使用无细胞蛋白质合成体系插入非天然氨基酸的方法

1.本发明属于合成生物学技术领域，具体地，涉及一种使用无细胞蛋白质合成体系插入非天然氨基酸的方法。


背景技术：

2.无细胞合成生物学正在成为一种强大的方法，其目的是在不使用整个活细胞的情况下理解，利用和扩展自然生物系统的功能。作为一种新兴的生物工程学科，无细胞合成生物学已被广泛用于医学，环境和材料科学领域。无细胞蛋白质合成(cfps)是无细胞合成生物学的技术核心，也被称为体外蛋白质翻译，是一种用于补充基于细胞内蛋白质表达的多功能技术，该技术作为基础生物学和应用生物学的研究工具已经使用了近七十年。cfps通过向细胞提取物中添加dna模板，能量和各种辅因子，模仿细胞内环境用于合成理想的蛋白质。cfps系统最初是由nirenberg和matthaei在20世纪60年代开发的，在发现遗传密码方面发挥了重要的作用。在过去的20年里，cfps系统经历了飞速的发展，以满足对廉价和快速重组蛋白表达技术的日益增长的需求，这导致了众多高活性cfps平台的发展。
3.为了生成感兴趣的蛋白质，应在cfps体系中加入各种元件来模拟体内的转录翻译环境。在cfps体系中加入编码该蛋白的dna或mrna模板，以及氨基酸和核苷酸来合成蛋白质。蛋白质合成过程中需要转录，翻译过程。cfps系统利用微生物、植物或动物细胞裂解物产生核糖体、氨酰-trna合成酶、翻译起始和延伸因子、核糖体释放因子等转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的元素。在开始无细胞蛋白质合成后，通常会持续产生蛋白，直到其中一个底物(例如，atp、半胱氨酸等)耗尽或副产物积累(例如无机磷酸盐)达到抑制浓度。
4.cfps之所以能够飞速发展，主要由于其快速表达具有生物活性重组蛋白的潜力。具有这个潜力的原因主要由于其相较于细胞体系的特有优势。首先，通过cfps使用细胞提取物来模拟细胞内的环境，无需完整活细胞且没有细胞膜限制，是一个开放的系统。该优点使蛋白质表达操作简单，可直接在体外控制转录及翻译过程，并且可以表达一些有毒或难溶的蛋白质。其次，系统中的所有能量都可用来生产感兴趣的蛋白质，可大大提高蛋白质的表达效率。这些优势克服了传统的基于细胞的蛋白质合成需要跨膜的局限。此外，cfps可以使用线性dna为表达模板，避免了基于质粒方法的耗时的克隆步骤，使cfps系统有潜力高通量方式研究，筛选和工程化蛋白质。cfps已经成为了代替体内蛋白表达的有力平台。
5.目前，在蛋白质中嵌入非天然氨基酸(unaa)的方法已得到快速发展。较成熟的方法主要有两大类，分别为基于天然翻译体系的全局抑制法以及基于ots的终止密码子抑制、移码抑制、及非天然碱基对的方法。终止密码子抑制方法强大而有效，可以将多种类型的unaas位点特异性地结合到蛋白中。其中，琥珀终止密码子(tag)抑制已被广泛使用。
6.然而，利用cfps系统合成非天然蛋白质，仍有表达量低及嵌入效率低下的。问题。此外，利用传统的琥珀抑制法嵌入非天然氨基酸只能实现单一种类unaa的特异位点嵌入，如果想要实现多种unaas的位点特异性嵌入，还需要借助其他终止子抑制的方法。
7.本发明对cfps体系反应条件，基于多种终止密码子抑制的无细胞非天然蛋白表达体系(cell-free unnatural protein synthesis,cfups)的建立以及不同种unaas的嵌入进行研究。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种使用无细胞蛋白质合成体系插入非天然氨基酸的方法。
9.具体来说，本发明涉及如下方面：1.一种用无细胞蛋白质合成体系插入非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
10.向编码目标蛋白质的核酸中插入一个或两个终止密码子，所述一个或两个终止密码子分别用于编码一种非天然氨基酸，
11.将所述插入有一个或两个终止密码子的编码目标蛋白质的核酸加入到无细胞非天然蛋白质合成体系中用于合成插入有非天然氨基酸的目标蛋白质。
12.2.根据项1所述的方法，其特征在于，所述终止密码子为选自琥珀密码子(tag)或赭石密码子(taa)。
13.3.根据项1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白质为荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上，优选为荧光蛋白。
14.4.根据项1所述的方法，其特征在于，所述无细胞非天然蛋白质合成体系包含金属离子、trna、正交氨酰trna合成酶和非天然氨基酸。
15.5.根据项4所述的方法，其特征在于，所述无细胞非天然蛋白质合成体系还包含能量源物质和氨基酸混合液，无机盐。
16.6.根据项4所述的方法，其特征在于，所述金属离子选自mg
2
、fe
2
、fe
3
、zn

、mn

、cu

、ni

、w
6
、mo
6
、ca
2
和co
2
中的一种或两种以上。
17.7.根据项6所述的方法，其特征在于，所述金属离子为mg
2
，其在无细胞非天然蛋白质合成体系中的浓度为0-50mm，优选为30-40mm。
18.8.根据项4所述的方法，其特征在于，trna在无细胞非天然蛋白质合成体系中的浓度为0-300ng/μl，优选为10-75ng/μl。
19.9.根据项4所述的方法，其特征在于，正交氨酰trna合成酶在无细胞非天然蛋白质合成体系中的浓度为0-1mm，优选为0.06-0.3mm。
20.10.根据项4所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自p-炔丙基-l-苯丙氨酸、p-叠氮基-l-苯丙氨酸、4-碘-l苯丙氨酸、对乙酰基-l-苯丙氨酸、4-乙酰基-l-苯基丙氨酸、炔丙基-l-赖氨酸、n-ε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸、n6-cbz-l-赖氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、三氟甲基苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、nε-炔丙氧基羰基-l-赖氨酸、ε苄氧基羰基升赖氨酸、nε-((((e)-环辛-2-烯-1-基)氧基)羰基)-l-赖氨酸、α-boc-1-4-硝基苯丙氨酸、对叠氮甲基-l-苯丙氨酸、nε-p-叠氮苄氧羰基赖氨酸、nε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸、nε-丙烯酰赖氨酸、nε-(环辛基-2-炔-1-基氧基)羰基)l-赖氨酸、双环[6.1.0]非-4-炔-9-基甲醇赖氨酸、反式-环辛-2-烯赖氨酸、反式-环辛-4-烯赖氨酸、二氧代-tco赖氨酸、3-(2-环丁烯-1-基)丙酸、nε-降冰片烯-2-酰氧羰基-l-赖氨酸、环辛炔赖氨酸、5-降冰片烯-2-醇酪氨
酸、环辛-2-炔醇酪氨酸、(e)-2-(环辛-4-烯-1-基酰氧基)乙醇酪氨酸、叠氮高丙氨酸、高丙炔基甘氨酸、叠氮亮氨酸、nε-2-叠氮乙氧羰基-l-赖氨酸、l-(7-羟基香豆素-4-基)乙基甘氨酸、2-氨基-3(5-二甲氨基)萘-1-(磺酰胺)丙酸、6-丙酰-2-(n,n-二甲基)-氨基萘中的一种或两种。
[0021]
11.根据项4所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸在无细胞体系中的浓度为0-10mm，优选为2-2.5mm。
[0022]
12.根据项1所述的方法，其特征在于，向编码目标蛋白质的核酸中插入琥珀密码子(tag)和赭石密码子(taa)，所述非天然氨基酸为p-炔丙基-l-苯丙氨酸和p-叠氮基-l-苯丙氨酸。
[0023]
13.根据项1-12中任一项所述的方法合成的蛋白质。
[0024]
本发明建立了基于多种终止子抑制的无细胞蛋白质合成体系，成功将非天然氨基酸插入到蛋白质的特定位点，扩展了非天然蛋白质的功能和类型，并促进cfups系统的开发和应用。
附图说明
[0025]
图1为cfups反应流程图；
[0026]
图2为基于单种终止子抑制的cfups体系的蛋白模板设计方法示意图及蛋白结构图；
[0027]
图3为aars的sds-page结果；
[0028]
图4为基于单种终止子抑制的cfups体系的ppafrs蛋白活性测试结果；
[0029]
图5为基于单种终止子抑制的cfups体系的最适氧化还原环境的筛选结果；
[0030]
图6为基于单种终止子抑制的cfups体系的最适mg
2
浓度筛选结果；
[0031]
图7为基于单种终止子抑制的cfups体系的最适trna浓度筛选结果；
[0032]
图8为基于单种终止子抑制的cfups体系的最适aars浓度筛选结果；
[0033]
图9为基于单种终止子抑制的cfups体系的最适unaa浓度筛选结果；
[0034]
图10为基于单种终止子抑制的cfups体系的非天然氨基酸的质谱结果图；
[0035]
图11为基于多种终止子抑制的cfups体系的蛋白模板设计方法示意图及蛋白结构图；
[0036]
图12为基于多种终止子抑制的cfups体系的最适mg
2
浓度的筛选结果；
[0037]
图13为基于多种终止子抑制的cfups体系的最适ots组分浓度的筛选结果；
[0038]
图14为基于多种终止子抑制的cfups体系的非天然氨基酸的荧光检测结果图；
[0039]
图15为基于多种终止子抑制的cfups体系的非天然氨基酸的质谱结果图。
具体实施方式
[0040]
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
[0041]
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定
义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
[0042]
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用无细胞蛋白质合成体系插入非天然氨基酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[0043]
步骤一：向编码目标蛋白质的核酸中插入一个或两个终止密码子，所述一个或两个终止密码子分别用于编码一种非天然氨基酸，
[0044]
步骤二：将所述插入有一个或两个终止密码子的编码目标蛋白质的核酸加入到无细胞非天然蛋白质合成体系中用于合成插入有非天然氨基酸的目标蛋白质。
[0045]
使用无细胞体系合成非天然蛋白质的体系称为无细胞非天然蛋白质合成(cfups)体系。无细胞非天然蛋白质合成体系(cfups)，由基础的无细胞蛋白质合成体系与外源添加的正交翻译组分(ots)组成，包括非天然氨基酸(unaas)、正交氨酰trna合成酶(aars)以及正交trna。ots制备方法及cfups基本流程如下图1所示。
[0046]
cfups常用方法是密码子抑制。在天然蛋白翻译体系中，核苷酸形成64种三碱基密码子，编码总共20种氨基酸。琥珀密码子(tag)，蛋白石密码子(tga)和赭石密码子(taa)是这64个密码子中的三个终止密码子，也称为无义密码子，用于终止蛋白质的翻译过程。但在詹氏甲烷球菌这种生物体内的天然翻译体系中，终止密码子可以被识别并且编码为酪氨酸。这种使用终止密码子取代天然蛋白质某位点的有义密码子并在该位点嵌入非天然氨基酸(unaa)的方法称为终止密码子抑制。
[0047]
在步骤一中，向编码目标蛋白质的核酸中插入终止密码子的方法可以采用现有技术中已有的方法进行。进一步地，所述终止密码子为选自琥珀密码子(tag)或赭石密码子(taa)。
[0048]
在一个具体的实施方式中，向编码目标蛋白质的核酸中插入一个终止密码子tag。
[0049]
在一个具体的实施方式中，向编码目标蛋白质的核酸中插入一个终止密码子taa。
[0050]
在一个具体的实施方式中，向编码目标蛋白质的核酸中插入两个终止密码子tag和taa。
[0051]
在本技术中，蛋白石密码子(tga)仍然用作终止密码子。
[0052]
对于编码目标蛋白质的核酸的类型，本发明没有任何限制，只要是能作为基因模板用于合成目标蛋白质即可，例如可以为线性dna或者mrna，也可以为环状dna或rna，可以是任何来源的dna或rna，也可以是任何结构形式的dna或rna，只要是能作为基因模板最终转录翻译成蛋白质即可。具体来说，如果是质粒dna，其表达质粒上只要是携带有编码目标蛋白质的基因即可。
[0053]
对于编码目标蛋白质的核酸，本发明没有任何限制，例如可以为编码荧光蛋白的基因、编码生物催化酶的基因、编码疫苗蛋白的基因、编码抗体蛋白的基因、编码膜蛋白的基因、编码多肽的基因等。
[0054]
在步骤二中，所述目标蛋白质可以根据需要选择，例如可以为荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上，优选为荧光蛋白。
[0055]
在一个具体的实施方式中，所述目标蛋白质为荧光蛋白sfgfp，其激发波长为485nm，发射波长为535nm。
[0056]
在一个具体的实施方式中，所述无细胞非天然蛋白质合成体系包含金属离子、trna、正交氨酰trna合成酶和非天然氨基酸。
[0057]
其中，所述金属离子选自mg
2
、fe
2
、fe
3
、zn

、mn

、cu

、ni

、w
6
、mo
6
、ca
2
和co
2
中的一种或两种以上。
[0058]
在一个具体的实施方式中，所述金属离子为mg
2
，其在无细胞非天然蛋白质合成体系中的浓度为0-50mm，例如可以为0mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm，优选为30-40mm。
[0059]
在一个具体的实施方式中，trna在无细胞非天然蛋白质合成体系中的浓度为0-300ng/μl，例如可以为0ng/μl、10ng/μl、20ng/μl、30ng/μl、40ng/μl、50ng/μl、60ng/μl、75ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、300ng/μl，优选为10-75ng/μl。
[0060]
在一个具体的实施方式中，正交氨酰trna合成酶在无细胞非天然蛋白质合成体系中的浓度为0-1mm，例如可以为0mm、0.02mm、0.04mm、0.06mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm，优选为0.06-0.3mm。
[0061]
在一个具体的实施方式中，所述非天然氨基酸选自p-炔丙基-l-苯丙氨酸、p-叠氮基-l-苯丙氨酸、4-碘-l苯丙氨酸、对乙酰基-l-苯丙氨酸、4-乙酰基-l-苯基丙氨酸、炔丙基-l-赖氨酸、n-ε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸、n6-cbz-l-赖氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、三氟甲基苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、nε-炔丙氧基羰基-l-赖氨酸、ε苄氧基羰基升赖氨酸、nε-((((e)-环辛-2-烯-1-基)氧基)羰基)-l-赖氨酸、α-boc-1-4-硝基苯丙氨酸、对叠氮甲基-l-苯丙氨酸、nε-p-叠氮苄氧羰基赖氨酸、nε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸、nε-丙烯酰赖氨酸、nε-(环辛基-2-炔-1-基氧基)羰基)l-赖氨酸、双环[6.1.0]非-4-炔-9-基甲醇赖氨酸、反式-环辛-2-烯赖氨酸、反式-环辛-4-烯赖氨酸、二氧代-tco赖氨酸、3-(2-环丁烯-1-基)丙酸、nε-降冰片烯-2-酰氧羰基-l-赖氨酸、环辛炔赖氨酸、5-降冰片烯-2-醇酪氨酸、环辛-2-炔醇酪氨酸、(e)-2-(环辛-4-烯-1-基酰氧基)乙醇酪氨酸、叠氮高丙氨酸、高丙炔基甘氨酸、叠氮亮氨酸、nε-2-叠氮乙氧羰基-l-赖氨酸、l-(7-羟基香豆素-4-基)乙基甘氨酸、2-氨基-3(5-二甲氨基)萘-1-(磺酰胺)丙酸、6-丙酰-2-(n,n-二甲基)-氨基萘中的一种或两种。
[0062]
在一个具体的实施方式中，所述非天然氨基酸在无细胞体系中的浓度为0-10mm，，例如可以为0mm、1mm、2mm、2.5mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm，优选为2-2.5mm。
[0063]
所述无细胞非天然蛋白质合成体系还可以包含能量源物质和氨基酸混合液，无机盐。
[0064]
所述能量来源物质为化学底物，其可被酶促地作用以提供能量来实现期望的化学反应，通常使用的能量来源允许通过断裂如存在于核苷三磷酸(例如atp)中的高能磷酸键来释放能量用于合成，可转变高能磷酸键的任何来源是特别适合的，通常，atp、gtp以及其他磷酸盐被认为是用于支持蛋白合成的等同的能量来源。
[0065]
在一个具体的实施方式中，所述能量源物质选自蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酸盐、多磷酸盐、磷酸烯醇式丙酮酸中的一种或两种以上。
[0066]
所述氨基酸混合液选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨
酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上。
[0067]
在一个具体的实施方式中，用无细胞蛋白质合成体系插入非天然氨基酸的方法包括以下步骤：
[0068]
向编码目标蛋白质sfgfp的核酸中插入tag和taa，
[0069]
将所述插入有两个终止密码子的编码目标蛋白质的核酸加入到无细胞非天然蛋白质合成体系中用于合成插入有非天然氨基酸的目标蛋白质。
[0070]
本发明还提供根据上述方法合成的蛋白质。
[0071]
实施例1无细胞蛋白质合成体系组分制备
[0072]
细胞提取物的制备
[0073]
1.本实施例使用的细胞提取物为商业化的e.coli bl21 star(de3)以及基因组被重新编码的c321.δa。菌株信息如下：
[0074]
2.溶液配制
[0075]
(1)2
×
ypt培养基：10g/l酵母提取物，16g/l蛋白胨，5g/l nacl，22mm kh2po4,40mm k2hpo4,固体培养基需要另加1.5％的琼脂。
[0076]
(2)dtt：配制终浓度为1m的dtt溶液，之后用0.22μm的滤头过滤除菌，储存于-20℃。
[0077]
(3)tris：配制终浓度为2m的tris溶液，之后用0.22μm的滤头过滤除菌,储存于室温。
[0078]
(4)s30a：60mm谷氨酸钾，14mm谷氨酸镁，50mm tris，使用乙酸调节ph值为7.7，4℃贮存。
[0079]
(5)s30b：60mm谷氨酸钾，14mm谷氨酸镁，使用2m tris调节ph值为8.2，4℃贮存。
[0080]
3.菌株培养
[0081]
(1)一级种子液：挑取单菌落接种于20ml的2
×
ytp-amp培养基中，置于37℃，220rpm摇床中过夜培养。
[0082]
(2)二级种子液：以2-5％的接种量将一级种子液接种于250ml 2
×
ytp-amp培养基中，置于37℃，220rpm摇床中培养3h。
[0083]
(3)三级发酵：二级种子液以2-5％的接种量接种于1l的摇瓶中，置于37℃，220rpm摇床中培养；若接种于4l发酵罐中，则在37℃，500rpm条件下培养。
[0084]
(4)收获细胞：培养过程中监测细胞的生长状况，在对数生长期的中后期，8000rpm，10min离心沉淀并收获细胞，用缓冲液s30a清洗菌体2～3次，离心后弃掉上清液，称量菌体质量。
[0085]
(5)破碎细胞：1g菌体添加1ml s30a，重悬使之成为匀浆。添加大量的冰或冰袋于高压破碎仪的腔室中使之保持低温，控制压力在15000～20000psi，破碎2次。
[0086]
(6)孵育：按1ml细胞裂解物添加3μl 1m ddt的比例加入dtt，37℃，120rpm避光孵育80min。
[0087]
(7)透析：4℃，13000
×
g离心30min，之后将上清转至6～8kda透析袋中，置于缓冲液s30b中，4℃透析过夜。
[0088]
(8)分装、冻存：收集透析过后的细胞提取物，将其4℃，13000
×
g离心30min，将所得上清分装于1.5ml离心管中，液氮闪冻，-80℃贮存。
[0089]
相关溶液配制
[0090]
1. 10
×
salt：用摩尔比为1:1的谷氨酸和氨水配制谷氨酸铵，无需调节ph，分装于1.5ml离心管中，液氮闪冻后于-80℃贮存。
[0091]
表1 10
×
salt组分
[0092][0093]
2. 25
×
pep：磷酸烯醇式丙酮酸(pep)配制全程置于冰上。按1g每毫升的比例加入无菌水，室温下用koh溶液调节ph为7.4，整个过程会放出较大热量，故要缓慢的滴入koh溶液。
[0094]
3.ntp mix：先分别配好1.5m亚精胺和1m腐胺，-80℃贮存，其他组分按下方的表格顺序逐一加入，需待上一药品全部溶解后再加入下一种药品。溶液的终ph值在7.4～7.6之间，分装于1.5ml的离心管中，液氮闪冻后置于-80℃保存。
[0095]
表2 ntp mix组分
[0096][0097]
4. 19aas：各氨基酸的浓度均为50mm，待前一种氨基酸完全溶解再加入下一种氨基酸，添加顺序按下表，最终的ph为8左右，使用浓盐酸调节ph至7.4。
[0098]
表3 19aas溶液组分
[0099]
[0100][0101]
5. 1m金属离子溶液：分别使用谷氨酸镁、氯化镁、氯化锰、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、钨酸钠、钼酸钠、氯化镍、氯化钙、氯化钴配制浓度为1m的母液，液氮闪冻，贮存于-80℃。
[0102]
6.氧化型谷胱甘肽(gssh)和还原性谷胱甘肽(gsh)：配制浓度为100mm的gssh和gsh储备液，需快速配制，液氮闪冻，储存于-80℃。
[0103]
7.拥挤剂：分别将peg200，peg400，peg600，peg1000，peg4000，peg8000，dextran5，dextran500，海藻糖，乙二醇，甘油，肉碱，乳糖，三甲基甘氨酸和棉子糖配置成质量浓度为20％的母液，液氮闪冻，贮存于-80℃。
[0104]
8.t7 rna聚合酶
[0105]
(1)相关溶液配制
[0106]
1)lb培养基：1％nacl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，固体培养基需加1.5％琼脂。
[0107]
2)细胞裂解液：50mm nacl，10mm edta，10mm磷酸氢二钾，1mm dtt，10mmβ-巯基乙醇，1
×
蛋白酶抑制剂，5％甘油，ph 8.0。
[0108]
3)s30缓冲液：终浓度为10mm的tris-乙酸，60mm的乙酸钾，14mm的乙酸镁，用乙酸调ph为8.2。
[0109]
4)透析缓冲液：终浓度为50mm的nacl，1mm的edta，40mm的磷酸氢二钾，1mm的dtt，20％蔗糖，ph 7.7。
[0110]
(2)操作步骤
[0111]
1)将菌株e.coli bl21(de3)-par1219(含有t7 rna聚合酶质粒)活化，挑取单菌落于20ml lb液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床中过夜培养，获得种子液。
[0112]
2)将种子液按5％的接种量转接于含有250ml lb培养基的1l挡板摇瓶中，置于37
℃，220rpm摇床中振荡培养。
[0113]
3)培养至od
600
值为0.6～0.8时，向菌液中加入iptg使其终浓度为0.1mm。
[0114]
4)继续培养，当od
600
值为2时，4℃，10000
×
g，10min离心收获菌体。
[0115]
5)将菌体转移至50ml的bd管中，测量菌体质量，加入适量的s30缓冲液洗涤菌体2次(4℃，10000
×
g，10min)。
[0116]
6)每克菌体湿重加入1ml提前预冷的细胞裂解液，重悬菌体。超声破碎仪破碎细胞2～3次。将破碎后的液体4℃，13000
×
g，离心30min，留上清。
[0117]
7)将上清液转移至6～8kda透析袋，置于1l预冷的透析缓冲液中4℃过夜透析。
[0118]
8)转移至bd管中，4℃，13000
×
g，30min离心，收集上清液。将上清分装至1.5ml离心管中，液氮闪冻，贮存于-80℃。
[0119]
实施例2细胞非天然蛋白质合成体系组分制备
[0120]
2.1基因表达模板制备
[0121]
本实施例中非天然氨基酸合成部分用到的目标蛋白为sfgfp，其氨基酸序列为：
[0122]
mrkgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvrgegegdatngkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertisfkddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyitadkqkngikanfkirhnvedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsvlskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykhhhhhh*(seq id no:1)
[0123]
编码目标蛋白质的核酸序列为：
[0124]
atgcgtaaaggcgaagagctgttcactggtgtcgtccctattctggtggaactggatggtgatgtcaacggtcataagttttccgtgcgtggcgagggtgaaggtgacgcaactaatggtaaactgacgctgaagttcatctgtactactggtaaactgccggtaccttggccgactctggtaacgacgctgacttatggtgttcagtgctttgctcgttatccggaccatatgaagcagcatgacttcttcaagtccgccatgccggaaggctatgtgcaggaacgcacgatttcctttaaggatgacggcacgtacaaaacgcgtgcggaagtgaaatttgaaggcgataccctggtaaaccgcattgagctgaaaggcattgactttaaagaagacggcaatatcctgggccataagctggaatacaattttaacagccacaatgtttacatcaccgccgataaacaaaaaaatggcattaaagcgaattttaaaattcgccacaacgtggaggatggcagcgtgcagctggctgatcactaccagcaaaacactccaatcggtgatggtcctgttctgctgccagacaatcactatctgagcacgcaaagcgttctgtctaaagatccgaacgagaaacgcgatcatatggttctgctggagttcgtaaccgcagcgggcatcacgcatggtatggatgaactgtacaaa catcaccatcaccatcat*(seq id no:2)
[0125]
sfgfp序列位于pet-23a的rbs和t7端之间，在sfgfp和aars的末端加入his标签进行蛋白纯化。通过基因突变，设计引物，将原始sfgfp质粒扩增成相应位点突变的sfgfp突变体。目标蛋白质嵌入位点的选择为23位点和35位点。单位点嵌入实验中，将相应位点的核酸序列分别突变为tag，taa，tga；双位点嵌入实验中将两位点分别突变为tag，taa和taa，tag。氨基酸序列如下：(*代表tag/taa/tga突变处)
[0126]
23tag-sfgfp/23taa-sfgfp/23tga-sfgfp:
[0127]
makgeelftgvvpilveldgdv*ghkfsvrgegegdatngkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertisfkddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyitadkqkngikanfkirhnvedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsvlskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykhhhhhh*
[0128]
35tag-sfgfp/35taa-sfgfp/35tga-sfgfp:
[0129]
makgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvrgege*datngkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertisfkddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyitadkqkngikanfkirhnvedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsvlskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykhhhhhh*
[0130]
23taa35tag-sfgfp:
[0131]
makgeelftgvvpilveldgdv*ghkfsvrgege*datngkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertisfkddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyitadkqkngikanfkirhnvedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsvlskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykhhhhhh*
[0132]
2.2正交翻译组分(ots)的制备
[0133]
2.2.1.非天然氨基酸溶液配制：
[0134]
本文中所用到的非天然氨基酸为：p-炔丙基-l-苯丙氨酸(ppaf，medchem source llp，lot#al-02-22)、p-叠氮基-l-苯丙氨酸(pazf，百灵威科技有限公司，cat.no.:33173-53-4)、4-碘-l苯丙氨酸(4-i-l-phe，阿拉丁)，配制成100mm的母液，-4℃避光保存。
[0135]
2.2.2氨酰trna合成酶(aars)制备：
[0136]
本文用到三种aars，分别为用于嵌入ppaf的ppafrs、用于嵌入pazf的pazfrs以及用于嵌入4-i-l-phe的phers。
[0137]
(1)载体及宿主细胞的选择：本实验中用到的aars均构建在含有t7启动子以及his-tag的pet24a载体上。aars合成酶的宿主细胞为bl21(de)3。
[0138]
(2)质粒的构建：利用pcr法对目的片段和载体分别进行扩增并回收。利用gibson组装法，将目的片段及载体连接。利用化学化转的方法将连接好的质粒化学转化到宿主细胞bl21(de)3中。第二天挑取单菌落测序，测序成功的单菌落可保菌进行后续实验。
[0139]
(3)纯化：纯化方法同本文中大批量蛋白纯化。纯化后测量浓度，保存于-80℃待用。
[0140]
2.2.3.trna制备：
[0141]
(1)相关溶液准备
[0142]
1)无水乙醇，置于-20℃贮存。
[0143]
2)70％乙醇，置于-20℃贮存。
[0144]
3)3m乙酸钠(ph 5.5)，置于4℃贮存。
[0145]
(2)正交trna设计
[0146]
本文中使用的三种trna序列，由金唯智公司合成，序列如下：
[0147]
trna
cua
：
[0148]
gcttttagatcttaatacgactcactatagggagaccggctgatgagtccgtgaggacgaaacggtacccggtaccgtcccggcggtagttcagcagggcagaacggcggactctaaatccgcatggcaggggttcaaatcccctccgccggacca(seq id no:3)
[0149]
trna
uua
：
[0150]
gcttttagatcttaatacgactcactatagggagaccggctgatgagtccgtgaggacgaaacggtacccggtaccgtcccggcggtagttcagcagggcagaacggcggactttaaatccgcatggcaggggttcaaatcccctccgccggacca(seq id no:4)
[0151]
trna
uca
：
[0152]
gcttttagatcttaatacgactcactatagggagaccggctgatgagtccgtgaggacgaaacggtacccggtaccgtcggggggatagctcagtcggtagagcaggggatttcaaatccccgtgtccttggttcgattccgagtccccccacca(seq id no:5)
[0153]
1)载体及宿主细胞选择：本实验中用到的trna片段均构建在含有t7启动子以及his-tag的pet23a载体上。trna的宿主细胞均为dh5α。
[0154]
2)质粒构建：利用pcr法对目的片段和载体分别进行扩增并回收。利用gibson组装法，将目的片段及载体连接。利用化学化转方法将连接好的质粒化学转化到宿主细胞dh5α中。第二天挑取单菌落测序，测序成功的单菌落可保菌进行后续实验。
[0155]
3)trna片段扩增：使用pfu dna聚合酶反应体系扩增trna片段。
[0156]
4)乙醇沉淀trna片段：将pcr产物采用乙醇沉淀法进行回收。首先加入总体积1/10的3m乙酸钠，两倍总体积的无水乙醇，混合均匀后置于-20℃过夜。次日，4℃，10000rpm，离心10min，取上清，使用70％乙醇将沉淀重悬并转移至1.5ml离心管中，10000rpm，离心5min，弃上清。之后放置于37℃恒温培养至乙醇挥发，根据所需浓度加入适量无菌水，待溶解后，离心测上清为终trna片段的浓度。
[0157]
实施例3基于多种终止子抑制的cfups体系的建立
[0158]
3.1目的蛋白模板的设计与制备
[0159]
针对三种终止子抑制方法设计了两种不同位点突变的sfgfp，即23位点和35位点。六种目的蛋白分别是：为tag抑制设计的23tag-sfgfp和35tag-sfgfp；为taa抑制设计的23taa-sfgfp和35taa-sfgfp；为tga抑制设计的23tga-sfgfp和35tag-sfgfp，其具体序列如实施例2所示。
[0160]
蛋白模板设计方法示意图及蛋白结构图如图2所示。将编码目标蛋白的核酸序列构建在载体pet23a上，并对其质粒进行大批量提取。将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明质粒提取成功。加ddh2o将浓度稀释至300ng/μl进行保存。
[0161]
3.2.trna制备
[0162]
按实施例2中所述方法制备三种trna，将trna片段进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明，使用pcr法成功地扩增出三种trna。之后用乙醇沉淀法纯化trna，加ddh2o稀释至1500ng/μl，于-20℃保存。
[0163]
3.3.氨酰trna合成酶(aars)制备：
[0164]
3.3.1.三种aars表达
[0165]
三种aars的蛋白分子量分别为ppars：36.0kda；pazfrs：36.1kda；phers：88.2kda。本实验中表达载体选择表达aars效果好的pet24a，将其导入到宿主细胞e.coli bl21(de3)中培养，并在30℃条件下使用诱导剂iptg进行小批量诱导表达，检测全蛋白样品以及上清样品，结果如图3所示。
[0166]
其中，左图是在bl21(de3)宿主菌中，pet24a-ppafrs和pet24a-ppafrs的表达结果。与空菌对照相比，两种aars的全蛋白和上清蛋白样品有明显的蛋白条带，条带位置与目标蛋白大小一致，且两种aars的全蛋白及上清蛋白表达量无明显差异。说明pet24a-ppafrs及pet24a-pazfrs可在bl21(de3)宿主菌中宿主菌中表达，且可以以可溶蛋白形式高效表达。右图是在bl21(de3)宿主菌中pet24a-phefrs的表达结果。全蛋白及上清蛋白有明显的
蛋白表达条带，且条带位置与目标蛋白大小一致。综上，ppars，pazfrs和phers均能以可溶形式较高效的表达，但还需进一步测试它们是否具有活性。
[0167]
3.3.2.aars的活性检测(以ppafrs为例)
[0168]
1)使用纯化系统纯化pet24a-ppafrs，之后透析并浓缩蛋白样品，结果表明已经将pet24a-ppafrs成功纯化。根据bsa标准曲线测定蛋白浓度，其最终浓度为9mg/ml。
[0169]
2)将纯化后的ppafrs加入到cfpus体系中(表4)，使用sfgfp测试其活性。使用天然的sfgfp为阳性对照，含有tag位点突变的sfgfp为实验组，同时设置无ppaf为阴性对照组。由图4可知：
[0170]
(1)对于sfgfp阳性对照组实验结果而言，加入ppaf使荧光值降低，说明unaa的加入会抑制cfups体系的表达。
[0171]
(2)对比实验组23tag-sfgfp和35tag-sfgfp，发现实验组加入ppaf后，即使unaa会抑制cfups的表达，荧光值仍然明显提高，可认为ppaf成功嵌入到sfgfp中，即ppafrs发生酰化作用，可进行后续实验。
[0172]
3.3.3.三种aars的纯化、浓缩及贮存
[0173]
结合上述结果，将三种aars使用系统纯化，浓缩和sds-page分析，保存在20％的蔗糖溶液中。三种aars的贮存浓度分别为：ppafrs：9mg/ml；pazfrs：2mg/ml；phers：9mg/ml。
[0174]
3.4cfups基础体系优化
[0175]
按照表4构建cfups体系，对mg
2
浓度、ots浓度、unaa浓度进行优化。其中，无细胞体系的蛋白荧光值按照以下方法检测：将无细胞体系稀释40倍，加入黑色的96孔板中，使用酶标仪测定荧光值，其中sfgfp的激发波长为485nm，发射波长为535nm。
[0176]
表4 cfps和cfups反应体系
[0177][0178][0179]
3.4.1氧化还原环境探索
[0180]
不同种类蛋白质因其结构不同，其氧化还原合成条件也不尽相同。因此通过在cfups体系中调节氧化型谷胱甘肽(gssg)与还原型谷胱甘肽(gsh)的比例，设计不同的氧化还原条件，进行筛选。结果如图5所示，其中a为在tag抑制中，最适氧化还原环境的筛选结果；b为在taa抑制中，最适氧化还原环境的筛选结果；c为tga抑制中，最适氧化还原环境的筛选结果。在tag、taa和tga抑制中，不同氧化还原环境下的蛋白荧光值。结果显示，非天然蛋白质在不同氧化还原条件下荧光值基本相同。氧化还原环境对不同终止密码子抑制的
cfups体系几乎没有影响。
[0181]
3.4.2最适mg
2
浓度的探索
[0182]
mg
2
浓度会随着不同种类细胞提取物及蛋白质的改变而改变。因此，需对三种终止子抑制的最适mg
2
浓度进行筛选。在tag、taa和tga抑制中，不同mg
2
浓度对蛋白表达的影响见图6，其中a为在tag抑制中，最适mg
2
浓度的筛选结果；b为在taa抑制中，最适mg
2
浓度的筛选结果；c为tga抑制中，最适mg
2
浓度的筛选结果。结果显示，tag抑制，taa抑制，tga抑制的最适mg
2
浓度分别为30mm，40mm和35mm。
[0183]
3.4.3最适trna浓度的筛选
[0184]
在cfups体系中，trna结合unaa，将其运载到核糖体并嵌入到天然的肽链中，从而合成非天然蛋白质。因此，trna的浓度会直接影响unaa的运载效率，影响非天然蛋白质的表达水平。因此，需对三种终止子抑制的最适trna浓度进行筛选，结果如图7所示。
[0185]
(1)图7a图表示的是在tag抑制中不同trna浓度下的蛋白荧光值。随着cfups体系中trna浓度的提高，天然蛋白sfgfp的表达量逐渐降低，说明添加外源trna对cfups体系有毒性作用，抑制其表达。然而非天然蛋白质的表达量先呈现升高的趋势，当达到75ng/μl以后荧光值开始降低。因此，trna的最适添加浓度为75ng/μl。
[0186]
(2)图7b图为在taa抑制中不同trna浓度下的蛋白荧光值。随着cfups体系中trna浓度的提高，非天然蛋白质的表达量呈现先升高后降低的趋势，浓度为75ng/μl时，蛋白荧光值最高。因此，trna的最适添加浓度为75ng/μl。
[0187]
(3)图7c图显示的是在tga抑制中不同trna浓度下的蛋白荧光值。随着trna浓度的提高，非天然蛋白质的荧光值没有明显的提升。当trna浓度为10ng/μl时，蛋白表达量略高于其它浓度。
[0188]
3.4.4最适aars浓度的筛选
[0189]
在cfups体系中，aars作用是酰化unaa将其结合到对应的trna上。与trna相同，aars对cfups体系也有一定的毒性作用。因此，在保证aars的添加量可以发挥作用的同时，应尽可能降低其对cfups体系的抑制作用。因此，在trna浓度最优时，测试了三种终止子抑制的最适aars浓度。结果如图8所示。
[0190]
(1)图8a图和8b图分别为在tag和taa抑制中，不同aars浓度下的蛋白荧光值。从荧光值结果中可知，当ppafrs浓度为0.06mm时，非天然蛋白质表达量最高；当pazfrs浓度为0.1mm时，非天然蛋白质表达量最高。
[0191]
(2)图8c图表示的是在tga抑制中，不同aars浓度下的蛋白荧光值。随着aars浓度的提高，非天然蛋白质的荧光值没有明显变化。当phers浓度为0.3mm时，非天然蛋白表达量略高于其它浓度。
[0192]
3.4.5最适unaa浓度的筛选
[0193]
外源unaa的添加有时会影响cfups体系的表达。在trna和aars均为最适浓度的情况下，测试了三种终止子抑制的最适unaa浓度，结果如图9所示。
[0194]
(1)图9a和9b分别是在tag和taa抑制中，不同unaa浓度下的蛋白荧光值。当ppaf浓度为2mm时，非天然蛋白质表达量最高；当pazf的浓度为2.5mm时，非天然蛋白质表达量最高。因此，tag抑制和taa抑制中unaa的最适浓度分别为2mm和2.5mm。
[0195]
(2)图9c是在tga抑制中，不同unaa浓度下的蛋白荧光值。随着unaa浓度的提高，非
天然蛋白质的荧光值没有明显的变化。当4-i-l-phe浓度为2mm时，非天然蛋白表达量略高于其它浓度。
[0196]
3.5质谱验证
[0197]
利用上述优化的三种终止子抑制cfups体系合成非天然的sfgfp，对其进行蛋白质谱分析。在16孔板中分别表达1ml的cfups体系，表达含有his-tag标签的非天然蛋白质，使用重力柱纯化蛋白，10kda超滤管浓缩蛋白，12.5％sds-page分析，从凝胶中切下目的蛋白条带并进行质谱检测。sfgfp第23位点原为asn，35位点原为gly。预期结果为：tag抑制能够在两位点检测到炔丙基修饰的phe存在，即表明ppaf成功嵌入；taa抑制能够在两位点检测到叠氮基修饰的phe存在，即表明pazf成功嵌入；tga抑制能够在两位点检测到碘修饰的phe存在，即表明4-i-l-phe成功嵌入。质谱结果如图10所示。
[0198]
(1)图10a和图10b分别为tag抑制在23位点和35位点嵌入ppaf的质谱分析图，结果表明在第23位点和35位点检测到高出phe分子量54.01063g/mol的炔丙基信号。
[0199]
(2)图10c和图10d分别为taa抑制在23位点和35位点嵌入pazf的质谱分析图，结果表明在第23位点和35位点检测到了高出phe分子量41.0014g/mol的叠氮基信号。
[0200]
(3)tga抑制的23位点及35位点在质谱分析中并没有检测到碘修饰，只检测到了天然氨基酸phe，原因可能其ots组分trna
uca
，phers，4-i-l-phe之间的正交性差，4-i-l-phe与phe之间发生了竞争，phers将天然的phe结合到了trna
uca
上，也可能是内源的aars酰化了天然氨基酸phe并结合至trna
uca
上合成了天然sfgfp。
[0201]
实施例4cfups体系中两种unaas嵌入
[0202]
利用一种抑制方式只能实现一种unaa的位点特异性嵌入，若想实现不同种unaas的位点特异性嵌入，需要使用不同种抑制方式相结合的方法去实现。本实施例利用已经成功建立的tag抑制法和taa抑制法将两种unaas嵌入到天然的sfgfp中。首先设计了含有位点突变的非天然sfgfp，之后利用两种抑制方式的最优ots组分将两种unaas(ppaf和pazf)嵌入，最后使用蛋白表达及质谱验证方式验证两种unaas的位点特异嵌入。
[0203]
4.1目的蛋白模板的设计与制备
[0204]
设计了目的蛋白序列，将23位点和35位点分别突变为taa和tag的非天然sfgfp：23taa35tag-sfgfp。其目的是在23位点嵌入pazf，35位点嵌入ppaf。设计方法示意图如图11。将目的蛋白的序列构建在pet23a载体上，并对其质粒进行大批量提取。将质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现质粒提取成功。加ddh2o将浓度稀释至300ng/μl进行保存。
[0205]
4.2体系优化
[0206]
实施例3中的研究表明氧化还原环境对三种终止子抑制方式的cfups体系无影响，因此本实施例只对基础体系中的最适mg
2
浓度进行筛选。此外，由于实现两种unaas的嵌入，需要两种ots组分，影响因素较多，因此设计了正交试验对最适当的ots组分浓度进行筛选。
[0207]
4.2.1最适mg
2
浓度的筛选
[0208]
本实验对cfups体系进行最适mg
2
浓度的筛选，结果如图12所示。结果显示，随着mg
2
浓度的增加，23taa35tag-sfgfp的荧光值呈现先升高后降低的趋势，在mg
2
浓度为30mm时达到最高值，表明cfups体系的最适mg
2
浓度均为30mm。
[0209]
4.2.2最适ots组分的正交筛选
[0210]
实验中含有两种ots组分，每个组分中含有3个元素，每种因素设计5个浓度梯度。
为筛选出最适的ots组分浓度，设计了6因素5水平的正交试验(表5)。根据表中ots组分的浓度进行cfups实验，结果如图13显示，实验组2的荧光值最高。因此在之后的蛋白表达和质谱验证实验中选择的ots浓度为：ppafrs为0.02mm，trna
cua
为25ng/μl，ppaf为2.5mm；pazfrs为0.05mm，trna
uua
为25ng/μl，pazf为2.5mm。
[0211]
表5正交试验表
[0212][0213][0214]
4.2.3嵌入结果验证
[0215]
4.2.3.1蛋白表达初步验证
[0216]
本实施例尝试利用tag抑制及taa抑制嵌入ppaf和pazf。将优化后的组分按最适浓度添加到cfpus体系中，表达非天然蛋白质，以无unaa和有unaa两组为对照组。
[0217]
蛋白表达验证的结果由图14所示，由此可知：
[0218]
(1)sfgfp组中，加入两种unaas使sfgfp的荧光值降低，说明外源unaas加入会抑制其蛋白表达。
[0219]
(2)实验组结果显示，在外源unaas抑制体系表达的情况下，加入unaas后其荧光值明显高于无unaas组。可初步说明有unaas嵌入到天然的sfgfp中，但是否位点特异性的嵌入
到sfgfp中，仍需要进行质谱验证。
[0220]
4.2.3.2质谱验证
[0221]
利用上述cfups体系合成非天然的绿色荧光蛋白，并进行蛋白质谱分析。在16孔板中分别表达1ml的cfups体系，表达含有his-tag标签的非天然蛋白质，使用重力柱纯化，10kda超滤管浓缩，12.5％sds-page分析，从凝胶中切下目标蛋白条带，进行质谱检测，结果如图15所示。
[0222]
从图15可见，23taa35tag-sfgfp第23位点检测到叠氮基信号，35位点检测到炔基信号。结果表明，利用tag抑制和taa抑制结合的方式可实现两种unaas嵌入到天然sfgfp中。