在低温、宽pH范围和高浓度盐下有活性的新型非特异性热不稳定核酸酶的制作方法

在低温、宽ph范围和高浓度盐下有活性的新型非特异性热不稳定核酸酶
1.本发明的主题是一种在低温、宽ph范围和高浓度盐(例如nacl、kcl、mgcl2、mgso4、(nh4)2so4)下有活性的新型热不稳定非特异性ppr核酸酶或其酶活性片段，或与其具有至少40％同一性的序列。本发明的主题还是一种编码ppr核酸酶或其酶活性片段的基因；一种编码ppr核酸酶或其酶活性片段的核酸的颗粒；一种包含编码ppr的基因的序列的表达质粒；一种大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr和大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr菌株的重组菌株；一种ppr核酸酶蛋白质生产的方法；该ppr核酸酶在dna含量明显较低的重组蛋白的纯化工艺中的用途，以及用于净化pcr、qpcr、rt-pcr、rt-qpcr和ngs的试剂和混合物以获得相关基因分析的更高的灵敏度和特异性的用途；该ppr核酸酶在纯化病毒载体(特别是用于现代基因和细胞疗法(嵌合抗原受体[car]t细胞免疫疗法)的慢病毒[lv]、腺病毒[av，aav]和逆转录病毒[rv]的工艺中的用途；该ppr核酸酶在用于治疗或诊断目的的外来体纯化工艺中的用途；该ppr核酸酶在纯化重组蛋白，特别是酶、抗体、疫苗接种抗原、用于细胞疗法的产品以及其他治疗性蛋白质的工艺中的用途。
[0002]
目前，最受欢迎的非特异性核酸酶是(默克公司(merck)，美国)，其最佳活性温度是37℃，并且主要的缺点包括不可能通过高温有效失活以及对增加的盐浓度的耐受性有限。(具有通用特征的有关产品；例如像denarase，其在另一种宿主，即芽孢杆菌属物种(c-lecta公司，德国)中产生)展现了相似的参数。具有相似特征的酶的另一个实例是cyanase
tm
核酸酶，其衍生自另一种微生物(ribosolutions公司，美国)。然而，诸位发明人的主要设想是获得衍生自嗜冷微生物和嗜盐微生物的非特异性核酸酶，该非特异性核酸酶在低于20℃和甚至在冷藏条件(4℃-8℃)下保持显著的活性，在宽范围的盐浓度和ph下维持最佳活性，并且特征在于较低温度下的不可逆的酶失活。目前，在世界市场上，仅有两种非特异性核酸酶在较低温度下展现出显著活性。这两种非特异性核酸酶是衍生自耐冷生物的cryonase
tm
(宝生物公司(takara)，日本)和hl-san(arcticzymes公司，挪威)。然而，与本主题发明相比，这些酶的特征在于：对高盐浓度的耐受性较低、在低温(《20℃)下活性较弱以及ph耐受性范围较窄(ph《7.0时残余活性)。
[0003]
dna污染(通常发生于微生物中产生的蛋白质产物中)在工业制造重组蛋白和酶(尤其是用于诊断、治疗和科学目的)期间造成了重大问题。
[0004]
对于基于扩增和/或dna连接(以及pcr、qpcr、rt-qpcr、ngs、rca、lamp)的精确诊断而言，核酸污染明显较低(所谓的“无dna”)的酶是理想的，其中要求具有最高的灵敏度、特异性并且没有模糊或假阳性结果。在上述的超灵敏技术中，即使痕量的外源dna也可能导致获得人工制品。当检测到的dna量较少时，dna污染问题升级。来自污染的dna的信号可能会干扰作为测量对象的低拷贝dna检测，从而会显著影响测试的灵敏度和可靠性。
[0005]
酶和试剂(尤其是dna聚合酶、pcr预混合液、用于ngs的试剂)的商业供应商确认了核酸污染的重要性，并提供在生产技术和质量控制方面与常规试剂不同的无dna产品。然而，由于强烈依赖于dna污染检测方法的灵敏度，这些产品的污染水平往往与预期相去甚远(根据文献发现，大部分公司提供的无dna的聚合酶，每1u酶含有10至1000个dna基因组拷
贝)。
[0006]
由于高质量标准，用于医药产品的治疗性蛋白质和活性物质的生产还需要去除工艺污染物，特别是与(宿主和外源的)dna相关的污染物。通常必须将剩余dna的量限制在每药物剂量100pg(例如在治疗性抗体的情况下)并且对于一些疫苗而言必须限制在每药物剂量10ng。这些值由世界卫生组织(who)，以及美国食品和药物管理局(fda)和欧洲药品管理局(emea)的指导确定。
[0007]
用于纯化核酸污染的理想工具似乎是应用适当的非特异性且通用的核酸酶，该核酸酶的特征在于在低温(4℃-22℃)、宽范围ph(6.0-10.0)、以及常用于纯化工艺(下游处理)中的盐和其他添加剂的高浓度下具有高活性，该核酸酶可以在对正在被纯化的酶和生物药物(蛋白质、酶、抗体、抗原、用于基因疗法的病毒载体等)安全的温度下失活。
[0008]
特别是在从病毒载体(以及用于现代基因和细胞疗法(例如car-t疗法)的慢病毒(lv)、腺病毒(av，aav)和逆转录病毒(rv)的核酸中有效纯化方面，高度期望在高盐浓度(250-1000mm nacl)下和ph 6.0-8.0内应用纯化条件(kramberger等人,hum vaccin immunother[人类疫苗与免疫疗法].2015；11(4):1010-21.doi:10.1080/21645515.2015.1009817)，即用于ppr核酸酶作用的最佳条件。此类条件显著地促进宿主细胞的构成染色质的核酸的消化，以及改变含有病毒载体或蛋白质的溶液的粘度，以促进其纯化。另外，此类条件对于经纯化的病毒载体或蛋白质与固定相的有效结合是必不可少的。这对于提高生产工艺的效率和显著降低生产成本至关重要。
[0009]
近年来，人们对来自嗜冷微生物(即适应在低温下生活的微生物)的酶的兴趣一直在增长。这些酶的重大意义与其在低温下的高活性(实现生产节约)和热不稳定性有关，由此这些酶才可能通过略微的温度增加(不会对正在接受酶处理的产品造成损害)来有效、快速且选择性地失活(在纯化工艺后)。
[0010]
本主题(热不稳定的非特异性核酸酶)可应用于生产不含核酸的酶(例如无dna的聚合酶、逆转录酶、或连接酶)。这些是非常昂贵且不能广泛使用的酶，通常是分子生物学和体外诊断专业技术所需要的。ppr核酸酶(我们发明的主题)也可由医药和化妆品公司用来从核酸中纯化天然来源的产品。出于该目的，医药市场目前使用嗜中温的(默克公司)，其特征在于在反应环境中，对单价和二价盐的耐受性低。
[0011]
国际公开wo 2006095769描述了一种衍生自希瓦氏菌属物种的具有内切核酸酶活性的多肽，希瓦氏菌属物种是嗜冷微生物，在低温下展现出高活性。它可去除蛋白质溶液中存在的任何核酸以及降低蛋白质提取物的粘度。然而，它的失活带来了一定的困难，因为根据文献报告(saramiento等人,front bioeng biotechnol.[生物工程与生物技术前沿]2015；3:148.)，它需要在70℃下孵育30分钟(在如此高的温度下，许多重组蛋白都可能变性)。
[0012]
此外，国际公开wo 2013/121228提出了一种非特异性内切核酸酶及其酶活性片段，能以商标名hl-san获得。本发明涉及内切核酸酶，其在温和的温度条件下会失活，展现出了热不稳定的特性。本发明还包括通过应用该内切核酸酶从生物制品中去除多核苷酸污染。本发明还涉及通过应用内切核酸酶预防核酸的扩增反应中的假阳性结果，特别是通过pcr方法的扩增反应中。
[0013]
本发明的目的是获得具有更佳特性的热不稳定的非特异性核酸酶，该核酸酶在低
于20℃、特别是在冷藏条件(4℃-8℃)下，在高盐浓度和可能的宽ph范围下维持高活性。此外，ppr核酸酶与生物工艺中使用的大多数缓冲液和添加剂相容。该水解核酸的酶可以是非常有价值的工具，用于生产核酸含量较低的重组蛋白、酶、抗体、疫苗接种抗原、外来体、用于基因或细胞疗法的病毒载体；用于制备用于细胞疗法的产品；并且用于从dna和rna污染中纯化其他治疗性蛋白质(例如用于分子生物学和精确体外诊断的酶、用于生物医药行业的蛋白质和病毒载体、以及用于兽医和化妆品行业的生物组分)。
[0014]
本发明的主题是：一种ppr核酸酶或其酶活性片段，其中该核酸酶序列是seq.2或与其具有至少40％同一性的序列。
[0015]
在1-5mm dtt的存在下，在52℃孵育15分钟后，ppr核酸酶或其酶活性片段不可逆地失活，并且有可能通过与dtt更长时间的孵育而降低失活温度。
[0016]
该ppr核酸酶或其酶活性片段通常在以下盐的浓度下具有活性：nacl：0-1400mm，mgcl2：5-200mm，尿素：0-6000mm，硫酸铵：0-200mm，咪唑：0-400mm。
[0017]
一种编码ppr核酸酶或其酶活性片段的基因，该基因的序列如seq.1所呈现。
[0018]
一种编码根据权利要求1-3所述的ppr核酸酶或其酶活性片段的或编码含有上述ppr核酸酶或其酶活性片段的蛋白质的核酸的颗粒。
[0019]
一种表达质粒pd454-ppr-ampr，其含有根据权利要求4所述的编码ppr的基因的序列。另外，该质粒包含：t7噬菌体启动子或另一种在大肠杆菌表达系统中具有活性的启动子。该质粒具有seq.4序列。
[0020]
用上述质粒转化大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株。
[0021]
一种ppr核酸酶蛋白质生产的方法，其中将大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株在培养基中培养，随后通过添加iptg进行ppr核酸酶基因表达的诱导；对该蛋白质进行分离和纯化。
[0022]
一种对如上所定义的ppr核酸酶或其酶活性片段进行分离和纯化的方法，该方法涉及在相关宿主细胞中表达先前描述的核酸酶或其片段，并因此从该宿主细胞和/或培养细胞的培养基中分离该核酸酶。
[0023]
ppr核酸酶在dna含量明显较低的重组蛋白的纯化工艺中的用途，以及用于净化pcr、qpcr、rt-pcr、rt-qpcr、rca、lamp和ngs的试剂和反应混合物以获得相关基因分析的增加的灵敏度和特异性的用途。
[0024]
该ppr核酸酶在纯化病毒载体(特别是用于现代基因和细胞疗法(例如，嵌合抗原受体[car]t细胞免疫疗法)的慢病毒[lv]、腺病毒[av，aav]和逆转录病毒[rv]的工艺中的用途。
[0025]
该ppr核酸酶在用于治疗和诊断目的的外来体的纯化工艺中的用途。
[0026]
该ppr核酸酶在纯化重组蛋白，特别是酶、抗体、疫苗接种抗原、用于细胞疗法的产品以及其他治疗性蛋白质的工艺中的用途。
[0027]
该ppr核酸酶在医药、兽医以及化妆品行业中的用途。
[0028]
该ppr核酸酶在医药和生物技术行业中去除用于哺乳动物发酵和微生物工艺的培养基中的dna污染的用途。
[0029]
以上说明书和专利权利要求中使用的术语含义如下：
[0030]
核酸酶-该术语是指将核酸(dna或rna)的多核苷酸链中的磷酸二酯键水解的酶。
[0031]
非特异性核酸酶-水解所有类型的核酸(包括ssdna、dsdna、环状dna、ssrna、dsrna)的酶。
[0032]
嗜冷生物-生活在低温(低于20℃)下的生物。
[0033]
耐冷(psychrotropic)生物-耐受低温的生物(可以在低温下生活，但不是必需的)。
[0034]
嗜盐生物-耐受高盐浓度的生物，生活在含盐的水或土壤中。
[0035]
ppr核酸酶-作为本发明主题的非特异性核酸酶，seq id序列号是2。
[0036]
附图和序列的说明：
[0037]
图1-示出了pd454-ppr表达质粒的方案。
[0038]
图2-示出了取决于nacl盐浓度的、ph对ppr核溶解活性的影响。使用改进的库尼茨(kunitz)测试进行测量，条件：20mm mgcl2、22℃的温度。
[0039]
图3-示出了温度和高盐(500mm nacl 100mm mgcl2)对ppr核溶解活性的影响。使用改进的库尼茨测试进行测量。
[0040]
图4-示出了mg
2
离子在选定的ph和温度条件下对ppr核溶解活性的影响。在ph 8.0的缓冲液中，在37℃下，在50-150mm浓度下获得最大ppr活性。在环境温度(22℃)下，在ph 6.5的缓冲液中，在明显较低的mg
2
离子浓度(20-50mm)下获得最佳活性。
[0041]
图5-示出了在5mm dtt的存在下，在不同温度条件下的ppr失活。在52℃下获得完全的ppr失活。
[0042]
图6-示出了ppr、hl-san和核酸酶在不同nacl浓度(0、250、500mm)、ph分别为7.0、8.0、9.0的缓冲液中的核溶解活性值的比较。剩余的反应条件如下：温度22℃、50mm tris、20mm mgcl2(用于时5mm mgcl2)。ppr在常用于重组蛋白和病毒载体的纯化工艺中的高nacl浓度(250-500mm)下显示出最大的竞争优势。ppr相对于hl-san核酸酶(这两种核酸酶的特征最为相似)的优势随着下降的ph(7.0-8.0)呈相关性增加。
[0043]
图7-示出了ppr、hl-san和核酸酶在dmem培养基中的核溶解活性值的比较，该培养基常用于哺乳动物体外细胞培养，其中产生重组蛋白、病毒载体和其他生物治疗剂。
[0044]
图8-示出了ppr、hl-san和核酸酶在添加了500mm nacl的、具有相似生理盐浓度的缓冲液(pbs和tbs)中的核溶解活性值的比较，这些缓冲液常用于重组蛋白纯化方法。
[0045]
图9-示出了使用qpcr方法对udg酶(udg)和经使用ppr核酸酶纯化的udg酶(udg ppr)样品中宿主dna污染(大肠杆菌)的检测。
[0046]
图10-示出了从产生西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐单抗(bevacizumab)单克隆抗体的cho细胞的培养后培养基中去除基因组dna污染。
[0047]
seq.1-示出了ppr核酸酶核苷酸序列。
[0048]
seq.2-示出了ppr核酸酶蛋白质的氨基酸序列。
[0049]
seq.3a-示出了pelb信号肽的氨基酸序列。
[0050]
seq.3b-示出了允许用于纯化的his6标签。
[0051]
seq.4-示出了重组pd454-ppr-ampr表达质粒的序列。
[0052]
本发明通过其性能的以下实例进行说明，但对其应用没有任何限制。
[0053]
实例1
[0054]
获得表达质粒pd454-ppr-ampr。
[0055]
为了获得表达质粒pd454-ppr-ampr(通过乙醇沉淀纯化)，将seq.1模式的dna片段用sapi限制性酶消化，并且随后将其与用相同的限制性酶消化的pd454-sr质粒载体(atum公司，美国加利福尼亚州纽华克市(newark,ca,usa)，94560)的dna连接。
[0056]
连接混合物将放置在含la培养基(1％蛋白胨；0.5％酵母提取物；1％nacl；1.5％琼脂)的皮氏培养皿上的感受态top10f大肠杆菌细胞转化，该la培养基含有氨苄西林(100μg/ml)。作为质粒dna分离的结果，从发育的细菌菌落中获得了具有seq.4序列的表达质粒pd454-ppr-ampr。pd454-ppr-ampr质粒的图谱如图1所示。
[0057]
实例2
[0058]
获得大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株。
[0059]
为了获得大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株，使用如实例1所述获得的pd454-ppr-ampr表达质粒的环状dna(seq.4)进行大肠杆菌jm109(de3)或大肠杆菌arcticexpress(de3)细胞的转化。将细菌细胞放置在含有氨苄西林(100μg/ml)的lb培养基(1％蛋白胨；0.5％酵母提取物；1％nacl)上，并且然后将获得的大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株的菌落用于ppr核酸酶的生物合成。
[0060]
实例3
[0061]
使用大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株的细胞获得ppr核酸酶。
[0062]
在37℃下，将根据实例2获得的大肠杆菌jm109(de3)pd454-ppr-ampr或大肠杆菌arcticexpress(de3)pd454-ppr-ampr的重组菌株在含有氨苄西林(50μg/ml)的lb培养基(1％蛋白胨；0.5％酵母提取物；1％nacl)中培养16-18h。随后，使用过夜的培养物以1:50比率接种内容物相同的培养基。在30℃下继续培养直到获得od
600
(光密度)＝0.4-0.5，并且然后通过添加iptg至最终浓度为0.2mm，进行ppr核酸酶基因表达的诱导。在18℃下维持培养20-22h，然后通过离心将细菌细胞从培养基中分离出来。悬浮在缓冲液中的细胞沉淀含有20mm tris-hcl(ph 8.0)、500mm nacl、10mm咪唑、5mm mgcl2；每1g的细胞沉淀至少5ml的缓冲溶液。
[0063]
随后，使用超声(进行3个超声处理周期；能量强度100j/ml的悬浮液)对细胞悬浮液进行崩解。以16000rcf对获得的细胞裂解物进行离心以去除不溶性蛋白质和细胞片段，并且然后通过0.2μm膜对其进行过滤。应用固定化金属亲和色谱法(imac，使用具有固定化的二价镍离子的固定相)，将ppr核酸酶蛋白质从剩余的细菌蛋白质中分离出来。然后通过含有20mm tris-hcl(ph 8.0)、500mm nacl、300mm咪唑、5mm mgcl2的缓冲液将结合至固定相的ppr核酸酶洗脱下来。在冷藏条件下，将含有ppr核酸酶的级分用含有20mm tris-hcl(ph 8.0)、500mm nacl、5mm mgcl2的缓冲溶液(每1ml酶至少100ml)透析至少18小时。将获得的酶配方与甘油以1:1混合，并在-20℃下冷冻。使用分光光度法在280nm波长下进行蛋白质浓度的测量。
[0064]
实例4
[0065]
ppr核酸酶重组蛋白的酶特性的检验。
[0066]
针对根据实例3获得的重组ppr核酸酶，对定义酶活性和失活的最佳条件所必需的有关核酸的具体核溶解活性进行确定。
[0067]
为了确定ppr核酸酶核溶解活性，将连续稀释的酶在含有20mm tris-hcl(ph8.0)、20mm mgcl2和1μg puc19质粒dna(20μl体积)的反应缓冲液中孵育10min。通过添加5μl 25mm dtt溶液至最终浓度为5mm来使反应停止，并将样品加热至55℃，持续10min。作为对照，在不添加核酸酶的情况下孵育1μg的puc19质粒dna。随后，将样品加载至1％琼脂糖凝胶上，并在凝胶中以130电压进行dna分离，持续40min。将凝胶中剩余的、未降解的dna用溴化乙锭染色并通过拍摄凝胶照片记录下来。将1u活性确定为在37℃下、10min内完全降解1μg的puc19质粒dna所必需的酶量。
[0068]
为了确定ppr核酸酶比活性，在37℃下，将连续稀释的酶在含有20mm tris-hcl(ph 8.0)、20mm mgcl2和100μg的鲱鱼精子基因组dna(300μl体积)的反应缓冲液中孵育30min。通过添加300μl 4％高氯酸溶液至2％最终浓度来使反应停止，并将样品在冰上孵育60min。作为对照，在不添加核酸酶的情况下孵育100μg的dna。然后，将样品离心10分钟直到未降解的dna的沉淀分离出来。通过测量260nm波长下的吸光度来确定上清液中小于10bp的游离核苷酸和寡核苷酸片段的含量。将1u核酸酶活性确定为在37℃下反应30分钟内使所研究样品在260nm波长下吸光度增加1.0的酶量。
[0069]
实例4a
[0070]
核溶解ppr核酸酶活性的最佳ph的确定。
[0071]
为了确定酶核溶解活性的最佳ph，如实例4中所述进行反应。在分别含有0、250、500mm nacl的反应混合物中1u酶的溶液(ph 6.0-10.0)。ppr核酸酶在500mm nacl浓度的ph 8.0的缓冲液中展现出最高的核溶解活性，如图2所示。
[0072]
实例4b
[0073]
ppr核酸酶核溶解活性的最佳温度的确定。
[0074]
如实例4所述，在不同温度(从6℃至45℃)下进行酶核溶解活性反应的最佳温度的确定，其中在含有50mm tris(ph 8.0)和不同浓度的mgcl2(5mm和100mm)的反应混合物中含有1u酶。ppr核酸酶在整个所测试的温度范围内维持核溶解活性(图3)。然而，在37℃和高浓度的nacl(500mm)和mgcl2(100mm)下展现出最高的活性。需要强调的是，在这些条件下，通过应用相关的盐浓度：nacl(500mm)和mgcl2(100mm)，可以在6℃的冷藏条件下获得100％的标准活性。
[0075]
实例4c
[0076]
对于ppr核酸酶核溶解活性而言，mg
2
离子的最佳浓度的确定。
[0077]
为了确定mg
2
离子浓度对ppr核溶解活性的影响，如实例4所述，在具有不同mg
2
离子含量(5mm至200mm)的溶液中进行反应，其中反应混合物中含有1u酶。在微碱性环境(ph 8.0)中，ppr核酸酶在含有150mm浓度(最佳为50-150mm)的mg
2
离子的缓冲液中显示出最高的核溶解活性，如图4所示。在低ph环境(ph 6.5)中，ppr在含有20mm浓度(最佳为20-50mm)的mg
2
离子的缓冲液中显示出最高的核溶解活性。在所有所观察的mgcl2范围(5-200mm)内，ppr浓度显示出高比活性。
[0078]
实例4d
[0079]
潜在抑制剂对ppr酶活性的影响的确认。
[0080]
为了确定酶对用于制备重组蛋白、存在于反应缓冲液中的常用离子组分的耐受范围，如实例4所述在具有不同量的单独潜在抑制剂(nacl、尿素、硫酸铵、咪唑)的溶液中进行核溶解反应。ppr核酸酶在增加浓度的所测试物质的存在下保持高核溶解活性，如表1所示。
[0081]
表1.抑制剂对ppr核溶解活性的作用
[0082][0083]
实例4e
[0084]
ppr酶活性的热失活
[0085]
为了确定ppr核酸酶失活的参数，制备0.2ml pcr测试探针系列，该系列含有在含5mm dtt的50μl反应缓冲液(如实例4a所述，除了puc10质粒dna)中的100u ppr。然后，将探针在相关温度下孵育15分钟，然后在冰上孵育5分钟。作为对照，将在相同缓冲液中的100u ppr核酸酶保存在冰上。随后，如实例4a所述失活后，使用来自前一阶段的5μl ppr溶液进行核溶解反应。作为对照，将反应缓冲液中的仅质粒dna(阴性对照)和含有在冰上保存的100u ppr的质粒dna(阳性对照)在与反应试验相同的条件下孵育。试验中质粒dna降解的程度在琼脂糖凝胶上进行分析。如图5所示，在52℃或更高温度下，ppr在ddt的存在下完全失活。
[0086]
实例4f
[0087]
ppr、hl-san、核酸酶在不同盐浓度和ph的缓冲液中的核溶解活性的确定。
[0088]
在以下条件下进行ppr、hl-san和核酸酶的核溶解活性的确定：不同的温度(6℃、22℃和37℃)，不同添加的nacl(最终浓度为0、250、500mm)，ph分别为7.0、8.0、9.0，存在50mm tris、20mm mgcl2(用于时5mm mgcl2)。如图6所示，在具有增加的含量的盐(250和500mm nacl)的缓冲液中，在ph为7.0、8.0和9.0时，ppr核酸酶在所有所测试的核酸酶中展现出最高的核溶解活性(仅hl-san在500mm nacl和ph 9.0时表现出略微更高的活性)。不论ph值是多少，核酸酶实际上在增加的盐浓度(250、500mm nacl)的任何条件下都不发挥作用。在较低ph(7.0、8.0)和环境温度(22℃)的条件下，与hl-san和相比，ppr核酸酶的活性明显更高。在6℃和37℃下观察到类似的相关性(数据未示出)。
[0089]
实例4g
[0090]
ppr、hl-san、核酸酶在dmem培养基中的核溶解活性的确定。
[0091]
如实例4所述在不同温度下(6℃、22℃和37℃)但使用dmem培养基(常用于哺乳动物细胞例如cho、hek培养，用于生产重组蛋白和病毒载体)而不是反应缓冲液进行ppr、hl-san和核酸酶的核溶解活性的确定。如图7所示，在所有所测试的温度下直接添
加至dmem培养基中的ppr核酸酶在所有所测试的酶中显示出最高的核溶解活性。在37℃下，ppr的活性是核酸酶的六倍。在冷藏条件(6℃)和环境温度(22℃)下，prr的活性是其他所测试的核酸酶(即hl-san和)的大约三倍(图7)。在制造商推荐的条件下，将每种酶的活性假定为100％活性。
[0092]
实例4h
[0093]
ppr、hl-san、核酸酶在pbs和tbs缓冲液中的核溶解活性的确定。
[0094]
如实例4所述在6℃、22℃和37℃下但使用以下常用于重组蛋白纯化工艺中的缓冲液：pbs(磷酸盐缓冲盐水，ph 7.4)(10mm na2hpo4、1.8mm kh2po4；2.7mm kcl；137mm nacl)和tbs(tris缓冲盐水)(50mm tris-cl，ph 7.6；150mm nacl)，而非反应缓冲液进行ppr、hl-san和核酸酶的核溶解活性的确定。此外，对核酸酶在添加了500mm nacl的tbs中的活性进行了比较。如图8所呈现，ppr核酸酶在所有所测试的缓冲液，即pbs、tbs和具有高含量的盐(500mm nacl)的tbs中，并且在所有所测试的温度下均显示出所有所测试的酶中最高的核溶解活性。在制造商推荐的条件下，将每种酶的活性假定为100％活性(图8)。
[0095]
实例5
[0096]
重组ppr核酸酶的用途。
[0097]
实例5a
[0098]
ppr核酸酶在生产宿主dna含量较低的重组udg酶中的用途。
[0099]
在实例3后，将获得的ppr核酸酶用于科学研究和分子诊断中常用的其他重组酶的纯化工艺中，特别是用于含有明显较低的宿主dna污染物的聚合酶、连接酶和udg酶的纯化工艺中。大肠杆菌细菌的udg酶纯化的标准方案已被修改，以便将ppr核酸酶按照以下方法添加至制备的含有过度生产的udg酶的细菌裂解物中：每1ml裂解物添加40u，随后使用设置为200转/min的磁力混合器在20℃-25℃下孵育1小时。因此，根据udg酶的标准程序对裂解物进行处理。使用qpcr方法(使用16s细菌特异性引物)进行宿主dna污染的含量测量。与未使用ppr核酸酶纯化的酶相比，使用另外的步骤(使用ppr核酸酶)纯化的udg酶包含的宿主dna污染物少100倍，如图9所示。以科学研究或分子诊断中使用的这种方法纯化的udg酶提高了该方法的灵敏度并显著降低了潜在假阳性结果的风险。
[0100]
实例5b
[0101]
ppr核酸酶用于去除哺乳动物细胞的单克隆抗体纯化工艺中的dna污染的用途。
[0102]
将如实例3所述获得的ppr核酸酶用于去除从中国仓鼠卵巢(cho)细胞中分离的重组单克隆抗体的纯化工艺中的dna污染物。将哺乳动物细胞在相关培养基中培养5天。然后，将细胞通过离心分离，并将上清液用于通过标准色谱法纯化抗体。在培养基中，除了抗体和培养基组分之外，还存在大量衍生自培养期间降解的宿主细胞的基因组dna。含ppr核酸酶的培养后培养基孵育的初步阶段的性能显著降低了培养基中的dna污染的含量，从而提高了抗体与固定相结合的效率。将通过添加ppr核酸酶至50u/ml培养基而在20℃-22℃下进行60分钟的培养后培养基孵育的阶段引入抗体纯化的标准工艺中。在该时间后，使用基因组dna分离试剂盒，从经ppr核酸酶处理和未经ppr核酸酶处理的1ml的培养基中分离dna。将全部获得的dna加载至1％琼脂糖凝胶上，并添加溴化乙锭以可视化核酸。然后，培养基经历抗体纯化的标准程序。作为对照，将培养后培养基在相同条件下(但不添加ppr核酸酶)孵育。如图10所示，ppr核酸酶的添加显著降低了培养后培养基中基因组dna的污染，该污染是在
将西妥昔单抗和贝伐单抗抗体分泌到培养基中的细胞的生长期间积累的。