一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术

1.本技术属于生物医学工程技术领域，尤其涉及一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术。


背景技术：

2.卒中、阿尔茨海默症、帕金森氏症等多种中枢神经系统疾病，造成神经再生与神经功能恢复速度缓慢，已经成为当今临床治疗的难点。干细胞因其具有自我增殖和向神经元、胶质细胞分化的潜力，在中枢神经系统疾病的细胞替代治疗中发挥重要的作用。比如，采用移植干细胞替代变性坏死的多巴胺能神经元，可以治疗帕金森氏症。然而，中枢神经系统疾病造成的病理内环境造成移植干细胞存活存活率低，神经元分化数量少和功能成熟度差等缺点，导致干细胞移植治疗中枢神经系统疾病研究和临床推广应用的停滞不前。已有的神经因子诱导干细胞增殖分化方法，效果不佳。
3.生理性电信号是哺乳动物神经发育、发生中扮演不可或缺的必需要素之一，外加电刺激能够以模拟生物性电信号的方式促进干细胞向神经元分化，促进神经发育发生，逐渐成为人们普遍关注的一种新型治疗方法。但是目前对于干细胞的增殖和分化的调控处理方法单一，对于干细胞的调控效果不佳，得到的干细胞存活率较低且分化的神经元数量少，导致干细胞移植治疗的成功率低，不利于进行临床使用。因此，亟需寻找一种更接近于干细胞生理性发育、分化的诱导方法，调控干细胞向神经元方向分化，以此来优化干细胞的临床移植治疗效果。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术，旨在解决现有技术中对于干细胞的增殖和分化的调控处理方法单一，得到的干细胞存活率较低且分化的神经元数量少，导致干细胞移植治疗的成功率低的问题。
5.为实现上述申请目的，本技术采用的技术方案如下：
6.第一方面，本技术提供一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术，包括如下步骤：
7.提供干细胞，
8.提供电场强度为50～500mv/mm的电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时。
9.本技术第一方面提供的基于电刺激的干细胞神经分化调控技术，该方法通过限定电场强度为50～500mv/mm、电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时的电刺激处理的条件，在该条件下对干细胞进行电刺激处理，能够有效缩短干细胞向神经元分化的时程，促进向神经元的分化，提高分化效率，同时抑制干细胞分化为星形胶质细胞，使得到的干细胞存活率较高且分化的神经元数量多，有利于提高干细胞移植治疗的成功率，并完善细胞的功能，提高干细胞移植对中枢神经系统损伤后的神经修复治疗的效果。
附图说明
10.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
11.图1是本技术实施例提供的神经元分化产率性能分析图。
12.图2是本技术实施例1和5与对比例1、2、3得到的7天直流、交流电刺激下对细胞存活率分析图。
13.图3是本技术实施例提供的实施例1和5与对比例1、2、3得到的7天直流、交流电刺激下对神经分化率(map2 cells)的分析图。
14.图4是本技术实施例提供的信号通路分析图。
15.图5是本技术实施例提供的移植干细胞对中枢神经系统损伤后的修复作用分析图。
具体实施方式
16.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
17.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
18.本技术中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
19.应理解，在本技术的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本技术实施例的实施过程构成任何限定。
20.在本技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
21.本技术实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本技术实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本技术实施例说明书公开的范围之内。具体地，本技术实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
22.术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本技术实施例范围的情况下，第一xx也可以被称为第二xx，类似地，第二xx也可以被称为第一xx。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
23.本技术实施例第一方面提供一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术，包括如下步骤：
24.s01.提供干细胞，
25.s02.提供电场强度为50～500mv/mm的电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时。
26.本技术实施例第一方面提供的基于电刺激的干细胞神经分化调控技术，该方法通过限定电场强度为50～500mv/mm、电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时的电刺激处理的条件，在该条件下对干细胞进行电刺激处理，能够有效缩短干细胞向神经元分化的时程，促进向神经元的分化，提高分化效率，同时抑制干细胞分化为星形胶质细胞，使得到的干细胞存活率较高且分化的神经元数量多，有利于提高干细胞移植治疗的成功率，并完善细胞的功能，提高干细胞移植对中枢神经系统损伤后的神经修复治疗的效果。
27.步骤s01中，提供干细胞。在一些实施例中，干细胞包括人源诱导多能干细胞、人源胚胎干细胞、小鼠源神经干细胞中的至少一种。提供的干细胞为常规购买即可。
28.在一些实施例中，对提供的干细胞置于细胞培养液中进行培养，并控制干细胞的密度为105～106细胞/1000mm2，控制干细胞的密度，能够确保在后续电刺激条件下，对提供的干细胞完整进行电刺激处理。若细胞密度过大，则在电刺激处理的过程中，无法均匀对细胞进行刺激处理，易导致干细胞向神经元的分化不均匀，得到的神经元数量较少，稳定性较差；若细胞密度过小，则在电刺激处理的过程中，由于细胞的损伤，最终得到能够使用的存活神经元数量少，严重影响干细胞移植治疗的成功率。
29.步骤s02中，提供电场强度为50～500mv/mm的电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时。
30.在一些实施例中，电刺激处理的电流包括直流电流、单向脉冲式方波电流、双向脉冲式方波电流、正弦交流电流中的任意一种。在一些具体实施例中，电刺激处理的电流为直流电流。使用直流电对干细胞进行电刺激，电刺激改变了细胞原来膜内外之间的电位差，使细胞产生兴奋，促进细胞分化。
31.在一些实施例中，对干细胞进行电刺激处理的过程中，提供电场强度为50～500mv/mm的电流进行处理。控制电场强度适中，能够有利于对干细胞进行电刺激处理，促进干细胞向神经元分化。在一些实施例中，电场强度选自50mv/mm、100mv/mm、150mv/mm、200mv/mm、250mv/mm、300mv/mm、350mv/mm、400mv/mm、450mv/mm、500mv/mm。
32.在一些具体实施例中，电流的电场强度为100mv/mm。
33.在一些实施例中，电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时。控制电刺激处理的条件，能够促进干细胞分化为神经元的产率。
34.在一些实施例中，电刺激处理的时间为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天。
35.在一些实施例中，电刺激处理过程中，每天处理时间为0.5小时、1小时、1.5小时、2小时。
36.在一些具体实施例中，电刺激处理的时间为7天，且每天处理2小时，进一步限定电刺激的处理时间，一方面促进向神经元的分化，缩短分化时间，另一方面也保证在该条件下得到的干细胞的成活率较高，更有利于提髙移植干细胞的临床治疗效果。
37.在一些实施例中，电刺激处理的周期为10～60分钟/次。在一些实施例中，电刺激处理的周期选自10分钟/次、20分钟/次、30分钟/次、40分钟/次、50分钟/次、60分钟/次。
38.在一些具体实施例中，每一次进行电刺激处理的过程中，每一次进行电刺激处理10～60分钟，处理后，让细胞进行静置1～2分钟，再进行电刺激处理。该处理方式能够有效促进干细胞分化为神经元，并且提高得到的神经元的成活率及功能，提髙移植干细胞的临床治疗效果。
39.在一些具体实施例中，对提供的干细胞进行电刺激处理，其中，电刺激处理的条件包括：选择直流电，控制电场强度为100mv/mm，处理时间为7天，且每天处理2小时。通过采用该电刺激处理的条件进行处理，能够激缩短干细胞向神经元分化的时程，提高分化效率，并且抑制干细胞分化为星形胶质细胞，同时能提高干细胞移植对中枢神经系统损伤后的神经修复治疗。
40.在一些实施例中，调控干细胞神经分化的步骤中，包括：刺激pi3k/akt/gsk-3β/β-catenin信号级联反应。对干细胞进行电刺激处理的过程中，电刺激首先增加了pi3k的磷酸化作用；基于pi3k的刺激，进一步增加了akt在ser9处的磷酸化；基于akt的磷酸化作用，对gsk-3β进行作用，进一步增加了gsk-3β在ser9处的磷酸化；基于gsk-3的作用，促进了干细胞细胞核中β-连环蛋白的表达，以调控干细胞进行神经分化形成神经元。
41.下面结合具体实施例进行说明。
42.实施例1
43.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
44.方法包括如下步骤：
45.提供人源诱导多能干细胞，且控制人源诱导多能干细胞的密度为105细胞/1000mm2；
46.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为100mv/mm；处理时间为7天，且每天处理1小时。
47.实施例2
48.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
49.方法包括如下步骤：
50.提供人源诱导多能干细胞，且控制人源诱导多能干细胞的密度为106细胞/1000mm2；
51.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为100mv/mm；处理时间为14天，且每天处理1小时。
52.实施例3
53.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
54.方法包括如下步骤：
55.提供人源胚胎干细胞，且控制人源胚胎干细胞的密度为105细胞/1000mm2；
56.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为200mv/mm；处理时间为1天，且每天处理2小时。
57.实施例4
58.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
59.方法包括如下步骤：
60.提供人源胚胎干细胞，且控制人源胚胎干细胞的密度为105细胞/1000mm2；
61.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为200mv/mm；处理时间为4天，且每天处理2小时。
62.实施例5
63.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
64.方法包括如下步骤：
65.提供人源胚胎干细胞，且控制人源胚胎干细胞的密度为105细胞/1000mm2；
66.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为200mv/mm；处理时间为7天，且每天处理1小时。
67.实施例6
68.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
69.方法包括如下步骤：
70.提供小鼠源神经干细胞，且控制小鼠源神经干细胞的密度为105细胞/1000mm2；
71.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用交流电进行处理，电场强度为100mv/mm；处理时间为7天，且每天处理2小时。
72.实施例7
73.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
74.方法包括如下步骤：
75.提供小鼠源神经干细胞，且控制小鼠源神经干细胞的密度为106细胞/1000mm2；
76.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用交流电进行处理，电场强度为200mv/mm；处理时间为7天，且每天处理2小时。
77.对比例1
78.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
79.方法包括如下步骤：
80.提供小鼠源神经干细胞，且控制小鼠源神经干细胞的密度为106细胞/1000mm2；
81.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为50mv/mm；处理时间为7天，且每天处理1小时。
82.对比例2
83.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
84.方法包括如下步骤：
85.提供小鼠源神经干细胞，且控制小鼠源神经干细胞的密度为106细胞/1000mm2；
86.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条件为：采用直流电进行处理，电场强度为600mv/mm；处理时间为7天，且每天处理1小时。
87.对比例3
88.一种基于电刺激的干细胞神经分化调控技术
89.方法包括如下步骤：
90.提供小鼠源神经干细胞，且控制小鼠源神经干细胞的密度为106细胞/1000mm2；
91.提供电流对干细胞进行电刺激处理，调控干细胞神经分化；其中，电刺激处理的条
件为：采用交流电进行处理，电场强度为600mv/mm；处理时间为7天，且每天处理1小时。
92.性能测试
93.(1)分析神经元分化产率
94.①
提供实施例1和实施例2得到的细胞，7、14和21天电刺激(ef)的情况下对map2 (神经元分化)和gfap (胶质细胞分化)的干细胞计数进行量化，计算神经元分化产率。
95.②
提供实施例1和5与对比例1、2、3得到的7天直流、交流电刺激下对细胞存活率与神经分化率进行量化，比较实施例中所用电刺激参数更有利于细胞存活和促进向神经元分化。
96.(2)分析信号通路探讨，阐明电刺激促进干细胞向神经元分化的分子信号机制
97.提供实施例3～5得到的细胞，于电刺激结束后分别提取细胞全蛋白质提取液，用于western blotting测定p-akt、akt、p-gsk-3β(ser9)、gsk-3β、细胞核内β-catenin的蛋白表达量，并以gapdh蛋白表达量作为内参对照，进行分析。
98.(3)验证移植干细胞对中枢神经系统损伤后的修复作用
99.提供实施例1得到的干细胞，利用小鼠脊髓损伤模型，验证移植干细胞对中枢神经系统损伤后的修复作用。对小鼠脊髓损伤和接受干细胞移植后的神经评估根据其左右后肢的运动神经功能评分量表进行评价(具体评分标准参考文献j neurotrauma.2002；19(10):1251-60.)。
100.结果分析
101.(1)分析神经元分化产率
102.①
提供实施例1和实施例2得到的细胞，在7、14和21天电刺激(ef)的情况下对map2 (神经元分化)和gfap (胶质细胞分化)的干细胞计数进行量化，其中，map2 (神经元分化)的干细胞计数图如图1的a所示，gfap (胶质细胞分化)的干细胞计数图如图1的b所示，可以看出，电刺激将干细胞神经分化时程从14天缩短为7天，神经元分化产率从15.2％提高到34.8％。说明，直流电刺激缩短干细胞向神经元分化的时程，提高分化效率，并且，抑制干细胞分化为星形胶质细胞。
103.②
提供实施例1和5与对比例1、2、3得到的7天直流、交流电刺激下对细胞存活率(cell viability)与神经分化率(map2 cells)进行量化。如图2和图3所示：50、100、200mv/mm直流电刺激(dc)对干细胞存活无影响，而600mv/mm直流(dc)和交流电刺激(ac)均对细胞产生杀伤作用；100和200mv/mm直流电刺激(dc)显著提高干细胞向神经元分化(map2 )，50、600mv/mm直流电(dc)及600mv/mm交流电刺激(ac)均无法显著促进干细胞的神经元分化(map2 )。
104.(2)分析信号通路，阐明电刺激促进干细胞向神经元分化的分子信号机制
105.提供实施例3～5得到的细胞，于电刺激结束后分别提取细胞全蛋白质提取液，用于western blotting测定p-akt、akt、p-gsk-3β(ser9)、gsk-3β、细胞核内β-catenin的蛋白表达量，并以gapdh蛋白表达量作为内参对照，结果如图4所示。其中，图4的a为western blotting实验结果蛋白表达条带，可以看出，在进行电刺激处理(ef)后，β-catenin进行了表达，而没有进行电刺激处理(noef)，β-catenin没有表达。
106.进一步，通过imagej软件扫描分析条带灰度，量化确定p-akt、akt、p-gsk-3β(ser9)、gsk-3β四个蛋白表达水平，图4的b为p-akt、akt蛋白的表达水平的量化情况，可以
看出，在进行电刺激处理(ef)后，p-akt、akt蛋白的表达水平比没有进行电刺激处理(noef)的表达水平高。图4的c为p-gsk-3β(ser9)、gsk-3蛋白的表达水平的量化情况，可以看出，在进行电刺激处理(ef)后，p-gsk-3β(ser9)、gsk-3蛋白的表达水平比没有进行电刺激处理(noef)的表达水平高。
107.通过以上蛋白表达水平进行分析，如图4的d所示，可以确定电刺激(ef)诱导干细胞中pi3k/akt/gsk-3β/β-catenin通路激活。
108.(3)验证移植干细胞对中枢神经系统损伤后的修复作用
109.提供实施例1得到的干细胞，利用小鼠脊髓损伤模型，验证移植干细胞对中枢神经系统损伤后的修复作用。
110.如图5的a所示，对小鼠神经功能评估(左右后肢的平均得分)用于神经干细胞移植的脊髓损伤(sci)小鼠后肢运动功能恢复。具有电刺激(ef)野生型(wt)神经干细胞(nscs)移植的小鼠表现出比无电刺激(noef)野生型(wt)神经干细胞(nscs)更好的运动功能修复。同时，使用pi3kγ-/-nscs，预电刺激(ef)的效果被取消。以pbs注射组作为阴性对照。
111.接受电刺激(ef)的神经干细胞(nscs)移植的脊髓损伤(sci)小鼠在右后肢(左)上偶尔会出现负重背踩。
112.如图5的b所示，移植14天后，电刺激(ef)和无电刺激(noef)神经干细胞(nscs)移植的脊髓损伤(sci)小鼠的示例照片。
113.可以看出，经电刺激的干细胞移植到小鼠损伤的脊髓中，在14天和28天后，电刺激促进损伤脊髓中神经元的成熟分化；移植后对脊髓损伤的效率提高4-5倍。通过小鼠脊髓损伤模型，验证移植干细胞对损伤脊髓的修复作用。
114.因此，本技术提供的基于电刺激的干细胞神经分化调控技术，该方法通过限定电场强度为50～500mv/mm、电刺激处理的时间为1～14天，且每天处理0.5～2小时的电刺激处理的条件，在该条件下对干细胞进行电刺激处理，能够有效缩短干细胞向神经元分化的时程，促进向神经元的分化，提高分化效率，同时抑制干细胞分化为星形胶质细胞，使得到的干细胞存活率较高且分化的神经元数量多，有利于提高干细胞移植治疗的成功率，并完善细胞的功能，提高干细胞移植对中枢神经系统损伤后的神经修复治疗的效果。
115.以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。