新型三倍体综合征检测试剂盒、检测方法及用途与流程

1.本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及新型三倍体综合征检测试剂盒、检测方法及用途。


背景技术：

2.近年来国家二胎政策的开放，使优生优育与出生缺陷再次成为全社会关注的热点议题。出生缺陷是指由于环境因素、遗传因素等造成的胎儿在出生前已经存在，出生前或出生后数年发现的解剖结构和功能异常，是造成流产、死胎、新生儿先天残疾和围产期死亡的重要原因。统计显示全世界每年约有700～800万有先天缺陷的新生儿出生，而其中在围产期死亡的出生缺陷儿约占330万。我国是全球人口出生缺陷高发国之一，全国人口出生缺陷率高达5.6％，每年新增约90万例出生缺陷儿，且新增出生缺陷人vi数量呈逐年升高趋势。出生缺陷不仅对儿童生长发育和生命安全造成严重威胁，还严重影响我国的出生人口素质，得以幸存的出生缺陷儿，往往会因身患残疾导致其生活质量和身心健康受到严重影响，也会给家庭及社会造成巨大的精神负担和经济压力。
3.染色体异常是导致新生儿出生缺陷最常见的病因之一。染色体异常包括染色体数目异常和结构异常。染色体异常患儿常有身体发育不良、多发畸形和智力障碍等症状。染色体非整倍体是胎儿最常见的染色体异常，其中以21-三体(trisomy 21，t21)、18.三体(trisomy 18，t18)、13-三体(trisomy 13，t13)和性染色体非整倍体最为常见，最常见的性染色体非整倍体有45，x(turner综合征)、47，xxx(3x染色体综合征)、47，xxy(原发小睾丸症)和47，xyy(雅各综合征)。目前尚无法明确导致染色体异常的病因，且没有对其有效的干预及治疗措施，因而只有通过孕期产前筛查、诊断出染色体异常高危儿，适时终止妊娠，避免患儿的出生，从而降低出生缺陷率。传统的产前筛查主要是指母体血清学筛查及超声筛查，但研究表明母体血清学筛查检出率较低，假阳性率、假阴性率均较高。虽然母体血清学和nt联合筛查是目前被认为最常用、最有效的孕早期筛查方案，可筛查出约90％的21-.三体患儿，但仍有约5％的假阳性率；孕中期母体血清学筛查的准确率约65％，假阳性率约8％，高龄妊娠孕妇的假阳性率更是高达20％以上。而超声筛查对染色体异常胎儿容易漏诊，存在较高的假阴性率。


技术实现要素：

4.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种新型三倍体综合征检测试剂盒、检测方法及应用，以达到减小准确率高、检测速度快的效果。
5.为了达到上述效果，本发明提供新型三倍体综合征检测试剂盒，包括引物组合、探针组合、pcr反应液和taq聚合酶；dna连接酶、末端转移酶、dntps和反应缓冲液；所述引物组合序列如seq id no.1～10所示；所述探针组合为全基因组拷贝数异常探针。
6.进一步的，所述全基因组拷贝数异常探针可检测拷贝数变异导致的基因组疾病；包括21-三体综合征、18-三体综合征、三倍体，以及基因组位置缺失或重复导致的智力障碍
疾病。
7.进一步的，目标染色体为21号染色体；所述目标染色体上的基因包括bace2、brwd1、c21orf119、cbr1和col6a2；扩增所述bace2基因的正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，扩增brwd1的正向引物的序列如seq id no.3所示，反向引物的序列如seq id no.4所示，扩增c21orf119的正向引物的序列如seq id no.5所示，反向引物的序列如seq id no.6所示，扩增cbr1的正向引物的序列如seq id no.7所示，反向引物的序列如seq id no.8所示，扩增col6a2的正向引物的序列如seq id no.9所示，反向引物的序列如seq id no.10所示。
8.进一步的，本发明所述的试剂盒还包含：扩增对照染色体上的基因对应的引物对，所述引物对中各引物的序列分别如seq id no.16～25所示；以及，对照染色体上基因对应的全基因组拷贝数异常探针，所述全基因组拷贝数异常探针的序列分别如seq idno.26～30所示。
9.进一步的，所述对照染色体包括1号染色体和2号染色体；所述对照染色体上的基因包括actl8、agt、bai2、c1orf101和cap1；扩增所述actl8基因的正向引物的序列如seq id no.16所示，反向引物的序列如seq id no.17所示，扩增agt的正向引物的序列如seq id no.18所示，反向引物的序列如seq id no.19所示，扩增bai2的正向引物的序列如seq id no.20所示，反向引物的序列如seq id no.21所示，扩增c1orf101的正向引物的序列如seq id no.22所示，反向引物的序列如seq id no.23所示，扩增cap1的正向引物的序列如seq id no.24所示，反向引物的序列如seq id no.25所示；优选的，actl8对应的taqman探针的序列如seq id no.26所示，agt对应的taqman探针的序列如seq id no.27所示，bai2对应的taqman探针的序列如seq id no.28所示，c1orf101对应的taqman探针的序列如seq id no.29所示，cap1对应的taqman探针的序列如seq idno.30所示；优选的，所述对照染色体上基因对应的taqman探针是采用hex荧光标记的。
10.进一步的，利用上述新型三倍体综合征检测试剂盒进行检测；所述方法包括以下步骤：
11.s1：分离、提取母体外周血血浆中的外周血游离dna，即cfdna；
12.s2：针对人类21，18和13号染色体，分别设计如seq id no.1～10所示的引物组合；
13.s3：采用生物素对cfdna末端进行标记，将标记后的cfdna与磁珠结合，然后进行扩增，扩增产物构成文库，对扩增产物进行测序；
14.s4：对正常孕妇的产检数据进行分析并建立正态分布，根据y.m.dennis lo染色体异倍检测方法，对染色体拷贝数进行z检验
15.进一步的，所述步骤s1中提取方法按照chelex-100法提取外周血标本中的dna。
16.进一步的，所述步骤s2中的扩增条件为：在bio-rad t100型pcr扩增仪上扩增，反应条件：95℃5min预变性，然后94℃30s、60℃1min、70℃1min，循环27次，再60℃延伸60min，最后扩增产物于4℃避光保存备用。
17.优选的，本发明所述的试剂盒以及检测方法可以用于检测母体外周血标本染色体的异常。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
19.本发明提供的一种超早期的、安全无创的、准确快速、经济的从母体外周血中检测
胎儿三倍体综合征，采用pcr技术，对孕妇妊娠时间要求较短，8-10周的孕妇即可进行超早期筛查、样本需求量少、只需要2ml的血浆样本、操作过程简单快速、检测周期短、且数据分析直观方便且成本只是ngs方法的一半，可在短时间内完成无创产前的超早期筛查。
20.本发明的检测方法为无创检测法，不会威胁孕妇或胎儿健康，并且诊断检测准确度高，费用低，流程和数据分析简便，有效避免了产生大量不必要的测序数据并且pcr反应条件要求不苛刻，具有广泛的适用性，促进了三体综合征无创筛查的普及，对提高我国人口素质有重大意义。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。实施例1
22.本实施例提供本发明所述的脆性x综合征检测试剂盒的检测方法；具体为：
23.(1)采集孕妇外周血
24.用带有编号的游离dna bct刑管(streck，omaha，ne)1次性采集孕妇外周静脉血10ml。
25.(2)分离血浆
26.采集孕妇外周静脉血后24小时内进行血浆分离。在4℃条件下，以1600g的转速离心10分钟，离心后将1.4ml血浆转移到1.5ml微量离心管中。再次在4℃条件下，以16000g的转速离心10分钟去除残余白细胞或细胞碎片，并将1.3ml血浆移入到新的1.5ml微量离心管中，然后将其保存在-80℃冰箱中避免冻溶。
27.(3)提取血浆中游离dna
28.①
15mlbd管中加入reagent2 15ul，磁珠30ul，reagentl 100ul，lysis buffer 2ml，血浆1.2ml。
29.②
将bd管放入垂直混合仪，以12r/min的速度在室温下混匀20分钟。
30.③
取上一步混合液，靠在magical trapper，用移液器取出磁珠，加入magical trapper上的2ml管子中吸附，用微型台式真空泵吸弃上清。
31.④
向2ml离心管中加入500μl wash buffer i，混匀后放回magicaltrapper。在室温下静置1分钟后，用微型台式真空泵吸弃上清。
32.⑤
向2ml离心管中加入500μl wash bufferii，混匀后放回magicaltrapper。在室温下静置1分钟后，用微型台式真空泵吸弃上清。
33.⑥
向2ml离心管磁珠另一侧缓慢加入550μl wash bufferlii，轻柔颠倒magical trapper，在室温下静置1分钟后，用微型台式真空泵吸弃上清。
34.⑦
向2ml离心管中加入42μl elution buffer后混匀。
35.⑧
将上述混合液放入55℃水浴锅中反应10分钟，每2分钟混匀一次。
36.⑨
将2ml离心管放回magical trapper，吸取上清移至1.5ml离心管中，得到cfdna。
37.(2)引物设计：
38.目标染色体为21号染色体；所述目标染色体上的基因包括bace2、brwd1、
c21orf119、cbr1和col6a2；扩增所述bace2基因的正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，扩增brwd1的正向引物的序列如seq id no.3所示，反向引物的序列如seq id no.4所示，扩增c21orf119的正向引物的序列如seq id no.5所示，反向引物的序列如seq id no.6所示，扩增cbr1的正向引物的序列如seq id no.7所示，反向引物的序列如seq id no.8所示，扩增col6a2的正向引物的序列如seq id no.9所示，反向引物的序列如seq id no.10所示。
39.扩增对照染色体上的基因对应的引物对，所述引物对中各引物的序列分别如seq id no.16～25所示；以及，对照染色体上基因对应的全基因组拷贝数异常探针，所述全基因组拷贝数异常探针的序列分别如seq idno.26～30所示。
40.所述对照染色体包括1号染色体和2号染色体；所述对照染色体上的基因包括actl8、agt、bai2、c1orf101和cap1；扩增所述actl8基因的正向引物的序列如seq id no.16所示，反向引物的序列如seq id no.17所示，扩增agt的正向引物的序列如seq id no.18所示，反向引物的序列如seq id no.19所示，扩增bai2的正向引物的序列如seq id no.20所示，反向引物的序列如seq id no.21所示，扩增c1orf101的正向引物的序列如seq id no.22所示，反向引物的序列如seq id no.23所示，扩增cap1的正向引物的序列如seq id no.24所示，反向引物的序列如seq id no.25所示；优选的，actl8对应的taqman探针的序列如seq id no.26所示，agt对应的taqman探针的序列如seq id no.27所示，bai2对应的taqman探针的序列如seq id no.28所示，c1orf101对应的taqman探针的序列如seq id no.29所示，cap1对应的taqman探针的序列如seq idno.30所示；优选的，所述对照染色体上基因对应的taqman探针是采用hex荧光标记的。
41.(3)扩增、测序
42.采用生物素对cfdna末端进行标记，50μl反应体系中含150pm biotin-16-dutp，12u tdt和1x tdt缓冲液，在37℃条件下孵育1h，加异丙醇沉淀后用10mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，0.1mm edta溶解cfdna，将上述cfdna与100μg myonec1tm磁珠(购自dynal公司)混合，并加入以下缓冲液混合至体积为50μl，所述缓冲液包括60mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)，6mm edta，300mm nacl2，35％甲酰胺(formamide)，0.1％乳化剂t-80(tween-80)及4nm结合引物，所述混合液在70℃条件下反应10min，退火后，在25℃条件下继续反应2h以上，然后将反应管放到磁力架上磁吸，加入50μl洗液(10mm tris-hcl缓冲液，ph 8.0,1mm edta,50mm nacl2)洗涤，磁珠重悬于50μl反应液中，所述反应液包含1u taq连接酶和1x taq缓冲液，然后在37℃条件下孵育1h，磁珠用洗液洗涤2次后悬浮于30μl te缓冲液中，连接产物于95℃洗脱3min，再经pcr扩增23循环，所述pcr反应体系包括1u pfusion多聚酶，1x pfusion缓冲液，200μm dntps，200nm上游通用引物，200nm下游通用引物，采用ampure xp(beckman公司产品)磁珠对所述pcr产物进行纯化，纯化后的文库经ion pgm template ot2 200kit制备成乳液pcr样本，并在ion torrent pgmtm(life technology)上测序；再进行数据分析。
43.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。