取1ml菌液至不同1.5ml ep管中，4000-5000rpm离心5min以收集菌体，去上清，分别加入含有目的片段的质粒、阳性对照质粒、阴性对照质粒、空载质粒各5-10μl，混匀后加入500μl酵母转化混合液，吸打混匀后室温静置1d，45℃热激15min，冰上放置15min。
39.④
将转化的酵母菌液4000rpm离心5min，除去400μl上清，剩下100μl吹打混匀后涂布于相应的缺陷型培养基上，30℃倒置培养3d左右。
40.⑤
挑取含有目的片段的质粒、空载质粒的若干单克隆于加有200μl sd/-trp液体筛选培养基的1.5ml ep管中，挑取含有阳性对照质粒、阴性对照质粒的若干单克隆于加有200μlsd/
–
leu/
–
trp液体筛选培养基的1.5ml ep管中，用封口膜封好，30℃，250rpm过夜培养。
41.⑥
将各菌液稀释10
×
、100
×
、1000
×
、10000
×
，吹打混匀后吸10μl点板，培养2-3d后拍照记录。
42.结果如图1所示：bd-sljaz2 ad空载在sd/
–
trp、sd/
–
trp/x-α-gal和sd/
–
trp/x-α-gal/aba固体筛选培养基上存在克隆，其中在sd/
–
trp和sd/
–
trp/x-α-gal/aba培养基上克隆颜色为白色，在sd/
–
trp/x-α-gal培养基上克隆颜色为蓝色；空白bd载体在sd/
–
trp固体筛选培养基上存在克隆且克隆颜色为白色；阳性对照和阴性对照在sd/
–
leu/
–
trp固体筛选培养基上存在克隆，且阳性对照克隆为蓝色，阴性对照克隆为白色。实验结果说明，sljaz2蛋白不存在自激活现象。
43.试验例2sljaz2转基因番茄的生理指标检测
44.为了检测sljaz2转基因和野生型番茄对pst dc3000的抗性是否存在差异，我们选择生长状况良好且一致的ac番茄叶片接种pst dc3000，观察发病情况，记录。
45.①
提前于含有25mg/ml利福平的kb固体培养基上划线培养pst dc3000，28℃倒置培养2d。
46.②
挑单克隆于5ml含有25mg/ml利福平的kb液体培养基中，摇菌，划线培养1-2天。
47.③
用1-2ml灭菌水洗下菌体，4000rpm，5min收集菌体，弃上清后，重复洗一次，然后用10mmol mgcl2洗一次后，用10mmol mgcl2重悬菌体，调节菌液od
600
＝0.2。
48.④
选择40d左右，长势一致且良好的植株叶片，用od
600
＝0.2的pst dc3000菌液侵染叶片(喷洒法)。在喷洒前加入0.025％silwet l-77，充分混匀喷洒sljaz2过表达和敲除sljaz2的植株叶片背面，用野生型叶片作对照。23℃环境黑暗处理过夜后，于28℃环境培养4d后观察叶片发病情况并拍照。分别在侵染0d、2d、4d后用直径1cm打孔器取下相同面积的
叶片进行细菌生长计数。结果见图2～图4。
49.结果分析：
50.喷施4d后叶片有轻微发病，但过表达sljaz2番茄和野生型叶片上发病对比不明显，直观观察不出二者具有明显的差异。
51.在侵染2d后，叶片已开始发病，出现黄色晕斑病状，野生型细菌数高于sljaz2过表达叶片的叶片细菌数，并且低于sljaz2敲除材料叶片的叶片细菌数，细菌数量均增加；在pst dc3000侵染番茄4d后，野生型材料和转基因材料叶片细菌数均增加，细菌数为敲除材料高于野生型，野生型高于过表达材料。
52.试验例3互作蛋白与sljaz2的互作关系验证
53.(1)sljaz2互作蛋白基因全长扩增
54.经初步筛选，选择表5中所示的5个蛋白为候选sljaz2互作蛋白。从phytozome数据库中下载蛋白基因序列，根据基因序列设计带有酶切位点的编码区引物，使用a9高保真酶，以番茄cdna为模板，扩增得到候选sljaz2互作蛋白的编码序列。通过酶切连接的方式连接到pgbk-t7载体中，测序验证无误后，摇菌提质粒，备用。
55.表5
[0056][0057]
表6引物设计
[0058]
[0059][0060]
(2)酵母双杂交验证互作蛋白与sljaz2的互作关系
[0061]
根据前文的方法检测互作蛋白的自激活活性，结果显示5个候选蛋白基因均无自激活活性。然后将带有sljaz2的pgad-t7载体和带有互作蛋白序列的pgbd-/t7载体共转入酵母ah109中，点在sd/tl，sd/tlha和sd/tlha x-α-gal平板上，验证sljaz2和互作蛋白之间的互作关系。结果见图5和图6。
[0062]
结果显示：sljaz1、slein2与sljaz2显示有互作；atpase gamma chain、sam2、rin4与sljaz2显示没有互作。
[0063]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。