果糖激酶失能的蓝细菌及其在分泌和生产果糖中的应用

1.本发明涉及蓝细菌的合成生物学领域，更特别地，涉及果糖激酶失能的蓝细菌及其在分泌和生产果糖中的应用。


背景技术：

2.果糖在食品、医药以及化工等行业广泛应用，尤其可用于对糖尿病、肥胖症、龋齿等疾病的预防。目前，市场上的果糖产品有果葡糖浆、结晶果糖两种形式。果葡糖浆的生产是以淀粉为主要原料，通过化学催化合成路线，首先利用α-淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖，再利用葡萄糖异构酶，将葡萄糖转化为含有42％果糖和58％葡萄糖的果葡糖浆。结晶果糖(纯度大于97％的果糖)，是细小的粉末状晶体，其生产也是以果葡糖浆为基础，从葡萄糖-果糖混合体系中进行产物提取，需经过色谱分离、富集、浓缩、结晶、筛分等一系列操作进行制备，生产工艺繁琐复杂、转化率较低、耗粮较大，且对设备要求较高。因此，开发高效、绿色的新型果糖合成技术对于降低果糖产业的经济和环境成本，提高产品竞争力和市场接受度具有重要意义。
3.蓝细菌是一类进行植物型放氧光合作用的原核微生物，相较于微藻和高等植物，蓝细菌具有结构简单、生长迅速、遗传改造便捷等优势，因此成为极具潜力的生物能源和生物基化学品光合合成平台。但是，目前研究中尚未发现有潜力的高果糖含量蓝细菌，也没有发现蓝细菌具有向外分泌果糖的能力。n iederho ltmeyer等通过向聚球藻pcc7942中转入己糖转运蛋白g l f基因，形成果糖分泌通路，使得该菌能够向外分泌果糖，但是即便在最优条件下，其产生的胞外果糖含量最高只有28.8mg/l，且果糖水平随着细胞密度的增加而下降，达不到工业化生产的要求(niederholtmeyer,h.,wolfstadter,b.t.,savage,d.f.,silver,p.a.,and way,j.c.,engineering cyanobacteria to synthesize and export hydrophilic products.appl.environ.microbiol.,2010.76(11):p.3462-3466)。
4.因此，需要一种新的方法，使蓝细菌获得大量生产果糖并向外分泌的能力。


技术实现要素：

5.我们在对聚球藻pcc7942、聚球藻pcc7002等多种蓝细菌的研究过程中发现，蓝细菌中普遍存在果糖激酶，当敲除该酶后，突变株出乎意料地表现出极高的果糖产量，并且这些果糖基本上均被分泌到胞外，使得培养体系中的果糖含量高达数百毫克每升。
6.基于以上发现，本发明提供了蓝细菌果糖激酶失能剂在制备具有果糖分泌功能或具有高果糖产量的蓝细菌中的应用。在本发明中，果糖激酶失能剂是指能够使蓝细菌中丧失果糖激酶活性的试剂，例如可完全缺失蓝细菌中的果糖激酶基因的核酸结构体，或者可使蓝细菌中的果糖激酶基因部分缺失或部分突变导致其失去果糖激酶功能的核酸结构体。这样的核酸结构体可以是dna和/或rna。果糖激酶失能剂也可以是果糖激酶功能拮抗剂，例如可通过在培养物中添加果糖激酶功能拮抗剂，或通过在蓝细菌内表达具有拮抗果糖激酶功能的基因来实现。
7.本发明虽然没有具体展示除了使用同源双交换敲除之外的实验证据，但是本领域技术人员在阅读了本技术披露的内容并领会本技术的精神之后，完全能够获得这样的启示：在把果糖激酶失能后，蓝细菌能够大量生产果糖并将其转运至胞外。本领域技术人员可以通过现有的和将有的任何技术实现果糖激酶失能，但是，这些都应当被涵盖在本发明的保护范围之内。
8.本发明还提供了一种具有高果糖产量的蓝细菌，所述蓝细菌中的果糖激酶失去功能。所述蓝细菌为聚球藻、集胞藻、鱼腥藻、节旋藻、念珠藻、微囊藻、鞘丝藻中的一种或多种组合。
9.本发明还提供了果糖激酶失能的蓝细菌在生产果糖中的应用。
10.果糖激酶失能是指，果糖激酶不再具有将果糖磷酸化的功能。我们通过缺失、突变或表达该果糖激酶的拮抗剂等方法，使果糖激酶失能。果糖激酶失能的蓝细菌将无法使产生的果糖磷酸化，果糖即会被大量生产并转运到细胞外。本领域技术人员可以通过现有的和将有的任何技术来实现果糖激酶失能，但是，这些都应当被涵盖在本发明的保护范围之内。
11.本发明还提供了一种使蓝细菌分泌果糖或生产果糖的方法，包括使所述蓝细菌中果糖激酶失能的步骤。
12.在一个具体实施方案中，通过敲除所述蓝细菌中的果糖激酶基因使所述蓝细菌的果糖激酶失能。
13.在一个具体实施方案中，所述敲除为同源双交换敲除。
14.在一个具体实施方案中，所述蓝细菌为聚球藻、集胞藻、鱼腥藻、节旋藻、念珠藻、微囊藻、鞘丝藻中的一种。
15.本发明通过对蓝细菌的碳循环通路中的果糖激酶进行敲除，突变株却意外地获得了大量生产果糖并分泌至胞外的能力，果糖产量提升数百倍，为后续利用蓝细菌工业化生产果糖提供了可能性，也为以蓝细菌作为底盘藻株进一步代谢工程改造提供了基础。
附图说明
16.图1为pjs11的质粒图。
17.图2为pydo8的质粒图。
18.图3为针对果糖激酶敲除位点的pcr扩增产物的电泳照片，其中左图为野生型pcc7942(wt)和敲除株js05的扩增产物的电泳照片，右图为野生型pcc7002(wt)和敲除株yd08的扩增产物的电泳照片。
19.图4为糖类标样的hplc出峰曲线。
20.图5为野生型pcc7942(wt)和敲除株js05的培养生长曲线(a)、胞外果糖含量(b)统计图和胞内果糖含量(c)统计图。
21.图6为野生型pcc7002(wt)和敲除株yd08的培养生长曲线(a)和胞外果糖含量(b)统计图。
具体实施方式
22.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并
非用于限定本发明的范围。
23.1、所用到的藻株
24.蓝细菌聚球藻pcc7942和蓝细菌聚球藻pcc7002均常被作为模式菌株进行相关的实验研究。其中，pcc7942的果糖激酶基因氨基酸序列如seq id no.1所示，核酸序列如seq id no.2所示；pcc7002的果糖激酶基因氨基酸序列如seq id no.3所示，核酸序列如seq id no.4所示。
25.2、质粒构建
26.2.1构建pcc7942果糖激酶敲除质粒pjs11：根据pcc7942的果糖激酶基因及其在基因组中的上下游序列设计引物，以pcc7942基因组为模板扩增得到果糖激酶上游同源臂(fk-n)和下游同源臂(fk-c)，通过将氯霉素抗性片段插在果糖激酶上游同源臂和下游同源臂之间，整合到puc19骨架上得到重组质粒pjs11，质粒图谱如图1所示。
27.2.2构建pcc7002果糖激酶敲除质粒pyd08：根据pcc7002的果糖激酶基因及其在基因组中的上下游序列设计引物，以pcc7002基因组为模板扩增得到果糖激酶上游同源臂(fk-上游)和下游同源臂(fk-下游)，在中间插入卡那霉素抗性片段，得到果糖激酶敲除质粒pyd08，质粒图谱如图2所示。
28.3、转基因藻株的构建
29.向野生型pcc7942中转入质粒pjs11得到藻株js05。方法如下：
30.1)取1ml对数生长期(od
730
约为1)的pcc7942培养物，5000g离心5min收集细胞，并用新鲜的bg11培养基清洗细胞2次，弃上清，细胞沉淀重悬于250μl bg11溶液中；
31.2)向上述重悬后的藻液中加入2μl的质粒pjs11(质粒浓度为100μg/ml)；
32.3)将加入质粒后的ep管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；
33.4)将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的bg11平板(氯霉素：5μg/ml)，30℃，100μmol photons m-2
s-1
条件下培养，4-5天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的bg11平板(氯霉素：5μg/ml)划线；通过筛选得到分离完全的藻株。
34.向野生型pcc7002中转入质粒pyd08得到藻株yd08。方法如下：
35.1)取1ml对数生长期的(od
730
约为1)的聚球藻pcc7002，5000g离心5min收集细胞，并用新鲜的a 培养基清洗细胞2次，弃上清，细胞沉淀重悬于250μl无抗a 培养基中；
36.2)向上述重悬后的藻液中加入3000ng的质粒pyd08(浓度为100μg/ml)；
37.3)将加入质粒后的ep管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；
38.4)将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的a 平板(卡那霉素：50μg/ml)，30℃，100μmol photons m-2
s-1
条件下培养，5-7天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的a 平板(卡那霉素：50μg/ml)划线；通过筛选得到分离完全的藻株。
39.如图3所示，js05和yd08中，其相应的果糖激酶(fk)被完全敲除。
40.4、js05分泌果糖
41.使用柱式光反应器，为直径3cm，长度为20cm的普通玻璃材质的圆底玻璃管，反应器总装液量可达100ml，实验过程中装液65ml。种子液为处于对数生长期的bg11培养物(补充有相应氯霉抗生素：5μg/ml)，初始接种浓度od
730
为2，在30℃，150μmol photons m-2
s-1
，通入混合气(3％co2 97％空气)条件下，进行无盐胁迫培养、或在培养初期向培养基中添加150mm nacl进行培养。
42.在js05进行柱式光照培养过程中监测菌株的生长，并绘制菌株生长曲线，同时对胞外果糖含量、胞内果糖含量进行定量分析。
43.果糖含量分析使用hplc法：取1ml培养过程中的工程菌株的藻液，13000rpm离心10min，将离心后的上清移入另一干净的1.5ml的ep管中，用于测定胞外果糖含量；对胞外提取的果糖稀释后利用液相色谱检测(使用安捷伦高效液相色谱仪1260，配备示差检测器，使用hpx-87h糖分析柱，流动相为5mm h2so4溶液，流速为0.5ml/min)，经预实验显示，果糖在20min附近出峰(图4)。
44.如图5所示，突变株js05在正常bg11培养基和添加150mm nacl的bg11培养基中培养的生长曲线相差不大。在培养前期，加盐培养基可导致藻株积累更高的细胞内果糖含量(6-12天)，但是到了14天时，各组的胞内果糖含量没有显著性差异，提示随着培养时间的延长，细胞内果糖含量积累逐渐达到极限值。
45.令人惊讶的是，无论加盐还是不加盐，野生型均未观察到果糖向胞外分泌，但是在js05中，我们在这两种条件下均观察到较高浓度的胞外果糖，尤其在加盐的条件下，培养14天后，js05藻株的胞外果糖含量高达387mg/l。这说明，果糖激酶的敲除不仅意外地大幅提高了聚球藻pcc7942中果糖的合成，同时，还激活了果糖向细胞外分泌的通路。
46.5、yd08合成并分泌果糖
47.使用柱式光反应器，为直径3cm，长度为20cm的普通玻璃材质的圆底玻璃管；反应器总装液量可达100ml，实验过程中装液65ml。种子液为处于对数生长期的a 培养物(补充有相应抗生素：卡那霉素，50μg/ml)，初始接种浓度od
730
为1，在30℃，200μmol photons m-2
s-1
，通入混合气(3％co2 97％空气)的条件下进行培养。检测方法同上文。
48.对yd08进行柱式光照培养过程中监测菌株的生长，并绘制菌株生长曲线，同时对胞外果糖含量进行定量分析。
49.结果如图6所示，野生型pcc7002和果糖激酶敲除株yd08，在a 培养基和200μmol photons m-2
s-1
的条件下培养得到的生长曲线相差不大。但是野生型不产生胞外果糖，而yd08藻株培养至第八天时胞外果糖浓度高达635mg/l。可见，在聚球藻pcc7002中，通过敲除果糖激酶，也能促使藻细胞向胞外大量分泌果糖。
50.此外，我们对聚球藻utex2973、集胞藻pcc6803、鱼腥藻pcc7120等做了相关实验，都得到了类似结果。这些实验证据证明，在多种蓝细菌中敲除果糖激酶不仅能大幅提高其果糖产量，而且能够使其将果糖向外分泌，突变株中果糖的总产量可达到野生型的数百倍。
51.不受本领域现有理论的约束，我们推测，在蓝细菌中果糖激酶可立即将生产出来的果糖磷酸化，使其构象发生改变，构象改变后的磷酸化果糖无法被分泌到胞外，而是进入到相应的碳代谢中，因此限制了蓝细菌中果糖的产量。在我们敲除果糖激酶后，由于果糖不再被磷酸化，这导致所产生的果糖以非磷酸化的形式存在，一方面不进入磷酸化果糖的代谢形式，更重要的是，非磷酸化的果糖出乎意料地能够大量分泌到胞外，从而使果糖不在胞内积累，大幅提高了果糖的产量。
52.需要说明的是，在本发明实施例中出于举例说明的目的，我们描述了用具体的方法对具体蓝细菌中的果糖激酶进行了敲除处理，以获得不含有效功能的果糖激酶的蓝细菌株系，但是，这些具体的方法不应用来限制本发明的范围。只要通过现有或将有的技术使蓝细菌中的果糖激酶失能均可实现蓝细菌的果糖分泌及产量的大幅提升。
53.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。