一株副干酪乳杆菌及其在制备皮肤抑菌和抗炎的产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株副干酪乳杆菌及其在皮肤抑菌和抗炎产品中的应用。


背景技术：

2.皮肤是机体与外部环境的交接面，是防止外来病原体入侵的重要物理屏障，其表面定居着大量的微生物，其中有多种益生菌，也有多种病原菌。
3.皮肤微生态中，多种菌群相互制约处于动态平衡，对当皮肤表皮的微生态平衡被打破，各种皮肤病就会出现。如皮肤表面的痤疮丙酸杆菌的能诱发痤疮和炎症反应，然而皮肤常驻的表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)能与痤疮丙酸杆菌相互拮抗竞争，抑制痤疮丙酸杆菌的增殖。而当菌体的相互拮抗失去平衡，痤疮丙酸杆菌大量繁殖就会诱发痤疮。再比如，某些特定部位的葡萄球菌属和棒状杆菌属的菌株，它们能代谢汗液中的营养物质产生异戊酸等具有臭味的短支链脂肪酸。当这些菌株大量地具有臭味且具有挥发性的代谢物，造成臭汗症。除此之外，鼻腔黏膜处也有大量的微生物，当机体免疫力低下，鼻腔黏膜抵抗力下降，会导致局部生态环境异常，从而使一些致病菌过度繁殖从而导致鼻窦炎。如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的过度繁殖易致鼻窦炎，与此同时，清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)却对于维持鼻腔正常功能有积极作用。
4.除了特定病原菌和有益菌的失衡造成特定的皮肤疾病，皮肤微生态失衡还容易造成炎症、皮肤屏障损伤、敏感肌等综合性的皮肤问题，这些问题反作用于皮肤微生态，形成循环的不良影响。随着皮肤炎症的加重，皮肤保水性下降、紧绷甚至脱屑，并且角质形成和细胞生长也将受到影响，皮肤的自我修复能力减弱。与此对应的是，表皮上一般存在部分益生菌，它们能调控细胞因子的释放，控制全身的免疫状态，起到防治炎症的作用。随着皮肤微生态的持续失衡，皮肤免疫力下降、角质层变薄，最终将损伤皮肤屏障、造成敏感肌。当皮肤屏障受损，金黄色葡萄球菌更易定植增殖，引发发炎红肿。幸运的是，皮肤常驻的表皮葡萄球菌能与金黄色葡萄球菌相互拮抗，降低其增殖速率。
5.根据以上所述，促进皮肤微生态平衡是解决痤疮、臭汗症、皮肤炎症、敏感肌等肌肤问题的重要途经。如今，不良化妆品的使用以及不健康的生活习惯诱发的皮肤炎症、屏障受损等肌肤问题越来越多，人们对美和健康的追求也越来越高，皮肤微生态平衡成为皮肤领域研究的热点。
6.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品。它具有干酪乳杆菌属调节肠道和增强免疫力等益生功能，代谢产生的细菌素具有优良的抑菌性能。因此，副干酪乳杆菌在食品、医疗保健等领域发挥重要作用，但目前尚未见该菌直接用于皮肤抑菌和抗炎的报道。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的问题在于提供一株副干酪乳杆菌及其在制备皮肤抑菌和抗炎的产品中的应用。
8.本发明提供了一株保藏编号为cctcc no：m20211534的副干酪乳杆菌profmic-207。
9.本发明还提供了所述菌株在制备皮肤的抑菌和抗炎的产品物中的应用，所述产品的功能包括：治疗痤疮、治疗臭汗症、治疗鼻窦炎、改善敏感肌、抗皮肤炎症中至少一种。
10.所述治疗痤疮包括：抑制痤疮丙酸杆菌生长、降低痤疮丙酸杆菌与表皮葡萄球菌的相对比例。
11.本发明中所述的菌株间的相对比例，在本发明的实施例中用菌株间的相对浓度比值来表征。
12.所述治疗臭汗症包括：抑制臭汗症病原菌的生长、抑制葡萄球菌产生异戊酸。
13.所述葡萄球菌包括：金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)和表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)中至少一种。
14.一些实施例中，profmic-207菌株降低葡萄球菌产生异戊酸，其降低率为69.55％。
15.所述臭汗症病原菌包括：金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干燥棒状杆菌(corynebacterium xerosis)中至少一种。
16.一些实施例中，profmic-207菌株抑制臭汗症病原菌的生长，其抑制率为28.7％～74.7％。
17.所述治疗鼻窦炎包括：抑制铜绿假单胞菌生长、促进清酒乳酸菌生长，降低铜绿假单胞菌与清酒乳酸菌的相对比例。
18.所述改善敏感肌包括：抑制金黄色葡萄球菌生长、降低金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌的相对比例。
19.所述抗炎包括：下调炎症因子相关基因il-8的表达、降低细胞no的生成量。
20.一些实施例中，profmic-207菌株下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat细胞炎症因子il-8基因的表达，下调率为30.37％；抑制脂多糖(lps)诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7的一氧化氮(no)生成，no的产量降低13.60％～18.09％。
21.本发明还提供了一种皮肤的抑菌和抗炎的产品，其原料包括本发明所述的profmic-207菌株。
22.本发明所述产品的原料包括所述副干酪乳杆菌profmic-207菌株的活菌、灭活菌、裂解物、提取物、培养上清液、衍生物中至少一种；所述衍生物包括：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖和含有免疫原性成分的化合物中至少一种。
23.优选地，本发明所述的产品的原料为所述副干酪乳杆菌profmic-207菌株的上清液或灭活菌体。
24.本发明于五岁健康女孩粪便中分离出副干酪乳杆菌profmic-207，其具备皮肤抑菌和抗炎的功效。具体地，该菌能抑制臭汗症病原菌的生长、抑制葡萄球菌产生异戊酸；该菌还能抑制痤疮丙酸杆菌以治疗痤疮、抑制铜绿假单胞菌以治疗鼻窦炎、抑制金黄色葡萄球菌以改善敏感肌。除此之外，所述菌株能下调炎症因子相关基因il-8的表达、降低细胞no
的生成量，从而抗皮肤炎症。本发明提供的副干酪乳杆菌profmic-207在食品、药品、保养品或化妆品中具有一定应用价值。
25.生物保藏说明
26.副干酪乳杆菌profmic-207 lactobacillus paracasei profmic-207，于2021年12月03日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20211534。
附图说明
27.图1示profmic-207抑制臭汗症相关病原菌生长。
具体实施方式
28.本发明提供了一株副干酪乳杆菌及其在制备皮肤抑菌和抗炎的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
29.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
30.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
31.实施例1 profmic-207的分离
32.于健康女孩粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于mrs固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为profmic-207。革兰氏染色镜检：菌株profmic-207为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
33.实施例2 protmic-207的核酸鉴定
34.1、16s rrna基因序列分析：
35.挑取单菌落置于mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。pcr扩增引物为细菌通用引物27f和1492r；pcr扩增体系为50μl体系，pcr扩增程序为：95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。扩增后测定核酸的碱基序列。
36.2、结果。
37.pcr产物的测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出profmic-207菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。
38.实施例3 profmic-207改变菌群比例以治疗痤疮
39.1、副干酪乳杆菌profmic-207菌液制备。
40.将活化的副干酪乳杆菌profmic-207菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静
置培养16～18h，检测并调整使得od
600
＝2.0，然后将培养菌液于121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得灭活上清液。
41.2、皮肤菌群菌液制备。
42.将痤疮丙酸杆菌cgmcc 1.5003和表皮葡萄球菌cgmcc 1.4260分别用bhi培养基于37℃培养18h，检测并调整至od
600
＝0.2。
43.3、添加上清液影响皮肤菌群生长实验。
44.将灭活上清液以10％(v/v)的比例分别加入两种皮肤菌群菌液中，37℃培养16h，以两种菌液的相对浓度(od
600
的比值)为指标评价灭活上清液对皮肤菌群生长影响。
45.相对浓度比值的计算公式为：a菌和b菌的相对浓度比值＝(实验组a菌的浓度/对照组a菌的浓度)/(实验组b菌的浓度/对照组b菌的浓度)。
46.4、结果。结果如表1所示，profmic-207对痤疮丙酸杆菌有显著抑制作用，而对表皮葡萄球菌抑制作用则低得多。所以profmic-207能够显著降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对浓度比值，降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例，有治疗痤疮的潜力。
47.表1 profmic-207对痤疮相关菌群生长影响
[0048][0049]
实施例4 profmic-207抑制臭汗症病原菌生长
[0050]
1、副干酪乳杆菌profmic-207菌液制备：
[0051]
将活化的副干酪乳杆菌profmic-207菌液用mrs液体培养基培养，于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至od
600
＝2.0，然后将培养菌液于121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得灭活上清液。
[0052]
2、病原菌菌液制备：
[0053]
将5种病原菌：金黄色葡萄球菌cgmcc 1.8721、人葡萄球菌cgmcc 1.493、溶血葡萄球菌cgmcc 1.540和干燥棒状杆菌cgmcc 1.1919分别用bhi培养基37℃培养18h，检测并调整至od
600
＝0.2。
[0054]
3、抑制臭汗症病原菌实验
[0055]
将灭活上清液以10％(v/v)加入病原菌中，37℃培养2h，以菌液浓度(od
600
)降低百分比为指标评价灭活上清液对病原菌生长的抑制作用。
[0056]
4、结果
[0057]
结果显示profmic-207对金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干燥棒状杆菌等臭汗症病原菌均具有抑制作用。profmic-207对臭汗症病原菌抑制率的结果见图1。
[0058]
表2 profmic-207对臭汗症病原菌抑制率
[0059][0060]
实施例5 profmic-207降低异戊酸的产生
[0061]
1、副干酪乳杆菌profmic-207菌液制备：
[0062]
将活化的副干酪乳杆菌profmic-207菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整od
600
至2.0，然后将培养菌液于121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得profmic-207灭活上清液。
[0063]
2、葡萄球菌混合菌液制备：
[0064]
将4种葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和溶血葡萄球菌分别以bhi培养基于37℃培养18h，检测并调整od
600
至2.0，最后将四种菌液等体积混合制得葡萄球菌混合菌液。
[0065]
3、副干酪乳杆菌profmic-207上清液添加及异戊酸含量检测。
[0066]
将灭活上清液以10％(v/v)的比例加入葡萄球菌混合菌液中为实验组，未添加灭活上清液的实验组为对照组，一起于37℃培养2h，然后分别用气相色谱法测定样品和对照的异戊酸含量，计算添加上清液后异戊酸含量降低率。
[0067]
4、结果如表3所示，profmic-207具有降低葡萄球菌产生异戊酸的作用，降低率为69.55％。
[0068]
表3 profmic-207的添加对异戊酸产生的降低率
[0069][0070]
实施例6 profmic-207降低raw264.7细胞的no生成量
[0071]
1、profmic-207菌液制备
[0072]
将profmic-207用mrs培养基培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od
600
＝0.2，离心后，将菌体于121℃高压灭菌30min得profmic-207灭活菌体样品，将上清用0.22μm滤膜过滤得profmic-207灭活上清液样品。
[0073]
2、raw264.7细胞制备
[0074]
将raw264.7细胞消化后以2
×
105个/孔的密度接种至24孔板，于5％二氧化碳培养箱中37℃培养过夜。
[0075]
3、profmic-207添加及lps刺激
[0076]
设置上清液和灭活菌体2个不同的实验组，将上清液以5％(v/v)、灭活菌体以10％(v/v)的比例分别加入对应实验组的培养过夜的raw264.7细胞中。2h后分别添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清，用no含量检测试剂
盒对细胞培养上清进行no含量检测，每次3个复孔，共进行三次实验。
[0077]
4、结果。结果如表4所示，protmic-207具有抗炎作用，能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量。与对照组相比，profmic-207上清液降低no生成量13.60％，profmic-207灭活菌体降低no生成量18.09％。
[0078]
表4 profmic-207降低raw264.7细胞的no生成量
[0079][0080]
实施例7 profmic-207下调炎症因子相关基因的表达
[0081]
1、profmic-207样品制备。
[0082]
将profmic-207用mrs培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od600＝0.2，离心后，菌体于121℃高压灭菌30min得灭活菌体样品，离心上清用0.22μm滤膜过滤得profmic-207上清液。
[0083]
2、hacat细胞制备
[0084]
将hacat细胞消化后以2
×
105个/孔的密度接种至24孔板，于5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0085]
3、金黄色葡萄球菌制备及添加
[0086]
金黄色葡萄球菌接入营养肉汤培养基，于37℃摇床培养过夜，用mem无血清培养基调整菌液浓度至od
600
＝6.0，然后以每孔100μl的量加入培养过夜的hacat细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，pbs清洗5次，每孔重新加入1ml的mem无血清培养基。
[0087]
4、profmic-207样品添加
[0088]
将profmic-207上清液以5％(v/v)的比例加入金黄色葡萄球菌刺激过的hacat细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
[0089]
5、qpcr法检测细胞炎症因子mrna相对表达倍数
[0090]
将上述细胞弃去培养基后，用rna提取试剂盒提取rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，用反转录试剂盒、sybrgreen qpcr试剂盒进行rt-pcr及qpcr，计算炎症因子基因il-8的相对表达倍数f。
[0091]
公式：f＝2-δδct
[0092]
结果。结果如表5所示，profmic-207能够下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat细胞炎症因子相关基因的表达，表达量降低30.37％。因此，profmic-207具有抗炎作用。
[0093]
表5 profmic-207下调炎症因子基因的表达
[0094][0095]
实施例8 profmic-207改变菌群比例以治疗鼻窦炎
[0096]
1、副干酪乳杆菌profmic-207菌液制备：
[0097]
将活化的副干酪乳杆菌profmic-207菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至od
600
＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得profmic-207灭活上清液样品。
[0098]
2、鼻腔菌群菌液制备：
[0099]
将铜绿假单胞菌cgmcc1.1785用bhi培养基、清酒乳杆菌用mrs培养基37℃培养18h，检测并调整至od
600
＝0.2。
[0100]
3、添加上清液影响皮肤菌群生长实验
[0101]
将灭活上清液以10％(v/v)的比例分别加入两种菌液中，37℃培养3h，以铜绿假单胞菌和清酒乳杆菌的相对浓度比值(od
600
比值)为指标评价prof mic-207灭活上清液对鼻腔菌群生长影响。
[0102]
相对浓度比值的计算公式为：a菌和b菌的相对浓度比值＝(实验组a菌的浓度/对照组a菌的浓度)/(实验组b菌的浓度/对照组b菌的浓度)。
[0103]
4、结果
[0104]
结果如表6所示，profmic-207对铜绿假单胞菌有显著抑制作用，而对清酒乳杆菌有一定促进增殖作用。profmic-207能够明显降低铜绿假单胞杆菌和清酒乳杆菌的相对浓度比值，降低铜绿假单胞杆菌和清酒乳杆菌的相对比例，从而有效治疗鼻窦炎。
[0105]
表6 profmic-207对铜绿假单胞菌/清酒乳杆菌比值影响
[0106][0107][0108]
实施例9 profmic-207改变菌群比例以改善敏感肌。
[0109]
1、副干酪乳杆菌profmic-207菌液制备。
[0110]
将活化的副干酪乳杆菌profmic-207菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至od
600 2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得profmic-207灭活上清液样品。
[0111]
2、敏感肌相关菌群菌液制备。
[0112]
将金黄色葡萄球菌cgmcc 1.8721和表皮葡萄球菌cgmcc 1.4260分别用bhi培养基37℃培养18h，检测并调整至od
600
＝0.2。
[0113]
3、添加上清液影响敏感肌相关菌群生长实验。
[0114]
将灭活上清液以10％(v/v)的比例分别加入两种皮肤菌群菌液中，37℃培养2h，以两种菌液的相对浓度比值(od600的比值)为指标评价对敏感肌相关菌群生长影响。
[0115]
相对浓度比值的计算公式为：a菌和b菌的相对浓度比值＝(实验组a菌的浓度/对照组a菌的浓度)/(实验组b菌的浓度/对照组b菌的浓度)。
[0116]
4、结果。
[0117]
结果如表7所示，profmic-207对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，而对表皮葡萄球菌的抑制作用较弱。profmic-207能够显著降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对
浓度比值，降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例，从而有效改善敏感肌。
[0118]
表7 profmic-207对敏感肌相关菌群生长的影响
[0119][0120]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护。