一种启动子及促进地衣芽孢杆菌产海藻糖生产用酶的应用

1.本发明涉及一种启动子及促进地衣芽孢杆菌产海藻糖生产用酶的应用，属于发酵工程领域。


背景技术：

2.麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase，mtsase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase，mthase)是酶法合成海藻糖的关键酶，广泛存在于嗜热硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)、嗜酸硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)、节杆菌(arthrobacter sp.)、根瘤菌(rhizobium sp.)中，其中硫化叶来源的mtsase、mthase具有较高的耐热性，最适温度为60-80℃具有较高的应用价值。目前该酶系已经成功在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等模式菌中表达，但大肠杆菌会产生内毒素影响其产物在食品工业上的应用，而芽孢杆菌表达系统表达mtsase及mthase能力依旧较弱，因此提高mtsase及mthase在芽孢杆菌中的具有重要意义。
3.地衣芽孢杆菌是gras(generally recongnized as safe)菌株，具有耐热、酶系丰富、胞外蛋白分泌能力强且不易形成包涵体的优势，被广泛应用于碱性蛋白酶、普鲁兰酶等多种酶制剂的表达及研究。但地衣芽孢杆菌现有表达水平难以实现规模化生产，启动子作为地衣芽孢杆菌表达系统中重要组成元件，负者调控基因转录水平，目前该表达系统常用的启动子主要是来源于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中筛选得到的天然启动子，这限制了地衣芽孢杆菌的表达水平。启动子常规的改造方式为随机突变和启动子串联。随机突变在构建启动子文库后需要大量筛选，且绝大部分突变体现为负突变。启动子串联在一定程度上可以提高启动子的强度，但是目前地衣芽孢杆菌可用的天然启动子非常有限，已有启动子的串联组合在提升强度方面效果一般。因此，亟待开发新的启动子，以提高地衣芽孢杆菌的酶的分泌表达能力。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术存在的缺陷，通过解析了启动子和转录核心蛋白-rna聚合酶的结合位点，对启动子进行理性的人工改造，获得了强度显著提升的人工启动子，并应用于海藻糖合成酶的表达。
5.本发明提供了一种能在地衣芽孢杆菌中高效表达目的基因的启动子1upp
p2
，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.在一种实施方法中，核苷酸序列seq id no.3所示启动子是在seq id no.1所示启动子-35区上游100bp处增加1段seq id no.2所示的调控区域序列。
7.本发明还提供了携带所述启动子的重组质粒。
8.在一种实施方法中，所用质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒phy-plk300。
9.在一种实施方法中，所述重组质粒还含有果聚糖合酶信号肽基因sacbss、麦芽三糖淀粉酶基因、木糖异构酶基因的终止子ter。
10.在一种实施方式中，所述麦芽三糖淀粉酶基因被替换为mtsase或mthase基因。
11.在一种实施方式中，所述mtsase基因(wp_015385613.1)的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述mthase基因(wp_011278268.1)的核苷酸序列如seq id no.8所示。
12.发明还提供含有所述重组质粒的重组地衣芽孢杆菌。
13.在一种实施方式中，所述重组地衣芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌cicim b1522为宿主；所述地衣芽孢杆菌cicim b1522购自江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心。
14.本发明还提供所述启动子在提高地衣芽孢杆菌产酶方面的应用。
15.在一种实施方式中，所述应用是将目的酶基因连接至seq id no.3所示启动子的下游，使所述启动子用于目的酶基因的起始转录。
16.本发明还提供一种生产海藻糖生产用酶的方法，所述方法是将所述重组地衣芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于35～37℃、200～250rpm条件下发酵至少72h。
17.在一种实施方式中，所述方法是将所述重组地衣芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于37℃、250rpm条件下发酵144h。
18.在一种实施方式中，所述发酵培养基以麦芽糊精和/或蔗糖为碳源。
19.在一种实施方式中，所述发酵培养基以黄豆饼粉和/或棉籽蛋白为氮源。
20.在一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：30g/l棉籽蛋白、90g/l蔗糖、9.12g/lk2hpo4·
3h2o、1.36g/l kh2po4、0.5g/l cacl2、0.5g/l mgso4·
7h2o、10g/l(nh4)2hpo4。
21.本发明还提供所述的启动子、重组质粒、重组地衣芽孢杆菌或所述方法在提高麦芽糖基海藻糖合成酶和麦芽糖基海藻糖水解酶表达中的应用。
22.有益效果：本发明通过在原有启动子基础上串联额外调控区域，得到转录水平提高的的启动子，使麦芽糖基海藻糖合成酶和麦芽糖基海藻糖水解酶在地衣芽孢杆菌中的表达量分别提高了37％和10％，并通过优化发酵培养基的碳源和氮源，使重组菌blsup1在以90g/l蔗糖作为碳源、30g/l棉籽蛋白作为氮源的条件下mtsase酶活最高可以达到2572.5u/ml，mthase酶活达到358.0u/ml，酶活达到2572.5u/ml。
附图说明
23.图1为重组质粒的构建。
24.图2为重组质粒的验证；m：dl10000，1：p
p2-mtsase，2：p
p2-mthase，3：1upp
p2-mtsase，4：1upp
p2-mthase，5：3upp
p2-mtsase，6：3upp
p2-mthase，7：5upp
p2-mtsase，8：5upp
p2-mthase。
25.图3为mtsase及mthase在地衣芽孢杆菌中表达；a：mtsase重组表达菌生长曲线，b：mtsase的重组表达，c：mthase重组表达菌生长曲线，d：mthase的重组表达。
26.图4为碳源对重组菌blsup1功能表达的影响；a：重组菌生长曲线，b：mtsase的重组表达；其中，1：90g/l葡萄糖，2：90g/l蔗糖，3：90g/l乳糖，4：90g/l麦芽糊精，5：30g/l葡萄糖 60g/l麦芽糊精，6：30g/l蔗糖 60g/l麦芽糊精，7：30g/l乳糖 60g/l麦芽糊精。
27.图5为氮源对重组菌blsup1功能表达的影响；a：重组菌生长曲线，b：mtsase的重组表达；其中，1：20g/l蛋白胨f321 10g/l酵母粉m408，2：20g/l蛋白胨f321 10g/l酵母粉m408 2g/l玉米浆，3：30g/l黄豆饼粉，4：30g/l棉籽蛋白，5：30g/l豆粕提取物，6：30g/l玉米浸
粉，7：30g/l硫酸铵。
28.图6为blhup1在发酵培养基条件下的功能表达；a：重组菌生长曲线，b：mthase的重组表达。
29.图7为发酵液上清电泳图；m：180kd protein marker，1：空白、2：mtsase，3：mthase。
具体实施方式
30.mtsase酶活检测方法：向提前在75℃条件下预热的900μl、终浓度10g/l的麦芽糊精溶液(ph 5.5)中加入100μl适当稀释的mtsase，75℃反应10min、沸水浴灭活20min，利用dns法检测反应前后底物吸光值变化。
31.mtsase酶活定义：每小时消耗相当于1μmol麦芽四糖还原糖所需的酶量，定义为一个酶活单位(u)。
32.mthase酶活检测方法：向提前在75℃条件下预热的900μl、终浓度10g/l的麦芽糖基海藻糖溶液(ph 5.5)中加入100μl适当稀释的mthase，75℃反应1h、沸水浴灭活20min，利用dns法检测反应前后底物吸光值变化。
33.mthase酶活定义：每小时生成相当于1μmol麦芽四糖还原糖所需的酶量，定义为一个酶活单位(u)。
34.其中dns法如下：取0.5ml样液，加入1.5ml dns溶液沸水浴反应5min，冰浴冷却后定容至25ml，取250μl于酶标板，利用酶标仪检测样液在od540处吸光值。
35.培养基：
36.lb培养基(g/l)：蛋白胨10、酵母粉5、nacl 10。
37.启动子筛选培养基(g/l)：蛋白胨fp321 20、酵母粉fm408 10、葡萄糖30、麦芽糊精60、k2hpo4·
3h2o 9.12、kh2po
4 1.36、cacl
2 0.5、mgso4·
7h2o 0.5、(nh4)2hpo
4 10。
38.发酵培养基(g/l)：棉籽蛋白30、蔗糖90、k2hpo4·
3h2o 9.12、kh2po
4 1.36、cacl20.5、mgso4·
7h2o 0.5、(nh4)2hpo
4 10。
39.重组菌发酵方法：将-70℃保藏的重组菌于lb平板(含20ng/μl四环素)划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15ml lb液体培养基中(含20ng/μl四环素)37℃、250rpm培养16h取1ml转接于装液量为30ml的地衣芽孢杆菌培养基，37℃、250rpm条件下培养144h。
40.蛋白电泳方法：将发酵液于4℃、12000rpm条件下离心10min，收集上清液。发酵液上清于60℃条件下温浴1h后再次离心，收集上清。热处理后上清液按4:1加入loading buffer，在沸水浴反应15min，反应结束后于12000rpm条件下离心10min，取20μl离心后反应液于泳道，进行蛋白电泳。
41.实施例1启动子及重组表达载体的构建
42.核苷酸序列seq id no.2所示片段位于核苷酸序列seq id no.1所示启动子-35区上游，大小为100bp的碱基序列，能够影响rna聚合酶与启动子结合强度。
43.分别通过基因合成在seq id no.1所示启动子-35区上游100bp处增加1段长度为100bp调控区域序列的seq id no.3所示的核苷酸序列；在seq id no.1所示启动子-35区上游100bp处增加3段长度为100bp调控区域序列的seq id no.4所示的核苷酸序列；在seq id no.1所示启动子-35区上游100bp处增加5段长度为100bp调控区域序列的seq id no.5所示
的核苷酸序序列；将含20bp载体同源臂序列与5个拷贝数的seq id no.2所示核苷酸序列片段连接至seq id no.1所示启动子p
p2
的-35区上游100bp处，得到核苷酸序列seq id no.6所示序列。
44.使用pfu dna聚合酶和引物mtsase-f、mtsase-r，以seq id no.7所示的核苷酸序列为模板，扩增得到mtsase基因序列，反应条件为：95℃预变性5min后进入下一循环94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸150s,30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
45.mtsase-f:5
’‑
cggggtaccatgatctcagccacgtaccg-3’；
46.mtsase-r:5
’‑
cgcgtcgacttacatgcggaccagaatgc-3’；
47.将pcr产物通过kpnⅰ和salⅰ双酶切，与经过kpnⅰ和salⅰ双酶切的载体phy-p2-tfa(载体已公开于论文《地衣芽孢杆菌强启动子开发及人工进化》中)连接，获得表达mtsase的重组质粒p
p2-mtsase，如图1，重组质粒导入大肠杆菌感受态中在amp抗性条件下筛选阳性转化子。构建成功的重组质粒经过kpnⅰ和salⅰ双酶切验证，如图2。
48.使用pfu dna聚合酶和引物，以seq id no.8所示的核苷酸序列为模板，扩增得到mthase基因序列，反应条件为：95℃预变性5min后进入下一循环94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸120s,30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
49.mthase-f:5
’‑
cggggtaccatgttcagctttggcggcaa-3’；
50.mthase-r:5
’‑
cgcgtcgacttactcaagttgatagacgccaacg-3’；
51.将pcr产物通过kpnⅰ和salⅰ双酶切，与经过kpnⅰ和salⅰ双酶切的载体phy-p2-tfa连接，获得表达mthase的重组质粒p
p2-mthase，如图1，重组质粒导入大肠杆菌感受态中在amp抗性条件下筛选阳性转化子。构建成功的重组质粒经过kpnⅰ和salⅰ双酶切验证，如图2。
52.使用pfu dna聚合酶和引物，以合成得到的核苷酸序列seq id no.6为模板，对模板进行扩增，反应条件为：95℃预变性5min后进入下一循环94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s,30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
53.uppp2-f:5
’‑
gcccaagcttctagagatct-3’；
54.uppp2-r:5
’‑
tttccttcacctcttaattaattttgggagc-3’；
55.将pcr产物通过同源重组分别与通过bglⅱ单酶切线性化的载体p
p2-mtsase、p
p2-mthase相连接如图1，由于seq id no.6所示序列包含6段重复的seq id no.2所示序列，重复的seq id no.2序列在同源重组过程中充当同源臂的作用。通过同源重组获得分别在启动子-35区上游100bp处增加1段长度为100bp的调控区域序列重组质粒1upp
p2-mtsase和1upp
p2-mthase。将重组质粒导入大肠杆菌感受态中在amp抗性条件下筛选阳性转化子。构建成功的重组质粒经过bglⅱ和xhoⅰ双酶切验证，如图2。
56.对比例
57.按照实施例1相仿的方法，构建分别在启动子-35区上游100bp处增加3段或5段长度为100bp调控区域序列的重组质粒3upp
p2-mtsase、5upp
p2-mtsase以及3upp
p2-mthase、5upp
p2-mthase。将重组质粒导入大肠杆菌感受态中在amp抗性条件下筛选阳性转化子。构建成功的重组质粒经过bglⅱ和xhoⅰ双酶切验证，如图2。
58.实施例2重组地衣芽孢杆菌的构建与mtsase、mthase的表达
59.将实施例1和对比例成功构建的重组质粒p
p2-mtsase、1upp
p2-mtsase、3upp
p2-mtsase、5upp
p2-mtsase、p
p2-mthase、1upp
p2-mthase、3upp
p2-mthase、5upp
p2-mthase分别按
照xiao f x,li y r,zhang y p,wang h r,zhang l,ding z y,gu z h,xu s,shi g y.construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis[j].applied microbiology and iotechnology,2020,104(12):5409-5425.的方法导入b.licheniformis cicim b1522，并筛选阳性转化子。获得重组菌bls、blsup1、blsup3、blsup5、blh、blhup1、blhup3、blhup5。构建成功的重组菌于lb平板(含20ng/μl四环素)划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15ml lb液体培养基中(含20ng/μl四环素)37℃、250rpm培养16h取1ml转接于装液量为30ml的启动子筛选培养基，37℃、250rpm条件下培养144h。
[0060]
以p
p2
启动子为对照，按mtsase、mthase酶活检测方法检测酶活，重组菌生在情况及酶活如图3。采用核苷酸序列seq id no.3所示启动子分别表达mtsase及mthase基因，酶活较原始核苷酸序列seq id no.1所示启动子分别提高了37％和10％，且高于核苷酸序列seq id no.4、seq id no.5所示启动子介导下mtsase或mthase的酶活。
[0061]
实施例3重组地衣芽孢杆菌利用不同碳源发酵产酶
[0062]
将重组菌blsup1接种于替换不同碳源的启动子筛选培养基，具体为：将30g/l葡萄糖 60g/l麦芽糊精分别替换为：90g/l葡萄糖，90g/l蔗糖，90g/l乳糖，30g/l蔗糖 60g/l麦芽糊精，30g/l乳糖 60g/l麦芽糊精或90g/l麦芽糊精。
[0063]
按重组菌发酵方法进行发酵培养，重组菌生长情况及酶活如图4。重组菌在90g/l麦芽糊精或30g/l乳糖 60g/l麦芽糊精作为碳源时无法正常生长，在90g/l蔗糖或30g/l蔗糖 60g/l麦芽糊精作为碳源时mtsase表达量相对较高，酶活分别达666.1u/ml和682.0u/ml。其中以蔗糖作为单一碳源时重组菌在发酵过程中产酶量相对稳定，有利于重组菌生长及表达。
[0064]
实施例4重组地衣芽孢杆菌利用不同氮源发酵产酶
[0065]
在实施方法3的培养基基础上(按g/l计，含有：蛋白胨fp321 20、酵母粉fm408 10、蔗糖90、k2hpo4·
3h2o 9.12、kh2po
4 1.36、cacl
2 0.5、mgso4·
7h2o 0.5、(nh4)2hpo
4 10)，以不同氮源替换培养基原有氮源，具体为：将20g/l蛋白胨fp321 10g/l酵母粉fm408分别替换为20g/l蛋白胨f321 10g/l酵母粉m408 2g/l玉米浆，30g/l黄豆饼粉，30g/l棉籽蛋白，30g/l豆粕提取物，30g/l玉米浸粉，或30g/l硫酸铵。
[0066]
将重组菌blsup1接种于带有不同氮源的培养基进行发酵培养，重组菌生长情况及酶活如图5。以豆粕提取物或硫酸铵作为氮源时不利于重组菌生长及产酶，以玉米浸取物或20g/l蛋白胨f321 10g/l酵母粉m408作为氮源时，重组菌可以正常生长，但产酶量不高。以黄豆饼粉或棉籽蛋白作为氮源时有利于重组菌生长及产酶，mtsase酶活分别达到2021.3u/ml、2572.5u/ml。
[0067]
实施例5重组菌1upp
p2-mthase的发酵
[0068]
将重组菌1upp
p2-mthase接种于发酵培养基(按g/l计，含有：棉籽蛋白30、蔗糖90、k2hpo4·
3h2o 9.12、kh2po
4 1.36、cacl
2 0.5、mgso4·
7h2o 0.5、(nh4)2hpo
4 10)，按具体实施方法中重组菌发酵方法进行发酵培养，重组菌生长情况及酶活如图6。在发酵培养基条件下，mthase酶活最大可以达到358.0u/ml。
[0069]
收集发酵结束的发酵液，按蛋白电泳方法处理样品，蛋白电泳结果如图7。泳道1、2、3分别为空白、blsup1及blhup1发酵液上清，泳道2在75kd maker上方出现明显特异性蛋
白条带，大小与mtsase预测大小79kd接近，泳道3在60-75kd maker之间出现明显特异性蛋白条带，大小与mthase预测大小61kd接近。
[0070]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。