一种制备具有不同分子量分布特点的阿拉伯木聚糖方法与流程

1.本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种制备具有不同分子量分布特点的阿拉伯木聚糖方法。


背景技术：

2.玉米是我国三大主粮之一，玉米皮是玉米深加工的副产品，占玉米总质量的10％-15％，其半纤维素含量达到70％左右。玉米皮纤维是目前已知的最为复杂的植物半纤维素，其木聚糖主链的侧链化程度非常高，玉米皮纤维中超过70％的主链木糖残基具有一个或多个侧链，侧链包含阿拉伯糖、阿魏酸、香豆酸等多种取代基。玉米皮降解产物在食品及医药领域具有很高的应用价值。玉米皮纤维中阿拉伯糖含量为植物组织中含量最高，其可降解为阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)，而阿拉伯木寡糖具有多种生物功能，例如促进肠道益生菌生长、提高细胞干扰素和白细胞杀菌素杀菌能力、抑制癌细胞生长和附着；阿魏酸(ferulic acid)具有抗血小板聚集、镇痛、缓解血管痉挛、阿尔茨海默病治疗等作用。但玉米皮目前主要用于饲料和发酵基料。
3.玉米皮纤维低聚糖的制备方法主要包括化学法、物理法及酶法。酶法具有条件温和、酶解特异性强产物可控、能最大限度地回收有效成分等优点。
4.内切-β-1,4-木聚糖酶(β-1,4-xylanase,ec 3.2.1.8)是一种糖苷水解酶，能够催化水解木聚糖主链β-1,4-d-木糖苷键生成木寡糖，是木聚糖降解酶系中最重要的一类糖苷水解酶。目前，已报道的木聚糖酶大多分布在gh10家族和gh11家族。嗜盐/耐盐性是酶的重要特性。嗜盐/耐盐木聚糖酶一般是指在高盐浓度下(0.5～4.5m)保持有催化活性的木聚糖酶。嗜盐/耐盐木聚糖酶在海产品、腐乳、面制品等高含盐量食品的加工生产中有很大的应用潜力。目前己报道的耐盐木聚糖酶多属于gh10家族，而属于gh11家族的耐盐木聚糖酶则非常少。
5.目前还未见在高盐体系中，应用gh10家族和gh11家族极端嗜盐/耐盐木聚糖酶水解玉米纤维胶，制备具有不同分子量分布特点的阿拉伯木聚糖的报道，而这些差异使阿拉伯木聚糖可能具有不同的理化性质和生物学功能。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，提出并完成了本发明。
7.本发明的目的是提供一种制备具有不同分子量分布特点的阿拉伯木聚糖方法。
8.根据本发明的制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖方法，所述方法包括以下步骤：
9.以木聚糖酶在高盐浓度下水解玉米纤维胶，制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖。
10.根据本发明的制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖方法，其中，所示木聚糖酶的氨基酸序列如seq id no：1或seq id no：3所示。
11.seq id no：1
12.lpkrqttglsahsrqttglntiaqaaglkylgsatdnpeltdthyvailsdssefgqltpgnsmkwdateptqgqfsfdnadaivelaqnnsqlirghtcvwysqlpswvsngswdadslnvamtthtstvvdhfkgkiyswdvvneafeddgsfrqnvfyttigedyianafkaaraadpdaklyindyniegtgakadalytfvssllnasvpidgigmqahlivgsvpttiqeniarftalglevalteldirmpvpaaeadleqqkadyeavvgacaavegcvgvtvwdytdkyswvpsvfdgygaalpwdenlekkpaydgivsglga。
13.其基因序列如seq id no：2所示：
14.ctccccaagcgtcagaccactggcctcagcgcccactcgcggcaaacgaccggccttaacaccatcgcgcaagccgccggcctcaagtacctcggctccgcgacggacaaccccgaattgacggacacgcactacgtcgcgatcctgagcgactcgagtgagtttgggcagctcacgccggggaatagtatgaagtgggacgccacggagcccacgcagggacagttctcgttcgacaatgcggacgcgatcgtggagcttgctcagaacaacagccagctcattcgaggtcacacctgcgtttggtacagtcagctgcccagctgggtctcaaacgggtcctgggacgcggactcgctgaatgtggccatgacgacgcatacttcgacggtggtcgatcatttcaagggcaaaatatatagctgggatgtagtaaacgaggcgtttgaggacgacggcagcttccgtcagaacgtcttctacacaaccatcggcgaggattacatcgccaacgcgttcaaagccgcccgcgcggctgaccctgatgcaaaactttatatcaacgactacaacatcgaaggcaccggcgccaaagccgacgcgctctacaccttcgtctcctcccttctcaacgcctccgtccccatcgacggcatcggcatgcaggcgcacctcatcgtcggctctgtcccaacgaccatccaggagaacatcgcgcgcttcactgctttgggcctcgaggttgcgctcacggagctcgacatacggatgcctgtgcccgccgccgaggcggatttggagcagcagaaggcggattacgaggccgtggtgggcgcgtgtgcggcggtggaggggtgcgtgggtgtgacggtctgggattatacggataagtactcctgggttccgagtgtcttcgatgggtatggagcggctttgccgtgggatgagaacttggaaaagaagccagcttacgacgggatcgtgagcggcttgggtgca.。
15.seq id no：3
16.splnatdvvdvsarsgtpsstgtdggyyyswwtdgagdatyqnngggsytltwsgnngnlvggkgwnpgaasrsisysgtyqpngnsylsvygwtrsslieyyivesygsydpssaashkgsvtcngatydilstwrynapsidgtqtfeqfwsvrnpkkapggsisgtvdvqchfdawkglgmnlgsehnyqivategyqssgtatitvt。
17.其基因序列如seq id no：4所示：
18.tcgccgctcaatgcgacggacgtcgttgacgtctccgctcgctccggtactcctagctcgaccggtaccgatggtggctactactactcttggtggacggacggtgctggtgacgccacctaccaaaacaacggcggtggatcgtacaccttgacctggtctggcaacaacggcaacctcgtcggcggaaagggatggaacccaggagctgcgtcccgctccatctcttactccggcacctaccagcccaacggcaacagctacctctccgtctacggctggacgcgcagctcgctcatcgagtactacatcgtcgagtcctacggctcctacgacccgtcctccgcggccagccacaagggctccgtcacctgcaacggcgccacgtacgacatcctctccacctggcgctacaacgcgccctccatcgacggcacgcagaccttcgagcagttctggagcgtccggaacccgaagaaggcgcccggagggtcgatcagcgggaccgtcgacgtccagtgccacttcgatgcttggaagggactcgggatgaacttgggtagcgagcacaactaccagatcgtggctaccgaaggctatcagagcagcggcactgcgaccatcacggtcacgtaa。
19.根据本发明的制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖方法，其中，所述木糖酶为氨基酸序列如seq id no：1和seq id no：3所示的木聚糖酶。
20.根据本发明的制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖方法，其中，以木聚糖酶在包含1～5m钠盐的环境下水解玉米纤维胶，制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖。
21.根据本发明的制备具有不同分子量分布的阿拉伯木聚糖方法，其中，所述玉米纤维胶通过以下步骤制备而得：
22.1)称取玉米皮粉，加入正己烷、搅拌、过滤、清洗，干燥后以α-淀粉酶处理，然后加入糖化酶，向上述处理液中加入中性蛋白酶，酶解后灭活、过滤。
23.2)称取步骤1)获得的样品，加入naoh、ca(oh)2和水，加热，反应后离心分离上清和沉淀；
24.3)向步骤2)获得的上清液加入h2o2，调整溶液的ph为碱性，室温搅拌，然后将ph值调整到酸性，离心分离上清液，向上清液加入无水乙醇，得到白色絮状沉淀物，即为玉米纤维胶。
25.4)向步骤2)获得的沉淀加入蒸馏水，再加入h2o2，调ph至碱性，加热，冷却后离心分离上清液，调节上清液的ph至为酸性，再离心分离上清液后加入无水乙醇，得到白色絮状沉淀，即为玉米纤维胶。
26.5)混合上述步骤3)和步骤4)获得的玉米皮纤维胶。
27.本技术发现，结构复杂天然底物在高盐体系中的理化状态会发生改变，进而影响酶催化效率和酶解产物的特点。此外，高盐体系能够减少酶解底物制备低聚糖过程中的微生物污染和杂菌生长，因此不需要对底物和反应体系采取高温灭菌或加入抑菌剂等处理，能够降低成本、防止高温对生物活性物质的破坏、减少其他抑菌成分的使用。本技术为以玉米皮为原料工业化制备特定分子量的功能性阿拉伯木聚糖提供了基础，有助于粮食加工副产物的资源化利用，延长粮食加工产业链，带动粮食经济发展。
附图说明
28.图1为重组木聚糖酶scxyn5的蛋白纯化电泳图片；
29.图2为重组木聚糖酶scxyn22的蛋白纯化电泳图片；
30.图3显示重组木聚糖酶scxyn22最适ph值；
31.图4显示重组木聚糖酶scxyn22最适温度；
32.图5显示重组木聚糖酶scxyn5最适ph值；
33.图6显示重组木聚糖酶scxyn5最适温度；
34.图7显示nacl浓度对scxyn5水解活性影响；
35.图8显示nacl浓度对scxyn22水解活性影响；
36.图9显示nacl浓度对scxyn5水解cfg效率影响；
37.图10显示nacl浓度对scxyn22水解cfg效率影响；
38.图11显示nacl浓度对cfg流变性的影响。
具体实施方式
39.试验材料和试剂
40.1、菌株及载体：表达宿主pichiapastoris gs115，表达质粒载体ppic9k；
41.2、工具酶及生化试剂：内切酶购自new england biolabs公司，重组酶购自全式金公司，桦木木聚糖购自sigma公司，小麦阿拉伯木聚糖购自megazyme公司；玉米皮购自河北广玉淀粉公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)；
42.3、培养基：
43.(1)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(v/v)，1.34％ynb，0.00004％biotin，
44.(2)bmmy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，0.5％甲醇(v/v)。
45.实施例1木聚糖酶重组载体的构建
46.以s.commune sp.db1来源的gh10和gh11家族木聚糖酶scxyn5-pet28a和scxyn22-pet28a为模板，采用pcr反应克隆木聚糖酶基因scxyn5和scxyn22片段，其中，木聚糖酶scxyn5的氨基酸序列如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq id no：2所示，木聚糖酶scxyn22的氨基酸序列如seq id no：3所示，核苷酸序列如seq id no：4所示，引物和反应条件如下：
47.scxyn5-f：5
′‑
ccggaattcctcccc aagcgtcagaccact-3
′
；
48.scxyn5-r：5
′‑
cgctagcggccgctgcacccaag ccgctcac-3
′
；
49.scxyn22-f：5
’‑
ccggaattc tcgccgctcaatgcgacg-3’；
50.scxyn22-r：5
’‑
cgcta gcggccgcgtgaccgtgatggtcgca-3’。
51.扩增产物分别经过ecorⅰ和notⅰ双酶切后直接与切开的ppic9k质粒进行连接，转化transi-t1感受态，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子即为重组酵母表达质粒ppic9k-scxyn5和ppic9k-scxyn22。
52.实施例2重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的构建
53.将重组表达载体ppic9k-scxyn5和ppic9k-scxyn22用内切酶saci线性化并转化毕赤酵母gs115，获得重组酵母菌株gs115/ppic9k-scxyn5，gs115/ppic9k-scxyn22。
54.挑取阳性转化子转接于含5ml bmgy培养基的50ml三角瓶中，置于30℃，230rpm摇床培养36h；将发酵液3000g离心5min，弃上清后沉淀菌体用5ml的bmmy培养基重悬，再置于30℃，230rpm摇床诱导培养72h。如图1和图2所示，发酵液取上清用于酶活性检测和sds-page电泳检测。
55.实施例3重组木聚糖酶的活性分析
56.木聚糖酶酶活力检测方法如下：200μl的酶解反应体系包含190μl底物和10μl适当的稀释酶液，在给定的温度和ph条件下保温反应10min，随后加入300μl的dns试剂，沸水煮5min。样品冷却后测定540nm下的吸光值。1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下，每分钟生成1μmol还原端所需的酶量。
57.1、重组木聚糖酶最适ph测定方法如下:
58.将实施例2纯化的重组木聚糖酶在不同的ph下酶促反应以测定其最适ph。底物桦木木聚糖用不同ph的缓冲液中(0.1mol/l gly-hcl缓冲溶液，1.5-3.0；0.1mol/l柠檬酸缓冲液，3.0-7.0；0.1mol/lnah2po
4-na2hpo4缓冲液，6.5-8.0；0.1mol/ltris-hcl缓冲溶液，7.5-8.5；0.1mol/l gly-naoh缓冲溶液，8.5-10.5)50℃下进行木聚糖酶活力测定。结果表明，重组木聚糖酶scxyn5最适反应ph大致在5.0-6.0左右(图3)；重组木聚糖酶scxyn22最适反应ph大致在4.0-5.0左右(图4)。
59.2、重组木聚糖酶最适温度测定方法如下:
60.重组木聚糖酶最适温度的测定为在0.1mol/l柠檬酸缓冲液各自最适ph缓冲液体
系及不同温度下进行酶促反应。结果表明,重组木聚糖酶scxyn5最适温度在65-75℃左右(图5)；重组木聚糖酶scxyn22最适温度在45-55℃左右(图6)。
61.3、nacl浓度对酶活性的影响
62.nacl浓度对酶活性的影响：以桦木木聚糖为底物，在含有不同浓度nacl(1-5m)缓冲体系中和最佳ph、温度下，参照上述测定重组木聚糖酶的水解活性。以未加入nacl反应体系酶活计100％，scxyn5在含有1～5m的nacl反应体系中，水解桦木木聚糖的酶活力分别提高了1.18、1.46、1.88、2、2.13倍(图7)；scxyn22在含有1～5m的nacl反应体系中，水解桦木木聚糖的酶活力分别提高了1.64、2.13、2.31、2.39、2.3倍(图8)。
63.实施例4阿拉伯木聚糖的制备
64.1、玉米纤维胶制备
65.玉米纤维胶的提取步骤如下：
66.1)玉米皮干燥粉碎后过60目筛。称取50g玉米皮粉，加入500ml正己烷，搅拌2h后用布氏漏斗过滤。用适量无水乙醇清洗样品，过滤干燥后按1:10(w/v)固液比加入蒸馏水，调节ph为6.0，向体系中加入耐高温α-淀粉酶，95℃水浴下处理30min，降低水浴温度为55℃，加入糖化酶，反应30min，并利用i
2-ki溶液检查淀粉水解情况。向上述处理处理液中加入中性蛋白酶，在水浴温度55℃，ph为7的条件下，反应1h后，加热至100℃灭酶5min，纱布过滤，滤渣用蒸馏水洗涤2遍，60℃烘干后备用。
67.2)称取1)中得到的50g样品，加入2g的naoh和1.9g的ca(oh)2，加入0.5l蒸馏水，混合后沸水浴1h。将反应后的溶液冷却至室温，6000
×
g离心20min后分离清a1和沉淀b1。
68.3)上清液a1加入3g的h2o2(30％，w/w)，调整溶液的ph为11.5，室温搅拌2h；将ph值调整到4.0，10000
×
g离心30min分离上清液；向上清液加入2倍体积无水乙醇，得到白色絮状沉淀物cfg1。
69.4)向沉淀b1加入适量蒸馏水，再加入30％的h2o2(按照干基的0.1％添加)，调ph至11.5，沸水浴1.5h。冷却后6000
×
g离心20min，分离上清液a2；调节a2的ph至4.0～4.5，再10000
×
g离心30min，分离上清液后加入2倍体积无水乙醇，得到白色絮状沉淀cfg2。
70.5)用蒸馏水溶解cfg1和cfg2后混合，在冷冻干燥获得玉米皮纤维胶cfg。
71.2、nacl浓度对重组木聚糖酶催化水解cfg酶活性的影响
72.参照实施例3测定nacl浓度对重组木聚糖酶催化水解cfg的活性的影响：200μl的酶解反应体系包含180μl底物(用含有1～5m的nacl的缓冲液溶解cfg底物)和20μl适当的稀释酶液，在最佳ph、温度条件下保温反应1h，随后加入300μl的dns试剂，沸水煮5min。样品冷却后测定540nm下的吸光值，计算重组木聚糖酶的水解cfg生成还原端的量。以木聚糖酶在0m的nacl反应体系中催化水解cfg时还原端生成量为100％；再用相同反应条件下，木聚糖酶在1～5m的nacl反应体系中催化水解cfg时还原端生成量相对于0m的nacl反应体系中还原端生成量做图，说明nacl对木聚糖酶活性影响。如图9和图10所示，scxyn5在含有1～5m的nacl反应体系中，水解cfg的还原端生成量分别提高了1.41、1.56、1.66、2.03、1.3倍(图9)；scxyn22在含有1～5m的nacl反应体系中，水解cfg的还原端生成量分别提高了1.75、3.63、3.66、3.46、3.86倍(图10)。
73.3、高nacl浓度下重组木聚糖酶催化水解cfg产物分析
74.参照上述确定的最适反应条件，应用重组木聚糖酶scxyn5和scxyn22分别在最适
条件下水解cfg底物制备低聚糖，应用凝胶色谱仪(eleos system，wyatt)分析水解产物分子量分布特征。计算结果如表1所示，重组木聚糖酶scxyn5水解产物中70.8％阿拉伯木聚糖分子量在2.6-22kda，重组木聚糖酶scxyn22水解产物中73.4％阿拉伯木聚糖分子量16-33kda。
75.表1 cfg和重组木聚糖酶水解产物分子量分布特征
[0076][0077]
4、高nacl浓度下cfg性质分析
[0078]
用1～5m的nacl溶液配置1％(w/v)的cfg溶液。以蒸馏水做参照，用测定cfg溶液在波长620nm的透光率(％)，结果如表2所示，cfg溶液透光率随nacl溶液浓度升高而降低。
[0079]
表2 cfg的nacl溶液透光率
[0080]
nacl浓度0m1m2m3m4m5m透光率(％)85.5167.0954.3341.4633.8626.82。
[0081]
用旋转流变仪(ar2000ex型)测定cfg溶液流变性。选用直径为40mm的平行板测量系统，将样品台温度设定为25℃，板间距1.0mm，将剪切速率从0.1s-1
增加到200s-1
，结果见图11，在1～5m的nacl的溶液中，cfg溶液粘度随nacl浓度升高而明显增高。
[0082]
说明cfg底物在高盐体系中的理化状态会发生改变，进而影响酶催化效率和酶解产物的特点。
[0083]
以上内容仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。