一种检测孕妇样品中胎儿游离DNA存在或比例的方法和试剂盒

技术特征：
1.一种检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的snp位点的方法，其包括以下步骤:(a)提供含有来源于所述母亲的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述父亲的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种候选snp位点，并且，提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种候选snp位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物包含第一通用序列；所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选snp位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过pcr反应分别扩增第一样品和第二样品中的靶核酸，从而获得分别与第一样品和第二样品对应的扩增产物；(c)对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，确定这样的snp位点：在该位点上第一样品和第二样品具有不同基因型别。2.权利要求1的方法，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定第一样品和第二样品的各个候选snp位点的型别，并分别进行比较，从而鉴定这样的snp位点：在该位点上第一样品具有第一纯合基因型别，且第二样品具有第二纯合基因型别；优选地，第一样品选自来自母亲的皮肤，唾液，毛发，指甲，及其任何组合；优选地，第二样品选自来自父亲的皮肤，唾液，毛发，指甲，及其任何组合；优选地，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；(2)所述候选snp位点位于不同染色体；(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)；优选地，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.01；(2)所述候选snp位点位于不同染色体；(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.3至0.7之间；优选地，所述候选snp位点为人基因组中的snp位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，
rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述snp位点的任意组合(例如，前述snp位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)；优选地，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304。3.权利要求1或2的方法，在步骤(a)中，针对每一种snp位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述snp位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与第一样品和第二样品对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行pcr反应，然后，在pcr反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行pcr反应，然后，在pcr反应结束后，进行熔解曲线分析；(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(pna)或锁核酸)，或其任何组合组成；(3)所述检测探针的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；(4)所述检测探针具有3'-oh末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；(5)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，alex-350,fam,vic,tet,cal fluor gold 540,joe,hex,cal fluor orange 560,tamra,cal fluor red 590,rox,cal fluor red 610,texas red,cal fluor red 635,quasar 670,cy3,cy5,cy5.5,quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如dabcyl、bhq(例如bhq-1或者bhq-2)、eclipse、和/或tamra)；(7)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷
基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-o-氨基丙基修饰，2'-o-烷基修饰，2'-o-烯丙基修饰，2'-o-丁基修饰，和1-(4'-硫代-pd-呋喃核糖基)修饰；(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；(11)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个snp位点的型别；(12)所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：seq id no:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69。4.权利要求1-3任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个靶特异性引物对；(2)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍；(3)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物；(4)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；(5)所述样品或靶核酸包含mrna，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；和(6)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行pcr反应；优选地，所述核酸聚合酶为dna聚合酶，例如热稳定的dna聚合酶；优选地，所述热稳定的dna聚合酶获自，thermus aquaticus(taq),thermus thermophiles(tth),thermus filiformis,thermis flavus,thermococcus literalis,thermus antranildanii,thermus caldophllus,thermus chliarophilus,thermus flavus,thermus igniterrae,thermus lacteus,thermus oshimai,thermus ruber,thermus rubens,thermus scotoductus,thermus silvanus,thermus thermophllus,thermotoga maritima,thermotoga neapolitana,thermosipho africanus,thermococcus litoralis,thermococcus barossi,thermococcus gorgonarius,thermotoga maritima,thermotoga neapolitana,thermosiphoafricanus,pyrococcus woesei,pyrococcus horikoshii,
pyrococcus abyssi,pyrodictium occultum,aquifexpyrophilus和aquifex aeolieus；优选地，所述dna聚合酶为taq聚合酶。5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；(2)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；(3)所述第一通用引物的长度为5-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；(4)所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(5)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；(6)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；(7)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；(8)所述第二通用引物的长度为8-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，或40-50nt；和(9)所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。6.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第一通用序列、核苷酸连接体和正向核苷酸序列组成；(4)所述正向核苷酸序列位于或构成所述正向引物的3'部分；(5)所述正向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；(6)所述正向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；(7)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(8)在所述反向引物中，所述反向核苷酸序列直接连接至第二通用序列的3'端，或者，所述反向核苷酸序列通过核苷酸连接体连接至第二通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；
(9)所述反向引物还包含额外的序列，其位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸；(10)所述反向引物从5'至3'包含或由第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列和反向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包含或由额外的序列、第二通用序列、核苷酸连接体和反向核苷酸序列组成；(11)所述反向核苷酸序列位于或构成所述反向引物的3'部分；(12)所述反向核苷酸序列的长度为10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt；(13)所述反向引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；(14)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；和(15)所述第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；例如，所述第二通用序列中位于3'末端的至少一个核苷酸，例如1-5个，5-10个，10-15个，15-20个或更多个核苷酸，不能与所述正向引物的互补序列互补；优选地，所述第一通用引物的序列如seq id no:71所示；优选地，所述第二通用引物的序列如seq id no:70所示；优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68。7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述方法的步骤(a)-(b)通过包含下述步骤(i)-(vi)的方案来进行：(i)提供来源于所述母亲的一种或多种靶核酸的第一样品，以及含有来源于所述父亲的一种或多种靶核酸的第二样品，所述靶核酸包含一种或多种snp位点；和，提供第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种snp位点，提供一个靶特异性引物对；以及任选地，针对每一种snp位点，提供一个检测探针；其中，所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对如权利要求1所定义；所述检测探针如权利要求3所定义；(ii)将所述样品与所述第一通用引物和第二通用引物和靶特异性引物对，核酸聚合酶，以及任选地，检测探针混合；(iii)在允许核酸变性的条件下，温育前一步骤的产物；(iv)在允许核酸退火或杂交的条件下，温育前一步骤的产物；(v)在允许核酸延伸的条件下，温育前一步骤的产物；和(vi)任选地，重复步骤(iii)-(v)一次或多次；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在步骤(iii)中，在80-105℃的温度下温育步骤(ii)的产物，从而使核酸变性；(2)在步骤(iii)中，温育步骤(ii)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；(3)在步骤(iv)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，或65-70
℃的温度下温育步骤(iii)的产物，从而允许核酸退火或杂交；(4)在步骤(iv)中，温育步骤(iii)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，或2-5min；(5)在步骤(v)中，在35-40℃，40-45℃，45-50℃，50-55℃，55-60℃，60-65℃，65-70℃，70-75℃，75-80℃，80-85℃的温度下温育步骤(iv)的产物，从而允许核酸延伸；(6)在步骤(v)中，温育步骤(iv)的产物10-20s，20-40s，40-60s，1-2min，2-5min，5-10min，10-20min或20-30min；(7)在相同或不同的温度下进行步骤(iv)和(v)；和(8)重复步骤(iii)-(v)至少一次，例如至少2次，至少5次，至少10次，至少20次，至少30次，至少40次，或至少50次；优选地，当重复步骤(iii)-(v)一次或多次时，每一个循环的步骤(iii)-(v)所使用的条件各自独立地是相同的或不同的。8.一种检测孕妇样品中胎儿游离dna的存在或其比例的方法，其中，所述方法包含以下步骤：(1)提供待检测的孕妇样品；(2)检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的一个或多个snp位点的基因型，并鉴定目标snp位点；其中，在所述目标snp位点上，母亲具有包含第一等位基因的纯合基因型，且，父亲具有包含第二等位基因的纯合基因型，其中，第一等位基因不同于第二等位基因；(3)对所述待检测的孕妇样品中各个目标snp位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；然后，根据第一等位基因和第二等位基因定量检测的结果，确定所述待检测的孕妇样品中胎儿的核酸的存在或其比例；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的机制来检测某个snp位点的基因型，从而鉴定目标snp位点：探针杂交、引物延伸、杂交连接和特异酶切；优选地，在步骤(2)中，可通过选自下列的方法来鉴定目标snp位点：测序法(例如，一代测序法、焦磷酸测序法、二代测序法)、芯片法(例如，使用能够检测snp的固相芯片、液相芯片)、基于qpcr的检测法(例如，taqman探针法)、质谱法(如基于massarray的iplex
tm gold)、色谱法(如变性高效液相色谱法dhplc)、电泳法(如snpshot法)、基于熔解曲线分析的检测法；优选地，在步骤(2)中，通过基于多重pcr结合熔解曲线分析的检测法鉴定目标snp位点；优选地，通过权利要求1-7任一项所描述的方法鉴定所述目标snp位点；优选地，在步骤(3)中，通过数字pcr对所述样品中各个目标snp位点的第一等位基因和第二等位基因分别进行定量检测；优选地，通过下述方案进行步骤(3)：(i)从步骤(2)中选取至少1个(例如，1个，2个，3个，或更多个)目标snp位点，并且，针对每一个选取的目标snp位点，提供一个扩增引物组和一个探针组，其中，(i-1)所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述目标snp位点的核酸分子；(i-2)所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团
能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且(ii)第一探针能够与含有所述目标snp位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标snp位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；(ii)使用所述扩增引物组和探针组对所述待检测的孕妇样品进行数字pcr，对具有第一等位基因的核酸分子和具有第二等位基因的核酸分子进行定量检测；(iii)根据步骤(ii)的定量检测结果，确定所述待检测的孕妇样品中胎儿游离dna的比例；优选地，所述孕妇样品为血液(例如，外周血)；优选地，所述第一探针在数字pcr反应过程中与具有第一等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；和，所述第二探针在数字pcr反应过程中与具有第二等位基因的核酸分子特异性退火或杂交；优选地，所述第一探针在数字pcr反应过程中不与具有第二等位基因的核酸分子退火或杂交；和/或，所述第二探针在数字pcr反应过程中不与具有第一等位基因的核酸分子退火或杂交；优选地，所述孕妇样品在步骤(1)之前经过预处理；优选地，所述预处理包括对样品进行核酸提取和/或对样品中的核酸进行富集；优选地，所述核酸富集通过核酸浓缩和/或核酸扩增的方法；优选地，通过所述扩增引物组进行所述核酸扩增。9.权利要求8的方法，其中，所述第一探针和第二探针各自独立地具有选自下列的一个或多个特征：(1)所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(pna)或锁核酸)，或其任何组合组成；(2)所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；(3)所述第一探针和第二探针各自独立地具有3'-oh末端；或者，所述探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；(4)所述第一探针和第二探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；(5)所述探针中的报告基团为荧光基团(例如，alex-350,fam,vic,tet,cal fluor gold 540,joe,hex,cal fluor orange 560,tamra,cal fluor red 590,rox,cal fluor red 610,texas red,cal fluor red 635,quasar 670,cy3,cy5,cy5.5,quasar 705)；并
且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如dabcyl、bhq(例如bhq-1或者bhq-2)、eclipse、和/或tamra)；(6)所述第一探针和第二探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；(7)所述第一探针和第二探针具有不同的报告基团；优选地，所述第一探针和第二探针是可被核酸聚合酶(例如dna聚合酶)降解的；(8)所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：seq id no:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163。10.权利要求8或9的方法，其中，所述扩增引物组的引物各自独立地具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)含有特异于含有snp位点的靶核酸的序列；(2)所述引物的长度为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-110nt，110-120nt，120-130nt，130-140nt，140-150nt；(3)所述引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(4)所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161。11.一种试剂盒，所述试剂盒包括，能够不对称扩增含有候选snp位点的靶核酸的鉴定引物组；优选地，所述鉴定引物组包含：第一通用引物和第二通用引物，以及，针对每一种候选snp位点，提供至少一个靶特异性引物对，其中，所述第一通用引物包含第一通用序列；所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述候选snp位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；优选地，所述试剂盒还包括一种或多种能够检测所述候选snp位点的检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述候选snp位点的区域退火或杂交，并且标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信
号；优选地，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.3(例如，小于0.2，小于0.1，小于0.05，小于0.01)；(2)所述候选snp位点位于不同染色体；(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.2至0.8之间(例如，0.3至0.7之间，0.4至0.6之间)；优选地，所述候选snp位点具有选自以下的1个或多个特征：(1)所述候选snp位点在不同人种之间的fst小于0.01；(2)所述候选snp位点位于不同染色体；(3)所述候选snp位点的等位基因频率在0.3至0.7之间；优选地，所述候选snp位点为人基因组中的snp位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，以及前述snp位点的任意组合(例如，前述snp位点中任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)；优选地，所述靶核酸包含下列人基因组snp位点：rs16363，rs1610937，rs5789826，rs1611048，rs2307533，rs112552066，rs5858210，rs2307839，rs149809066，rs66960151，rs34765837，rs68076527，rs10779650，rs4971514，rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs711725，rs2053911，rs9613776和rs7160304；优选地，所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，15个，20个，23个的组合)：seq id no:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66和69；优选地，所述第一通用引物的序列如seq id no:71所示；优选地，所述第二通用引物的序列如seq id no:70所示；优选地，所述靶特异性引物对包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:1和2；4和5；7和8；10和11；13和14；16和17；19和20；22和23；25和26；28和29；31和32；34和35；37和38；40和41；43和44；46和47；49和50；52和53；55和56；58和59；61和62；64和65；67和68；优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：扩增引物组，探针组，用于进行数字pcr的试剂；优选地，所述扩增引物组至少包含一条扩增引物(例如一对扩增引物或更多的扩增引物)，其在允许核酸杂交或退火的条件下，能够特异性扩增含有所述snp位点的核酸分子；优选地，所述探针组包含第一探针和第二探针；其中，(i)第一探针和第二探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，第一探针和第二探针分别标记不同的报告基团(例如荧光基团)；并且(ii)第一探针能够与含有所述目标snp位点的第一等位基因的核酸分子杂交或退火
(优选完全互补)，第二探针能够与含有所述目标snp位点的第二等位基因的核酸分子杂交或退火(优选完全互补)；并且，所述第一探针和第二探针特异于不同的等位基因；优选地，所述探针组包括具有选自下列的核苷酸序列的探针或其任何组合(例如，任意5个，10个，20个，40个，60个的组合)：seq id no:73，74，78，79，82，83，86，87，90，91，94，95，98，99，102，103，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，127，130，131，134，135，138，139，142，143，146，147，150，151，154，155，158，159，162，163；优选地，所述扩增引物组包括具有选自下列的核苷酸序列的引物对或其任何组合(例如，任意5对，10对，15对，20对，23对的组合)：seq id no:72和73；77和76；80和81；84和85；88和89；92和93；96和97；100和101；104和105；108和109；112和113；116和117；120和121；124和125；128和129；132和133；136和137；140和141；144和145；148和149；152和153；156和157；160和161；优选地，所述进行数字pcr的试剂选自包括选自下列的一种或多种组分：用于制备微液滴样本的试剂，用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，用于检测微液滴样本的试剂，或其任何组合；优选地，所述试剂盒还包括选自下列的一种或多种组分：核酸聚合酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于进行熔解曲线分析的试剂，或其任何组合；优选地，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶，例如dna聚合酶，特别是热稳定的dna聚合酶；优选地，所述核酸聚合酶如权利要求4和5所定义；优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dntps(标记或未标记的)、水、包含离子(例如mg
2
)的溶液、单链dna结合蛋白、或其任何组合；优选地，所述试剂盒用于判断孕妇样品中是否含有胎儿游离dna，或者，计算孕妇样品中胎儿游离dna的比例；优选地，所述数字pcr选自微滴式数字pcr和芯片式数字pcr。12.权利要求11所定义的鉴定引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于不对称扩增靶核酸分子，或用于检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的snp位点；优选地，所述试剂盒还包含权利要求3所定义的检测探针；优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-10任一项所描述的方法。13.权利要求11所定义的扩增引物组和探针组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测孕妇样品中胎儿游离dna的存在或其比例；优选地，所述试剂盒还包含用于确定孕妇或胎儿的基因组中一个或多个snp位点的基因型别的试剂；优选地，所述试剂盒还包含权利要求11所定义的鉴定引物组和检测探针；优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-10任一项所描述的方法。

技术总结
本申请涉及分子诊断领域。具体而言，本申请利用多重不对称PCR扩增和多色探针熔解曲线分析，建立了一种检测母亲来源的样品与父亲来源的样品的SNP位点的方法。进一步的，本申请结合数字PCR系统，开发了一种检测孕妇样品中胎儿游离DNA存在或比例的方法和试剂盒。与现有技术相比，本申请的方法及试剂盒能够实现自动化检测，人工操作步骤少，检测周期短，并且检测准确，灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。


技术研发人员：黄秋英 陈昕雯 李庆阁
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2020.12.17
技术公布日：2022/6/21