基因组组合及其在制备鉴别肝脏癌变、组织分型及预后的制品中的用途

1.本发明属生物和医学检验领域，涉及基因组组合及其用途，尤其是在制备鉴别肝脏癌变、组织分型及预后的制品中的用途。本发明应用所述基因组组合(包括其中二种及二种以上任意组合)在肝脏癌变前后表达量的差异建立对原发性肝癌的鉴别、组织分型及预后评估的分子学方法。
背景技术：
：：2.现有技术公开了肝癌主要包括原发性肝癌和继发性肝癌。据报道，原发性肝癌(liverhepatocelluarcarcinoma,lihc)是我国高发性肿瘤，主要包括：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)、纤维板型癌(fibrolamellarcarcinoma)、胆管上皮癌(hepatocholangiocarcinoma)等类型。病理形态学是诊断肝癌的金标准，然而近年来病理医生紧缺且病理诊断耗时长，成为病理学发展的瓶颈。3.有文献报道了有关基因与肿瘤之间的密切关系[1-35]，但尚未见将这些基因进行组合，作为肝癌标志物谱以提高肝癌的鉴别的报道；也尚未有文献报道有关基因谱在不同组织类型中的表达存在着差异性，并将这些差异进行互补用于肝癌的组织分型，以及联合有关基因进行患者的预后评估。[0004]基于现有技术的研究基础与现状，本技术的发明人拟提供一种用于肝癌鉴别、组织分型及预后评估的方法；具体涉及一种基因组组合及其在制备鉴别肝脏癌变、组织分型及预后的制品中的用途。本发明通过所述基因组组合(包括其中二种及二种以上任意组合)在肝癌组织中的表达量改变，辅助肝癌鉴别、组织分型、和预后评估。尤其是通过多种肿瘤标志物联合形成阵列，再与提取、检测肝癌组织中蛋白质如，免疫比浊、胶体金、免疫化学发光等或rna如，rt-pcr、荧光定量pcr、rnaarray、rnasequencing等相结合，为原发性肝癌的预测、组织分型及预后评估提供一种快速、高通量、有效、客观的分子学方法。[0005]与本发明相关的参考文献有：[0006]1.choudharyi,etal.proteomicinvestigationtoidentifyanticancertargetsofnemopilemanomuraijellyfishvenominhumanhepatocarcinomahepg2cells.toxins(basel).2018；10(5):194.[0007]2.murataa,etal.pretreatmentakr1b10expressionpredictstheriskofhepatocellularcarcinomadevelopmentafterhepatitiscviruseradication.worldjgastroenterol.2016；22(33):7569-78.[0008]3.zhangyl,dingc,sunl.highexpressionb3gat3isrelatedwithpoorprognosisoflivercancer.openmed(wars).2019；14:251-258.[0009]4.fengh,etal.identificationofsignificantgeneswithpoorprognosisinovariancancerviabioinformaticalanalysis.jovarianres.2019；12(1):35.[0010]5.daiwetal.downregulationofexosomalclec3binhepatocellularcarcinomapromotesmetastasisandangiogenesisviaampkandvegfsignals.cellcommunsignal.2019；17(1):113.[0011]6.yanghc,etal.theredoxroleofg6pdincellgrowth,celldeath,andcancer.cells.2019；8(9):1055.[0012]7.kushwahapp,rapallikc,kumars.gemininamultitaskproteininvolvedincancerpathophysiologyanddevelopmentalprocess:areview.biochimie.2016；131:115-127.[0013]8.weic,etal.lpcat1promotesbrainmetastasisoflungadenocarcinomabyup-regulatingpi3k/akt/mycpathway.jexpclincancerres.2019；38(1):95.[0014]9.lairk,etal.ndufa4l2fine-tunesoxidativestressinhepatocellularcarcinoma.clincancerres.2016；22(12):3105-17.[0015]10.liks,etal.nt5dc2promotestumorcellproliferationbystabilizingegfrinhepatocellularcarcinoma.celldeathdis.2020；11(5):335.[0016]11.fuz,etal.pes1inlivercancer:aprognosticbiomarkerwithtumorigenicroles.cancermanagres.2019；11:9641-9653.[0017]12.mayinuera,etal.upregulationofproteintyrosinephosphatasetypeivamember3(ptp4a3/prl-3)isassociatedwithtumordifferentiationandapoorprognosisinhumanhepatocellularcarcinoma.annsurgoncol.2013；20(1):305-17.[0018]13.lic,etal.hepatitisbvirusmrna-mediatedmir-122inhibitionupregulatespttg1-bindingprotein,whichpromoteshepatocellularcarcinomatumorgrowthandcellinvasion.jvirol.2013；87(4):2193-205.[0019]14.soundararajanp,kimjs.anti-carcinogenicglucosinolatesincruciferousvegetablesandtheirantagonisticeffectsonpreventionofcancers.molecules.2018；23(11):2983.[0020]15.huangk,etal.highspink1expressionpredictspoorprognosisandpromotescellproliferationandmetastasisofhepatocellularcarcinoma.jinvestsurg.2020:1-10.[0021]16.tsuchiyan,etal.biomarkersfortheearlydiagnosisofhepatocellularcarcinoma.sawaday,endoi,saitok,uemuray,nakatsurat.worldjgastroenterol.2015；21(37):10573-83.[0022]17.zhangr,etal.stmn1upregulationmediateshepatocellularcarcinomaandhepaticstellatecellcrosstalktoaggravatecancerbytriggeringthemetpathway.cancersci.2020；111(2):406-417.[0023]18.yaor,etal.asmallcompoundtargetingtacc3revealeditsdifferentspatiotemporalcontributionsforspindleassemblyincancercells.oncogene.2014；33(33):4242-52.[0024]19.weiq,etal.anticanceractivityofathymidinequinoxalineconjugateismodulatedbycytosolicthymidinepathways.bmccancer.2015；15:usingmassspectrometry.proteomics.2019；194:125-131.[0040]35.fernandez-garcíace,etal.associationofficolin-3withabdominalaorticaneurysmpresenceandprogression.jthrombhaemost.2017；15(3):575-585.。技术实现要素：[0041]本发明的目的在于基于现有技术的现状，为“快速且以高精度的鉴别肝癌、组织分型及预后评估”提供方法的目的，提供一种基因组组合及其用途，尤其是所述基因组组合在制备鉴别肝脏癌变、组织分型及预后的制品中的用途。本发明利用所述基因组组合肿瘤标志物组中的基因表达谱的改变辅助肝癌的鉴别、组织分型及预后评估，进一步，建立一种分子学方法。[0042]本发明基于大规模的肝癌相关癌基因/抑癌基因表达谱的分析，筛查出与正常肝组织相比基因表达差异显著的、与肝癌组织分型及预后相关的一组基因：ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd、ube2c、plvap、dnase1l3、socs2、clec4g、cyp1a2、fcn3。所述的肝癌鉴别、组织分型及预后评估与上述基因组在肝组织癌变前后出现表达量改变相关，可用于鉴别肝脏是否发生癌变、癌变细胞类型(包括肝细胞癌、纤维板型癌、混合型肝胆管癌等)及患者预后；[0043]本发明中，s1联合上述基因(2个及2个以上的任意组合)表达量改变预测肝脏是否癌变、肝癌类型及病人预后；[0044]本发明中，s2上述基因任意组合后再与其它指标相结合后，预测肝脏是否癌变、肝癌类型及病人预后；[0045]本发明中，实验显示：与其对应的正常组织相比，在肝癌组织中dnase1l3、socs2、clec4g、cyp1a2、fcn3等基因的表达量极度降低，而ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd、ube2c、plvap等基因表达量极度增高；clec3b在肝细胞癌和纤维板型癌总降低，肝胆管癌中增高。[0046]本发明中，研究显示：ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2c、ube2t等基因的表达量较高者提示肿瘤恶性程度高、病人预后差；而clec3b、dnase1l3、plvap、socs2等基因表达量较高者提示肿瘤恶性程度低、病人预后好。[0047]本发明涉及到检测上述基因表达产物包括：蛋白质和rna。[0048]本发明涉及到检测的上述基因产物，既包括肿瘤细胞中的，也包括各种原因进入体液中的mrna、蛋白质以及外泌体中的，包括是完整和片段。[0049]本发明所涉及的用于分析的生物样品包括肝癌组织、体液(包括血液、尿液、穿刺液等)、穿刺组织等，上述基因表达量改变的检测，作为预测肝脏癌变、肿瘤恶性程度、靶向药物筛选、转移能力、分子分型、生存期等预后评估指标。[0050]本发明所涉及的体液包括血液、尿液、胸腔积液、腹腔积液、肿瘤穿刺液、淋巴液等。[0051]本发明所涉及的血液包括全血、血清、血浆、分离有核细胞、血液中的循环肿瘤细胞、外泌体等。[0052]本发明所涉及的上述基因蛋白检测包括直接提取肝癌组织蛋白经化学或免疫学方法进行检测和免疫组化分析。[0053]本发明所涉及的上述基因rna检测包括经直接提取肝癌组织rna后结合rt-pcr技术、荧光定量pcr技术、rnasequencing、rnaarray等进行检测。[0054]本发明涉及的组织分型实用范围为原发性肝癌和继发性肝癌,原发性肝癌包括：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)、纤维板型癌(fibrolamellarcarcinoma)、胆管上皮癌(hepatocholangiocarcinoma)。[0055]本发明涉及的：基因产物的检测包括蛋白水平和rna水平，检测方法涉及：免疫组化、免疫荧光、westernblot、elisa、流式细胞术检测、rt-pcr、免疫学检测、化学法检测、荧光定量pcr、mrnasequencing、rnaarray等检测技术，但不仅限于这些技术、基因甲基化检测(包括各种检测基因甲基化的方法)等。[0056]本发明所涉及所述的rt-pcr检测上述基因的rna产物，逆转录后，涉及到pcr包括：普通pcr、荧光定量pcr、巢式pcr、多重pcr、数字pcr等。[0057]本发明的有益效果是：[0058]病理形态学是诊断肝癌的金标准，然而近年来病理医生紧缺而且病理诊断耗时长，成为病理学发展的瓶颈。在本发明中，本发明提供了一种基于肿瘤标志物谱辅助肝癌鉴别、组织分型和预后评估的分子学方法。尤其是通过多种肿瘤标志物联合形成阵列，再与提取、检测肝病变组织中蛋白质(如免疫比浊、胶体金、免疫化学发光等)或rna(如rt-pcr、荧光定量pcr、rnaarray、rnasequencing等)等相结合，可以为肝癌的预测、组织分型及预后评估提供一种快速、高通量、有效、客观的方法。[0059]本发明涉及的基因组组合肿瘤标志物也可用于肝癌的疗效评估、药物筛选、分子分型等。附图说明[0060]图1.mrnasequencing结果的热图显示：[0061]本发明涉及的基因ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd、ube2c、plvap、dnase1l3、socs2、clec4g、cyp1a2、fcn3等的mrna在正常肝组织和肝癌组织中总体表达情况。[0062]图2.mrnasequencing结果显示：[0063]与正常肝组织相比，肝癌组织总体及各亚型中ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1等基因的mrna表达量的改变，****p《0.0001,***p《0.001，**p《0.01。[0064]图3mrnasequencing结果显示：[0065]与正常肝组织相比，肝癌组织总体及各亚型中cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2等基因的mrna表达量的改变。[0066]图4.mrnasequencing结果显示：[0067]与正常肝组织相比，肝癌组织总体及各亚型中nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1等基因的mrna表达量的改变。[0068]图5.mrnasequencing结果显示：[0069]spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3等基因的mrna表达量的改变。[0070]图6.mrnasequencing结果显示：[0071]与正常肝组织相比，肝癌组织总体及各亚型中lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd等基因的mrna表达量的改变。[0072]图7.mrnasequencing结果显示：[0073]与正常肝组织相比，肝癌组织总体及各亚型中ube2c、plvap、dnase1l3、socs2、clec4g、cyp1a2、fcn3等基因的mrna表达量的改变。[0074]图8.生存曲线结果显示：[0075]akr1b10、ccdc58、spink1、spp1、tk1等基因的mrna表达量高的病人总体生存时间短、预后差；clec3b、dnase1l3、plvap、socs2等基因的mrna表达量高的病人总体生存时间长、预后好。[0076]图9.生存曲线结果显示：[0077]ahsa1、b3gat3、c7orf68、ccnb1、cenpw、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3(取cutoff值)等基因的mrna表达量高的病人总体生存时间短、预后差。[0078]图10.生存曲线结果显示：[0079]pttg1、sfn、stmn1、tacc3、ube2c、ube2t(取cutoff值)等基因的mrna表达量高的病人总体生存时间短、预后差。[0080]图11.基因组在原发性肝癌鉴定中的应用：其中显示，[0081]基于gpc3,lcn2,spp1,ube2c,pttg1,sfn,mdk等基因的mrnasequencing检测结果在正常肝组织和肝癌组织中的表达差异，联合这7个基因，鉴定肝组织癌变的阳性率为95.4％，特异性为96％。具体实施方式[0082]实施例1[0083]在本实施例中，以原发性肝癌为实施对象；以rnasequencing技术分析原发性肝癌(liverhepatocelluarcarcinoma,lihc)与正常肝癌组织中mrna表达量的差异与肝癌的鉴别、组织分型及预后之间的关系为例。组织分型包括：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)、纤维板型癌(fibrolamellarcarcinoma)、胆管上皮癌(hepatocholangiocarcinoma)等类型。基于thecancergenomeatlas(tcga)数据库研究，分析大量肝癌相关癌基因/抑癌基因在正常肝组织和原发性肝癌组织间表达的差异、表达谱与肝癌组织类型之间的关系、基因表达量与原发性肝癌预后之间的关系，筛选出与原发性肝癌鉴别、组织分型、预后密切相关的一组基因；包括：ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd、ube2c、plvap、dnase1l3、socs2、clec4g、cyp1a2、fcn3等基因。[0084]通过分析tcga数据库中mrnasequencing结果，显示：与在正常肝组织相比，在肝癌组织中表达量显著性增高的基因包括：ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd、ube2c、plvap等基因；而clec4g、cyp1a2、fcn3等基因显著性降低(图1-7)。[0085]通过对tcga数据库中mrnasequencing结果与病人总体生存曲线间关系的研究，结果显示：ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2c、ube2t等基因的表达量较高时，病人总体生存期较短；clec3b、plvap、dnase1l3、socs2等基因表达量较高时，病人总体生存期较长(图8-10)。[0086]通过上述基因的不同组合，可以提高原发性肝癌鉴定的灵敏度和特异性，显著性提高原发性肝癌的鉴定效率；例如，用gpc3,lcn2,spp1,ube2c,pttg1,sfn,mdk基因组，区分正常肝组织和原发性肝癌组织的灵敏度为95.4％、特异性为96％(图11，表1)。[0087]通过对tcga数据库中mrnasequencing结果与肝癌组织类型的关系分析，结果表明：akr1b10、b3gat3、ccnb1、cenpw、pes1、pttg1、sfn、spink1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、ubd、ube2c、plvap、dnase1l3、clec4g、cyp1a2、fcn3等基因在不同类型的肝癌中表达量存在着显著性差异(图2-7，表2)；联合应用所述基因，可以辅助肝癌的组织分型，例如：应用sfn、spink1、mdk、dnase1l3、sparcl1组合对肝癌的组织类型进行分型(表3)。[0088]结果表明：ahsa1、akr1b10、b3gat3、c7orf68、ccdc58、ccnb1、cenpw、clec3b、g6pd、gmnn、lpcat1、ndufa4l2、nt5dc2、pes1、ptp4a3、pttg1、sfn、spink1、spp1、stmn1、tacc3、tk1、ube2t、gpc3、lcn2、mdk、pdzk1ip1、sparcl1、thy1、ubd、ube2c、plvap、dnase1l3、socs2、clec4g、cyp1a2、fcn3等基因组合与原发性肝癌之间具有紧密联系，上述基因组mrna表达量的改变可用于建立原发性肝癌的鉴定、组织分型及预后评估的方法；而且联合应用sfn、spink1、mdk、dnase1l3、sparcl1基因mrna表达量的改变用于肝癌的鉴定特异性为96％时，灵敏度可以达到95.4％；[0089]本发明提供的基因组组合能为原发性肝癌的快速鉴定建立可靠的方法。而且可以根据不同的需求选用不同的上述基因进行组合。[0090][0091][0092][0093]注：红色表示有显著性差异，黑色表示无显著性差异。[0094]当前第1页12当前第1页12