用于评价骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的试剂盒的制作方法

本发明涉及能够评价作为骨髓增殖性肿瘤诊断项目而有用的基因突变的探针组、包含该探针组的微阵列。
背景技术：
骨髓增殖性肿瘤(MPN，Myeloproliferativeneoplasms)是一种由于髓系细胞形成肿瘤而发病的疾病。MPN的特征在于髓系细胞(粒细胞、胚细胞、骨髓巨核细胞和肥大细胞等)的明显增殖。MPN包括慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia，CML)、慢性中性粒细胞白血病(chronicneutrophilicleukemia，CNL)、真性红细胞增多症或真性多血症(polycythemiavera，PV)、原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)、原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(chroniceosinophilicleukemia，CEL)、高嗜酸性粒细胞综合征(hypereosinophilicsyndrome，HES)、肥大细胞增生症(mastocytosis)以及无法分类的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms，unclassifiable，MPN，U)。对于MPN的诊断，如非专利文献1所述，是以临床参数、骨髓形态和基因突变数据为指标。对于费城染色体阴性患者，可以通过将这些数据结合起来进行诊断来诊断除CML以外的MPN。作为基因突变数据，具体可以使用三个基因即JAK2、CALR和MPL的相关突变信息，还可以追加使用ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/IDH2、SRSF2和SF3B1的相关突变信息。尤其是JAK2、CALR和MPL，考虑到它们是MPN发病的分子基础，因此这群基因中有无突变在MPN的确诊中是重要因素。另外，非专利文献2公开了对于JAK2，在PV、ET和PMF中观察到大量JAK2V617F突变(第617位的缬氨酸置换突变为苯丙氨酸)，另外在少数PV中除了上述突变以外还观察到外显子12中的插入/缺失型突变。AK2(Janus活化激酶2(Janusactivatingkinase2))是编码控制促红细胞生成素受体信号的蛋白质的基因。除此以外，非专利文献3中，关于JAK2，公开了存在于外显子12中的突变与真性多血症(polycythemiavera,PV)或特发性红细胞增多症(idiopathicerythrocytosis,IE)相关。进一步，专利文献5中，作为表示骨髓增殖性疾病的突变，公开了检测出存在于JAK2基因的外显子12中的突变中的c2035t突变(T514M突变)。非专利文献2还公开了对于MPL，在PMF和ET中观察到MPLW515L/K突变PMF。MPL是编码血小板生成素受体的基因。非专利文献2还公开了关于CALR，52碱基缺失的1型突变和5碱基插入的2型突变的频率最高，在ET和PMF中观察到这些突变。非专利文献2还公开了1型突变在PMF中频率更高，与ET中的向骨髓纤维化的转换有关。CALR是编码内质网分子伴侣之一钙网蛋白的基因。而且，作为JAK2基因的突变分析方法，专利文献1公开了JAK2V617F位点特异性荧光标记探针。专利文献2公开了在JAK2V617F突变为阴性且显示出骨髓增殖性肿瘤的患者中发现的与JAK2V617F突变不同的突变的检测技术。再另外，作为用于检测MPL基因多态性的探针，专利文献3公开了用于检测MPL中的W515K突变和W515L突变的探针组。再另外，专利文献4公开了用于鉴定CALR中的突变的技术。更进一步，专利文献5中公开了JAK2核酸中的突变检测，并公开了存在于JAK2的外显子12中的基因突变。更进一步，专利文献6中鉴于上述实际情况，作为同时简便地检测骨髓增殖性肿瘤相关的多个基因突变的方法，公开了对于各基因突变设计了引物和探针，并公开了JAK2中的V617F突变、CALR中的1型突变和2型突变、MPL中的W515L突变和W515K突变作为检测对象的基因突变(3个基因中的5个基因突变)。予以说明，作为用于检测目标基因突变的探针的设计方法，基于含有该基因突变的周围区域的碱基序列设计探针。这时，作为探针，如专利文献7所公开的，设计了与包含基因突变的周围区域的碱基序列完全一致的序列，或者包含1个或数个非天然核苷酸的碱基序列。包含1个或数个非天然核苷酸的探针在该非天然核苷酸的位置与含有基因突变的周围区域之间不形成杂交(错配)。根据专利文献7，记载了通过该错配能够高精度地检测样品中的靶核酸是否具有基因突变。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2012-034580专利文献2：WO2009/060804专利文献3：WO2011/052755专利文献4：日本特表2016-537012专利文献5：日本第6017136号专利文献6：WO2019/004334专利文献7：日本特表2000-511434非专利文献非专利文献1：FrancescoPassamontiandMargheritaMaffioli,Hematology2016,p.534-542非专利文献2：NCCNClinicalPracticeGuidelinesinOncology(NCCNGuidelines),MyeloproliferativeNeoplasms,Version2.2017,October19,2016非专利文献3：LindaM.Scottetal.,NEnglJMed.2007Feb1；356(5):459-68技术实现要素：发明所要解决的问题本发明的目的在于提供一种用于评价基因突变的试剂盒，其在能够正确判断骨髓增殖性肿瘤相关基因突变中是否存在于CARL中的多个类型的基因突变的同时，能够更高精度地判断有无骨髓增殖性肿瘤，还提供一种用于评价基因突变的试剂盒，其在能够同时判断骨髓增殖性肿瘤相关基因突变中是否存在于JAK2中的多个基因突变的同时，能够更高精度地判断有无骨髓增殖性肿瘤。解决问题的技术方案本发明包含以下内容：(1)一种用于评价基因突变的试剂盒，其用于评价骨髓增殖性肿瘤相关基因突变，所述试剂盒包含与选自下述CALR中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变中的至少一个基因突变相对应的CALR突变型探针：在SEQIDNO:10所示野生型CARL基因的碱基序列中缺失第506位至第557位这52个碱基的52碱基缺失的1型突变、在该碱基序列中缺失第509位至第554位这46个碱基的46碱基缺失的3型突变、在该碱基序列中缺失第516位至第549位这34个碱基的34碱基缺失的4型突变和在该碱基序列中缺失第505位至第556位这52个碱基的52碱基缺失的5型突变，其特征在于，所述CALR突变型探针具有被人为缺失导致的错配。(2)根据(1)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，针对所述1型突变的CALR突变型探针具有在SEQIDNO:10中缺失选自第558位至第564位范围的1个或多于一个碱基的碱基序列或其互补碱基序列，针对所述3型突变的CALR突变型探针具有在SEQIDNO:10中缺失选自第555位至第559位范围的1个或多于一个碱基的碱基序列或其互补碱基序列，针对所述4型突变的CALR突变型探针具有在SEQIDNO:10中缺失选自第550位至第558位范围的1个或多于一个碱基的碱基序列或其互补碱基序列，针对所述5型突变的CALR突变型探针具有在SEQIDNO:10中缺失选自第558位至第564位范围的1个或多于一个碱基的碱基序列或其互补碱基序列。(3)根据(1)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，针对所述1型突变的CALR突变型探针包含SEQIDNO:95所示碱基序列或其互补碱基序列，针对所述3型突变的CALR突变型探针包含SEQIDNO:53所示碱基序列或其互补碱基序列，针对所述4型突变的CALR突变型探针包含SEQIDNO:54所示碱基序列或其互补碱基序列，针对所述5型突变的CALR突变型探针包含SEQIDNO:55所示碱基序列或其互补碱基序列。(4)根据(1)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，其还具有与在SEQIDNO:10所示野生型CARL基因的碱基序列中第568位和第569位之间插入TTGTC的2型突变相对应的CALR突变型探针。(5)根据(1)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还具有与JAK2中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变相对应的JAK2突变型探针和/或与MPL中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变相对应的MPL突变型探针。(6)一种用于骨髓增殖性肿瘤诊断的数据分析方法，其使用上述(1)～(5)中任一项所述的用于评价基因突变的试剂盒，对诊断对象鉴定选自下述突变中的至少一个基因突变：CARL中骨髓增殖性肿瘤相关的1型突变、3型突变、4型突变和5型突变。(7)一种用于评价基因突变的试剂盒，其用于评价骨髓增殖性肿瘤相关基因突变，所述试剂盒包含与JAK2中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变相对应的JAK2突变型探针和对含有所述基因突变的区域进行扩增的引物组，其特征在于，所述JAK2突变型探针包含与V617F突变相对应的V617F突变型探针和与存在于JAK2基因的外显子12中的基因突变相对应的外显子12突变型探针，所述引物组包含对含有V617F突变的区域进行扩增的V617F突变用引物组和对存在于JAK2基因的外显子12中的含有基因突变的区域进行扩增的外显子12用引物组。(8)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述外显子12突变型探针为选自下述突变型探针中的至少1个以上的突变型探针：与JAK2中N542-E543的缺失突变相对应的N542_E543del突变型探针、与JAK2中E543-D544的缺失突变相对应的E543_D544del突变型探针、与JAK2中R541-E543变为赖氨酸的突变相对应的R541_E543>K突变型探针、与JAK2中F537-K539变为亮氨酸的突变相对应的F537_K539>L突变型探针、与JAK2中K539L(TT)突变相对应的K539L(TT)突变型探针和与JAK2中K539L(CT)突变相对应的K539L(CT)突变型探针。(9)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，V617F突变用引物组中所含的一个引物的浓度为1.0μM以上。(10)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，外显子12用引物组中所含的一个引物的浓度为2.5μM以上。(11)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，V617F突变用引物组中标记的引物与外显子12用引物组中标记的引物的浓度比[外显子12用引物的浓度]/[V617F突变用引物的浓度]为1.0～5.5。(12)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述外显子12用引物组由外显子12用正向引物和外显子12用反向引物构成，其中，外显子12用正向引物具有选自SEQIDNO:1所示碱基序列的10个连续碱基以上的长度，所述外显子12用反向引物具有选自SEQIDNO:2所示碱基序列的10个连续碱基以上的长度。(13)根据(12)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述外显子12用正向引物为选自下述正向引物中的一个引物：由SEQIDNO:3所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F1、由SEQIDNO:4所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F3、由SEQIDNO:5所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F4和由SEQIDNO:6所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F5。(14)根据(12)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述外显子12用反向引物为选自下述反向引物中的一个引物：由SEQIDNO:7所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R1、由SEQIDNO:8所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R2和由SEQIDNO:9所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R3。(15)根据(12)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述外显子12用引物组由如下引物构成：由SEQIDNO:6所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F5和由SEQIDNO:8所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R2。(16)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：与CALR中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变相对应的CALR突变型探针、对CALR中含有与骨髓增殖性肿瘤相关的该基因突变的区域进行扩增的CALR用引物组、与MPL中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变相对应的MPL突变型探针、对MPL中含有与骨髓增殖性肿瘤相关的该基因突变的区域进行扩增的MPL用引物组。(17)根据(7)所述的用于评价基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：微阵列，所述微阵列将所述V617F突变型探针和所述外显子12突变型探针固定于载体上。(18)一种用于骨髓增殖性肿瘤诊断的数据分析方法，其使用上述(7)～(17)中任一项所述的用于评价基因突变的试剂盒，对诊断对象同时鉴定JAK2中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变中的V617F突变和存在于外显子12中的基因突变。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-158722号、日本专利申请号2019-176891号和日本专利申请号2020-133602号的公开内容。发明效果根据本发明，能够正确判定骨髓增殖性肿瘤相关基因突变中尤其是存在于CARL中的多个基因突变(1型突变、3型突变～5型突变)。因此，根据本发明，能够提高利用诊断对象的上述基因突变信息的骨髓增殖性肿瘤的诊断准确度。另外，根据本发明，能够同时判定骨髓增殖性肿瘤相关基因突变中尤其是存在于JAK2中的多个基因突变(V617F突变和存在于外显子12中的基因突变)。因此，根据本发明，能够提高利用诊断对象的上述基因突变信息的骨髓增殖性肿瘤的诊断准确度。附图说明图1是用于说明CARL中的1型基因突变、3型基因突变、4型基因突变和5型基因突变中缺失区域的构成图。图2是表示使用实施例中设计的3型突变探针5、4型突变探针5和5型突变探针4测定各突变样品和野生型样品得到的结果的特性图。图3是对引物进行说明的构成图，所述引物是为了对JAK2的外显子12中所含的多个含有基因突变的区域扩增而设计的。图4是表示测定来自4个扩增片段的荧光强度结果的特性图，所述4个扩增片段是使用实施例1中设计的引物组而得到的。图5是以对含有V617F突变位点的区域进行扩增的引物组中标记的引物(正向引物)的浓度为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。图6是以对含有V617F突变位点的区域进行扩增的引物组中标记的引物(正向引物)的浓度为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。图7是以对JAK2外显子12进行扩增的引物组中标记的引物(反向引物)的浓度为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。图8是以对JAK2外显子12进行扩增的引物组中标记的引物(反向引物)的浓度为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。图9是以对外显子12进行扩增的引物组中标记的引物(反向引物)与对含有V617F突变位点的区域进行扩增的引物组中标记的引物(正向引物)的浓度比为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。图10是表示使用突变模型样本检测JAK2的V617F突变和存在于外显子12中的基因突变等的结果的特性图。具体实施方式<CARL基因突变>本发明的用于评价骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的试剂盒具有鉴定以下基因突变的CALR突变型探针，所述基因突变作为CARL中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变，选自称为1型突变、3型突变、4型突变和5型突变中的至少一个。予以说明，作为CALR的基因突变，已知主要为：52碱基缺失的1型突变、5碱基插入的2型突变、46碱基缺失的3型突变、34碱基缺失的4型突变和52个碱基缺失与1型突变不同的52碱基缺失的5型突变。这些1型突变至5型突变位于CALR蛋白质的C末端。在原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)患者或原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)患者中，以20％～25％的频率观察到这些突变中的任一突变。2型突变主要与原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)相关，1型突变主要与原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)相关。此外，CALR的基因突变也是在没有JAK2中的基因突变的骨髓增殖性肿瘤中被观察到的突变，JAK2中的基因突变的详情见后述。将编码野生型CALR的碱基序列示于SEQIDNO:10。当存在1型突变时，在SEQIDNO:10所示碱基序列中第506位至第557位这52个碱基缺失。当存在2型突变时，在SEQIDNO:10所示碱基序列中第568位和第569位碱基之间插入TTGTC。当存在3型突变时，在SEQIDNO:10所示碱基序列中第509位至第554位这46个碱基缺失。当存在4型突变时，在SEQIDNO:10所示碱基序列中第516位至第549位这34个碱基缺失。当存在5型突变时，在SEQIDNO:10所示碱基序列中第506位至第556位这52个碱基缺失。对于作为缺失型基因突变的1型突变、3型突变、4型突变和5型突变，以编码野生型CALR的碱基序列的一部分(SEQIDNO:56)为基准而缺失的区域示意性地示于图1中。如图1所示，野生型CALR的52个碱基缺失的1型突变(SEQIDNO:57)、野生型CALR的46个碱基缺失的3型突变(SEQIDNO:58)、野生型CALR的34个碱基缺失的4型突变(SEQIDNO:59)、野生型CALR的52个碱基缺失的5型突变(SEQIDNO:60)分别在自缺失位置(图中箭头)起3’侧并在缺失前后具有非常类似的序列。予以说明，图1所示的1型突变、3型突变、4型突变和5型突变的各碱基序列中在缺失前后一致的序列标有下划线。本发明的用于评价基因突变的试剂盒，包含选自下述突变探针中的至少一个探针作为CALR突变型探针：用于检测1型突变的1型突变探针、用于检测3型突变的3型突变探针、用于检测4型突变的4型突变探针和用于检测5型突变的5型突变探针。即，本发明的用于评价基因突变的试剂盒可包含1型突变探针、3型突变探针、4型突变探针和5型突变探针中的所有探针，也可包含3型突变探针、4型突变探针和5型突变探针中的一个或任意两个探针。这些CALR突变型探针具有被人为缺失导致的错配。即，CARL突变型探针设计为对于图1所示的1型突变、3型突变、4型突变和5型突变的缺失突变后的序列，使至少1个碱基(1个至数个碱基，例如1～5个碱基，优选1～3个碱基，更优选1个碱基)缺失(即被人为缺失)的互补链。本文中，作为被人为缺失的碱基，如图1所示，优选选自在1型突变、3型突变、4型突变和5型突变各缺失后的序列中与野生型的序列一致的区域(图1的划线部分)。予以说明，CALR突变型探针可以设计为指定的碱基序列的互补链，但也可以设计为与该碱基序列为相同的链。即，这些与1型突变、3型突变、4型突变或5型突变相对应的CALR突变型探针可以设计为自缺失位置(图1的箭头)起3’末端侧的10个碱基以内、优选8个碱基以内、更优选5个碱基以内的区域中缺失至少1个碱基的互补链。更具体而言，与1型突变相对应的CALR突变型探针可以设计为自缺失位置(图1的箭头)算起在3’末端侧的7个碱基的范围(图1的划线部分)缺失至少1个碱基的互补链。如果以SEQIDNO:10所示碱基序列为基准，与1型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为从第558位～第564位这7个碱基的范围缺失至少1个碱基的互补链。特别是，与1型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为缺失SEQIDNO:10所示碱基序列中第560位～第562位AGA的GACGAGGAGCGGACAAGGAG(SEQIDNO:95)的互补链(也可为SEQIDNO:95的碱基序列)。与3型突变相对应的CALR突变型探针可以设计为自缺失位置(图1的箭头)算起在3’末端侧的5个碱基的范围(图1的划线部分)缺失至少1个碱基的互补链。如果以SEQIDNO:10所示碱基序列为基准，与3型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为第555位～第559位这5个碱基的范围缺失至少1个碱基的互补链。特别是，与3型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为缺失SEQIDNO:10所示碱基序列中第558位G的GAGGAGCAGAGCAGAGGACAA(SEQIDNO:53)的互补链(也可为SEQIDNO:53的碱基序列)。与4型突变相对应的CALR突变型探针可以设计为自缺失位置(图1的箭头)算起在3’末端侧的9个碱基的范围(图1的划线部分)缺失至少1个碱基的互补链。如果以SEQIDNO:10所示碱基序列为基准，与4型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为第550位～第558位这9个碱基的范围缺失至少1个碱基的互补链。特别是，与4型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为缺失了SEQIDNO:10所示碱基序列中第552位G的CAGAGGCTTAGAGGAGGCAGAG(SEQIDNO:54)的互补链(也可为SEQIDNO:54的碱基序列)。与5型突变相对应的CALR突变型探针可以设计为自缺失位置(图1的箭头)算起在3’末端侧的2～8位这7个碱基的范围(图1的划线部分)缺失至少1个碱基的互补链。如果以SEQIDNO:10所示碱基序列为基准，与5型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为第558位～第564位这7个碱基的范围缺失至少1个碱基的互补链。特别是，与5型突变相对应的CALR突变型探针优选设计为缺失SEQIDNO:10所示碱基序列中560～562位AGA的GACGAGGGGCGGACAAGGAG(SEQIDNO:55)的互补链(也可为SEQIDNO:55的碱基序列)。<JAK2基因突变>本发明的用于评价骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的试剂盒同时鉴定作为JAK2中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的V617F突变和存在于外显子12中的基因突变。即，用于评价基因突变的试剂盒，作为JAK2突变型探针，包含与作为JAK2中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的V617F突变相对应的V617F突变型探针和与作为JAK2中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的存在于外显子12中的基因突变相对应的外显子12突变型探针。另外，用于评价基因突变的试剂盒包含JAK2中对含有V617F突变的区域进行扩增的V617F突变用引物组和对JAK2基因的含有存在于外显子12中的基因突变的区域进行扩增的外显子12用引物组。具体而言，JAK2的基因突变中的V617F突变是指第617位的缬氨酸置换突变为苯丙氨酸。该突变促进JAK-STAT通路活化，是真性多血症(polycythemiavera，PV)的明显特征。此外，在原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)患者或原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)患者中，也以50％～60％的频率观察到该V617F突变。予以说明，将野生型JAK2基因中所含第617位缬氨酸的外显子14的碱基序列示于SEQIDNO:11。当存在V617F突变时，在SEQIDNO:11所示碱基序列中第351位的G置换突变为T。另外，存在于外显子12中的基因突变已知作为世界卫生组织(WHO)所示的MPN的诊断标准，特别是在真性多血症(polycythemiavera，PV)中被检测的基因突变。存在于JAK2基因的外显子12中的基因突变没有特别限定，例如，第542位的天冬酰胺和第543位的谷氨酸缺失的突变(称作N542_E543del突变)、第543位谷氨酸和第544位天冬氨酸缺失的突变(称作E543_D544del突变)、从第541位精氨酸至第543位谷氨酸突变为赖氨酸(称作R541_E543>K突变)、从第537位苯丙氨酸至第539位赖氨酸突变为亮氨酸(称作F537_K539>L突变)、第539位赖氨酸突变为亮氨酸(称作K539L(TT)突变或K539L(CT)突变)。予以说明，K539L(TT)突变是指编码第539位赖氨酸的密码子(AAA)突变为编码亮氨酸的密码子(TTA)。K539L(CT)突变是指编码第539位赖氨酸的密码子(AAA)突变为编码亮氨酸的密码子(CTA)。本文中，野生型JAK2基因中编码外显子12的碱基序列如SEQIDNO:12所示。当存在N542_E543del突变时，SEQIDNO:12所示碱基序列中第250位至第255位的6个碱基缺失。当存在E543_D544del突变时，SEQIDNO:12所示碱基序列中第253位至第258位的6个碱基缺失。当存在R541_E543>K突变时，SEQIDNO:12所示碱基序列中第248位至第253位的这6个碱基缺失。当存在F537_K539>L突变时，SEQIDNO:12所示碱基序列中第237位至第242位的6个碱基缺失。当存在K539L(TT)突变时，SEQIDNO:12所示碱基序列中第241位和第242位的AA置换突变为TT。当存在K539L(CT)突变时，SEQIDNO:12所示碱基序列中第241位和第242位的AA置换突变为CT。<用于评价基因突变的试剂盒>本发明的用于评价基因突变的试剂盒可为下述构成中的任何一种：包含上述<CARL基因突变>中说明的CALR突变型探针的构成、包含上述<JAK2基因突变>中说明的JAK2突变型探针的构成、以及包含这些CALR突变型探针和JAK2突变型探针的构成。进一步地，本发明的用于评价基因突变的试剂盒还可为除这些CALR和/或JAK2中基因突变还同时鉴定MPL中基因突变的试剂盒。这些在CALR、JAK2和MPL中的基因突变是在世界卫生组织(WHO)的分类(例如2016年度版)中用于诊断骨髓增殖性肿瘤的基因突变。本文中，作为MPL中骨髓增殖性肿瘤相关基因突变，可举出W515K突变(第515位的色氨酸置换突变为赖氨酸)或W515L突变(第515位的色氨酸置换突变为亮氨酸)。该MPL的基因突变在3％～5％的原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)患者中被观察到，在6％～10％的原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)患者中被观察到。予以说明，将编码野生型MPL的碱基序列示于SEQIDNO:13。当存在W515K突变时，在SEQIDNO:13所示碱基序列中第305位和第306位的TG置换突变为AA。当存在W515L突变时，在SEQIDNO:13所示碱基序列中第306位的G置换突变为T。本发明的用于评价基因突变的试剂盒在包含上述<CARL基因突变>中说明的CALR突变型探针时，用于鉴定JAK2和MPL中基因突变的探针可使用任意的探针。此外，本发明的用于评价基因突变的试剂盒在包含上述<JAK2基因突变>中说明的JAK2突变型探针时，用于鉴定CALR和MPL中基因突变的探针可使用任意的探针。更具体而言，对于JAK2的V617F突变，可以将对应于SEQIDNO:11中上述置换突变的寡核苷酸用作突变型探针，所述寡核苷酸例如含有CTCCACAGAaACATACTCC(SEQIDNO:14)。予以说明，在上述序列中的小写字母a对应于SEQIDNO:11所示碱基序列中第351位的G置换突变为T。此外，在鉴定JAK2的V617F突变时，也可以使用对应于野生型JAK2的野生型探针(将上述序列中的小写字母a改为c的序列)。即，对于鉴定JAK2的V617F突变，可以使用含有SEQIDNO:14碱基序列的突变型探针，此外也可以使用由该突变型探针和野生型探针组成的探针组。此外，对于JAK2的N542_E543del突变，可以将含有CACAAAATCAGA-GATTTGATATTTG(SEQIDNO:15)的寡核苷酸用作突变型探针。予以说明，在上述序列中连字符的位置对应于SEQIDNO:12所示碱基序列中第250位至第255位6碱基缺失。对于JAK2的E543_D544del突变，可以将含有CACAAAATCAGAAAT-TTGATATTTGT(SEQIDNO:16)的寡核苷酸用作突变型探针。予以说明，上述序列中连字符的位置对应于SEQIDNO:12所示碱基序列中第253位至第258位6碱基缺失。对于JAK2的R541_E543>K突变，可以将含有CACAAAATCA-AAGATTTGATATTTGT(SEQIDNO:17)的寡核苷酸用作突变型探针。予以说明，上述序列中连字符的位置对应于SEQIDNO:12所示碱基序列中第248位至第253位6碱基缺失。对于JAK2的F537_K539>L突变，可以将含有CCAAATGGTG-TTAATCAGAAATGAA(SEQIDNO:18)的寡核苷酸用作突变型探针。予以说明，上述序列中连字符的位置对应于SEQIDNO:12所示碱基序列中第237位至第242位6碱基缺失。对于JAK2的K539L(TT)突变，可以将含有GGTGTTTCACttAATCAGAAATGA(SEQIDNO:19)的寡核苷酸用作突变型探针。予以说明，上述序列中的小写字母tt对应于SEQIDNO:12所示碱基序列中第241位和第242位的AA。对于JAK2的K539L(CT)突变，可以将含有GTGTTTCACctAATCAGAAATGA(SEQIDNO:20)的寡核苷酸用作突变型探针。予以说明，上述序列中的小写字母ct对应于SEQIDNO:12所示碱基序列中第241位和第242位的AA。此外，在鉴定上述JAK2的外显子12中的各突变时，也可使用与各突变的野生型相对应的野生型探针。本文中，由于所述的各突变相互非常近或者一部分重复，因此可用1个野生型探针作为代表，也可组合多个野生型探针使用。后述的实施例中，使用了以N542_E543del突变、E543_D544del突变和R541_E543>K突变为中心的野生型探针和以F537_K539>L突变为中心的野生型探针这两种。进一步地，对于CALR的1型突变，可以将对应于SEQIDNO:10中上述52碱基缺失的寡核苷酸用作突变型探针，所述寡核苷酸例如含有CTCCTTGT-CCGCTCCTCGTC(SEQIDNO:21)。予以说明，在上述序列中连字符的位置对应于SEQIDNO:10所示碱基序列中第506位至第557位的52碱基缺失。此外，在鉴定CALR的1型突变时，也可以使用对应于野生型CALR的野生型探针。即，对于鉴定CALR的1型突变，可以使用含有SEQIDNO:21碱基序列的突变型探针，此外也可以使用由该突变型探针和野生型探针组成的探针组。进一步地，对于CALR的2型突变，可以将对应于SEQIDNO:10中上述5碱基插入的寡核苷酸用作突变型探针，所述寡核苷酸例如含有ATCCTCCgacaaTTGTCCT(SEQIDNO:22)。予以说明，上述序列中的小写字母gacaa是5碱基插入。此外，在鉴定CALR的2型突变时，也可以使用对应于野生型CALR的野生型探针。即，对于鉴定CALR的2型突变，可以使用含有SEQIDNO:22碱基序列的突变型探针，此外也可以使用由该突变型探针和野生型探针组成的探针组。再另外，对于MPL的W515K突变，可以将对应于SEQIDNO:13中上述置换突变的寡核苷酸用作突变型探针，所述寡核苷酸例如含有GAAACTGCttCCTCAGCA(SEQIDNO:23)。予以说明，在上述序列中的小写字母tt对应于SEQIDNO:13所示碱基序列中第305位和第306位的TG置换突变为AA。此外，在鉴定MPL的W515K突变时，也可以使用对应于野生型MPL的野生型探针(将上述序列中的小写字母tt改为ca的序列)。即，对于鉴定MPL的W515K突变，可以使用含有SEQIDNO:23碱基序列的突变型探针，此外也可以使用由该突变型探针和野生型探针组成的探针组。再另外，对于MPL的W515L突变，可以将对应于SEQIDNO:13中上述置换突变的寡核苷酸用作突变型探针，所述寡核苷酸例如含有GGAAACTGCAaCCTCAG(SEQIDNO:24)。予以说明，在上述序列中的小写字母a对应于SEQIDNO:13所示碱基序列中第306位的G置换突变为T。此外，在鉴定MPL的W515L突变时，也可以使用对应于野生型MPL的野生型探针(将上述序列中的小写字母a改为c的序列)。即，对于鉴定MPL的W515L突变，可以使用含有SEQIDNO:24碱基序列的突变型探针，此外也可以使用由该突变型探针和野生型探针组成的探针组。如上所述，作为用于鉴别存在于CALR中的1型突变、3型突变、4型突变和/或5型突变的具有错配的CARL突变型探针而分别列举了SEQIDNO:95、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54和SEQIDNO:55，但CARL突变型探针的碱基序列并不限定于SEQIDNO:95、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54和SEQIDNO:55，可基于SEQIDNO:57所示1型突变的碱基序列、SEQIDNO:58所示3型突变的碱基序列、SEQIDNO:59所示4型突变的碱基序列和SEQIDNO:60所示5型突变的碱基序列进行适当设计。进一步地，列举了用于鉴定存在于JAK2中的基因突变的突变型探针，但突变型探针的碱基序列并不限定于SEQIDNO:14～SEQIDNO:20，可基于SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示JAK2的碱基序列进行适当设计。作为用于鉴别存在于CALR中的1型突变和2型突变的突变型探针而分别列举了SEQIDNO:21和SEQIDNO:22，但突变型探针的碱基序列并不限定于SEQIDNO:21和SEQIDNO:22，可基于SEQIDNO:10所示CALR的碱基序列进行适当设计。作为用于鉴别存在于MPL中的基因突变的突变型探针而列举了SEQIDNO:23和24，但突变型探针的碱基序列并不限定于SEQIDNO:23和24，可基于SEQIDNO:13所示MPL的碱基序列适当设计。这些探针的碱基长度没有特别限定，例如可以设为10～30个碱基长度，优选设为15～25个碱基长度。予以说明，探针可以是基于如上所述的含有SEQIDNO:10～SEQIDNO:13的碱基序列中基因突变的区域而设计的碱基序列和在该碱基序列中的一个或两个末端添加的碱基序列的总和，例如设为10～30个碱基长度，优选设为15～25个碱基长度。另外，如上设计的探针优选为核酸，更优选为DNA。DNA中可含有双链和单链，优选为单链DNA。探针例如可以通过核酸合成装置进行化学合成而获得。作为核酸合成装置，可以使用称为DNA合成仪、全自动核酸合成装置、核酸自动合成装置等的装置。如上设计的探针，优选将其5’末端固定在载体上，以微阵列(例如DNA芯片)的形式使用。此时，微阵列对于上述各基因突变，优选具有突变型探针和野生型探针。对于各基因突变，通过利用突变型探针和野生型探针，不仅能够准确地判定是否存在突变，还能够准确地判定突变的比例。本文中，突变型探针和野生型探针的长度差优选在2个碱基以内，更优选为长度相同。本发明的微阵列可以通过将上述探针固定在载体上来制作。作为载体的材料，可以使用本
技术领域：
内公知的材料，没有特别限制。例如可举出：铂、铂黑、金、钯、铑、银、汞、钨及它们的化合物等贵金属，以及以石墨、碳纤维为代表的碳等导电体材料；以单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等为代表的硅材料、以SOI(绝缘衬底上的硅)等为代表的硅材料的复合材料；玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、光敏玻璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、环状聚烯烃、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜等有机材料等。载体的形状也没有特别限制，优选为平板状。在本发明中，作为载体，优选使用在表面上具有碳层和化学修饰基团的载体。在表面具有碳层和化学修饰基团的载体包括：在基板表面具有碳层和化学修饰基团的载体，以及在由碳层组成的基板的表面具有化学修饰基团的载体。作为基板的材料，可以使用本
技术领域：
内公知的材料，没有特别限制，可以使用与上述作为载体材料而举出的材料相同的材料。在本发明的微阵列中，优选使用具有精细平板状结构的载体。形状不受限制，为长方形、正方形和圆形等，通常使用1～75mm正方形的载体，优选为1～10mm正方形的载体，更优选为3～5mm正方形的载体。从容易制造精细平板状结构的载体的角度出发，优选使用由硅材料、树脂材料形成的基板，特别更优选在由单晶硅形成的基板表面上具有碳层和化学修饰基团的载体。单晶硅也包括局部的晶轴方向轻微改变的晶体(有时也称为嵌镶晶体)和包含在原子尺度上的无序(晶格缺陷)的晶体。在本发明中，作为在基板上形成的碳层没有特别限制，优选使用人造金刚石、高压人造金刚石、天然金刚石、软金刚石(例如类金刚石碳)、非晶碳、含碳物质(例如石墨、富勒烯、碳纳米管)中的任一种、它们的混合物，或者它们层叠而成的物质。此外，也可以使用碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等碳化物。本文中，软金刚石是指称为类金刚石碳(DLC，DiamondLikeCarbon)等金刚石与碳的混合体，即不完全金刚石结构体的总称，其混合比例没有特别限定。碳层在以下几点上有利：化学稳定性优异，能够耐受之后的引入化学修饰基团和与分析对象物质结合中的反应；通过静电结合与分析对象物质结合，因此该结合具有灵活性；因不吸收UV而对于检测类UV具有透光性；在进行电印迹时能够通电。此外，在与分析对象物质的结合反应中，在非特异性吸附少这一点上也是有利的。如前所述，也可以使用基板本身由碳层组成的载体。在本发明中，可以通过公知的方法来形成碳层。例如可举出：微波等离子体CVD(Chemicalvapordeposit，化学气相沉积)法、ECRCVD(Electriccyclotronresonancechemicalvapordeposit，电子回旋共振化学气相沉积)法、ICP(Inductivecoupledplasma，电感耦合等离子体)法、直流溅射法、ECR(Electriccyclotronresonance，电子回旋共振)溅射法、电离蒸镀法、电弧蒸镀法、激光蒸镀法、EB(Electronbeam，电子束)蒸镀法、电阻加热蒸镀法等。高频等离子体CVD法是利用通过高频在电极间产生的辉光放电来将原料气体(甲烷)分解，在基板上合成碳层。电离蒸镀法是利用通过钨丝生成的热电子将原料气体(苯)分解和电离，通过偏置电压在基板上形成碳层。在由1体积％～99体积％的氢气和剩余的99体积％～1体积％的甲烷气体组成的混合气体中，也可以通过电离蒸镀法形成碳层。电弧蒸镀法是通过在固体石墨材料(阴极蒸发源)和真空容器(阳极)之间施加直流电压，来在真空中引发电弧放电并从阴极产生碳原子的等离子体，再从蒸发源向基板施加负偏置电压，由此使等离子体中的碳离子向基板加速，从而能够形成碳层。激光蒸镀法例如是向石墨的目标板照射Nd：YAG激光(脉冲振荡)使其熔融，在玻璃基板上层叠碳原子，由此能够形成碳层。当在基板表面形成碳层时，碳层的厚度通常为单分子层～100μm左右，过薄的话可能会导致底层基板的表面局部露出；相反，如果太厚则会导致生产性变差，因此优选为2nm～1μm，更优选为5nm～500nm。通过在形成有碳层的基板表面引入化学修饰基团，可以将寡核苷酸探针牢固地固定在载体上。引入的化学修饰基团可以由本领域技术人员适当选择，没有特别限制，例如可举出：氨基、羧基、环氧基、甲酰基、羟基和活性酯基。引入氨基例如可以通过在氨气中用紫外线照射碳层或者进行等离子体处理来实施。或者，可以通过在氯气中用紫外线照射碳层使其氯化，再在氨气中进行紫外线照射来实施。或者，也可以通过使亚甲基二胺、乙二胺等多价胺类气体与氯化的碳层反应来实施。引入羧基例如可以通过使前述那样氨基化的碳层与适当的化合物反应来实施。作为用于引入羧基的化合物，例如可举出：由式：X-R1-COOH(式中，X表示卤素原子，R1表示碳原子数为10～12的二价烃基)表示的卤代羧酸，例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；由式：HOOC-R2-COOH(式中，R2表示单键或碳原子数为1～12的二价烃基)表示的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸；聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等多价羧酸；由式：R3-CO-R4-COOH(式中，R3表示氢原子或碳原子数为1～12的二价烃基，R4表示碳原子数为1～12的二价烃基)表示的酮酸或醛酸；由式：X-OC-R5-COOH(式中，X表示卤素原子，R5表示单键或碳原子数为1～12的二价烃基)表示的二羧酸的一卤化物，例如琥珀酸一氯化物、丙二酸一氯化物；邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐、草酸酐、马来酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。引入环氧基例如可以通过使前述那样氨基化的碳层与适当的多价环氧化合物反应来实施。或者，可以通过使碳层所含的碳碳双键与有机过酸反应来获得。作为有机过酸，可举出过乙酸、过苯甲酸、双过氧邻苯二甲酸、过甲酸、三氟过氧乙酸等。引入甲酰基例如可以通过使前述那样氨基化的碳层与戊二醛反应来实施。引入羟基例如可以通过使前述那样氯化的碳层与水反应来实施。活性酯基是指在酯基的醇侧具有酸度高的吸电子基团、使亲核反应活化的酯类，即反应活性高的酯基。活性酯基是在酯基的醇侧具有吸电子基团、比烷基酯更加活化的酯基。活性酯基对氨基、巯基、羟基等基团具有反应性。此外，具体而言，酚酯类、硫酚酯类、N-羟胺酯类、氰甲基酯、杂环羟基化合物的酯类等是已知的活性远高于烷基酯等的活性酯基。更具体而言，作为活性酯基，例如可举出对硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、5-降冰片烯2,3-二甲酰亚胺基等，特别优选使用N-羟基琥珀酰亚胺基。引入活性酯基例如可以通过利用氨腈、碳二亚胺(例如1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺)等脱水缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺等化合物，将前述那样引入的羧基进行活性酯化来实施。通过该处理，可以形成经由酰胺键在烃基的末端结合N-羟基琥珀酰亚胺基等活性酯基而成的基团(日本特开2001-139532)。将探针溶解于点样用缓冲剂来配制点样用溶液，将其分注到96孔或384孔塑料板，通过点样装置等将分注的溶液点样到载体上，由此可以制造将探针固定在载体上的微阵列。或者，也可以用微量移液器对点样溶液手动进行点样。点样后，为了进行使探针与载体结合的反应，优选进行孵育。孵育通常在-20～100℃，优选为0～90℃的温度，通常0.5～16小时，优选为在1～2小时内进行。孵育希望在高湿度的环境中，例如，在湿度50％～90％的条件下进行。孵育之后，为了除去未与载体结合的DNA，优选用洗涤溶液(例如，50mMTBS/0.05％Tween20、2×SSC/0.2％SDS溶液、超纯水等)进行洗涤。通过使用如上配置的微阵列，对于存在于JAK2、CALR和MPL中的上述基因突变，能够同时判定诊断对象中有无各个基因突变。具体包括以下步骤：在判定是否有存在于JAK2、CALR和MPL中的上述基因突变时，从诊断对象来源的样品中提取DNA；将提取的DNA作为模板，对JAK2中含上述基因突变区域(包含JAK2的V617F突变位点的区域、包含外显子12中所含的基因突变的区域)、CALR中含上述基因突变区域和MPL中含上述基因突变区域分别进行扩增；使用上述微阵列，分别检测扩增后的核酸中是否含有存在于JAK2、CALR和MPL中的上述基因突变。诊断对象通常是人，人种等没有特别限定，一般是黄种人，优选为东亚人种，特别优选为日本人。此外，诊断对象可以是骨髓增殖性肿瘤疑似患者。诊断对象来源的样品没有特别限制。例如可举出：血液相关样品(血液、血清、血浆等)、淋巴液、粪便、癌细胞、组织或脏器的破碎物和提取物等。首先，从采自诊断对象的样品中提取DNA。作为提取方法，没有特别限定。例如可利用使用苯酚/氯仿、乙醇、氢氧化钠、CTAB等的DNA提取法。接着，将获得的DNA用作模板进行扩增反应，对含有JAK2的区域(包含JAK2的V617F突变位点的区域、包含外显子12中所含的基因突变的区域)、含有CALR的区域和含有MPL的区域进行扩增。作为扩增反应，可使用聚合酶链式反应(PCR)、LAMP(Loop-MediatedIsothermalAmplification，环介导等温扩增)、ICAN(IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids，等温和嵌合引物引发的核酸扩增)法等。特别希望的是，在扩增反应中添加标记以能够鉴别扩增后的区域。这时，作为对扩增的核酸进行标记的方法，并没有特别限定，例如可以使用对扩增反应中使用的引物进行预先标记的方法，使用在扩增反应中将标记核苷酸用作底物的方法。作为标记物质，并没有特别限定，可以使用放射性同位素、荧光染料，或者有机化合物诸如地高辛配基(DIG)及生物素等等。另外，该反应体系是包含核酸扩增与标记所需的缓冲剂、耐热DNA聚合酶、对扩增区域特异的引物、标记的核苷三磷酸(具体地是附加荧光标记等的核苷三磷酸)、核苷三磷酸和氯化镁等的反应体系。本发明的用于评价基因突变的试剂盒在包含上述<CALR基因突变>中说明的CALR突变型探针时，可以包含以下引物组，所述引物组用于扩增存在于CALR中的包含1型突变、3型突变、4型突变和5型突变的区域即包含缺失位置(图1中的箭头)的区域。本文中，引物组是指由正向引物和反向引物构成的一组引物。使用引物组扩增的包含缺失位置的区域通过具有上述错配的CARL突变型探针(例如SEQIDNO:95、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54和SEQIDNO:55)来检测。如图1所示，1型突变、3型突变、4型突变和5型突变在缺失位置的3’侧具有与野生型相同的序列(图1中划线部分)。因此，假设对于1型突变、3型突变、4型突变和5型突变，在使用包含缺失位置完全一致地设计的探针的情况下，即使针对野生型的样本，也有非特异杂交的可能性。与此相对，在上述那样地使用CARL突变型探针(例如SEQIDNO:95、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54和SEQIDNO:55)的情况下，由于有该错配，因此可以降低与野生型的非特异杂交的可能性。因此，通过使用本发明的用于评价基因突变的试剂盒，可以确实地检测出野生型样本与具有1型突变的样本。另外，通过使用本发明的用于评价基因突变的试剂盒，可确实地区分并检测出野生型样本和具有3型突变的样本。另外，通过使用本发明的用于评价基因突变的试剂盒，可确实地区分并检测出野生型样本与具有4型突变的样本。进一步，通过使用本发明的用于评价基因突变的试剂盒，可确实地区分并检测出野生型样本与具有5型突变的样本。以上的说明中，对于用于检测存在于CALR中的1型突变、3型突变、4型突变和5型突变的具有错配的CARL突变型探针的设计进行了说明，但也可对于除了CALR基因以外的其他突变也同样地设计突变型探针。例如，对于超过指定长度的缺失突变，缺失突变后的序列与野生型序列类似的情况，可同样地设计突变型探针。更具体地，在5个碱基长度以上的缺失突变、优选10个碱基以上的缺失突变、比作为探针的适合的碱基长度更长的缺失突变，且野生型的碱基序列中包含缺失位置的10个碱基以内与缺失后的序列有2个碱基长度以上一致的序列的情况下，可以设计为突变型探针，以使一致的序列的一部分发生错配。予以说明，用于检测存在于CALR中的1型突变、3型突变、4型突变和5型突变的具有错配的CARL突变型探针中，由于从野生型的碱基序列中缺失位置起5’侧上有与缺失后的序列一致的序列，因此在缺失位置的3’侧设计了具有错配的突变型探针，反之，在是从野生型的碱基序列中缺失位置起3’侧上有与缺失后的序列一致的序列的突变型的情况下，可在缺失位置的5’侧设定错配来设计突变型探针。另一方面，本发明的用于评价基因突变的试剂盒在包含上述<JAK2基因突变>中说明的JAK2突变型探针时，用于扩增JAK2中含有基因突变的区域的引物组包含用于扩增含有V617F突变的区域的V617F突变用引物组和用于扩增存在于JAK2基因的外显子12中的含有基因突变的区域的外显子12用引物组。本文中，引物组是指由正向引物和反向引物构成的一組引物。V617F突变用引物组只要是能够特异性扩增编码与野生型中第617位的缬氨酸相当的氨基酸的区域的引物组，就没有特别限制，本领域技术人员可以适当地设计。例如可举出由以下引物组成的引物组：正向引物JAK2-F：5'-GAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGG-3'(SEQIDNO:25)和反向引物JAK2-R：5'-CTGACACCTAGCTGTGATCCTGAAACTG-3'(SEQIDNO:26)。本文中，使用V617F突变用引物组对含有V617F突变的区域进行扩增时，优选将V617F突变用引物组中的任意一个引物，例如附加荧光标记的引物(例如正向引物)的浓度设为1.0μM以上。通过将该引物的浓度设定在该范围，可较好地对含有V617F突变的区域和存在于外显子12中的含有基因突变的区域进行扩增。予以说明，该引物浓度的上限没有特别限制，可设为通常的核酸扩增反应中的引物浓度上限值(例如10μM)。另一方面，作为外显子12用引物组，优选设计成能够将上述的外显子12中所含的多个基因突变的至少2个、优选3个、更优选4个、更加优选5个、最优选6个全部一起扩增。更具体而言，作为外显子12用引物组，如图3所示，可以采用选自SEQIDNO:1所示碱基序列的具有10个连续碱基以上长度的外显子12用正向引物和选自SEQIDNO:2所示碱基序列的具有10个连续碱基以上长度的外显子12用反向引物。本文中，SEQIDNO:1为编码外显子12的碱基序列的第178位至第228位，SEQIDNO:2为399位至第435位，均为SEQIDNO:12中的部分序列，两者之间包含所述的全部6个基因突变。更具体而言，外显子12用正向引物可以为选自下述正向引物中的一个引物：由SEQIDNO:3所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F1、由SEQIDNO:4所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F3、由SEQIDNO:5所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F4和由SEQIDNO:6所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F5。此外，具体而言，外显子12用反向引物可以为选自下述反向引物中的一个引物：由SEQIDNO:7所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R1、由SEQIDNO:8所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R2和由SEQIDNO:9所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R3。尤其是，外显子12用引物组更优选为由SEQIDNO:6所示碱基序列构成的外显子12用正向引物F5与由SEQIDNO:8所示碱基序列构成的外显子12用反向引物R2的组合。予以说明，所述的正向引物F1、F3～F5和反向引物R1～R3的碱基序列由编码外显子12的碱基序列上所对应的位置来表示。因此，构成引物组的正向或反向中的任意一个引物为SEQIDNO.所示碱基序列的互补链。后述的实施例中，均以反向侧作为互补链来制作。本文中，使用外显子12用引物组对包含外显子12中所含的基因突变的区域进行扩增时，优选将外显子12用引物组中的任意一个引物，例如附加荧光标记的引物(例如反向引物)的浓度设为2.5μM以上。通过将该引物的浓度设定在该范围，可较好地对含有V617F突变的区域和存在于外显子12中的含有基因突变的区域进行扩增。予以说明，该引物浓度的上限没有特别限制，可设为通常的核酸扩增反应中的引物浓度上限值(例如10μM)。虽然并不限定于用于外显子12，但引物组中正向引物的浓度和反向引物的浓度可相同也可不同。不同时，任意一个引物满足上述浓度条件即可。后述的实施例中，JAK2V617F、外显子12、CALR、MPL的任意一个引物组中，都较高地设定了荧光标记的引物浓度。此外，V617F突变用引物组中标记的引物与外显子12用引物组中标记的引物的浓度比[外显子12用引物浓度]/[V617F突变用引物浓度]优选设为1.0～5.5。通过将该浓度比设定在该范围，可较好地对含有V617F突变的区域和存在于外显子12中的含有基因突变的区域进行扩增。用于CALR中含上述基因突变区域的扩增反应的引物，只要是能够特异性扩增含上述基因突变区域的引物，就没有特别限制，本领域技术人员可以适当地设计。例如可举出由以下引物组成的引物组：引物CALR-F：5'-CGTAACAAAGGTGAGGCCTGGT-3'(SEQIDNO:27)和引物CALR-R：5'-GGCCTCTCTACAGCTCGTCCTTG-3'(SEQIDNO:28)。用于MPL中含上述基因突变区域的扩增反应的引物，只要是能够特异性扩增含上述基因突变区域的引物，就没有特别限制，本领域技术人员可以适当地设计。例如可举出由以下引物组成的引物组：引物MPL-F：5'-CTCCTAGCCTGGATCTCCTTGG-3'(SEQIDNO:29)和引物MPL-R：5'-ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGTTTAC-3'(SEQIDNO:30)。另外，通过引物扩增的核酸片段只要含有对应于设计探针的区域，就没有特别限定，例如优选为1kbp以下，更优选为800bp以下，进一步优选为500bp以下，特别优选为350bp以下。将如上获得的经扩增的核酸和固定在载体上的探针进行杂交反应，检测经扩增的核酸与突变型探针的杂交，由此可以评价诊断对象中是否存在上述基因突变。即，例如可以通过检测标记来测定经扩增的核酸与突变型探针进行的杂交。来自标记的信号，例如使用荧光标记时，使用荧光扫描仪进行荧光信号检测，通过图像分析软件对其进行分析而能够将信号强度量化。杂交反应优选在严格条件下实施。严格条件是指形成特异性杂交，但不形成非特异性杂交的条件，例如是指在50℃进行16小时杂交反应，然后在25℃用2×SSC/0.2％SDS洗涤10分钟和在25℃用2×SSC洗涤5分钟的条件。或者，作为杂交的温度，当盐浓度为0.5×SSC时，可设定为45～60℃，当探针链长较短时，更优选将杂交温度设为低于该温度，当链长较长时，更优选将杂交温度设为高于该温度。当然，如果盐浓度提高则特异性杂交的温度升高，反之如果盐浓度降低则特异性杂交的温度下降。另外，对于上述各基因突变，当使用包含突变型探针和野生型探针的微阵列时，可以利用来自这些突变型探针和野生型探针的信号强度来评价有无上述基因突变。具体而言，分别测定野生型探针的信号强度和突变型探针的信号强度，计算出用于评价来自突变型探针的信号强度的判定值。作为判定值的计算示例，例如可举出使用公式：[来自突变型探针的信号强度]/([来自野生型探针的信号强度] [来自突变型探针的信号强度])的方法。然后，将通过上述公式计算出的判定值和预设的阈值(临界值)进行比较，当判定值超过阈值时，则判断经扩增的核酸中含有上述基因突变；当判定值低于阈值时，则判断经扩增的核酸中不含有上述基因突变。通过如上所述利用判定值，可以判定有无JAK2、CALR和MPL中的各基因突变。本文中，阈值没有特别限定，例如可以使用已确定在JAK2、CALR和MPL中存在的上述各基因突变为野生型的样本，根据通过上述公式计算的判定值来规定。更具体而言，使用已确定在JAK2、CALR和MPL中存在的上述各基因突变为野生型的多个样本计算多个判定值，将其平均值 3σ(σ：标准偏差)的值设为阈值。予以说明，也可以将平均值 2σ或平均值 σ的值设为阈值。如上所述，利用包含用于鉴定存在于JAK2、CALR和MPL中的各基因突变的突变型探针的微阵列，可以同时鉴定存在于JAK2、CALR和MPL中的各基因突变。存在于JAK2、CALR和MPL中的各基因突变的相关信息，例如可以用于WHO的分类(2016年度版)中的骨髓增殖性肿瘤的诊断。详细而言，在WHO的分类中，在真性红细胞增多症或真性多血症(polycythemiavera，PV)的诊断中，JAK2中的上述基因突变的存在是一个重要因素。此外，在WHO的分类中，在原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)的诊断中，存在于JAK2、CALR和MPL中的基因突变的任一种突变的存在是一个重要因素。而且，在WHO的分类中，在纤维化前期/早期的原发性骨髓纤维化(prefibrotic/earlyprimarymyelofibrosis，prefibrotic/earlyPMF)或原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)的诊断中，存在于JAK2、CALR和MPL中的基因突变的任一种突变的存在是一个重要因素。如上所述，例如在利用WHO的分类(2016年度版)的骨髓增殖性肿瘤的诊断中，可以利用包含用于鉴定存在于JAK2、CALR和MPL中的各基因突变的突变型探针的微阵列。实施例以下通过实施例进一步详细说明本发明，本发明的技术范围并不限定于这些实施例。[实施例1]1.样品制备本实施例中，使用了健康者外周血来源的基因组DNA(购自Biochain公司)作为野生型样品。本实施例中，为了检测表1所示的基因突变，分别扩增了含有该基因突变的对象区域(4个位置)。[表1]本实施例中，为了扩增表1所示的4个对象区域，设计了表2所示的引物。予以说明，外显子12-F为F5，外显子12-R为R2的互补链。[表2]使用如上制备的DNA样品，对于JAK2基因、CALR基因和MPL基因，分别通过PCR扩增了4个对象区域。予以说明，PCR中，作为模板的基因组DNA为8ng/μL或16ng/μL。反应液组成如表3所示。[表3]试剂名称制备厂家体积(μL)10×PCR缓冲液罗氏诊断公司2.010nMdNTP混合物罗氏诊断公司0.4FaststartDNAtaq聚合酶罗氏诊断公司0.2引物混合物LifeTechnologies日本公司2.0DNA样品(8ng/μL或16ng/μL)5.0纯化水10.4然后，将PCR的热循环在95℃进行5分钟，之后以95℃30秒、59℃30秒和72℃45秒作为1个循环进行40个循环，之后在72℃进行10分钟，最终保持为4℃。2.微阵列本实施例中设计了对应于JAK2基因中V617F突变及外显子12中所含的6个基因突变、CALR基因中1型突变～5型突变和MPL基因中W515L/K突变的突变型探针和对应于上述的野生型探针。各探针的碱基序列归纳于表4中。[表4]3.基因突变的鉴定使用包含上述探针的芯片，如下进行杂交。首先，在设置为规定温度(52℃)的杂交室内放置湿盒，充分预热杂交室和湿盒。将4μL的PCR反应液与2μL杂交缓冲液(2.25×SSC/0.23％SDS/0.2nMIC5标记寡核苷酸DNA(LifeTechnologies日本公司公司制)进行混合，取3μl该溶液，滴到原位杂交盖玻片的中心凸起部上，将其盖到芯片上，在设定为52℃的杂交室装置(东洋钢钣株式会社制)内反应1小时。杂交反应完成后，将剥离原位杂交盖玻片的芯片安置在夹持板上，将洗涤用不锈钢夹持板浸入在0.1×SSC/0.1％SDS溶液中。上下振动数次后，将夹持板浸入在1×SSC溶液(室温)中直到检测芯片荧光强度。在检测前用覆膜盖住芯片，利用BIOSHOT(东洋钢钣株式会社制)检测芯片的荧光强度。使用如上测定的野生型探针和突变型探针的荧光强度，对于JAK2的基因突变(V617F突变及外显子12中所含的6个基因突变)、CALR的基因突变和MPL的基因突变，通过以下公式计算判定值。判定值＝[突变型探针的荧光强度]/([野生型探针的荧光强度] [突变型探针的荧光强度])[实验例1-1]本实验例设计了多个CARL突变型探针并进行评价，所述CARL突变型探针用于检测作为存在于CARL中的缺失型基因突变的3型突变、4型突变或5型突变。即，对于各个3型突变、4型突变或5型突变，设计了与含有缺失位置(图1中箭头)的区域完全一致的多个CARL突变型探针、该区域上具有错配的多个CARL突变型探针(表5)。予以说明，实际制作的探针在设计的序列的互补链的5’-侧结合有接头(T的连续部分)。[表5]探针名探针序列(5’-3’)备注SEQIDNO.3型突变探针1GAGGAGCAGAGGCAGA完全匹配643型突变探针2GAGCAGAGGCAGAGGA完全匹配653型突变探针3AGGAGCAGAGGCAGAG完全匹配663型突变探针4AGGAGCAGGGCAGAGGA有错配(-A)673型突变探针5GAGGAGCAGAGCAGAGGACAA有错配(-G)533型突变探针6GAGGAGCAGGCAGAGGACAA有错配(-GA)683型突变探针7ACGAGGAGCAGCAGAGGACAA有错配(-GAG)694型突变探针1GGCTTAGGAGGAGGCA完全匹配704型突变探针2AGAGGCTTAGGAGGAGG完全匹配714型突变探针3CAGAGGCTTAGGAGGAGG完全匹配724型突变探针4CAGAGGCTTAGAGGAGGCAG有错配(-G)734型突变探针5CAGAGGCTTAGAGGAGGCAGAG有错配(-G)544型突变探针6GCAGAGGCTTAGAGGAGGCAGA有错配(-G)744型突变探针7GCAGAGGCTTAGAGGAGGCA有错配(-G)754型突变探针8AGCAGAGGCTTGAGGAGGCAGA有错配(-AG)764型突变探针9GCAGAGGCTTGAGGAGGCAGA有错配(-AG)774型突变探针10GCAGAGGCTTGAGGAGGCA有错配(-AG)784型突变探针11GCAGAGGCTTGGAGGAGGCA有错配(-A)794型突变探针12AGCAGAGGCTTGGAGGAGGCA有错配(-A)804型突变探针13AGCAGAGGCTTAAGGAGGCAGAG有错配(-GG)814型突变探针14AGCAGAGGCTTAAGGAGGCAGA有错配(-GG)825型突变探针1GGGGCAGAGGACAAGG完全匹配835型突变探针2GGGCAGAGGACAAGG完全匹配845型突变探针3GACGAGGGGCGGACAAGGA有错配(-AGA)855型突变探针4GACGAGGGGCGGACAAGGAG有错配(-AGA)555型突变探针5ACGAGGGGCGGACAAGGAG有错配(-AGA)865型突变探针6CGAGGGGCGGACAAGGA有错配(-AGA)875型突变探针7CGAGGGGCGGACAAGG有错配(-AGA)88本实验例中使用了表5所示的各探针测定了针对突变模型样品(100％突变质粒)的荧光强度和针对野生型模型样品(质粒)的荧光强度。其结果如表6所示。予以说明，表6中，“特异性荧光强度*1”为针对突变模型样品的荧光强度，“非特异性荧光强度*2”为针对野生型模型样品的荧光强度。[表6]如表6所示，可知在指定位置具有缺失型错配的探针可与特异性荧光强度*1高、非特异性荧光强度*2低的突变型样品进行特异性杂交。如表6所示，设计出了可与特异性荧光强度*1为10000以上、非特异性荧光强度*2为1000以下的突变型样品进行非常特异性杂交的探针。更进一步，设计的突变探针中，设计出了可与特异性荧光强度*1为15000以上、非特异性荧光强度*2为500以下这样的突变型样品进行非常特异性杂交的探针(例如3型突变探针5、4型突变探针5、4型突变探针7、5型突变探针4和5型突变探针5)。予以说明，作为用于鉴定4型突变的探针的4型突变探针5和4型突变探针7，从特异性荧光强度*1的高度来看，可认为更优选4型突变探针5。此外，作为用于鉴定5型突变的探针的5型突变探针4和5型突变探针5，从特异性荧光强度*1的高度来看，可认为更优选5型突变探针4。此外，使用了表5所示的各探针测定了针对各突变模型样品(1型突变模型质粒、2型突变模型质粒、3型突变模型质粒、4型突变模型质粒和5型突变模型质粒)的荧光强度和针对野生型模型样品(质粒)的荧光强度。其结果如表7所示。[表7]探针名野生型1型2型3型4型5型3型突变探针11931011624568866343型突变探针25461514729158423型突变探针385681196223260403型突变探针46057491452137223型突变探针5128134103164491342313型突变探针640248230791129216243993型突变探针71836051381048030093884型突变探针157757226110891484型突变探针2506934981013146724型突变探针325126021868711637174型突变探针41236217010312227214型突变探针5362943965425854484型突变探针617007212445328914344型突变探针7418663534617838474型突变探针8771836436918071574型突变探针993511179210218896394型突变探针10235781942075276484型突变探针1123018515703925213364型突变探针1226598920024326570404型突变探针131478289129724521704464型突变探针141411986118286211730445型突变探针133701141121251211336273915型突变探针2461181616928318242137885型突变探针357300232335123585型突变探针41144700968321191262815型突变探针5111121976332624169235型突变探针6127099864629975型突变探针749423117511863如表7所示，可知在指定位置具有缺失型错配的探针可特异性地检测各突变类型。表7所示的结果中，使用了3型突变探针5、4型突变探针5和5型突变探针4测定的结果归纳于图2中。3型突变探针5、4型突变探针5和5型突变探针4实际制作的探针序列如表4所示。予以说明，图2中还示出了后述实验例1-2中示出的结果中使用了1型突变探针7(实际制作的探针序列如表4所示)测定的结果。[实验例1-2]本实验例中设计了多个CARL突变型探针并进行了评价，所述CARL突变型探针用于检测作为存在于CARL中的缺失型基因突变的1型突变。即，对于1型突变，设计了与含有缺失位置(图1中箭头)的区域完全一致的多个CARL突变型探针、在该区域具有错配的多个CARL突变型探针(表8)。予以说明，实际制作的探针在设计的序列的互补链的5’-侧结合有接头(T的连续部分)。[表8]本实验例中使用了表8所示的各探针测定了针对突变模型样品(突变5％质粒)的荧光强度和针对野生型模型样品(质粒)的荧光强度。其结果如表9所示。予以说明，表9中，“特异性荧光强度*1”为针对突变模型样品的荧光强度，“非特异性荧光强度*2”针为对野生型模型样品的荧光强度。[表9]如表9所示，可知在指定位置具有缺失型错配的探针可与特异性荧光强度*1高、非特异性荧光强度*2低的突变型样品进行特异性杂交。如表9所示，设计出了可与特异性荧光强度*1为15000以上、非特异性荧光强度*2为3000以下这样的突变型样品进行非常特异性杂交的探针(1型突变探针7)。[实验例2]本实验例设计了多个引物组并进行了评价，所述引物组用于扩增含有JAK2的外显子12中所含的6个基因突变的区域。设计的引物组如图3所示。本实施例中，对下列表10所示的引物组进行了评价。表10中的F1～F5和R1～R3与图1对应。如图3所示，正向引物F1、F3～F5包含在SEQIDNO:1所示碱基序列的范围，正向引物F2设计在偏离该范围的位置(SEQIDNO:52)。予以说明，实验例1和后述实验例2中，作为样本使用了野生型的来自健康者的外周血基因组DNA，并用野生型探针的荧光强度进行评价。[表10]正向引物反向引物引物组1F1R1引物组2F2R2引物组3F3R3引物组4F4R3引物组5F5R2结果如图4所示。由图4可表明，可知在本实施例中设计的引物组中，在使用除了使用F2的引物组2以外的引物组的情况下，对于所有的扩增片段均达到了优异的荧光强度。这些引物组中，可认为优选整体荧光强度高的引物组1、4和5，可认为更优选各分析对象区域间的强度差相对较小的引物组1和5。以下的评价中，采用了表2所示的引物组5(F5与R2的组合)。[实验例3]图5和图6中表示以PCR反应液中混合的引物混合物中的引物的浓度、以扩增含V617F突变位点的区域的引物组中标记的引物(正向引物)的浓度为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。另外，图7和图8中表示以PCR反应液中混合的引物混合物中的引物的浓度、以扩增JAK2外显子12的引物组中标记的引物(反向引物)的浓度为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。由图5可表明，扩增含V617F突变位点的区域的引物组中标记的一个引物浓度为0.5μM时，没有达到荧光强度12000以上。另外，由图6可表明，扩增含V617F突变位点的区域的引物组中标记的一个引物浓度即使为2.5μM，扩增外显子12的引物组中标记的一个引物浓度为2.0μM时，也未能达到荧光强度12000以上。另一方面，由图7可表明，扩增外显子12的引物组中标记的一个引物浓度即使为3.0～4.0μM，扩增含V617F突变位点的区域的引物组中标记的一个引物浓度为0.5μM时，也未能达到荧光强度12000以上。另外，由图8可表明，在扩增含V617F突变位点的区域的引物组中标记的一个引物浓度为1.0μM以上、扩增外显子12的引物组中标记的一个引物浓度为2.5μM以上的条件下，达到了荧光强度12000以上。图9中表示以PCR反应液中混合的引物混合物中的引物的浓度、以扩增外显子12的引物组中标记的引物(反向引物)与扩增含V617F突变位点的区域的引物组中标记的引物(正向引物)的浓度比为横轴、以来自扩增的4个区域的荧光强度为纵轴的特性图。由图9可表明，所述浓度比在1.0～5.5的范围的情况下，对于所有的扩增片段，均达到了荧光强度12000以上。[实施例2]本实施例中，在突变模型样本中，构建携带有基因分析对象区域的野生型或突变型序列的人工基因(质粒)，使用任意混合野生型人工基因与突变型人工基因的混合物，按照表11所示的反应液组成进行了用于突变检测的PCR。[表11]试剂名称制备厂家体积(μL)10×PCR缓冲液罗氏诊断公司4.010nMdNTP混合物罗氏诊断公司0.8FaststartDNAtaq聚合酶罗氏诊断公司0.4引物混合物LifeTechnologies日本公司4.0DNA样品(0.16pg/μL)10.0纯化水20.8另外，本实施例中，在PCR的反应液中添加表12所示的阻断剂寡DNA。阻断剂以抑制突变检测用探针的非特异性杂交为目的进行添加，从而即使在分析对象基因的突变比例很小的情况下，也能够获得足够的检测灵敏度，因此设计为能与来自野生型的扩增产物进行特异性杂交。[表12]予以说明，本实施例中，使用所有的分析对象基因区域是野生型的野生型样本(n＝9)、分析对象区域的一部分为突变型的突变模型样本(n＝3)，突变体模型样本的比例设为1％或5％。结果如图10所示。予以说明，图10中的误差线为5σ。如图10所示，对于1％或5％的基因突变，均能得到识别。本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入本说明书。序列表<110>东洋钢钣株式会社<120>用于评价骨髓增殖性肿瘤相关基因突变的试剂盒<130>H129PCT<150>JP2019-158722<151>2019-08-30<150>JP2019-176891<151>2019-09-27<150>JP2020-133602<151>2020-08-06<160>95<170>PatentInversion3.5<210>1<211>51<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>1tctgatgtaccaacctcaccaacattacagaggcctactcatatgaaccaa51<210>2<211>37<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>2tatgaaaaatatgccaaccttgtgttagatgttagca37<210>3<211>22<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>3tctgatgtaccaacctcaccaa22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>4caacctcaccaacattacagaggc24<210>5<211>25<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>5acagaggcctactcatatgaaccaa25<210>6<211>24<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>6accaacattacagaggcctactca24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>7gccaaccttgtgttagatgttagc24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>8tatgaaaaatatgccaaccttgtgt25<210>9<211>25<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>9gccaaccttgtgttagatgttagca25<210>10<211>1062<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>10ggctgattttttgtatttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccagggtggtctc60gatctcctgacctcgtgatccgcccaccttggcctctgggcgaggattacaggcgtgatc120cacctcacctggcctctccatctttttaactgcagtgtcagcggtgttccttgtcttctc180tgcagatgcaggcagcagaatatagtggttataggaacacaggtggaaaccctgtccaaa240gcaagggctatcgggtatcacctctgaccatccttcccattcatcctccaggtcaagtct300ggcaccatctttgacaacttcctcatcaccaacgatgaggcatacgctgaggagtttggc360aacgagacgtggggcgtaacaaaggtgaggcctggtcctggtcctgatgtcgggggcggg420cagggctggcagggggcaaggccctgaggtgtgtgctctgcctgcaggcagcagagaaac480aaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggcttaaggaggaggaagaagacaagaaac540gcaaagaggaggaggaggcagaggacaaggaggatgatgaggacaaagatgaggatgagg600aggatgaggaggacaaggaggaagatgaggaggaagatgtccccggccaggccaaggacg660agctgtagagaggcctgcctccagggctggactgaggcctgagcgctcctgccgcagagc720tggccgcgccaaataatgtctctgtgagactcgagaactttcatttttttccaggctggt780tcggatttggggtggattttggttttgttcccctcctccactctcccccaccccctcccc840gcccttttttttttttttttttaaactggtattttatctttgattctccttcagccctca900cccctggttctcatctttcttgatcaacatcttttcttgcctctgtccccttctctcatc960tcttagctcccctccaacctggggggcagtggtgtggagaagccacaggcctgagatttc1020atctgctctccttcctggagcccagaggagggcagcagaagg1062<210>11<211>700<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>11tatgggtcaagcctgtttgactggcattattcatgattcctgtaccactcttgctctctc60tcactttgatctccatattccaggcttacacaggggtttcctcagaacgttgatggcagt120tgcaggtccatataaagggaccaaagcacattgtatcctcatctatagtcatgctgaaag180taggagaaagtgcatctttattatggcagagagaattttctgaactatttatggacaaca240gtcaaacaacaattctttgtacttttttttttccttagtctttctttgaagcagcaagta300tgatgagcaagctttctcacaagcatttggttttaaattatggagtatgtgtctgtggag360acgagagtaagtaaaactacaggctttctaatgcctttctcagagcatctgtttttgttt420atatagaaaattcagtttcaggatcacagctaggtgtcagtgtaaactataatttaacag480gagttaagtatttttgaaactgaaaacactgtaggactattcagttatatcttgtgaaaa540aggaaagcaatgaagttaaaagtagaaggttacaatgcccaaacaatagagtattatagt600aaacaaatgtctataaaacattttgtgttcatgatagcaaaagagattatggcaggttca660acataacattggaataactggccttttcagtacaaactta700<210>12<211>605<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>12ttttctattataaaaaaagaacaattaggagttattaagcatttcttatacgtagaacac60atttcattttactcctctttggagcaattcatactttcagtgtattttgaagtgatatat120atgtattttattttttcagataaatcaaaccttctagtcttcagaacgaatggtgtttct180gatgtaccaacctcaccaacattacagaggcctactcatatgaaccaaatggtgtttcac240aaaatcagaaatgaagatttgatatttgtaagtcattagatactcattactgtctttttt300gtccttttaaaacaacatctgttttcttgatttacattcatgtgacattggaattatttt360gttatatacaaatttagttgtgatttaaatatttttcttatgaaaaatatgccaaccttg420tgttagatgttagcaaaattaattatcttaattatcctaagaatggaatcttaattttct480ttttggaaatttaaaaatgattcttcacaaatctcaaattaaaaattaaaaatctacaaa540gacctatatcgcaactcccaagttctcaagaaagtaagggaaattcaaggggttaaaaat600aaaga605<210>13<211>611<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>13cacagcgcctgcgccagggactgggcgccgggtgcgagtggggcggggctcggagagggg60cgaggcgcggggcgcggagaggggcggggccctgaccttgcgggccgacggctgcgcagg120tgcccgcagtgcccaggggcggcgaggggcggggccagagtaggggctggctggatgagg180gcggggctccggcccgggtgggccgaagtctgaccctttttgtctcctagcctggatctc240cttggtgaccgctctgcatctagtgctgggcctcagcgccgtcctgggcctgctgctgct300gaggtggcagtttcctgcacactacaggtaccgcccccgccaggcaggagactggcggtg360gaccaggtggagccgaaggcctgtaaacaggcattcttggttcgctctgtgaccccagat420ctccgtccaccgcccgtgcgcacctacggcttcgccacttcctgcacgtcacctctggga480ctcgccgcggctccttacactctaacacgcccactataccgcccacctcgaacagccccg540cctcctgctgctcacctcggcgactaggccaccgtccacccttcagccaaactgcccact600ccacccccatc611<210>14<211>19<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>14ctccacagaaacatactcc19<210>15<211>25<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>15cacaaaatcagagatttgatatttg25<210>16<211>26<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>16cacaaaatcagaaatttgatatttgt26<210>17<211>26<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>17cacaaaatcaaagatttgatatttgt26<210>18<211>25<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>18ccaaatggtgttaatcagaaatgaa25<210>19<211>24<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>19ggtgtttcacttaatcagaaatga24<210>20<211>23<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>20gtgtttcacctaatcagaaatga23<210>21<211>20<212>DNA<213>人工的(Artificial)<220><223>合成DNA<400>21ctccttgtccgctcctcgtc20<210>22<21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