一种用于皮肤抗炎和治疗痤疮的副干酪乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于皮肤抗炎和治疗痤疮的副干酪乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.皮肤微生态是指由细菌、真菌、病毒、螨虫和节肢动物等各种微生物与皮肤表面的组织、细胞及各种分泌物、微环境等共同组成的生态系统。很多皮肤问题都与皮肤微生态失衡有着密切关系。
3.痤疮就和痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acne)的大量繁殖密切相关。痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症反应等因素密切相关。进入青春期后，大量皮脂的分泌和排出。毛囊中存在多种微生物，其中痤疮丙酸杆菌的作用最为关键。痤疮丙酸杆菌为厌氧菌，皮脂的排出受阻正好为其创造了良好的局部厌氧环境，使得痤疮丙酸杆菌大量繁殖，痤疮丙酸杆菌产生的脂酶可分解皮脂中的甘油三酯，产生游离脂肪酸，后者是导致痤疮炎症性损害形成的主要因素。此外，痤疮丙酸杆菌还可产生多肽类物质，趋化嗜中性白细胞、活化补体，诱发或加重炎症。
4.痤疮的本质是一种炎症反应，而炎症反应是痤疮损害发生的最早事件，并贯穿于痤疮的始终。痤疮的发病与多种炎症因子有关，il-6、il-8、il-12和il-1α基因的表达会促进毛囊口的过度角化以及痤疮的特征性炎性损伤。当皮肤受到外界各种刺激物、过敏源的影响时，会导致皮肤氧化应激，此外活性氧自由基(ros)过多引起的氧化应激也会诱导皮肤炎症发生。一方面，炎性细胞产生ros，参与氧化应激，另一方面，ros又可激活nf-κb，导致多种炎性细胞因子(il-1、il-6、il-8)基因表达增强，中性粒细胞等炎症细胞趋化、炎性反应增强。
5.皮肤炎症的发生常伴随着皮肤屏障的受损。皮肤屏障的结构基础主要是角质层以及表皮脂质、天然保湿因子等。健康的皮肤屏障能够抵御外界有害物、刺激物和日光侵害皮肤，同时具有保湿及调节作用。当皮肤屏障受损，皮肤的防御能力减弱，多种过敏原(包括外来病菌)很容易通过受损的皮肤屏障侵入我们的皮肤内部，进而产生一系列皮肤炎症反应如皮炎、皮肤瘙痒等问题。
6.皮肤常驻的表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)能与痤疮丙酸杆菌相互拮抗竞争，抑制痤疮丙酸杆菌增殖。因此，增加表皮葡萄球菌的菌群比例可以有效缓解痤疮炎症，从而通过调节皮肤微生态平衡来维持皮肤健康。益生菌外用可以使皮肤表面的微生物菌群达到平衡，促进皮肤屏障的修护。另外有些益生菌在维持宿主机体稳态，激活免疫系统、维持机体免疫平衡等方面具有重要作用，研究发现某些益生菌能通过调节巨噬细胞的吞噬能力以及细胞因子的释放来控制全身免疫状态，从而预防和治疗各种炎症疾病。
7.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品。它具有干酪乳杆菌属调节肠道和增强免疫力等益生功能，
代谢产生的细菌素具有优良的抑菌性能。因此，其在食品、医疗保健等领域发挥重要作用。但是鲜少有副干酪乳杆菌直接用于皮肤抗菌和屏障修复方面的报导。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明要解决的问题在于提供一种用于皮肤抗炎和治疗痤疮的副干酪乳杆菌及其应用。。
9.本发明提供了保藏编号为cctcc no：m 20211554的副干酪乳杆菌profmic-209。
10.具体地，该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
11.本发明提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备抗炎药物中的应用。
12.所述抗炎包括促进炎症因子相关基因的表达，所述基因包括il-6、il-8、il-22、cox-2和trpv1中至少一种。
13.一些实施例中，本发明提供的副干酪乳杆菌profmic-209下调金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)诱导的hacat细胞炎症因子相关基因il-6、il-8、il-22、cox-2、trpv-1的表达，基因表达量下调19.27％～63.08％。
14.所述抗炎还包括抑制细胞no的产生。
15.一些实施例中，本发明提供的副干酪乳杆菌profmic-209降低脂多糖(lps)诱导小鼠巨噬细胞raw264.7的一氧化氮(no)生成量29.53％～45.78％。
16.本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备治疗痤疮的药物中的应用。
17.所述治疗痤疮包括抑制痤疮丙酸杆菌的生长、降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例。
18.本发明中所述的菌株间的相对比例，在本发明的实施例中用菌株间的相对浓度比值来表征。
19.本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备能上调屏障修复基因flg的药物中的应用。
20.一些实施例中，本发明提供的副干酪乳杆菌profmic-209上调屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因flg的表达，基因表达量上调1.36倍。
21.本发明还提供了一种益生菌菌剂，其原料包括所述的副干酪乳杆菌菌株。
22.具体的，本发明所述产品的原料包括所述副干酪乳杆菌profmic-209菌株的活菌、灭活菌、裂解物、提取物、培养上清液、衍生物中至少一种；所述衍生物包括：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖和含有免疫原性成分的化合物中至少一种。
23.优选地，本发明所述的产品的原料为所述副干酪乳杆菌profmic-209菌株的上清液或灭活菌体。
24.本发明从7岁健康女孩粪便中分离鉴定的副干酪乳杆菌profmic-209，能抑制痤疮丙酸杆菌的生长、降低痤疮丙酸杆菌/表皮葡萄球菌的菌群比，从而治疗痤疮；所述副干酪乳杆菌还具备促进炎症因子相关因子il-6、il-8、il-22、cox-2和trpv1的基因表达的作用，并能抑制细胞产生no，从而有效缓解或治疗皮肤炎症；除此之外，所述的副干酪乳杆菌菌株还能上调屏障修复相关基因flg的表达。总之，本发明提供的profmic-209菌株在制备皮肤
抗炎和治疗痤疮的产品中具有相当的应用前景。
25.生物保藏证明
26.副干酪乳杆菌profmic-209 lactobacillus paracasei profmic-209，于2021年12月06日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20211554。
附图说明
27.图1示profmic-209上清液下调炎症因子相关基因的表达。
具体实施方式
28.本发明提供了一种可用于皮肤抗炎和治疗痤疮的副干酪乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
29.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
30.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
31.实施例1 profmic-209的分离
32.于7岁健康女孩粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于mrs固体平板，37℃恒温培养24～48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为profmic-209。
33.革兰氏染色镜检：菌株profmic-209为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
34.实施例2 profmic-209的核酸鉴定
35.1、16s rrna基因序列分析。
36.挑取单菌落置于mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，然后将菌体按照dna提取试剂盒步骤进行操作提取dna。然后以提取的细菌dna进行pcr扩增，pcr引物为细菌通用引物27f和1492r；pcr扩增体系为50μl体系，pcr扩增程序为：95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
37.2、结果。
38.pcr产物的测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出profmic-209菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。
39.实施例3 profmic-209降低raw264.7细胞的no生成量
40.1、profmic-209菌液制备
41.将profmic-209用mrs培养基培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od600＝0.2，离心后，将菌体121℃高压灭菌30min得profmic-209灭活菌体样品，将离心上清用0.22μm滤膜过滤得profmic-209灭活上清液样品。
42.2、raw264.7细胞制备
43.将raw264.7细胞消化后以2
×
105个/孔的密度接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
44.3、profmic-209添加及lps刺激
45.分别将上清液以5％(v/v)体积比、灭活菌体以10％(v/v)体积比分不同组加入培养过夜的raw264.7细胞中，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清，用no含量检测试剂盒进行no含量检测，每次3个复孔，共进行三次实验。
46.结果。结果如表1所示，profmic-209具有抗炎作用，能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量，与对照组相比，profmic-209上清液降低细胞的no生成量45.78％，profmic-209灭活菌体降低细胞的no生成量29.53％。
47.表1 profmic-209降低raw264.7细胞no生成量
[0048][0049]
实施例4 profmic-209下调hacat细胞的炎症因子相关基因的表达
[0050]
1、profmic-209样品制备
[0051]
将profmic-209用mrs培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od
600
＝0.2，离心后，将菌体于121℃高压灭菌30min得profmic-209灭活菌体样品，将离心发酵液用0.22μm滤膜过滤得profmic-209灭活上清液样品。
[0052]
2、hacat细胞制备
[0053]
将hacat细胞消化后以2
×
105个/孔的密度接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0054]
3、金黄色葡萄球菌制备及添加
[0055]
将金黄色葡萄球菌接入营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用mem无血清培养基调整菌液浓度至od
600
＝6.0，然后以每孔100μl的量添加入培养过夜的hacat细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，pbs清洗5次，每孔重新加入1ml的mem无血清培养基。
[0056]
4、profmic-209样品添加
[0057]
将profmic-209上清液以5％(v/v)的比例加入金黄色葡萄球菌刺激过的hacat细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
[0058]
5、qpcr法检测细胞炎症因子mrna相对表达倍数
[0059]
将上述细胞弃去培养基后，用rna提取试剂盒提取rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，用反转录试剂盒、sybrgreen qpcr试剂盒进行rt-pcr及qpcr，然后计算炎症因子基因il-8和trpv1的相对表达倍数f。
[0060]
公式：f＝2-δδct
[0061]
6、结果。结果如表2所示，profmic-209能够下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat细胞炎症因子相关基因的表达，表达量降低19.27％～63.08％。因此，profmic-209具有抗炎作
用。profmic-209下调炎症因子相关基因表达的统计结果见图1。
[0062]
表2 profmic-209下调炎症因子基因的表达
[0063][0064]
实施例5 profmic-209改变菌群比例治疗痤疮的作用
[0065]
1、副干酪乳杆菌profmic-209菌液制备：
[0066]
将活化的副干酪乳杆菌profmic-209菌液用mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至od
600
＝2.0，然后121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得profmic-209灭活上清液样品。
[0067]
2、皮肤菌群菌液制备：
[0068]
将痤疮丙酸杆菌cgmcc 1.5003和表皮葡萄球菌cgmcc 1.4260分别用bhi培养基37℃培养18h，检测并调整至od
600
＝0.2。
[0069]
3、添加上清液影响皮肤菌群生长实验
[0070]
将灭活上清液以10％(v/v)的比例分别加入两种皮肤菌群菌液中，37℃培养16h，以两种菌液的相对浓度(od
600
)比值为指标评价profmic-209对皮肤菌群生长影响。
[0071]
相对浓度比值的计算公式为：a菌和b菌的相对浓度比值＝(实验组a菌的浓度/对照组a菌的浓度)/(实验组b菌的浓度/对照组b菌的浓度)。
[0072]
4、结果。结果如表3所示，profmic-209对痤疮丙酸杆菌有显著抑制作用，而对表皮葡萄球菌抑制作用则相对低得多。profmic-209能够明显降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对浓度比值，降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例，从而达到治疗痤疮的目的。
[0073]
表3 profmic-209对痤疮相关菌群生长影响
[0074][0075]
实施例6 profmic-209促进hacat屏障修复相关基因表达实验
[0076]
接种人永生化角质形成细胞hacat(5
×
105个/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。加入profmic-209菌株灭活上清液5％(v/v)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，并反转录为cdna，进行qpcr检测flg基因的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
[0077]
公式：f＝2-δδct
结果如表4所示，加入profmic-209具有促进皮肤屏障修护的作用。
[0078]
表4 profmic-209上清液上调屏障修护相关基因表达
[0079][0080]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。