表达禽病原体抗原的重组火鸡疱疹病毒载体和其用途的制作方法

表达禽病原体抗原的重组火鸡疱疹病毒载体和其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35usc 119(e)要求于2019年9月11日提交的美国临时申请第62/898651号的权益，所述美国临时申请通过全文引用的方式并入本文中。
技术领域
3.本发明涉及用于插入和表达用于安全免疫的外源基因以预防多种病原体的重组病毒载体。其还涉及包括用于预防多种病原体的一种或多种重组病毒载体的多价组合物或疫苗。本发明涉及制备和使用所述重组病毒载体的方法。


背景技术：

4.马立克氏病(marek's disease)作为一种高度传染性淋巴组织增生性疾病，是主要影响幼鸡的最普遍的禽感染之一。马立克氏病是由马立克氏病病毒引起的。马立克氏病病毒(mdv)作为一种疱疹病毒，是马立克病毒属的成员，具有三种血清型(物种)：mdv-1(禽类疱疹病毒2型(gallid herpesvirus 2))、mdv-2(禽类疱疹病毒3型)和mdv-3(火鸡疱疹病毒1型(meleagrid herpesvirus 1)、火鸡疱疹病毒(turkey herpesvirus，hvt))。mdv-1是在未接种疫苗的家禽中引起广泛疾病的三种血清型中毒性最强的。感染mdv-1的鸟类表现出神经、内脏和皮肤临床症状，如腿、翅膀和颈部麻痹；眼部病变和视力障碍、体重减轻、许多器官中的癌性肿瘤，如胸腺、心脏、肺、性腺、肌肉和毛囊。受影响鸟类的发病率为10-50％，并且死亡率可以是至多100％。尽管马立克氏病可以影响任何年龄的鸟类，但急性马立克氏病导致大量未接种疫苗的四周到八周的早龄的鸟类死亡。马立克病通过直接或间接暴露于受感染的鸡的鸡皮屑而传播，并且病毒通过吸入摄入。mdv-2和mdv-3表示无毒病毒株，并已用于制备针对相关和毒性mdv-1的接种疫苗。
5.除了马立克氏病之外，存在影响家禽并对家禽养殖构成威胁的若干种病原体。生产者必须依靠通过疫苗提供的免疫力来保护鸡群免受病毒、细菌和其它病原体的影响。活疫苗、灭活疫苗和重组疫苗已用于给鸟类接种疫苗。活疫苗的优点是免疫力强且持久，但因为所述活疫苗可能会引起轻度到重度的反应，因此必须小心处理。另一方面，灭活疫苗比活疫苗更稳定且更安全，但产生的免疫应答较弱，因此需要多次施用。活疫苗和灭活疫苗两者均已被证明是安全且有效的，然而仍然需要开发和不断改进多价疫苗，以在一次疫苗接种中提供预防多于一种病原体。
6.已开发出重组载体疫苗以同时提供对多种病原体的免疫力。这些疫苗是通过以下制备的：去除非病原生物体的宿主基因组内的一些非必需基因部分；并用一个或多个编码负责产生针对病原生物体的免疫应答的抗原的基因替代这些非必要基因部分。然后使用新产生的载体感染宿主，在所述宿主中，其将复制和表达毒性生物体的抗原以引起免疫应答。重组载体疫苗组合了活疫苗和灭活疫苗的优点。与活疫苗类似，重组载体提供更持久的免疫力，并且同时在如灭活疫苗等接种疫苗之后引起较温和的反应。另外，载体和插入的基因两者均可以提供免疫力，从而保护鸟类免受两种或更多种疾病的影响。
7.马立克病病毒是多价疫苗对家禽疾病进行免疫的最有效载体之一，因为这些病毒只需一次疫苗接种即可产生终生保护。另外，这些病毒仅限于禽类宿主，因此不会感染其它动物和在家禽养殖场工作的人。在马立克病病毒中，火鸡疱疹病毒(hvt)已被更广泛地用作活疫苗和针对更具毒性的mdv-1的重组疫苗载体。hvt于1969-1970年首次从火鸡中分离，并且很快发现其针对mdv具有预防性，并于1971年被批准为疫苗。火鸡疱疹病毒(hvt)具有与马立克氏病病毒(mdv-1)类似的抗原特征，但对鸡无致病性。另外，hvt对针对mdv或hvt的母体源性的抗体不敏感，因此活hvt疫苗已被用于在卵内或在孵化之前的早期有效地针对mdv-1进行疫苗接种。另外，hvt基因组已用作疫苗载体，以含有其它禽病原体的外源dna序列。


技术实现要素：

8.本发明提供了用于插入和表达用于安全免疫的外源基因以保护禽免受多种病原体的重组病毒载体。本发明还提供包括用于预防多种病原体的一种或多种重组hvt病毒载体的多价组合物或疫苗。另外，本发明提供了单独或与其它疫苗或药物组合物组合制备和使用重组病毒载体的方法。
9.在一方面，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(hvt)基因组，所述hvt基因组包括编码一种或多种异源抗原的插入到所述hvt基因组的独特长(ul)区中的基因间基因座ul 35/ul 36中的一个或多个核苷酸序列。
10.在一方面，本发明提供一种重组火鸡疱疹病毒(hvt)基因组，所述hvt基因组包括：编码一种或多种异源抗原或抗原的插入到所述hvt基因组的独特长区中的基因间基因座ul 35/ul 36中的一个或多个核苷酸序列；以及编码一种或多种异源抗原的插入在所述hvt基因组的独特长区(ul)中的ul55/基因3位点处的一个或多个核苷酸序列或序列。
11.在一个或多个实施例中，本发明提供了一种重组hvt，其中所述一种或多种异源抗原或抗原对禽病原体或选自由以下组成的组的病原体具有预防性：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。
12.在一个或多个实施例中，本发明提供了一种重组hvt，其中所述一种或一种或多种异源抗原选自由以下组成的组：所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp2、vp3或vp4蛋白；所述鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；所述新城疫病毒(ndv)的f/hn嵌合蛋白或f、np、p、m、hn或l蛋白；所述传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；所述传染性喉气管炎病毒(iltv)的gb、gc、gd、ge、gh、gi或gl蛋白；以及所述禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
13.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原对ibdv具有预防性。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原是所述ibdv的vp2蛋白。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述vp2蛋白由与包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了vp2蛋白由包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列编码。
14.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原
或抗原对新城疫病毒(ndv)具有预防性。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原是ndv的f蛋白。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述ndv的f蛋白由与包括seq id no:3的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt，所述ndv的f蛋白由包括seq id no:3的核苷酸序列编码。
15.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供所述一种或多种异源抗原对ndv和ibdv具有预防性。在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供所述至少一种异源抗原是所述ndv的f蛋白和所述ibdv的vp2蛋白。
16.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述ndv的f蛋白由与包括seq id no:3的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码，并且所述ibdv的vp2蛋白由与包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
17.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述ndv的f蛋白由包括seq id no:3的核苷酸序列编码，并且所述ibdv的vp2蛋白由包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列编码。
18.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt包括包含一个表达盒或多个表达盒的基因组，所述一个表达盒或多个表达盒包括编码一种异源抗原或多种异源抗原的一个核苷酸序列或多个核苷酸序列。在一个实施例中，所述重组hvt包括重组hvt基因组表达盒，所述表达盒包括编码启动子的核苷酸序列，所述启动子与编码要表达的抗原的一个或多个核苷酸操作性地连接。在一个实施例中，要表达的抗原包括ndv的f蛋白。在一个实施例中，要表达的抗原包括ibdv的vp2蛋白。在一个实施例中，要表达的抗原包括所述ndv的f蛋白和所述ibdv的vp2蛋白两者。
19.在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了选自由以下组成的组的所述一个或多个启动子：即刻早期人巨细胞病毒(hcmv)启动子：豚鼠即刻早期cmv启动子；鼠类即刻早期cmv启动子；pec启动子；β鸡肌动蛋白启动子；sv40启动子；糖蛋白x启动子的伪狂犬病病毒启动子；单纯疱疹病毒-1α4启动子；糖蛋白ga、gc、gb、ge或gi启动子的马立克氏病病毒启动子；糖蛋白gb、ge、gl、gd启动子的传染性喉气管炎病毒启动子；以及牛疱疹病毒1/1vp8启动子。在一个实施例中，所述重组hvt包括所述人cmv启动子。在一个实施例中，所述重组hvt包括所述鼠类cmv启动子。在一个实施例中，所述重组hvt包括所述hcmv启动子和所述mcmv启动子。
20.在一个或多个实施例中，所述重组hvt包括编码多腺苷酸化(polya)信号的核苷酸序列。在一个或多个实施例中，所述重组hvt包括编码poly a信号的核苷酸序列，并且选自bgh poly a(seq id no:6)或sv40 poly a序列(seq id no:12)。在一个实施例中，所述poly a信号是bgh poly a信号。在一个实施例中，所述poly a信号sv40 poly a信号。
21.在一方面，本发明的重组hvt包括与编码来自ibdv的vp2蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述vp2蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，即插入在hvt基因组的非编码区的vp2表达盒的所有部分。在一个实施例中，cmv启动子包括hcmv启动子(seq id no:1)。在一个实施例中，编码ibdv的vp2蛋白的核苷酸序列选自seq id no:5或seq id no:10。在一个实施例中，编码vp2蛋白的核苷酸序列包括seq id no:5。在一个实
施例中，编码vp2蛋白的核苷酸序列包括seq id no:10。在一个实施例中，多腺苷酸化信号包括seq id no:6。在一个实施例中，多腺苷酸化信号包括seq id no:12。在一个实施例中，启动子、编码vp2蛋白的核苷酸序列和poly a信号包括表达盒。在一个实施例中，将表达盒在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，将表达盒在基因组内的ul35/36位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，表达盒按顺序包括在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中的seq id no:1、seq id no:5或seq id no:10和seq id no:6。
22.在一方面，本发明的重组hvt包括与编码ndv的f蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述f蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，即插入在hvt基因组的非编码位置中的ndv f盒的所有部分。在一个实施例中，cmv启动子包括mcmv(seq id no:2)启动子。在一个实施例中，编码ndv的f蛋白的核苷酸序列包括seq id no:3。在一个实施例中，多腺苷酸化信号由包括seq id no:12的核苷酸序列编码。在一个实施例中，启动子、编码f蛋白的核苷酸序列和poly a信号包括表达盒。在一个实施例中，将表达盒在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，将表达盒在基因组内的ul35/36位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，表达盒按顺序包括在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中的seq id no:2、seq id no:3和seq id no:12。
23.在一方面，本发明的重组hvt包括与编码ibdv的vp2蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述vp2蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，均包括插入到hvt基因组内的非编码位置中的vp2表达盒。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步包括与编码ndv的f蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述f蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，所述核苷酸序列作为插入到相同插入位点中的作为vp2盒的ndv f表达盒的一部分。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步包括与编码ndv的f蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述f蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，所述核苷酸序列作为插入到不同插入位点中作为vp2盒的ndv f表达盒的一部分。
24.在一个实施例中，本发明的重组hvt提供了一种vp2表达盒，所述vp2表达盒按顺序包括：编码hcmv启动子的核苷酸序列(seq id no:1)；编码ibdv vp2的核苷酸序列(选自seq id no:5或seq id no:10)；以及编码bgh多腺苷酸化信号的在ul35/36非编码区中插入到hvt基因组中的核苷酸序列(seq id no:6)，并且按顺序包括：编码mcmv启动子的核苷酸序列(seq id no:2)；编码来自ndv的f蛋白的核苷酸序列(seq id no:3)；以及编码sv40多腺苷酸化信号的在ul55/基因3非编码区中插入到hvt基因组中的核苷酸序列(seq id no:12)。在一方面，本发明的重组hvt包含括与编码传染性喉气管炎病毒抗原的核苷酸序列操作性地连接的启动子，所述抗原进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列。在一个实施例中，ilt抗原包括选自由以下组成的组的一种或多种抗原：传染性喉气管炎病毒(iltv)的ilt抗原中的一种或多种的gb、gc、gd、ge、gh、gi、gl或嵌合蛋白。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步包括编码选自由以下组成的组的一种或多种抗原的核苷酸序列：传染性法氏囊病病毒、鸡贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步提供了与核苷酸序列操作性地连接的启动子，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的抗原：所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp1、vp2、vp3或vp4抗原；所述鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；所述新城疫病毒(ndv)的f/hn嵌合蛋白或f、
np、p、m、hn或l蛋白；所述传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；以及所述禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
25.在一个实施例中，本发明的重组hvt包括一种或多种ilt抗原作为表达盒的一部分，所述表达盒包括与编码ilt抗原的核苷酸操作性地连接的启动子，并且进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列。在一个实施例中，本发明的重组hvt包括第二表达盒和第三表达盒，每个表达盒包括编码与编码禽抗原的核苷酸序列操作性地连接的启动子的核苷酸序列，并且进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，所述禽抗原选自由以下组成的组：所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp1、vp2、vp3或vp4抗原；所述鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；所述新城疫病毒(ndv)的f/hn嵌合蛋白或f、np、p、m、hn或l蛋白；所述传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；以及所述禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
26.在一个或多个方面，本发明提供了一种重组dna，所述重组dna编码本发明的重组hvt基因组。
27.在一个或多个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，所述免疫组合物包括本发明的重组hvt，并且进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
28.在一个或多个方面，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本发明的重组hvt，并且进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
29.在一个实施例中，本发明的疫苗进一步包括另外的马立克氏病病毒(mdv)，所述mdv选自由以下组成的组：天然减毒的mdv-1病毒株rispens(cvi-988)；或禽类疱疹病毒3病毒株sb-1病毒。在一个实施例中，本发明的疫苗提供另外的mdv包括重组基因组。在一个实施例中，本发明的疫苗提供另外的重组mdv基因组包括一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列编码对一种或多种禽病原体具有预防性的一种或多种异源抗原。
30.在一个实施例中，本发明的疫苗用于针对由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病对禽进行疫苗接种。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗用于保护禽免受由一种或多种禽病原体引起的临床症状。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗用于保护禽免受由马立克氏病病毒引起的临床症状和由一种或多种禽病原体引起的临床症状。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗提供选自由以下组成的组的所述一种或多种禽病原体：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述一种或多种禽病原体包括传染性法氏囊病病毒(ibdv)。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒和所述传染性法氏囊病病毒。
31.在一个或多个实施例中，本发明的疫苗用于对禽进行疫苗接种，其中所述疫苗通过至少一次疫苗施用，通过喷雾施用、卵内施用、皮下施用、肌肉内施用、口服施用、经鼻施用或其组合进行施用。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述疫苗通过卵内施用进行施用。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述卵内施用在含胚卵发育介于约16-22天之间发生。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗提供所述卵内施用在含胚卵发育约18天时发生。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述疫苗的所述施用包括卵内施用，随后是喷雾施用。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述疫苗的所述施用包括喷雾施用。
32.在一方面，本发明提供一种对禽进行疫苗接种以治疗或预防马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种禽疾病的方法，所述方法包括施用有效量的疫苗组合物本发明的步骤。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体选自由以下组成的组：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒(ndv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)和所述新城疫病毒(ndv)。
33.本发明的一方面提供了一种在禽动物中诱导对马立克氏病病毒和一种或多种禽病原体的免疫应答的方法，所述方法包括向禽施用有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物的步骤。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体选自由以下组成的组：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒(ndv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)和所述新城疫病毒(ndv)。在一个或多个实施例中，本发明的方法提供所述施用是通过喷雾施用、卵内施用、皮下施用、肌肉内施用、口服施用或经鼻施用进行的。在一个实施例中，所述方法包括卵内施用。在一个实施例中，所述方法提供所述卵内施用在含胚卵发育介于约16-22天之间发生。在一个或多个实施例中，所述方法提供所述卵内施用在含胚卵发育约18天时发生。在一个或多个实施例中，所述方法提供施用途径包括卵内施用，随后是喷雾施用。在一个实施例中，所述方法提供施用途径包括喷雾施用。在一个或多个实施例中，所述方法提供所述禽选自由以下组成的组：鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鸵鸟、鸽子和鹌鹑。在一个实施例中，所述方法提供所述禽包括鸡。
34.本发明的一方面提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本发明的重组hvt，所述重组hvt包括编码来自新城疫病毒的f蛋白的核苷酸序列，所述疫苗组合物进一步包括减毒传染性法氏囊病毒和与传染性法氏囊病毒特异性结合的抗体的组合物。在一个或多个实施例中，所述包括ibdv的组合物是减毒ibd病毒株2512并且包括bursaplex
tm
疫苗。在一个或多个实施例中，所述包括ibdv的组合物是减毒ibd病毒株v877，包括magniplex
tm
疫苗。
附图说明
35.图1是展示gfp基因正确插入在hvt基因组的ul55/基因3位点处的pcr反应的图示。
36.图2是展示gfp基因在hvt基因组的ul35/36整合位点处的整合位点的pcr反应的图示。
37.图3a、3b、3c是展示vp2基因正确整合到hvt ibd 1的hvt基因组中的图示pcr反应。
38.图4a和4b是ibdv vp2的经转染/受感染的jbj-1细胞染色(图a)和hvt ibd 5的hvt感染(图b)的图示。
39.图5是进行的用于确认hvt ibd 5插入到hvt基因组的ul35/36整合位点中的vp2的
正确取向的pcr反应的图示。
40.图6是使用ibdvr63的单克隆抗体，对受感染的细胞裂解物进行的蛋白质印迹分析的图示，显示出hvt ibd 6a的蛋白质条带为约50kd。
41.图7a和7b是展示了hvt ibd 6a的在hvt基因组中的ul35/36位点处的正确的vp2基因整合的pcr反应的图示。
42.图8是展示了hvt ibd 9的在hvt基因组中的ul55/基因3位点处的正确vp2基因整合的pcr反应的图示。
43.图9是展示了hvt ibd 30的在hvt基因组中的ul55/基因3位点处的正确的vp2基因整合的pcr反应的图示。
44.图10a和10b是使用hvt ibd 31的ibdvr63的单克隆抗体，对经转染/受感染的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析的图示。
45.图11是展示了hvt ibd 31的在hvt基因组中的ul35/36整合位点处的正确的vp2基因整合的pcr反应的图示。
46.图12是展示了hvt ibd 34的在hvt基因组中的ul55/基因3整合位点处的正确vp2基因整合的pcr反应的图示。
47.图13是对hvt-ibd 1、5、9和15的ibdv血清应答的图形图示。
48.图14是对hvt ibd 6a、30、31的ibdv血清应答的图形图示。
49.图15a和15b是展示了hvt nd#38的ndvf插入物的正确取向的pcr反应的图示。
50.图16a和16b是展示了hvt nd#39的ndvf插入物的正确取向的pcr反应的图示。
51.图17a、17b、17c是展示了hvt nd#40的ndv f插入物的正确取向的pcr反应的图示。
52.图18是展示了hvt ndv 42的ndvf插入物的正确取向的多个pcr反应的图示。
53.图19是展示了hvt ndv 45的ndvf插入物的正确取向的pcr反应的图示。
54.图20a、20b、20c是展示了hvt ndv 46的ndvf插入物的正确取向的pcr反应的图示。
55.图21是表示插入位点a，即ul35(hvt043)-ul36(hvt044)的hvt基因组的线性表示。
56.图22是表示插入位点b，即ul55(hvt065)-基因3(hvt066)的hvt基因组的线性表示。
57.图23是ibdv vp2 faragher病毒株f52/70的图示。
58.图24是质粒phvt-ibd#30的合成的图示。
59.图25是质粒phvt-nd#42的合成的图示。
60.图26是转移质粒psitea#30的环状图谱的图示。
61.图27是转移质粒psite b#42的环状图谱的图示。
62.图28是中间体重组hvt-nd#42的产生的图示。
63.图29是hvt-ibd#30-nd#42的产生的图示。
64.图30是基于位点a的pcr和限制性核酸内切酶消化的hvt-ibd#30-nd#42的构建体表征的图示。
65.图31是基于位点b的pcr和限制性核酸内切酶消化的hvt-ibd#30-nd#42的构建体表征的图示。
66.图32是ibd vp2的hvt-ibd#30-nd#42靶蛋白表达的蛋白质印迹分析的图示。
67.图33是ndv f的hvt-ibd#30-nd#42靶蛋白表达的蛋白质印迹分析的图示。
68.序列简要说明
69.70.71.72.73.74.75.76.77.具体实施方式
78.以下是提供的详细描述，以辅助本领域技术人员。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本领域普通技术人员可以对本文所描述的实施例进行修改和改变。
79.本发明涉及禽用疫苗，所述禽用疫苗基于活的重组禽疱疹病毒，即具体地马立克氏病病毒(mdv)，并且更具体地基于hvt病毒(火鸡疱疹病毒)的，在所述疫苗中已插入编码和表达病原体的抗原多肽的一个或多个核苷酸序列，从而在提供免疫的条件下有效保护已接种疫苗的动物免受所述病原体。
80.马立克氏病(md)是一种常见的鸡淋巴组织增生性疾病，由马立克氏病病毒(mdv)引起，可能导致家禽工业的重大损失。目前，在家禽中使用mdv的血清型3的疫苗控制md，所述疫苗是相关的火鸡疱疹病毒(hvt)。通过在特定遗传位置处将来自除mdv之外的家禽病毒的基因引入到hvt基因组中，发明人已经能够开发能够通过施用单一病毒疫苗同时保护家禽免受md和一种或多种另外的疾病的新型重组病毒疫苗。
81.本发明提供了用于插入和表达用于安全免疫的外源基因以保护禽免受多种病原体的重组病毒载体。本发明还提供包括用于预防多种病原体的一种或多种重组hvt病毒载体的多价组合物或疫苗。另外，本发明提供了单独或与其它疫苗或药物组合物组合制备和使用重组病毒载体的方法。
82.在一方面，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(hvt)基因组，所述hvt基因组包括编码一种或多种异源抗原的插入到所述hvt基因组的独特长(ul)区中的基因间基因座ul 35/ul 36中的一个或多个核苷酸序列。
83.在一方面，本发明提供一种重组火鸡疱疹病毒(hvt)基因组，所述hvt基因组包括：编码一种或多种异源抗原或抗原的插入到所述hvt基因组的独特长区中的基因间基因座ul 35/ul 36中的一个或多个核苷酸序列；以及编码一种或多种异源抗原的插入在所述hvt基因组的独特长区(ul)中的ul55/基因3位点处的一个或多个核苷酸序列或序列。
84.在一个或多个实施例中，本发明提供了一种重组hvt，其中所述一种或多种异源抗原或抗原对禽病原体或选自由以下组成的组的病原体具有预防性：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫
血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。
85.在一个或多个实施例中，本发明提供了一种重组hvt，其中所述一种或一种或多种异源抗原选自由以下组成的组：所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp2、vp3或vp4蛋白；所述鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；所述新城疫病毒(ndv)的f/hn嵌合蛋白或f、np、p、m、hn或l蛋白；所述传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；所述传染性喉气管炎病毒(iltv)的gb、gc、gd、ge、gh、gi或gl蛋白；以及所述禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
86.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原对ibdv具有预防性。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原是所述ibdv的vp2蛋白。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述vp2蛋白由与包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了vp2蛋白由包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列编码。
87.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原或抗原对新城疫病毒(ndv)具有预防性。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述一种或多种异源抗原是ndv的f蛋白。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述ndv的f蛋白由与包括seq id no:3的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，本发明的所述重组hvt，所述ndv的f蛋白由包括seq id no:3的核苷酸序列编码。
88.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供所述一种或多种异源抗原对ndv和ibdv具有预防性。在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供所述至少一种异源抗原是所述ndv的f蛋白和所述ibdv的vp2蛋白。
89.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述ndv的f蛋白由与包括seq id no:3的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码，并且所述ibdv的vp2蛋白由与包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列包括至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
90.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了所述ndv的f蛋白由包括seq id no:3的核苷酸序列编码，并且所述ibdv的vp2蛋白由包括seq id no:5或seq id no:10的核苷酸序列编码。
91.在一个或多个实施例中，本发明的所述重组hvt包括包含一个表达盒或多个表达盒的基因组，所述一个表达盒或多个表达盒包括编码一种异源抗原或多种异源抗原的一个核苷酸序列或多个核苷酸序列。在一个实施例中，所述重组hvt包括重组hvt基因组表达盒，所述表达盒包括编码启动子的核苷酸序列，所述启动子与编码要表达的抗原的一个或多个核苷酸操作性地连接。在一个实施例中，要表达的抗原包括ndv的f蛋白。在一个实施例中，要表达的抗原包括ibdv的vp2蛋白。在一个实施例中，要表达的抗原包括所述ndv的f蛋白和所述ibdv的vp2蛋白两者。
92.在一个实施例中，本发明的所述重组hvt提供了选自由以下组成的组的所述一个或多个启动子：即刻早期人巨细胞病毒(hcmv)启动子：豚鼠即刻早期cmv启动子；鼠类即刻早期cmv启动子；pec启动子；β鸡肌动蛋白启动子；sv40启动子；糖蛋白x启动子的伪狂犬病
病毒启动子；单纯疱疹病毒-1α4启动子；糖蛋白ga、gc、gb、ge或gi启动子的马立克氏病病毒启动子；糖蛋白gb、ge、gl、gd启动子的传染性喉气管炎病毒启动子；和牛疱疹病毒1/1vp8启动子。在一个实施例中，所述重组hvt包括所述人cmv启动子。在一个实施例中，所述重组hvt包括所述鼠类cmv启动子。在一个实施例中，所述重组hvt包括所述hcmv启动子和所述mcmv启动子。
93.在一个或多个实施例中，所述重组hvt包括编码多腺苷酸化(polya)信号的核苷酸序列。在一个或多个实施例中，所述重组hvt包括编码poly a信号的核苷酸序列，并且选自bgh poly a(seq id no:6)或sv40 poly a序列(seq id no:12)。在一个实施例中，所述poly a信号是bgh poly a信号。在一个实施例中，所述poly a信号sv40 poly a信号。
94.在一方面，本发明的重组hvt包括与编码来自ibdv的vp2蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述vp2蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，即插入在hvt基因组的非编码区的vp2表达盒的所有部分。在一个实施例中，cmv启动子包括hcmv启动子(seq id no:1)。在一个实施例中，编码ibdv的vp2蛋白的核苷酸序列选自seq id no:5或seq id no:10。在一个实施例中，编码vp2蛋白的核苷酸序列包括seq id no:5。在一个实施例中，编码vp2蛋白的核苷酸序列包括seq id no:10。在一个实施例中，多腺苷酸化信号包括seq id no:6。在一个实施例中，多腺苷酸化信号包括seq id no:12。在一个实施例中，启动子、编码vp2蛋白的核苷酸序列和poly a信号包括表达盒。在一个实施例中，将表达盒在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，将表达盒在基因组内的ul35/36位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，表达盒按顺序包括在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中的seq id no:1、seq id no:5或seq id no:10和seq id no:6。
95.在一方面，本发明的重组hvt包括与编码ndv的f蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述f蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，即插入在hvt基因组的非编码位置中的ndv f盒的所有部分。在一个实施例中，cmv启动子包括mcmv(seq id no:2)启动子。在一个实施例中，编码ndv的f蛋白的核苷酸序列包括seq id no:3。在一个实施例中，多腺苷酸化信号由包括seq id no:12的核苷酸序列编码。在一个实施例中，启动子、编码f蛋白的核苷酸序列和poly a信号包括表达盒。在一个实施例中，将表达盒在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，将表达盒在基因组内的ul35/36位点处插入到hvt基因组中。在一个实施例中，表达盒按顺序包括在ul55/基因3位点处插入到hvt基因组中的seq id no:2、seq id no:3和seq id no:12。
96.在一方面，本发明的重组hvt包括与编码ibdv的vp2蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述vp2蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，均包括插入到hvt基因组内的非编码位置中的vp2表达盒。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步包括与编码ndv的f蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述f蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，所述核苷酸序列作为插入到相同插入位点中的作为vp2盒的ndv f表达盒的一部分。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步包括与编码ndv的f蛋白的核苷酸序列操作性地连接的cmv启动子，所述f蛋白进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，所述核苷酸序列作为插入到不同插入位点中作为vp2盒的ndv f表达盒的一部分。
97.在一个实施例中，本发明的重组hvt提供了一种vp2表达盒，所述vp2表达盒按顺序
包括：编码hcmv启动子的核苷酸序列(seq id no:1)；编码ibdv vp2的核苷酸序列(选自seq id no:5或seq id no:10)；以及编码bgh多腺苷酸化信号的在ul35/36非编码区中插入到hvt基因组中的核苷酸序列(seq id no:6)，并且按顺序包括：编码mcmv启动子的核苷酸序列(seq id no:2)；编码来自ndv的f蛋白的核苷酸序列(seq id no:3)；以及编码sv40多腺苷酸化信号的在ul55/基因3非编码区中插入到hvt基因组中的核苷酸序列(seq id no:12)。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步包括编码选自由以下组成的组的一种或多种抗原的核苷酸序列：传染性法氏囊病病毒、鸡贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和禽流感病毒。在一个实施例中，本发明的重组hvt进一步提供了与核苷酸序列操作性地连接的启动子，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的抗原：所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp1、vp2、vp3或vp4抗原；所述鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；所述新城疫病毒(ndv)的f/hn嵌合蛋白或f、np、p、m、hn或l蛋白；所述传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；以及所述禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
98.在一个实施例中，本发明的重组hvt包括一种或多种ilt抗原作为表达盒的一部分，所述表达盒包括与编码ilt抗原的核苷酸操作性地连接的启动子，并且进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列。在一个实施例中，本发明的重组hvt包括第二表达盒和第三表达盒，每个表达盒包括编码与编码禽抗原的核苷酸序列操作性地连接的启动子的核苷酸序列，并且进一步包括编码多腺苷酸化信号的核苷酸序列，所述禽抗原选自由以下组成的组：所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp1、vp2、vp3或vp4抗原；所述鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；所述新城疫病毒(ndv)的f/hn嵌合蛋白或f、np、p、m、hn或l蛋白；所述传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；以及所述禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
99.在一个或多个方面，本发明提供了一种重组dna，所述重组dna编码本发明的重组hvt基因组。
100.在一个或多个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，所述免疫组合物包括本发明的重组hvt，并且进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
101.在一个或多个方面，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本发明的重组hvt，并且进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
102.在一个实施例中，本发明的疫苗进一步包括另外的马立克氏病病毒(mdv)，所述mdv选自由以下组成的组：天然减毒的mdv-1病毒株rispens(cvi-988)；或禽类疱疹病毒3病毒株sb-1病毒。在一个实施例中，本发明的疫苗提供另外的mdv包括重组基因组。在一个实施例中，本发明的疫苗提供另外的重组mdv基因组包括一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列编码对一种或多种禽病原体具有预防性的一种或多种异源抗原。
103.在一个实施例中，本发明的疫苗用于针对由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病对禽进行疫苗接种。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗用于保护禽免受由一种或多种禽病原体引起的临床症状。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗用于保护禽免受由马立克氏病病毒引起的临床症状和由一种或多种禽病原体引起的临床症状。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗提供选自由以下组成的组的所述一种或多种禽病原体：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒
(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述一种或多种禽病原体包括传染性法氏囊病病毒(ibdv)。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒和所述传染性法氏囊病病毒。
104.在一个或多个实施例中，本发明的疫苗用于对禽进行疫苗接种，其中所述疫苗通过至少一次疫苗施用，通过喷雾施用、卵内施用、皮下施用、肌肉内施用、口服施用、经鼻施用或其组合进行施用。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述疫苗通过卵内施用进行施用。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述卵内施用在含胚卵发育介于约16-22天之间发生。在一个或多个实施例中，本发明的疫苗提供所述卵内施用在含胚卵发育约18天时发生。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述疫苗的所述施用包括卵内施用，随后是喷雾施用。在一个实施例中，本发明的疫苗提供所述疫苗的所述施用包括喷雾施用。
105.在一方面，本发明提供一种对禽进行疫苗接种以治疗或预防马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种禽疾病的方法，所述方法包括施用有效量的疫苗组合物本发明的步骤。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体选自由以下组成的组：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒(ndv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)和所述新城疫病毒(ndv)。
106.本发明的一方面提供了一种在禽动物中诱导对马立克氏病病毒和一种或多种禽病原体的免疫应答的方法，所述方法包括向禽施用有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物的步骤。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体选自由以下组成的组：传染性法氏囊病病毒(ibdv)；新城疫病毒(ndv)；传染性支气管炎病毒(ibv)；传染性喉气管炎病毒(iltv)；鸡贫血病毒(cav)；以及禽流感病毒(aiv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述新城疫病毒(ndv)。在一个实施例中，本发明的方法提供所述一种或多种禽病原体包括所述传染性法氏囊病病毒(ibdv)和所述新城疫病毒(ndv)。在一个或多个实施例中，本发明的方法提供所述施用是通过喷雾施用、卵内施用、皮下施用、肌肉内施用、口服施用或经鼻施用进行的。在一个实施例中，所述方法包括卵内施用。在一个实施例中，所述方法提供所述卵内施用在含胚卵发育介于约16-22天之间发生。在一个或多个实施例中，所述方法提供所述卵内施用在含胚卵发育约18天时发生。在一个或多个实施例中，所述方法提供施用途径包括卵内施用，随后是喷雾施用。在一个实施例中，所述方法提供施用途径包括喷雾施用。在一个或多个实施例中，所述方法提供所述禽选自由以下组成的组：鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鸵鸟、鸽子和鹌鹑。在一个实施例中，所述方法提供所述禽包括鸡。
107.一般方法：
108.应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在限制本发明的范围。
109.除非另外定义，否则结合本文所描述的本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。通常，与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的术语表和其技术是本领域众所周知和常用的术语表和技术。
110.本领域技术人员熟知的标准技术用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转染。如本领域通常实现的或如本文所描述的来根据制造商的说明进行酶促反应和纯化技术。前述技术和程序通常是根据本领域熟知的常规方法并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述，但不限于那样进行，参见ex.sambrook等人《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:lab.manual)》(第3版,纽约冷泉港实验室的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor lab.press,cold spring harbor,n.y.)2001)和ausubel等人《当代分子生物学实验手册(current protocols in molecular biology)》(纽约：格林出版协会和威立国际科学出版社(new york:greene publishing association jwiley interscience)，《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编辑,1984)；《分子生物学方法(methods in molecular biology)》,胡玛纳出版社(humana press)；《细胞生物学：实验室手册(cell biology:a laboratory notebook)》(j.e.cellis编辑,1998)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.1.freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(introduction to cell and tissue culture)》(1.p.mather和p.e.roberts,1998)普莱南出版社(plenum press)；《细胞和组织培养：实验室程序(cell and tissue culture:laboratory procedures)》(a.doyle,j.b.griffiths和d.g.newell编辑,1993-1998)，约翰
·
威利父子出版公司(j.wiley and sons)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社公司)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编辑,1987)；《当代分子生物学实验手册》(编辑：f.m.ausubel等人,1987)；《pcr：聚合酶链式反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编辑,1994)；《免疫学实验指南(current protocols in immunology)》(e.coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(short protocols in molecular biology)》(约翰
·
威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(immunobiology)》(c.a.janeway和p.travers,1997)；《抗体(antibodies)》(p.finch,1997)；《抗体：实用方法(antibodies:a practical approach)》(d.catty.编辑,irl出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(monoclonal antibodies:a practical approach)》(p.shepherd和c.dean编辑,牛津大学出版社(oxford university press),2000)；《使用抗体：实验室手册(using antibodies:a laboratory manual)》(e.harlow和d.lane(冷泉港实验室出版社,1999))；《抗体》(m.zanetti和j.d.capra编辑,哈伍德学术出版社(harwood academic publishers),1995)；和《癌症：肿瘤学原理和实践(cancer:principles and practice of oncology)》(y.t.devita等人编辑,j.b.利平科特出版公司(j.b lippincott company),1993)。
111.除了在操作实例中或在另外指出的地方之外，在所有情况下，本文中使用的表示成分或反应条件的量的所有数字应被理解为由术语“约”修饰。
112.出于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法的目的，所有鉴定的专利和其它出版物明确地通过引用并入本文。仅提供这些公开在本技术的提交日期之前的公开内容。
113.定义
114.在详细描述本发明之前，将定义在本发明的上下文中使用的若干个术语。除了这些术语之外，其它术语在本说明书的其它地方根据需要进行定义。除非本文另有明确定义，否则本说明书中使用的技术术语将具有其技术公认的含义。
115.注意，在本公开中，如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“组成(consisting)”、“组成(consisted)”、“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”、“包含(includes)”、“包含(included)”等术语是根据标准的美国和国际专利法实践定义的。
116.贯穿本技术，术语“约”在本文用于表示某个值包含用于测定所述值的装置或方法的标准误差偏差。权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出其仅指代替代方案或替代方案相互排斥，但本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。当不与权利要求中的封闭式措辞结合使用或另外特别指出时，词语“一个(a)”和“一种”(an)表示“一个或多个”。例如，术语“由转基因赋予”因此涵盖一个或多个转基因。
117.术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和r基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的r基(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
118.氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过iupac-iub生物化学命名法委员会(the iupac-iub biochemical nomenclature commission)推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来指代。如多肽结构等大分子结构可以根据不同的组织水平来描述。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内局部有序的三维结构。这些结构通常被称为结构域，例如酶结构域、胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域或细胞质尾部结构域。结构域是形成多肽的紧凑单元的多肽的各部分。示例性结构域包含具有酶活性的结构域。结构域可以由较小组织的区段，如β-片层和α-螺旋的段组成。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立的三级单元非共价缔合形成的三维结构。各向异性项也称为能量项。
119.如本文所使用的，“抗体”是指包括来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的特异性结合抗原并识别抗原的多肽。识别的免疫球蛋白基因可以包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链可以分类为κ或λ。重链可以分类可以为γ、μ、α、δ或ε，这进而分别限定免疫球蛋白类别igy、igg、igm、iga、igd和ige。
120.示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元可以包括四聚体，其中每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”链(约25kd)和一个“重”链(约50-70kd)。每条链的n端限
定了主要负责抗原识别的约100个到110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链和可变重链是指这些轻链和重链。抗体例如以完整的免疫球蛋白或以通过用各种肽酶消化产生的若干个充分表征片段形式存在。尽管就完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是本领域的技术人员将理解，可以化学或通过使用重组dna方法从头合成此类片段。因此，如本文所使用的，术语“抗体”还包含通过修饰整个抗体产生的抗体片段或通过重组dna方法从头合成的抗体片段或通过使用本领域中已知的其它方法鉴定的抗体片段。
121.为了制备抗体，例如重组抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用本领域已知的许多技术。编码所关注的抗体的重链和轻链的基因可以从细胞中克隆，并且用于产生重组单克隆抗体。也可以使用编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大抗体池。在本领域中发现了产生单链抗体或重组抗体的技术，并且所述技术可以适于产生针对根据本发明的多肽的抗体。噬菌体展示技术还可以用于鉴定与所选抗原特异性结合的抗体和异聚体片段。抗体也可以制备成双特异性的，即能够识别两种不同的抗原或异源缀合物，例如两种共价连接的抗体或免疫毒素。
122.如本文所使用的，“抗原”是指病毒蛋白或如病毒多肽等多肽，以及病毒颗粒。在一些实施例中，根据本发明的抗原还可以是病毒核酸。抗原是被免疫系统识别并能够在宿主生物体中诱导免疫应答的分子。抗原可以包括完整的、减毒的、杀伤的或活的生物体或生物体的亚基或部分。其还可以是可以诱导免疫应答的dna片段(piece或fragment)、多肽、表位、半抗原或这些的任何组合。
123.如本文所使用的，术语“禽”包含家禽，如鸡形目的成员。更具体地，更具有经济和/或农业利益的一类鸟类，如鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鸵鸟、鸽子和鹌鹑等。
124.如本文所使用的，“生物样品”或“样品”可以包含血液和血液部分，包含但不限于血清、血浆、血小板或红细胞；痰、泄殖腔拭子、粘膜、组织、培养细胞，包含原代培养物、外植体和转化的细胞；生物流体、粪便和尿液。生物样品还可以包含组织切片，如活检和尸检样品，以及用于组织学目的的冷冻切片。生物样品可以从真核生物体，如鸟类，包含但不限于来自鸡形目的鸟类，如鸡、鹌鹑和火鸡获得。可以使用适于根据本发明使用的任何组织，例如，皮肤、脑、脊髓、肾上腺、胸肌、肺、心脏、肝脏、嗉囊、腺胃、胃憩室、十二指肠、小肠、大肠、泄殖腔、肾、法氏囊、脾、胰腺、肾上腺、骨髓、腰骶脊髓或血液。
125.术语“保守氨基酸取代”指示给定氨基酸残基的任何氨基酸取代，其中取代残基在化学上与给定残基类似，以至于不会导致多肽功能(例如，酶活性)显著降低。保守氨基酸取代在本领域中通常是已知的，并且其实例描述于例如美国专利第6,790,639号、第6,774,107号、第6,194,167号或第5,350,576号中。在优选实施例中，保守氨基酸取代将是以下六组之一中发生的任一种：
126.·
1.小的脂肪族基本上非极性残基：ala、gly、pro、ser和thr；
127.·
2.大的脂肪族非极性残基：lie、leu和val；met；
128.·
3.极性带负电荷的残基及其酰胺：asp和glu；
129.·
4.极性带负电残基的酰胺：asn和gin；his；
130.·
5.极性带正电荷的残基：arg和lys；his；以及
131.·
6.大的芳香族残基：trp和tyr；phe。
132.在优选实施例中，保守氨基酸取代将是以下任何一种，其如以下天然残基(保守取
代)对所列出：ala(ser)；精氨酸(lys)；asn(gin；his)；asp(glu)；gin(asn)；glu(asp)；gly(pro)；his(asn；gln)；lie(leu；val)；leu(lie；val)；lys(arg；gin；glu)；met(leu；lie)；phe(met；leu；tyr)；ser(thr)；thr(ser)；trp(tyr)；trp(trp；phe)；以及val(lie；leu)。
133.如本文所描述的，在用于测试调节病毒活性的化合物的测定的上下文中的短语“功能效应”包含确定间接或直接受这种病毒影响的参数，如表型或化学效应。“功能效应”可以包含体外、体内和离体活性，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式测量，如蛋白质的光谱特性、形状、色谱或溶解度特性的变化，测量蛋白质的诱导型标志物或转录激活；测量例如与抗体结合的结合活性或结合测定；测量配体或底物结合活性的变化；测量病毒复制；测量细胞表面标志物表达；测量蛋白质水平的变化；测量rna稳定性；通过例如化学发光、荧光、比色反应、抗体结合和/或诱导型标志物鉴定下游或报告基因表达。
134.术语“基因”是指包括病毒dna或rna、cdna、病毒内含子和外显子dna、人工病毒dna多核苷酸或编码病毒肽、病毒多肽、病毒蛋白或病毒rna转录分子的其它dna的组分，以及可以作为病毒基因组中的天然基因或转基因存在的可以侧接有参与调控表达的编码序列的基因元件，如启动子区、5'前导区、3'非翻译区。可以对基因或其片段进行确定包括基因的核苷酸的顺序的多核苷酸测序方法。
135.术语“火鸡疱疹病毒(hvt)”被定义为家养火鸡的非致病性病毒，并且被分类为抗原和遗传相关的嗜淋巴细胞禽疱疹病毒的马立克氏病病毒组中的第三血清型。
136.术语“异源的”当结合核酸的部分使用时表明核酸包括在自然界中未发现彼此之间的相同关系的两个或更多个序列。例如，核酸通常是重组地产生的，具有来自不相关基因的排列成产生新的功能性核酸的两个或更多个序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质指示蛋白质包括在自然界中未发现彼此之间的相同关系的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。异源还可以指病毒序列，如被插入到通常不存在其的病毒基因组中的基因或转基因或其一部分，或被引入到通常不存在其的生物体中的基因。
137.术语“宿主细胞”意指以任何方式被选择、修饰、转化、生长或使用或操纵的任何生物体的任何细胞，以通过所述细胞来产生物质，例如基因、dna或rna序列、蛋白质或酶在细胞中的表达。宿主细胞旨在包含可以是或已经是载体受体或用于掺入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的受体的任何单个细胞或细胞培养物。其还旨在包含单个细胞的后代。由于天然的、偶然的或故意的突变，后代(在形态学上或基因组或总dna互补物上)可能不一定与原始亲本细胞完全相同。细胞可以是原核的或真核的。
138.如本文所使用的，术语“宿主”、“受试者”、“患者”或“生物体”可以包含动物，具体地鸟类，尤其是家禽。对于兽医应用，鸟类可以来自鸡形目，所述鸡形目包含鸡、鹌鹑和火鸡等。术语“活宿主”是指如上所述的宿主或另一种活的生物体。所述术语还可以指整个宿主或生物体，并且不仅仅是从活宿主中切除的一部分(例如，脑或其它器官)。这些术语还包含处于所有发育阶段的个体，包含胚胎和胎儿阶段。
139.在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指如使用利用以下描述的默认参数的blast或blast 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查(参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/blast/等上找到的ncbi网站)测量的相同的或具有指定百分比的氨基酸残基的两个或更多个序列或相同的核苷酸(即，当在比较窗口或指
定区内针对最大对应性进行比较和比对时，在指定区内的约60％同一性，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。然后此类序列被称为“基本上相同”。此定义还涉及或可以应用于特定序列的互补物此定义还可以包含具有缺失、添加和/或取代的序列。
140.为了进行序列比较，一个序列通常用作与其它序列进行比较的参考序列。当使用序列比对算法时，可以将参考序列和比较序列输入到计算机中，并且根据需要选择序列算法程序参数。然后基于选择的参数，生成针对比较序列相对于参考序列的序列同一性百分比。可以适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例是blast算法和blast 2.0算法，所述算法分别在altschul等人(《核酸研究(nuc acids res)》25:3389-3402,1977)和altschul等人(《分子生物学杂志(j mol biol)》215:403-410,1990)中有所描述。blast和blast 2.0在本领域中是众所周知的，并且可以用于确定任何核酸或蛋白质的序列同一性百分比，如本文所描述的核酸或蛋白质。
141.如本文所使用的，“免疫原性组合物”或“药物组合物”或“疫苗”意在涵盖包括适于施用于如禽受试者等受试者的抗原的组合物。所述组合物通常意在在受试者中引起免疫应答。免疫应答可以包含t细胞应答、b细胞应答或t细胞应答和b细胞应答两者。组合物可以通过在细胞表面处呈递与mhc分子相关的抗原来使受试者患者敏感。另外，可以产生抗原特异性t淋巴细胞或抗体，以允许将来保护免疫的宿主。“免疫原性组合物”可以含有活的、减毒的或灭活(killed/inactivated)疫苗，所述疫苗包括诱导细胞介导(t细胞)的免疫应答或抗体介导(b细胞)的免疫应答或两者的完整微生物体或源自所述完整微生物体的免疫原性部分，并且可以保护动物免受与微生物感染相关的一种或多种症状，或者可以保护动物免于由微生物感染而引起的死亡。通常，“免疫原性组合物”是无菌的，并且优选地不含可以在受试者体内引起不良应答的污染物(例如，免疫原性组合物中的化合物是药物级的)。免疫原性组合物可以被设计用于通过包含以下的多种不同的施用途径施用于有需要的受试者：卵内施用、口服施用、静脉内施用、口腔施用、直肠施用、肠胃外施用、腹膜内施用、皮内施用、气管内施用、肌肉内施用、皮下施用、吸入施用等。
142.如本文所使用的，术语“免疫原性”蛋白或肽包含具有在以下意义上免疫活性的多肽：一旦施用于宿主，其能够诱发针对蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，使得蛋白质片段具有与全长蛋白质基本上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包括至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成。如本文所使用的，“免疫原性”蛋白或多肽包含蛋白质、其类似物或其免疫原性片段的全长序列。“免疫原性片段”意指包含一个或多个表位并且因此引起上述免疫应答的蛋白质片段。
143.术语“免疫原性蛋白或肽”进一步设想了对序列的缺失、添加和取代，只要多肽起作用以产生如本文所定义的免疫应答。术语“保守变异”表示氨基酸残基被另一个生物学上类似的残基置换或核酸序列中的核苷酸的取代，使得经编码的氨基酸残基不改变或改变为另一个生物学上类似的残基。在这点上，特别优选的取代在本质上通常是保守的，即发生在氨基酸家族内的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳
香族氨基酸。保守变异的实例包含用一个疏水残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一个疏水残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，如用精氨酸取代赖氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸或用谷氨酰胺替代天冬酰胺等；或者用不会对生物活性产生重大影响的在结构上相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守置换。因此，具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列但拥有基本上不影响蛋白质的免疫原性的少量氨基酸取代的蛋白质在参考多肽的定义之内。通过这些修饰产生的所有多肽都包含在本文中。术语“保守变异”还包含使用经取代的氨基酸替代未取代的亲本氨基酸，条件是针对经取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。
144.如本文所使用的，“免疫有效量”是指足以引起免疫应答，细胞(t细胞)或体液(b细胞或抗体)应答的抗原或疫苗的量，如通过本领域技术人员已知的标准测定测量的。例如，关于本发明，“免疫有效量”是最小保护剂量(滴度)。抗原作为免疫原的有效性可以通过增殖测定、细胞溶解测定，如铬释放测定来测量以测量t细胞裂解其特异性靶细胞的能力，或通过测量b细胞活性水平，通过测量血清中对抗原具有特异性的循环抗体的水平或本领域技术人员已知和使用的其它测定来测量。此外，免疫应答的保护水平可以通过用已注射的抗原激发免疫宿主来测量。例如，如果需要对其产生免疫应答的抗原是病毒或肿瘤细胞，则通过在动物的病毒或肿瘤细胞激发之后检测存活百分比或死亡率百分比来测量由抗原的“免疫有效量”诱导的保护水平。
145.确定什么是根据本发明的疫苗的免疫有效量是技术人员完全可以实现的，例如通过监测在接种疫苗之后或在激发感染之后的免疫应答，例如通过重新分离病原体，或通过监测疾病的靶临床症状或血清学参数，并将这些与模拟接种疫苗的动物中所看见的应答进行比较。用于将根据本发明的疫苗应用于靶生物体的给药方案可以是单剂量或多剂量，所述疫苗可以以与疫苗的调配物相容的方式同时或依次给与，并且以将是免疫有效的此类量给与。
146.病毒核酸和多肽序列的术语“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”用于指使用病毒核酸和多肽序列的体外和体内测定鉴定的激活、抑制或调节分子。抑制剂是可以结合、部分或完全阻断活性，降低、预防、延迟激活、灭活、脱敏或下调病毒的活性或表达的化合物。激活剂是指增加、打开、激活、促进、增强激活、敏化、激动或上调病毒活性的化合物。抑制剂、激活剂或调节剂还包含如本文所描述的病毒的经过基因修饰的版本，如，具有改变的活性的版本，以及天然存在的和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶、化学小分子等。如本文所描述的，抑制剂和激活剂的测定包含例如在体外、在细胞中或细胞膜中表达是本发明的病毒，应用推定的调节剂化合物，并且然后确定对活性的功能影响。
147.可以将包括本发明的病毒的用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理测试样品或测定与缺乏抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品进行比较以确定抑制程度。与测试样品或测定进行比较的对照样品可以分配有100％的相对蛋白质活性值。当测试样品相对于对照样品的活性值小于约80％，包含约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％和约0％时，实现了病毒的抑制。
148.如本文所描述的，基因间基因座被定义为定位于基因之间的dna序列区，包含非翻
译区、5'和3'侧接区、内含子等。基因间区是非编码dna的可以含有基因控制元件，如启动子和增强子的一部分。
149.术语“分离的”意指已与自然界中存在的其它物质基本上分离或富集的物质。按重量计，经分离的物质的纯度通常为至少约80％，纯度为至少90％，纯度为至少98％或纯度为至少约99％纯。
[0150]“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包含
32
p、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于elisa中)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原和能够被检测的蛋白质，例如通过将放射性标记掺入到肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体。
[0151]
如本文所使用的，“马立克氏病病毒”或“mdv”是指马立克病毒属的任何α疱疹病毒，其包含如本文所描述的火鸡疱疹病毒(hvt)。在具体实施例中，本发明涉及马立克氏病病毒、其基因组分、基因和由此产生的蛋白质。如本文所使用的，此类病毒可以包含病毒的基因组分，即基因组和其转录物、由基因组编码的蛋白质(包含结构和非结构蛋白质)以及功能性或非功能性病毒颗粒。编码此类病毒的多核苷酸和多肽序列在本领域中是众所周知的，并且是本领域技术人员很容易发现的。
[0152]
术语“突变体”和“突变”是指遗传物质，例如dna中任何可检测到的变化，或此类变化的任何过程、机制或结果。这包含基因的结构(例如，dna序列)被改变的基因突变、由任何突变过程产生的任何基因或dna以及由经修饰的基因或dna序列表达的任何表达产物(例如，蛋白质或酶)。术语“变体”还可以用于指示经修饰或改变的基因、dna序列、酶、细胞等，即任何种类的突变体。
[0153]
如本文所使用的，术语“核酸”是指从5'端到3'端读段的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。“核酸”还可以任选地含有非天然存在的或改变的核苷酸碱基，其允许通过聚合酶进行的正确读段并且不降低由所述核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为单独的单链或双链体中的核酸的有义链和反义链两者。术语“核糖核酸”(rna)包含rnai(抑制性rna)、dsrna(双链rna)、sirna(小干扰rna)、mrna(信使rna)、mirna(微小rna)、trna(转移rna，是否用对应的酰化氨基酸带电荷或不带电荷)和crna(互补rna)。术语“核酸区段”、“核苷酸序列区段”或更一般地“区段”将被本领域技术人员理解为包含基因组序列、核糖体rna序列、转移rna序列、信使rna序列、操纵子序列和表达或可以适于表达蛋白质、多肽或肽的较小的工程化核苷酸序列的功能术语。本文所使用的命名法是美国联邦法规第37篇
§
1.822所要求的命名法，并在wipo标准st.25(1998)附录2表1和表3中的表格中列出。
[0154]
术语“可操作性地连接”在本文中用于指侧接序列的排列，其中如此描述的侧接序列被配置成或被组装成进行其通常功能。因此，可操作性地连接的侧接序列可以能够影响编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。侧接序列不必与编码序列连续，只要其功能正确即可。因此，例如，在启动子序列与编码序列之间可以存在插入的未翻译但转录的序列，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。
[0155]
术语“药学上可接受的载体”是指药物调配物中除活性成分外的在生理上相容以施用于受试者的成分。药学上可接受的载体包含但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、佐剂、防
腐剂、稀释剂、水性或非水性媒剂和其它添加剂。另外，此术语是指通常由联邦监管机构、州政府或其它监管机构批准的，或在美国药典或其它公认的用于人和非人动物两者的药典中列出的免疫原性组合物或疫苗的元件。此类药物载体可以是无茵液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液以及右旋糖和甘油水溶液还可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物等形式。可以用如甘油三酯等传统的粘合剂和载体将组合物调配为栓剂。口服调配物可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例描述于e.w.martin的“《雷明顿药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》”中。调配物应适合施用方式。
[0156]
如本文所使用的，“家禽”是指为其所产生的蛋以及其肉和羽毛而饲养的家养或商业鸟类。在一些实施例中，家禽可以包含来自鸡形目的鸟类，其包含鸡、鹌鹑和火鸡，并且还可以包含鹅、鸭、天鹅、豚鼠、鸽子等。
[0157]
如本文所描述的多核苷酸可以与病毒基因序列的全部或部分互补，包含启动子、内含子、编码序列、外显子、5'非翻译区和3'非翻译区。
[0158]
特定核酸序列还可以涵盖“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质隐含地涵盖由所述核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。剪接变体是对基因进行选择性剪接的产物。在转录之后，可以剪接初始核酸转录物，使得不同(替代性)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制各不相同但包含外显子的替代性剪接。此定义还涵盖通过通读转录源自相同核酸的替代性多肽。剪接反应的任何产物，包含剪接产物的重组形式都包含在此定义中。
[0159]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0160]
术语“多价疫苗”、“组合或组合疫苗”和“多价疫苗”可互换使用以指代含有多于一种抗原的疫苗。多价疫苗可以含有两种、三种、四种或更多种抗原。多价疫苗可以包括重组病毒载体、活性或减毒或灭活的野生型病毒，或重组病毒载体和活性或减毒或灭活形式的野生型病毒的混合物。
[0161]
如本文所使用的，“启动子”是指定义rna聚合酶基因转录的起始位置的dna序列。启动子通常定位于转录起始位点的上游。启动子还可以包括远端增强子或阻遏子元件，其可以定位于与转录起始位点相距多达数千个核苷酸处。启动子定义了转录的方向并指明了哪条dna链将被转录。启动子可以源自包含病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官、或相对于发生表达的发育阶段或响应于如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂等外部刺激而组成性或差异性地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包含噬菌体t7启动子、噬菌体t3启动子、sp6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、rsv-ltr启动子、cmv ie启动子、人cmv启动子；鼠类cmv启动子；pec启动子；β
鸡肌动蛋白启动子；豚鼠cmv启动子、伪狂犬病病毒启动子；糖蛋白x启动子、单纯疱疹病毒-1启动子；马立克氏病病毒启动子；以及sv40启动子。
[0162]
如本文所使用的，术语“预防性治疗(prophylactically treat)”或“预防性治疗(prophylactically treating)”是指完全或部分预防疾病或其症状和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。
[0163]
当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达以其它方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。在一些实施例中，重组序列还可以包含核酸、蛋白质或重组基因组，如病毒基因组。如本文所描述的重组病毒载体可以含有与异源启动子操作性地连接的转基因，以实现转基因的转录。
[0164]
短语“严格杂交条件”是指探针通常在核酸的复杂混合物中将与其靶序列杂交而不是与其它序列杂交的条件。严格条件可以取决于序列，并且在不同情况下会有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。严格条件可以通过添加如甲酰胺等去稳定剂来实现。
[0165]
促进dna杂交的适当严格条件是本领域技术人员熟知的，并且可以包含例如在约45℃下的6x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)，然后在50℃下用2x ssc洗涤。洗涤步骤中的盐浓度可以选自在50℃下约2x ssc的低严格性到在50℃下约0.2x ssc的高严格性。洗涤步骤中的温度可以从约22℃的室温下的低严格条件增加到约65℃下的高严格条件。温度和/或盐条件可以适当变化以获得最佳结果。根据本发明，核酸可以表现出与如本文所描述的一种或多种核酸分子具有至少约80％到约100％的序列同一性，例如，至少约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或约100％的序列同一性。
[0166]
如果核酸所编码的多肽基本上相同，那么在严格条件下并不彼此杂交的所述核酸仍基本上相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，就会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在适度严格杂交条件下杂交。
[0167]
如本文所使用的，术语“治疗有效量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是指产生其所施用的效果的剂量。此类剂量或量还可以指将在一定程度上缓解正在治疗的疾病，即感染的症状中的一种或多种症状的所施用的药剂的实施例的量，和/或将在一定程度上预防已接受治疗的宿主的疾病或有风险患上的所述疾病，即感染的症状中的一种或多种症状的量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且本领域技术人员将能够使用本领域已知的技术来确定此类剂量。
[0168]
如本文所使用的，“转基因”是指用于从一种生物体引入到另一种生物体的含有异源编码序列或其它遗传物质的dna区段。例如，在某些实施例中，根据本发明的转基因可以包括抗原编码序列，如病毒基因或编码病毒蛋白的序列。
[0169]
如本文所使用的，术语“治疗(treatment、treating和treat)”被定义为用药剂作用于疾病、病症或病状以减少或改善疾病、病症或病状和/或其症状的药理学效果和/或生理学效果。如本文所使用的，“治疗”涵盖对受试者或宿主(例如，兽医所关注的动物)的疾病的任何治疗，并且包含：(a)降低确定易患疾病但尚未被诊断为感染疾病的受试者患有疾病的风险；(b)阻止疾病的发展；以及(c)减轻疾病，即引起疾病消退和/或减轻一种或多种疾病症状。“治疗”还旨在涵盖甚至在不存在疾病或病状的情况下递送抑制剂以提供药理学效
果。例如，“治疗”涵盖递送疾病或病原体抑制剂，其在受试者中提供增强的或期望的效果(例如，减少病原体负载、减少疾病症状等)。
[0170]
如本文所使用的，术语“单位剂型”是指适合作为动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有以足以产生期望的效果计算的预定量的化合物(例如，如本文所描述的抗病毒化合物)以及药学上可接受的稀释剂、载体或媒剂。单位剂型的规格取决于所采用的特定化合物、施用途径和频率、要达到的效果以及与宿主中的每种化合物相关的药效学。
[0171]
在本文中可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包括本发明的在受试者中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物的药物组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护受试者免于疾病或可能的死亡，并且可以包含或不包含增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外的组分。本发明的诱导预防性免疫应答的组合物包括一种重组hvt病毒，所述重组hvt病毒具有在基因间区ul 35/36处插入到hvt基因组中的一个或多个异源抗原编码基因。在一些实施例中，本发明的组合物包括一种重组hvt病毒，所述重组hvt病毒具有在ul 35/36处插入到hvt基因组中的一种或多种异源抗原编码基因以及在ul55处插入到hvt基因组中的一种或多种抗原编码基因。在一些实施例中，抗原编码基因是源自家禽病原体，如新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒和/或鸡贫血病毒的抗原。在一些实施例中，重组hvt与在家禽中引起预防性免疫应答的另一种重组马立克氏病病毒疫苗组合。本发明的疫苗或疫苗组合物可以另外包括对疫苗或疫苗组合物典型的另外的组分，包含例如佐剂或免疫调节剂。疫苗可以包括上述元件中的一种或同时包括上述元件中的多于一种。
[0172]
本发明的疫苗可以进一步包括合适的药物载体。术语“药学上可接受的载体”旨在包含针对宿主的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。术语“载体”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类药物载体可以是无茵液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液以及右旋糖和甘油水溶液还可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物等形式。取决于施用方法，组合物可以与传统的粘合剂和如甘油三酯等载体一起调配。特定调配物可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例描述于e.w.martin的“《雷明顿药物科学》”中。调配物应适合施用方式。合适的载体对本领域技术人员来说是显而易见的，并且将在很大程度上取决于施用途径。本发明中可能存在的另外的组分是佐剂、防腐剂、表面活性剂、化学稳定剂、悬浮剂或分散剂。通常，稳定剂、佐剂和防腐剂经优化以确定针对靶受试者的功效的最佳调配物。
[0173]“变体”肽在本文中是指这样一种肽：通过亲本肽序列中的一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代而在氨基酸序列中与“亲本”疫苗肽氨基酸序列不同，并保留亲本疫苗肽的至少一种期望的活性。例如，变体可以包括肽的要用作本发明的疫苗的一部分的一个或多个氨基酸序列中的至少一个，例如约一个到约十个，并且优选地约两个到约五个取
代。通常，变体将具有与亲本氨基酸序列具有至少50％的氨基酸序列同一性，优选地至少65％，更优选地至少70％，更优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，并且最优选地至少95％的序列同一性的氨基酸序列。关于此序列的同一性或同源性在本文中被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，在候选序列中与亲本肽残基相同的氨基酸残基的百分比。肽序列的n端、c端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响序列同一性或同源性。变体保留了引起免疫应答的能力，并优选地期望的活性优于亲本肽的活性。
[0174]
变体肽在一种或多种活性中可以具有完全功能或可以缺乏功能。完全功能变体通常仅含有保守变异或非关键残基或非关键区的变异。功能变体还可以含有不会产生功能变化或产生不显著变化的类似氨基酸的取代。可替代地，此类取代可以在某种程度上对功能产生积极或消极的影响。非功能变体通常含有一个或多个非保守氨基酸取代、缺失、插入、倒置或截短或在关键残基或关键区中的取代、插入、倒置或缺失。
[0175]
此外，多肽通常含有二十种“天然存在的”氨基酸以外的氨基酸。进一步地，许多氨基酸，包含末端氨基酸可以通过天然过程，如加工和其它翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。已知的修饰包含但不限于乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、gpi锚定物形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移-rna介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酸化以及泛素化。此类修饰是本领域技术人员熟知的并且已在科学文献中非常详细地描述了。例如，若干特别常见的修饰，糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和adp核糖基化在大多数基本文本中有所描述，如《蛋白质结构和分子特性(proteins-structure and molecular properties)》(第2版,t.e.creighton,纽约的wh弗里曼公司(w.h.freeman&co.,ny)1993)。关于此主题有许多详细的综述，如《蛋白质的翻译后共价修饰(posttranslational covalent modification of proteins)》,1-12(johnson编辑,纽约的学术出版社(academic press,ny),1983)；seifter等人182《酶学方法(meth.enzymol.)》626-46(1990)；和rattan等人663《纽约科学院年报(ann.ny acad.sci.)》48-62(1992)。
[0176]
因此，本发明的肽还涵盖其中经取代的氨基酸残基不是由遗传密码编码的衍生物或类似物。类似地，刚刚描述的氨基酸序列中的添加和取代以及变化和修饰可以同样适用于抗原和/或其表位或肽的氨基酸序列，并且因此涵盖在本发明中。
[0177]“变体”核酸在本文中是指在序列上与“亲本”核酸不同的分子。多核苷酸序列差异可以由突变变化引起，如一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加。这些变化中的每个变化都可以单独发生或组合发生，以给定的顺序发生一次或多次。
[0178]
正如多肽可以含有保守氨基酸取代一样，其多核苷酸也可以含有保守密码子取代。如果密码子取代在表达时产生如上文所描述的保守氨基酸取代，则所述密码子取代被认为是保守的。未产生氨基酸取代的简并密码子取代也可以用于根据本发明的多核苷酸。因此，例如，编码可用于本发明的一个实施例的所选多肽的多核苷酸可以通过简并密码子取代而突变，以便近似由要用其转化的表达宿主细胞所表现出的密码子使用频率，或以其
它方式改进其表达。
[0179]
如本文所使用的，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一个或多个所关注的基因或序列的构建体。载体的实例包含但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体、包封在脂质体中的dna或rna表达载体以及某些真核细胞，如生产细胞。如本文所描述的，载体具有表达控制序列，意指指导核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子、或增强子。表达控制序列与要转录的核酸序列“可操作地连接”。当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或所述增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处连接来完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
[0180]
如本文所使用的，“病毒蛋白”或“病毒多肽”是指由本文所描述的病毒编码的蛋白质，包含结构蛋白和非结构蛋白。此类蛋白质可以包含来自mdv、ndv和/或ibdv的天然存在的或非天然存在的病毒蛋白，包含vp2、f和/或hn、np、p、m或l蛋白。此类蛋白质还可以包含来自iltv的天然存在或非天然存在的病毒蛋白，如gb、gc、gd、ge、gh、gi或gl，来自传染性支气管炎病毒(ibv)的s1、s2或m蛋白；鸡贫血病毒(cav)的vp1或vp2蛋白；和/或禽流感病毒(aiv)的ha、na、np或m蛋白中的任一种。
[0181]
根据本发明，如本文所描述的重组病毒载体可以通过提供表达来自此类病毒病原体的基因的重组病毒载体来保护家禽免受两种或更多种不同的病毒病原体。在一些实施例中，本发明的重组病毒载体可以以如本文所描述的免疫原性组合物提供给家禽。可以使用来自适合于与如本文所描述的重组病毒载体一起使用的任何病毒病原体的基因。例如，在一些实施例中，重组病毒载体可以表达来自以下的基因：新城疫病毒(ndv)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)、禽流感病毒(aiv)、鸡贫血病毒(cav)、传染性支气管炎病毒(ibv)和传染性喉气管炎病毒(iltv)等。
[0182]
根据本发明，赋予对一种或多种特定病毒的保护或抗性的转基因可以在特定位置处插入到病毒基因组中。例如，在一些实施例中，如本文所描述的转基因可以在基因间区中插入到病毒基因组中，所述基因间区侧接基因组的独特长区中的hvt ul 35/ul 36。在本发明的另一个实施例中，转基因在本文中被描述为包括在除了使用的第二位点之外的基因间区中插入到病毒基因组中的一个或多个异源基因，所述基因间区侧接hvt基因组的hvt ul 35/ul 36，其中一个或更多个异源基因插入到hvt基因组内的ul55位点中。在其它实施例中，可以将多于一个转基因插入的这些区中的一个区或两个区中。
[0183]
在一些实施例中，重组病毒载体可以表达来自单一病毒物种的多个基因或者可以表达来自多于一种病毒物种的基因，以获得对多种病毒的抗性。例如，在一个实施例中，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括hvt基因组和来自不同病毒病原体的至少一个转基因，因此在如家禽等鸟类中提供针对马立克氏病和至少一种其它病毒性疾病的保护。例如，在一个实施例中，根据本发明的重组病毒载体可以在家禽中提供针对mdv
和ndv的保护，或者可以提供预防mdv和ibdv或者可以提供预防mdv、ndv和ibdv。
[0184]
用于通过本发明的重组病毒载体家禽中表达的病毒抗原可以由病毒基因，如本文所描述的病毒基因编码。在这方面，本领域技术人员将理解，可以不需要掺入特定病毒基因的全部以获得期望的病毒抗性。相反，可以使用此类基因的一部分。可以期望选择对任何给定的一种或多种靶病毒具有特异性的期望的基因的特定部分。无论蛋白质的长度如何，对期望的病毒蛋白或编码此类蛋白质的序列的优化都可以使用本领域已知的适用于本发明的方法容易地进行。本领域技术人员将理解，可以对一种或多种病毒基因或由其编码的蛋白质进行修饰，以在引入到受试者中时增加病毒蛋白的活性。对病毒基因或蛋白的修饰可以在宿主中增加或减少对特异性病毒的应答。
[0185]
在某些实施例中，本发明的重组马立克氏病病毒或重组病毒载体可以具有编码ibdv病毒蛋白或基因产物，如ibdv vp2蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码ndv病毒蛋白或基因产物，如ndv f或hn蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码禽流感病毒(aiv)病毒蛋白或基因产物，如aiv ha或n蛋白或基因产物的转基因。在另一个实施例中，此类重组病毒或病毒载体可以具有编码传染性支气管炎病毒(ibv)病毒蛋白或基因产物，如ibv s1或s2蛋白或基因产物的转基因。本发明的转基因可以具有多于一种基因，包含基因融合蛋白或基因产物，如ndv f-hn融合蛋白、嵌合体或基因产物。在一些实施例中，可以使用此类基因的完整编码序列，使得产生全长或全功能蛋白质或多肽。可替代地，病毒蛋白或多肽的一部分或片段可以足以提供对一种或多种特定病毒的保护或抗性。
[0186]
在某些实施例中，本发明的重组马立克氏病病毒或重组病毒载体可以具有编码免疫调节剂，如细胞因子蛋白或基因产物的转基因。根据本发明，细胞因子可以是白介素(il)，包含但不限于il2、il6、il7、il8、il12、il18等。可以将此类编码细胞因子的转基因插入到如本文所描述的一个或两个基因组位点中。在一些实施例中，可以将编码病毒蛋白的转基因插入到本文所描述的一个位点中，并且将编码所述病毒蛋白的转基因插入到另一个位点中。其它免疫调节剂可以是有用的，如干扰素、趋化因子、葡聚糖、粒细胞集落刺激因子、寡脱氧核苷酸还可以根据本发明使用。
[0187]
病毒基因或病毒蛋白的分离
[0188]
在本发明的实施例中，如本文所描述的病毒基因可以使用严格杂交条件下的核酸探针和/或寡核苷酸、pcr或微阵列、筛选dna文库或使用本领域已知的任何其它方法来分离。本领域技术人员将根据本发明容易地理解如何分离供使用的病毒基因或病毒蛋白。可替代地，表达文库可以用于通过检测用抗血清或针对来自另一物种或其部分的病毒的经纯化的抗体免疫的同源物来克隆病毒、其多态变体、直系同源物或等位基因。
[0189]
用于制备和筛选cdna文库的方法在本领域中是众所周知的。例如，为了制备cdna文库以克隆由基因组表达的病毒基因，可以使用逆转录酶将mrna逆转录为cdna。然后可以将cdna连接到载体，如重组载体中，并引入到宿主细胞或生物体中以进行繁殖、筛选和克隆。
[0190]
对于基因组文库，dna可以从期望的组织中提取，并且可以使用生物酶消化或可以机械剪切。然后可以从不期望的dna片段中分离所得dna片段，并构建到合适的载体中，然后可以将其在体外包装。可以通过本领域已知的任何方法分析重组载体。
[0191]
如聚合酶链式反应(pcr和rt-pcr)和连接酶链式反应(lcr)等方法可以用于直接从mrna、cdna、基因组文库或cdna文库中扩增核酸序列。可以使用本文所提供的序列设计简并寡核苷酸以扩增同源物。限制性核酸内切酶位点可以掺入到引物中。聚合酶链式反应或其它体外扩增方法还可以是有用的，例如，克隆编码要表达的蛋白质的核酸序列，使核酸用作探针以检测要靶向的疾病，如mdv、ndv和/或ibdv的存在，编码生物样品中的mrna，用于核酸测序或用于其它目的。通过pcr扩增的基因可以从琼脂糖中纯化并克隆到合适的载体中。
[0192]
病毒基因的表达还可以通过本领域已知的技术来分析，例如，mrna的逆转录和扩增、总rna或polya rna的分离、northern印迹、斑点印迹、原位杂交、rnase保护、高密度多核苷酸阵列技术等。
[0193]
编码病毒基因组或蛋白质的核酸可以用于高密度寡核苷酸阵列技术(例如，genechip
tm
)以鉴定本发明中的病毒基因、直系同源物、等位基因、其变体和多态变体。在转化到原核细胞或真核细胞中以用于复制和/或表达之前，可以将所选基因克隆到中间载体中。这些中间载体可以是原核生物载体，例如，质粒或穿梭载体。
[0194]
核酸修饰
[0195]
本领域技术人员熟知的许多方法可以用于分离和操纵dna分子。例如，聚合酶链式反应(pcr)技术可以用于扩增特定起始dna分子和/或产生起始dna分子的变体。dna分子或其片段还可以通过本领域已知的任何技术获得，包含通过化学手段直接合成片段。因此，可以合成如本文所描述的核酸的全部或一部分。
[0196]
如本文所使用的，术语“互补核酸”是指能够彼此特异性杂交的两个核酸分子，其中所述两个分子可以形成反平行的双链核酸结构。在这方面，如果核酸分子表现出完全互补性，则其被认为是另一个核酸分子的互补物。如果两个分子可以在足以允许其在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火的稳定性下彼此杂交，则所述两个分子被认为“最低限度地互补”。类似地，如果分子可以在足以允许其在常规的“高严格”条件下保持彼此退火的稳定性下彼此杂交，则所述两个分子被认为是“互补的”。常规的严格条件由sambrook等人(1989)和haymes等人(1985)描述。
[0197]
从完全互补偏离是允许的，只要分子形成双链结构的能力保持不变。因此，为了使核酸分子或核酸分子的片段充当引物或探针，此类分子或片段仅需要在序列上充分互补以能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
[0198]
如本文所使用的，术语“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”用于描述两个或更多个核苷酸序列之间的序列关系。两个序列之间的“序列同一性”的百分比通过在具体数量的核苷酸内比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列相比，比较窗口中的序列的部分可以包括添加或缺失(即，空位)。如果每个位置处的核苷酸都相同，则两个序列被认为相同。当在5'到3'方向上观察时，如果第一核苷酸序列表现出与第二序列或参考序列完全互补，则所述核苷酸序列被认为在3'到5'方向上是第二核苷酸序列的“互补物”或与其互补。如本文所使用的，当读取5'到3'的序列之一的每个核苷酸与在读取3'到5'时的另一个序列的每个核苷酸互补时，核酸序列分子被认为表现出“完全互补性”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将显示出与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。
[0199]
重组载体和宿主细胞
[0200]
重组dna载体可以是例如线性或环状质粒。载体系统可以是单个载体或质粒或一
起含有要引入到宿主细胞的基因组中的总dna的两个或更多个载体或质粒。如本文所描述的重组载体可以是表达载体，例如以能够在如细菌细胞等宿主细胞中产生期望的蛋白质。如本文所描述的核酸分子或其互补物或片段可以在合适的启动子控制下插入到载体中，所述启动子在一种或多种微生物宿主中起作用以驱动连接的编码序列或其它dna序列的表达。为此目的，许多载体是可用的并且在本领域中是已知的，并且合适的载体的选择取决于要插入到载体中的核酸以及要用载体转化的宿主细胞的大小。根据其功能(例如，dna的扩增或dna的表达)和与其相容的特定宿主细胞，每个载体可以含有各种组分。用于细菌转化的载体组分通常包含但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个可选择标志物基因和允许外源dna表达的诱导型启动子。
[0201]
如本文所使用的，“重组马立克氏病病毒”或“重组hvt”或“重组病毒”表示已通过将一种或多种异源核酸序列掺入到病毒基因组中而被基因修饰的感染性病毒或病毒颗粒，即编码与病毒中天然存在的基因的核酸序列不同的病毒基因或其片段或部分的dna。在重组马立克氏病病毒感染细胞时，重组病毒以异源多肽的形式表达异源基因。
[0202]
如本文所使用的，“重组病毒载体”或“病毒载体”是指插入到病毒中以引入到宿主细胞中的重组构建体。根据本发明的此类载体可以源自任何hvt病毒株。适当时，可以将病毒基因或蛋白质编码序列掺入到如本文所描述的此类重组病毒载体中，以引入到鸡或其它家禽中以预防一种或多种病毒性疾病。
[0203]
如本文所使用的，“插入位点”是指病毒基因组中的转基因或外源dna插入到其中的区。本发明的插入位点可以是基因间区。根据本发明的基因间区可以侧接基因组的独特长区中的hvt ul35和hvt ul36。在本发明的一些实施例中，还可以将编码抗原的一种或多种异源核苷酸插入到由hvt基因组的ul55基因座定义的区中。在一些实施例中，本发明的插入位点可以包含基因间区任一侧上的侧接基因的全部或一部分。将一个或多个转基因插入到这些区之一中能够产生重组病毒载体，然后可以将其引入到鸡或其它家禽中以预防一种或多种疾病。
[0204]
如本文所使用的，当关于调控序列和核苷酸序列使用时，术语“可操作地连接”意指调控序列引起连接的结构核苷酸序列的受调控表达。术语“调控序列”、“调控元件”或“控制元件”是指定位于结构核苷酸序列上游(5'序列)、内部或下游(3'序列)的核苷酸序列。此类序列影响相关结构核苷酸序列的转录、rna加工或稳定性或翻译的定时和水平或量。调控序列可以包含但不限于启动子、前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏子结合序列和多腺苷酸化识别序列，包含但不限于牛生长激素polya信号、猿猴病毒40(sv40)polya信号、苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)核型多角体病毒(acnpv)1629orf poly(a)信号和单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶(tk)polya信号。本领域技术人员将认识到启动子和/或调控元件的不同组合可以用于增加或降低如本文所描述的转基因的表达。
[0205]
在不同物种中起作用的启动子也是本领域熟知的。可用于多肽的表达的启动子包含诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子或组成型启动子和/或是组织特异性的、时间调控的、空间调控的和空间时间调控的启动子。例如，根据本发明有用的启动子可以包含但不限于即刻早期(ie)巨细胞病毒(cmv)启动子；豚鼠cmv启动子；sv40启动子；伪狂犬病病毒启动子，如糖蛋白x启动子；单纯疱疹病毒-1，如α4启动子；马立克氏病病毒启动子，包含mdv的任何分离物或病毒株，如mdv-1、mdv-2和hvt，例如，控制糖蛋白的表达的启动子，如gc、gb、
ge或gi；传染性喉气管炎病毒启动子，如糖蛋白gb、ge、gi、gd基因的启动子；或任何其它合适的启动子。本领域技术人员将知道如何鉴定根据本发明的有用的启动子。
[0206]
根据本发明，如本文所描述的重组马立克氏病病毒或重组病毒载体可以包括与一个或多个启动子操作性地连接的一个或多个转基因，以用于表达一种或多种病毒蛋白或肽或其片段或部分。在一些实施例中，单个转基因可以与单个启动子操作性地连接，或者多于一个转基因可以与单个启动子操作性地连接。在其它实施例中，重组载体中可以存在多于一个转基因，其中第一转基因与第一启动子操作性地连接，第二转基因与第二启动子操作性地连接。
[0207]
载体的构建和选择
[0208]
如本文所描述的含有一种或多种组分的载体的构建是本领域技术人员已知的并且可以使用标准重组dna技术，所述构建用于将基因或转基因或其部分插入到靶位点中。重组dna载体或构建体可以包括赋予细胞可选择表型的可选择标志物。可选择标志物还可以用于选择含有编码如本文所描述的多肽或蛋白质的外源核酸的细胞。此类标志物可以编码例如杀生物剂抗性或抗生素抗性(例如，卡那霉素、g418、博来霉素、潮霉素等)。可选择标志物是本领域技术人员熟知的，并且可以包含适于根据本发明使用的任何标志物。
[0209]
重组载体或构建体还可以包含可筛选标志物，其可以用于监测表达但不会导致细胞死亡。合适的可筛选标志物可以包含例如β-葡萄糖醛酸酶或uida基因(gus)；各种荧光蛋白基因中的一种或多种，如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)；或在特性波长处发出荧光的蛋白质的大家族中的任一个；编码各种显色底物是已知的酶的基因；荧光素酶基因；xyle基因，其编码转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；β-淀粉酶基因；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化成dopa和多巴醌，进而浓缩成黑色素的酶；或α-半乳糖苷酶，其催化显色的α-半乳糖底物。
[0210]
蛋白质在宿主细胞中的表达
[0211]
为了获得如本文所描述的克隆病毒基因的高水平表达，可以将核酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的强启动子和转录/翻译终止子。对于经编码的蛋白质，还可以包含用于翻译起始的核糖体结合位点。用于表达载体的合适启动子是本领域熟知的，如细菌启动子、病毒启动子等。用于表达蛋白质的表达系统可在本领域已知的若干种原核物种和真核物种中获得。用于此类表达系统的商业试剂盒也很容易获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域是众所周知的并且也是可商购获得的。
[0212]
选择合适的启动子来指导异源核酸的表达将取决于特定应用。此类启动子可以定位于距异源转录起始位点一定距离处，所述距离与其自然环境中的距离类似，尽管本领域技术人员将理解，在不损失启动子功能的情况下，可以允许此距离有一些变化。
[0213]
除了启动子之外，表达载体通常含有转录盒或表达盒，其含有核酸在宿主细胞中表达所需的所有元件。本领域已知的可用于在真核细胞或原核细胞中表达的任何常规载体都可以用于将遗传信息转运到细胞中。因此，典型的表达盒含有与编码所选核酸的核酸序列可操作地连接的启动子和高效加工，例如核糖体结合位点、多腺苷酸化和翻译终止所需的对应信号。另外的元件可以包含增强子，并且对于作为结构基因的基因组dna的情况，包含具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
[0214]
除了启动子序列，如本文所列出的启动子之外，表达盒还可以含有结构基因下游
的转录终止区，以提供高效的转录终止。终止区可以来自与启动子序列相同的基因，或者可以来自不同的基因。如荧光蛋白、绿色或红色荧光蛋白、β-gal、cat等标志物可以包含在载体中作为载体转导的标志物。还可以将表位标签或序列标签添加到重组蛋白中以提供方便的分离方法。
[0215]
含有来自真核病毒的调控元件的表达载体通常用于真核表达载体，例如，sv40载体、乳头状瘤病毒载体、逆转录病毒载体和源自爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)的载体。其它示例性真核载体包含pmsg、pav009/a 、pmto10/a 、pmamneo-5、杆状病毒pdsve，以及任何其它在cmv启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子(rous sarcoma virus promoter)、多角体蛋白启动子或其它本领域已知的可以在真核细胞中有效表达的启动子的指导下允许蛋白质表达的载体。
[0216]
还可以使用诱导型启动子调控来自真核载体的蛋白质的表达。在诱导型启动子的情况下，通过将这些药剂的应答元件掺入到启动子中，表达水平与诱导剂，如四环素或蜕皮激素的浓度有关。在存在诱导剂的情况下，可以从诱导型启动子获得高水平的表达。一些表达系统具有提供基因扩增的标志物，如胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。
[0217]
表达载体还可以包含在大肠杆菌中起作用的复制子、用于选择携带重组质粒的细菌的抗生素抗性基因以及在质粒非必需区中的允许插入真核序列的独特限制性位点。可以采用适于本发明的任何抗生素抗性基因。
[0218]
本领域已知的标准转染方法可以用于产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系。然后可以使用本领域已知的标准技术纯化此类细胞系，并且可以根据本领域已知的用于将克隆的基因组dna、cdna、合成dna或其它外源遗传物质引入到宿主细胞中的任何方法转化原核和/或真核细胞。此类方法可以包含但不限于质粒或病毒载体、磷酸钙转染、原生质体融合、电穿孔、基因枪、脂质体、显微注射或本领域可用的任何方法。
[0219]
在将表达载体或转基因引入到宿主细胞中之后，然后可以在最佳表达期望的蛋白质的条件下培养细胞，可以使用本领域已知的标准技术来回收。然后可以纯化如本文所描述的病毒病原体或病毒蛋白以用于诊断测定，用于制备抗体和免疫原性组合物以及用于鉴定抗病毒化合物。天然存在的蛋白质可以从生物样品中纯化，如来自如本文所描述的感染病毒的鸟类的组织样品，而重组蛋白可以使用本领域已知的任何合适的方法或表达系统来纯化。
[0220]
多种用于纯化重组蛋白的程序在本领域中是可用的。例如，具有确定的分子粘附特性的蛋白质可以可逆地与另一种蛋白质融合。另外，特异性蛋白质可以选择性地吸附到纯化柱，并且然后使用适当的配体或底物以相对纯的形式从柱中释放。然后可以通过酶活性去除融合蛋白。还可以使用亲和柱纯化蛋白质。重组蛋白可以从任何合适的来源纯化。
[0221]
从重组细菌中纯化蛋白质
[0222]
重组蛋白可以由细菌大量表达，例如使用诱导型启动子或组成型启动子。使用iptg进行启动子诱导是诱导型启动子系统的实例。根据本领域已知的标准程序，可以从新鲜或冷冻培养物中培养细菌。
[0223]
在细菌中表达的蛋白质可以形成被称为包涵体的不溶性聚集体。用于纯化蛋白质包涵体的合适方案是本领域已知的。可以使用本领域已知的任何方法进行细菌裂解以回收
表达的蛋白质，所述方法可以包含引入化学缓冲液、超声处理、机械破坏等。还可以溶解包涵体，并且可以将裂解的细胞悬浮液离心以去除不想要的细胞碎片。包涵体蛋白可以通过用适当的缓冲液稀释或透析来复性。
[0224]
重组蛋白还可以从细菌周质中获得。在细菌细胞裂解之后，可以通过本领域已知的任何方法分离细菌的周质部分。上清液中存在的重组蛋白可以通过本领域技术人员熟知的标准分离技术与宿主蛋白分离。
[0225]
可以使用本领域已知的任何技术分离蛋白质，例如溶解度分馏或尺寸差异过滤，其基于分子量使用通过不同孔径的膜的过滤来分离蛋白质。基于大小、净表面电荷、疏水性或对配体或底物的亲和力，柱色谱法可以用于从其它蛋白质中分离蛋白质。另外，针对所关注的蛋白质产生的抗体可以与柱缀合，并对蛋白质进行免疫纯化。所有这些方法在本领域中都是众所周知的。对本领域技术人员而言显而易见的是，色谱技术可以以任何规模并使用任何合适的商业设备进行。
[0226]
抗体产生
[0227]
产生与病毒蛋白、病毒颗粒和/或核酸特异性反应的多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域已知的。此类技术可以包含通过从噬菌体或其它载体中的重组抗体文库中选择抗体来制备抗体，以及通过对兔或小鼠进行免疫来制备多克隆抗体和单克隆抗体。
[0228]
包括病毒蛋白或其部分、病毒颗粒和/或核酸的多个抗原或抗原区可以用于产生与期望的病毒病原体特异性反应的抗体。例如，可以使用本文所描述的或本领域已知的任何方法分离重组病毒蛋白或其抗原性片段。重组蛋白可以在原核细胞或真核细胞中表达并如本文所描述地纯化。单克隆抗体和/或多克隆抗体可以使用本领域已知的方法使用(以纯的或不纯的形式)天然存在的蛋白或重组蛋白来产生。源自病毒序列的合成肽还可以用于产生抗体，并且可以与载体蛋白缀合并注射到能够产生抗体的动物(例如，兔)中。
[0229]
产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用本领域已知的标准免疫方案，使用标准佐剂，如本文所描述的佐剂用蛋白质免疫小鼠或兔的近交品系。当获得适当高滴度的蛋白质抗体时，可以制备抗血清，并进行富集以获得与蛋白质反应的抗体。
[0230]
单克隆抗体还可以通过本领域已知的各种方法获得。例如，来自用期望的抗原免疫的动物的脾细胞可以永生化，通常通过与骨髓瘤细胞融合或通过用爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)、癌基因或逆转录病毒转化或本领域熟知的其它方法。然后可以筛选永生化细胞以产生对抗原具有期望的特异性和亲和力的抗体。通过本领域已知的各种技术，例如通过注射到脊椎动物宿主的腹膜腔中，可以提高由此类细胞产生的单克隆抗体的产量。
[0231]
可以将单克隆抗体和多克隆血清收集，并在免疫测定中针对期望的抗原或蛋白质进行滴定，例如，将蛋白质固定在固体载体上的固相免疫测定。还可以通过减去其它交叉反应蛋白质来制备仅对特定病毒蛋白具有特异性的抗体。以这种方式，可以获得仅与所选蛋白质结合的抗体。
[0232]
一旦针对期望的病毒抗原如蛋白质、病毒和/或核酸的特异性抗体可用，可以使用多种免疫测定方法检测期望抗原。抗体还可以用于治疗。
[0233]
可以使用多种公认的免疫结合测定中的任一种来检测与本文所描述的病毒颗粒相关或不同的蛋白质和/或对所述蛋白质进行定量。病毒颗粒可以基于由如存在于病毒颗
粒中的病毒蛋白定义的表位和/或由与病毒颗粒分离的病毒蛋白定义的表位来检测(例如，如可以存在于受感染的细胞中)。免疫学测定可以使用与所选蛋白质或抗原特异性结合的抗体。可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中的任一种来产生抗体。免疫测定还可以使用标记剂以与由抗体和抗原形成的复合物特异性结合以用于检测目的。标记剂本身可以是包括抗体/抗原复合物的部分之一。因此，标记剂可以是经标记的病毒蛋白核酸或经标记的抗病毒抗体。可替代地，标记剂可以是与抗体/抗原复合物特异性结合的第三部分，如二级抗体。次级抗体可以对初级抗体所源自的物种的抗体具有特异性。标记剂可以用可检测部分修饰，如生物素，所述可检测部分可以与另一个分子，如链霉抗生物素蛋白特异性结合。多种可检测部分为本领域技术人员所熟知。
[0234]
用于检测样品中的病毒蛋白、病毒和/或核酸的免疫测定是本领域众所周知的。此类测定可以是竞争性的或非竞争性的，并且可以是定量的或非定量的。非竞争性免疫测定是可以直接检测抗原并且在某些情况下直接测量抗原量的测定。在竞争性测定中，样品中存在的病毒抗原通过与已知的添加(外源)病毒抗原相关的可检测信号间接检测，所述病毒抗原通过样品中存在的病毒抗原从抗病毒抗原抗体中置换。以这种方式，此类测定还可以适于提供间接测量样品中存在的病毒抗原量。竞争性结合免疫测定还可以用于确定交叉反应性，其中可以从合并的抗血清中去除任何交叉反应性抗体。根据本发明，还可以使用其它测定类型，包含但不限于蛋白质印迹或脂质体免疫测定。
[0235]
本领域技术人员将理解，通常期望在免疫测定中最小化非特异性结合。具体地，在测定涉及固定在固体底物上的抗原或抗体时，期望尽量最小化与底物的非特异性结合量。减少此类非特异性结合的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0236]
如本文所描述的测定可以包含不显著干扰测定中使用的抗体的特异性结合的标记或可检测基团。可检测基团可以是具有可检测物理或化学特性的任何材料。此类可检测标记在本领域中是已知的，并且通常在此类方法中有用的任何标记都可以应用于本发明。因此，如本文所使用的，“标记”可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。本发明中有用的标记可以包含磁珠(例如，dynabeads
tm
)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如，3h、
125
1、
35
s、
14
c或
32
p)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和/或本领域已知并用于elisa的任何其它酶)和比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。
[0237]
根据本领域公知的方法，根据本发明的标记可以直接或间接地与测定的期望的组分偶联。如上文所描述的，可以使用多种标记，其中标记的选择取决于灵敏度、易于与化合物缀合、稳定性要求或可用的仪器等。
[0238]
可以通过间接手段将非放射性标记附接。通常，配体分子(例如，生物素)与分子共价结合。然后配体可以与另一个分子(例如，链霉亲和素)结合，所述分子可以是固有可检测的或与信号系统共价结合的，如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。配体和其对应靶标可以与识别病毒抗原的抗体或识别抗病毒抗原的次级抗体以任何合适的组合使用。分子还可以直接与产生信号的化合物缀合，例如通过与酶或荧光团结合。要用作标记的所关注的酶可以是水解酶，例如磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化酶，如过氧化物酶。荧光化合物可以包含荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物可以包含荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮，例如，鲁米诺(luminol)、或本领域已知的其它化合物。
[0239]
检测标记的手段为本领域技术人员所熟知，并且将取决于所使用的标记的类型。例如，放射自显影可以用于检测放射性标记，或者荧光染料可以用于检测荧光标记。荧光可以视觉检测，例如通过如电荷耦接装置(ccd)或光电倍增管等电子检测器。类似地，酶标记可以通过提供酶的适当底物并检测所得反应产物来进行检测。可以通过观察与特定标记相关的颜色来检测比色标记或化学发光标记。在一些实施例中，测定格式可能不需要使用经标记的组分，而是可以通过简单的目视检查来检测。
[0240]
药物/免疫原性组合物及其施用
[0241]
在一些方面，如本文所描述的包括表达一种或多种病毒蛋白或肽或其片段的一种或多种转基因的重组载体可以用作用于施用于如鸡或其它家禽等受试者以提供预防一种或多种病毒的药物组合物或免疫原性组合物。例如，如本文所描述的免疫原性组合物包括一种重组载体，所述重组载体具有如本文所描述的一种或多种转基因，所述一种或多种转基因插入到病毒基因组中，例如，插入到侧接hvt基因组的独特长(ul)区中的基因间基因座ul 35/ul 36的基因间区中。在一方面，本发明提供一种重组火鸡疱疹病毒(hvt)基因组，所述hvt基因组包括：编码一种或多种异源抗原的插入到所述hvt基因组的独特长区中的基因间基因座ul 35/ul 36中的一个或多个核苷酸序列；以及编码一种或多种异源抗原的插入在所述hvt基因组的独特长区(ul)中的ul55位点处的一个或多个核苷酸序列。
[0242]
在其它方面，可以将蛋白质或肽及其免疫原性片段和/或多核苷酸以及抗病毒抗体和/或t细胞掺入到药物组合物或免疫原性组合物(例如，疫苗)中。在另一个实施例中，根据本发明的免疫原性组合物可以至少包括第三转基因、第四转基因等，其可以编码另外的病毒蛋白。以这种方式，有可能向如家禽等受试者提供免疫原性组合物，其提供预防任何期望数量的病毒。全病毒疫苗(活的和减毒的、或复制无能的或灭活的)或亚基疫苗，如其结构或非结构病毒蛋白或其免疫原性片段可以用于通过在受试者中引起免疫应答来治疗或预防病毒感染。可替代地，药物组合物可以包括用病毒多核苷酸转染的抗原呈递细胞，使得抗原呈递细胞表达病毒肽。
[0243]
可以设计根据本发明的免疫原性组合物以在受试者中产生抗体免疫和/或细胞免疫。此类组合物可以包括一种或多种此类化合物以及非天然存在的药学上可接受的载体。在其它实施例中，根据本发明的免疫原性组合物可以包含多于一种佐剂或药学上可接受的载体，使得至少一种是非天然存在的。药学上可接受的载体或佐剂可以是增强受试者对外源抗原的免疫应答的任何物质，包含但不限于佐剂、脂质体、可生物降解微球。药学上可接受的载体或佐剂可以含有被设计成保护抗原免于快速分解代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，或者免疫应答的刺激剂，如源自百日咳博德氏杆菌(bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)的蛋白质。可商购获得的佐剂可以包含例如弗氏不完全佐剂(freund's incomplete adjuvant)和完全佐剂、默克佐剂65、铝盐，如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；cpg寡核苷酸、钙、盐或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解微球；以及单磷酰脂质a。本领域技术人员将能够鉴定用于本发明的合适的药学上可接受的载体。
[0244]
本发明范围内的药物组合物或免疫原性组合物和/或疫苗还可以含有其它化合物，其可以是生物活性的或无活性的。例如，在根据本发明的组合物或疫苗中，可以存在其它抗原的掺入到融合多肽中或作为单独的化合物的一个或多个免疫原性部分。在一些实施
例中，可用于本发明的多肽可以与其它大分子缀合。药物组合物或免疫原性组合物和疫苗通常可以用于预防和/或治疗目的。例如，根据本发明，可以在感染或暴露于病毒之前将如本文所描述的组合物提供给如鸟类等受试者，以便提供预防一种或多种病毒感染或患上感染的症状。在其它实施例中，可以在感染或暴露于一种或多种病毒之后将此类组合物提供给如鸟类等受试者，以在受试者中提供对病毒的治疗，如通过减少或消除受试者体内的感染。
[0245]
本文所描述的编码病毒的基因组、结构或非结构蛋白或其片段的核酸疫苗还可以用于引起免疫应答以治疗或预防病毒感染。许多基因递送技术在本领域中是众所周知的。适当的核酸表达系统可以含有在受试者中表达所需的dna序列(如合适的启动子和终止信号)。在一些实施例中，如本文所描述的dna可以使用病毒表达系统(例如，马立克氏病病毒或hvt)来引入，这可以涉及使用非致病性有复制能力的病毒。
[0246]
药物组合物或免疫原性组合物可以在单剂量或多剂量容器中提供，如密封的安瓿瓶或小瓶。此类容器可以密封以保持组合物的无菌性直至使用。通常，如本文所描述的组合物可以作为悬浮液、溶液或乳液储存在油性或水性媒剂中。可替代地，此类组合物可以在冷冻干燥条件下储存，从而仅需要在使用前立即添加无菌液体载体。
[0247]
如本文所描述的，免疫原性组合物可以与药学上可接受的载体组合。合适载体的选择可以部分地由所施用的特定组合物(例如，核酸、蛋白质、调节化合物或经转导的细胞)以及通过用于施用组合物的特定方法来确定。因此，可获得可以用于本发明的药物或免疫原性组合物的多种合适的调配物。可以以任何方便的方式施用，例如通过注射、口服施用、吸入、经皮应用或直肠施用。如本文所描述的重组载体或免疫原性组合物的注射可以单次施用或以单剂量，或者可以多于一次，如以重复剂量施用提供给如家禽等受试者。
[0248]
适于肠胃外施用，例如通过关节内(关节内)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、卵内和皮下途径的调配物包含可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂的水性和非水性等渗无菌注射溶液和使调配物与预期受试者的血液等渗的溶质以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。在本发明的实践中，组合物可以例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内施用。
[0249]
此类组合物还可以包括缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或如甘氨酸等氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、如edta或谷胱甘肽等螯合剂、佐剂(例如，氢氧化铝)、与受试者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可替代地，本发明的组合物可以被调配成冻干物。还可以使用本领域已知的方法将化合物包封在脂质体中。
[0250]
如本文所描述的，可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备注射溶液和悬浮液。用于离体疗法的由核酸转导的细胞也可以如上文所描述的静脉内或肠胃外施用。如本文所描述的注射可以涉及如本文所描述的灭活(killed/inactivated)、减毒或其它无毒力的病毒培养物、经纯化或未纯化的病毒蛋白溶液或核酸的一种或多种的悬浮液。注射溶液还可以含有如本文所描述的药学上可接受的载体。
[0251]
适于口服施用的调配物可以由以下组成：(a)液体溶液，如悬浮在如水、盐水或peg 400等稀释剂中的有效量的包装病毒蛋白或核酸；(b)胶囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分，为液体、固体、颗粒剂或明胶；(c)于适当液体中的悬浮液；或者(d)合适的乳液。片
剂形式可以包含以下中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。锭剂形式可以包括呈调味剂，例如蔗糖的形式的活性成分，以及包括呈惰性基质的形式的活性成分的糖锭，除活性成分之外，本领域已知的含有如明胶和甘油或蔗糖和金合欢乳液、凝胶等的载体。
[0252]
单独或与其它合适的组分组合的所选化合物可以制备成要通过吸入施用的气溶胶调配物。气雾剂调配物可以放置到加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
[0253]
在本发明的上下文中，施用于受试者的剂量应足以随时间推移而影响受试者的有益治疗应答。剂量将由所采用的特定载体的功效和受试者的病状，以及要治疗的患者的体重和/或表面积来确定。剂量的大小还可以由在特定患者中伴随特定载体或经转导的细胞类型的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。对于包括如本文所描述的载体的组合物，要施用的载体的有效量可以部分地基于载体的循环血浆水平、载体毒性、受试者的健康和抗载体抗体的产生来确定。
[0254]
对于施用，如应用于受试者的质量和整体健康状况，本发明的化合物和经转导的细胞可以以由抑制剂、载体或经转导的细胞类型的ld-50以及抑制剂、载体或细胞类型在各种浓度下的副作用所确定的速率施用。施用可以通过单次、多次或分开的剂量来实现。
[0255]
多肽和核酸的免疫学检测
[0256]
免疫测定可以用于检测病毒蛋白、病毒颗粒和/或核酸。此类测定可用于治疗和/或诊断应用，如本文所描述的那些。免疫测定在本领域中是众所周知的并且可以用于定性或定量分析蛋白质、病毒颗粒和/或核酸。
[0257]
病毒蛋白和病毒抗原抗体的测定
[0258]
在本发明的一个实施例中，样品中的如本文所描述的病毒、病毒核酸或病毒蛋白的存在可以通过免疫测定来确定。酶介导的免疫测定，如免疫荧光测定(ifa)、酶联免疫吸附测定(elisa)、捕获测定、微凝集测试和免疫印迹测定(例如，蛋白质印迹)可以很容易地适于完成病毒或病毒蛋白的检测。elisa方法可以有效用于检测如本文所描述的病毒或病毒蛋白。例如，此类elisa可以具有以下步骤：(1)将抗病毒抗体或抗原与底物结合；(2)使结合的受体与含有病毒、病毒抗原、病毒蛋白或病毒抗体的生物样品接触；(3)使生物样品与和可检测部分(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)结合的抗体接触；(4)使生物样品与酶的底物接触；(5)使生物样品与如显色试剂等检测试剂接触；(6)观察可检测的结果。在一些实施例中，适于此类elisa的生物样品可以是血液或其它流体。在另一个实施例中，如本文所描述的elisa可以检测组织样品中的病毒或病毒蛋白。技术人员可以容易地修改此类方法以检测样品中抗病毒抗体或特异性病毒蛋白以及病毒的存在。在某些实施例中，根据本发明的elisa可以检测抗病毒抗体的存在。
[0259]
如本文所描述的elisa测定可以包含用如本文所描述的病毒蛋白浸渍的硝酸纤维素条。当与含有抗病毒核蛋白抗体的测试样品接触时，硝酸纤维素条可能会产生视觉结果。此类测试可以鉴定已经具有针对病毒蛋白的抗体的受试者，并且因此所述受试者可能对病毒具有免疫力。在此类受试者中可能不需要施用如本文所描述的免疫原性组合物以预防病
毒感染，并且因此，鉴定已经具有免疫原性抗体的受试者可以预防向此类受试者不必要地施用免疫原性化合物。在此方面，本发明的一个实施例可以涉及使用如本文所描述的如elisa测定等测定来鉴定缺乏抗病毒抗体的受试者，并且然后向所述受试者提供如本文所描述的免疫原性组合物以预防病毒感染。在另一个实施例中，用于根据本发明的elisa的硝酸纤维素条可以浸渍有抗体，如抗病毒抗体，并且当与含有病毒蛋白的测试样品接触时可以产生视觉结果。此类测试可以鉴定感染了如本文所描述的病毒的受试者。
[0260]
另一种可用于检测病毒的免疫学技术是竞争性抑制测定。这种测定利用与具体病毒反应的单克隆抗体(mab)。来自受试者的生物流体(例如，血液)可以与结合到底物的第一抗体接触，并且经标记的单克隆抗体与第一抗体-病毒复合物接触。相对于对照，测量单克隆抗体结合的抑制量。
[0261]
如本领域技术人员将容易理解的，用于上述测定的生物样品可以直接从受试者取出或可以是部分纯化的形式。对特定病毒具有特异性的抗体将通过与病毒结合进行反应作为初级反应。此后，还可以添加与结合到或标记有可检测部分的抗体的次级反应，以增强对初级反应的检测。通常，在次级反应中，将选择与病毒的不同结合位点(表位)特异性或非特异性反应的抗体或其它配体，因为其具有与抗体和病毒复合物上的多个位点反应的能力。因此，例如，次级反应中的若干个抗体分子可以与通过初级反应形成的每个复合物发生反应，从而使初级反应更易于检测。
[0262]
可检测部分可以允许对沉淀物或颜色变化进行视觉检测，通过显微术进行视觉检测，或者通过光谱法、辐射测量等进行自动检测。可检测部分的实例包含荧光素和罗丹明(用于荧光显微术)、辣根过氧化物酶(用于光学或电子显微镜和生化检测)、生物素-链霉亲和素(用于光学或电子显微术)和碱性磷酸酶(用于通过颜色变化进行生化检测)。所使用的检测方法和部分可以选自例如本文公开的或本领域可用的任何方法。
[0263]
检测病毒核酸的存在
[0264]
在一些实施例中，如本文所描述的病毒感染可以基于生物样品中特定rna或dna的水平来检测。来自特定病毒或病毒病原体的引物可以用于检测、诊断和确定病毒的存在。使用本领域已知的任何合适的方法，可以使用任何合适的引物来检测基因组dna或其中的任何序列、开放阅读框或基因或所选蛋白质。合适的核酸序列可以用作单链或双链探针或引物，以用于检测如可以存在于生物样品中的由其产生的病毒mrna或cdna。如本文所描述的病毒多核苷酸还可以用于产生多核苷酸的另外的拷贝，以产生反义寡核苷酸或作为形成三链的寡核苷酸。例如，两种寡核苷酸引物可以用于基于pcr的测定以扩增源自生物样品的病毒cdna的一部分，其中寡核苷酸引物中的至少一种寡核苷酸引物对病毒多核苷酸具有特异性(即，与其杂交)。此类引物可以是足以与本文所描述的病毒核酸杂交并能够扩增的任何长度，包含至少或约10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸或50个核苷酸；或者长度为约12个到约50个核苷酸，长度为15个到30个核苷酸，长度为15个到25个核苷酸或长度为20个到30个核苷酸。适于本发明的dna引物可以是本文所描述的任何引物，如seq id no:40-157所示的那些。
[0265]
然后可以使用本领域熟知的技术，如凝胶电泳来分离和检测经扩增的核苷酸，例如cdna。类似地，与病毒多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸探针可以用于杂交测定以检测生物样品中的病毒多核苷酸的存在。
[0266]
可以使用本文所公开的多核苷酸序列产生如本文所描述的对病毒具有特异性的核酸探针或引物。探针优选地为至少约12个、15个、16个、18个、20个、22个、24个或25个核苷酸片段或编码病毒核酸或多肽的其它多核苷酸序列。核酸探针的长度可以小于约200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、60bp、40bp、30bp、25bp、2kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.25kb、0.1kb或0.05kb。探针可以通过例如化学合成、pcr扩增、使用限制酶从更长的多核苷酸产生或本领域熟知的其它方法来产生。本文所描述的多核苷酸还可以用于涉及使用如阵列等固体底物的方法或测定。此类阵列可以具有一种或多种不同的多核苷酸，其可以使用本领域已知的方法固定在阵列上。
[0267]
在一些实施例中，本发明的多核苷酸可以被可检测地标记。可检测标记可以包含但不限于放射性标记、荧光染料，包含异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-fam)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-x-罗丹明(rox)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(hex)、5-羧基荧光素(5-fam)或n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)；放射性标记，如
32
p、
35
s和3h等。在一些实施例中，可检测标记可以涉及多个步骤(例如，生物素-抗生物素蛋白、半抗原-抗半抗原抗体等)。
[0268]
根据本发明，可以使用本领域已知的用于检测特异性病毒核酸(例如，rna或dna)的任何合适的定性或定量方法。如本文所描述的病毒核酸可以通过例如组织切片中的原位杂交、使用检测杂交核酸之间单碱基对差异的方法、通过逆转录酶-pcr或含有poly a mrna的northern印迹或本领域熟知的其它方法来检测。为了检测血液或血液源性样品中的病毒多核苷酸，可以采用允许检测单碱基对错配的方法。
[0269]
病毒核酸序列可以以相对低水平存在于从受感染的个体获得的生物样品中，并且因此本领域已知的扩增技术(例如，pcr)可以用于在进行杂交测定之前扩增序列。
[0270]
核酸探针可以使用如本文所描述的病毒基因组来制备。此类探针可以包含至少约8个或更多个核苷酸，并且可以合成制备或通过从重组多核苷酸中切除来制备。如本文所描述的探针可以与病毒核酸杂交，并且因此此类探针可用于检测生物样品中的特定病毒。如本文所描述的探针还可以用于鉴定受感染的受试者，以及用于病毒基因组的另外的表征。用于检测病毒多核苷酸(天然的或衍生的)的探针可以具有特定长度或具有允许通过杂交检测独特病毒序列的序列。虽然约6-8个核苷酸可能是有用的，但更长的序列可能是优选的，例如，约10-12个核苷酸或约20个或更多个核苷酸的序列。本领域技术人员将知道如何制备和使用如本文所描述的探针。
[0271]
核酸探针可以使用常规方法制备，包含但不限于自动化寡核苷酸合成方法。用于制备此类探针的序列可以包含针对病毒基因组的任何独特部分的互补物，例如允许将特定病毒与可以存在于样品中的其它病毒区分开来的病毒基因组的一部分。如本文所描述的探针可以与所关注的靶序列完全互补或者可以具有一个或多个错配。根据本发明有用的具有多个错配之一的探针仍将与所关注的靶序列杂交。为了将此类探针用作诊断剂，如果需要的话，可以在分析之前对要分析的生物样品进行处理，以提取其中所含的核酸。来自样品的所得核酸可以进行凝胶电泳或其它尺寸分离技术。探针可以用如本文所描述的可检测标记
进行标记。合适的标记和用于标记探针的方法是本领域已知的，并且可以包含本文所描述的任何标记或对本发明有用的其它标记。
[0272]
探针可以与病毒基因组或其部分(例如，与编码如本文所描述的病毒蛋白的序列的全部或一部分)完全互补。可以期望高度严格的条件，以便预防或至少最小化假阳性结果。杂交的严格性可以由杂交和洗涤期间的若干个因素确定，包含温度、离子强度、时间长度和试剂浓度。来自样品的探针或核酸可以在溶液中提供以用于此类测定，或者可以固定到载体(例如，固体或半固体载体)。可以使用的载体的实例包含但不限于硝酸纤维素(例如，膜或微量滴定孔形式)、聚氯乙烯(例如，片材或微量滴定孔)、聚苯乙烯胶乳(例如，珠粒或微量滴定板、聚偏氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、激活的珠粒和蛋白a珠)。
[0273]
在一个实施例中，可以在阵列上提供探针或样品核酸以用于检测。阵列可以通过例如将多核苷酸探针点样到二维矩阵或阵列中的底物(例如，玻璃、硝酸纤维素等)上来创建。探针可以通过共价键或通过如疏水相互作用等非特异性相互作用与底物结合。多核苷酸样品可以被可检测地标记(例如，使用放射性标记或荧光标记)，并且然后与探针杂交。一旦去除了样品的未结合部分，就可以检测到包括与探针多核苷酸结合的经标记的样品多核苷酸的双链多核苷酸。用于构建阵列的技术和使用这些阵列的方法是本领域已知的。阵列可以用于要分析两个或更多个核酸靶区的存在的单个样品。在这种情况下，可以在单个阵列上提供用于每个靶区的探针以及对照(阳性和阴性两者)。阵列因此促进快速且方便的分析。
[0274]
诊断测试和试剂盒
[0275]
本发明进一步提供诊断试剂和包括一种或多种此类试剂的试剂盒，以用于多种诊断测定，包含例如免疫测定，如elisa和“夹层”型免疫测定，以及核酸测定，例如pcr测定。在相关实施例中，可以以流通或条带测试格式进行测定，其中结合剂被固定在如硝酸纤维素等膜上。此类试剂盒可以优选地包含至少第一肽、或本发明的第一抗体或抗原结合片段、其功能片段或其混合物、或第一寡核苷酸对以及用于信号产生的装置。在一些实施例中，试剂盒可以包括免疫原性组合物，如本文所描述的重组病毒。试剂盒中可以包含试剂和其它化合物，如药学上可接受的载体。当在此类试剂盒中提供时，免疫原性组合物可以是溶液，如预先测量的剂量或量，或者可以是干燥的组合物，如呈适于再水合或再悬浮的干燥或冻干形式。试剂盒组分可以预先附着到固相载体上或者可以在使用试剂盒时应用于固相载体的表面。在使用之前，信号产生装置可以与本发明的抗体或核酸预先相关，或者可以需要与一种或多种组分组合，例如缓冲液、核酸、抗体-酶缀合物、酶底物等。
[0276]
试剂盒还可以包含另外的试剂，例如，用于减少与固相表面的非特异性结合的阻断试剂、洗涤试剂、酶底物、酶等。固相表面可以呈微量滴定板、微球或其它适合固定核酸、蛋白质、肽或多肽的材料的形式。催化化学发光产物或显色产物的形成或化学发光底物或显色底物的还原的酶是信号产生装置的此类组分之一。此类酶在本领域中是众所周知的。在试剂盒内包含放射性标记、发色的、荧光的或其它类型的可检测标记或检测装置时，标记试剂可以与诊断或治疗组合物本身在同一容器中提供或者可以可替代地放置在第二不同的容器中，可以将此第二组合物放置在所述第二不同的容器中并适当地等分。可替代地，检测试剂和标记可以在单个容器装置中制备。
[0277]
出于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法的目的，
所有鉴定的专利和其它出版物明确地通过引用并入本文。仅提供这些公开在本技术的提交日期之前的公开内容。
[0278]
通过以下实例进一步说明和支持本发明。然而，这些实例决不应被视为进一步限制本发明的范围。相反，本领域的普通技术人员将容易理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，还存在本发明的其它实施例、修改和等效物。
[0279]
实例
[0280]
实例1：
[0281]
hvt-gfp质粒的构建
[0282]
hvt-绿色荧光蛋白(gfp)-b转移质粒构建
[0283]
hvt-gfp-b转移质粒(seq id no:18)是通过赛默飞世尔公司(thermofisher)的geneart化学合成的。在6孔板中使用ltx转染试剂(英杰公司(invitrogen))将2.5ug质粒转染到二级cef细胞中。约4-6小时后，以0.006moi(1.5
×
104pfu/2.5
×
106个细胞)将经转染的细胞用hvt感染。三天后，将细胞用新鲜cef(1
×
107个细胞/t75)以1:15传代到t75。三天后，将细胞以1:50接种到24孔板上。将来自含有绿色荧光病灶的孔中的细胞与新鲜细胞(6
×
10^4细胞/孔)以1:200、1:500和1:1000的稀释度一起接种到96孔板上。使用96孔板通过有限稀释方法对含有单个绿色病灶的孔进行3轮纯化。使用cef细胞将经纯化的病毒扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-gfp-b”。
[0284]
使用正好在ul55-基因3整合位点外部的引物对三个经纯化的克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:49；下部引物：5'-seq id no:50)得到如所预测的1.893kb的条带。hvt得到如所预期的0.15kb的条带。请参考图1。
[0285]
hvt-gfp-a修饰的转移质粒构建
[0286]
经修饰的转移质粒hvt-gfp-a(seq id no:16)是通过使用两对引物(在gfp基因上游产生sbfi的上部引物对：seq id no:40和seq id no:41；在gfp基因下游产生sbfi的下部引物对：seq id no:42和seq id no:43，均针对通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的原始转移质粒的hvt-gfp-a(seq id no:17))应用位点特异性诱变产生的。使用7.5ul pei(聚乙烯亚胺)将0.01ug经修饰的转移质粒hvt-gfp-a与2.5ug hvt dna共转染到6孔板上的二级cef细胞上。绿色荧光病灶在第1代时变得明显。在通过有限稀释方法进行三轮纯化之后，将hvt-gfp-a的1个克隆进一步扩增并制备冷冻储备液。
[0287]
使用正好在ul35-ul36整合位点外部的引物对经纯化的克隆(左泳道)进行pcr分析(上部引物：seq id no:44；下部引物：seq id no:45)得到如预期的1.922kb条带(图4)。经修饰的转移质粒hvt-gfp-a的dna用作对照(右泳道)。请参考图2。
[0288]
实例2：
[0289]
hvt-ibd构建
[0290]
hvt-ibd#1的构建
[0291]
hvt-ibd#1转移质粒(seq id no:20)是通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的。在6孔板中使用ltx转染试剂(英杰公司(invitrogen))将2.5ug质粒转染到二级cef细胞中。大约4-6小时后，以0.055moi将经转染的细胞用hvt感染。三天后，将细胞用新鲜cef(1
×
107个细胞/t75)以1:7.5传代到t75。然后将细胞接种到96个孔板中的10个上，并在三天后制备重复的板。将一组板固定并用抗ibdv鸡血清染色。鉴定了含有ibd阳性染色病灶的两个
孔。使用96孔板通过有限稀释方法对含有阳性染色病灶的对应孔进行三轮纯化。使用cef细胞将经纯化的病毒扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-ibd#1”。
[0292]
使用正好在ul55-基因3整合位点外部的引物对不同克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:46；下部引物：seq id no:47，图a)得到2.414kb的条带，而原始载体的pcr条带为1.922kb。正确整合通过使用插入的下游接合点周围的引物(定位于ibdv vp2编码区内的上部引物seq id no:48；定位于转移质粒下游的下部引物seq id no:49，图b)来进一步确认。获得了如所预期的1.118kb的pcr条带。上游整合位点的正确整合是使用插入的上游接合点周围的引物(定位于转移质粒的上游的上部引物seq id no:50；位于ibdv vp2编码区内的下部引物seq id no:51，图c)进行。获得了如所预期的1.428kb的pcr条带。请参考图3a、b和c。
[0293]
hvt-ibd#5的构建
[0294]
hvt-ibd#5转移质粒(seq id no:21)是通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的。使用ltx转染试剂(英杰公司)将6孔板中的jbj-1细胞(鸡成纤维细胞系)用2.5ug质粒转染。转染后大约5小时，以0.05moi将经转染的细胞用hvt感染。通过连续传代(1:4-1:10)将经转染/受感染的细胞扩增，并且随后将一部分以有限稀释度接种在96孔板中。ibdv vp2抗原表达通过用抗体染色活细胞单层来评估，无需固定。请参见图4a和4b。通过用放置在阳性病灶周围的克隆圆柱体对细胞进行胰蛋白酶消化将经染色的病灶采集。此“活染色”之后是克隆圆柱体传代重复4次，并产生纯vp2阳性培养物。通过在jbj-1细胞上的连续传代以及在滚瓶中的原代cef细胞上最终扩增之前将培养物扩增。所采集的cef细胞用于制备冷冻细胞储备液并指定为“hvt-ibd#5”。
[0295]
用于确认插入物跨两个插入位点的整合的使用2组引物的克隆#7的pcr分析。在pcr a中，上部引物(seq id no:52)与ibdv vp2编码区结合，而下部引物(seq id no:53)结合ul35-ul36的整合位点的下游。此组引物产生了如所预期的1.244kb的pcr条带。在pcr b中，上部引物(seq id no:54)结合ul35-ul36插入位点的上游，并且下部引物(seq id no:55)结合插入物的人cmv启动子内并产生如所预期的0.926kb的pcr条带。请参考图5。
[0296]
hvt-ibd#6a的构建
[0297]
hvt-ibd#6a转移质粒(seq id no:22)是通过生物基础公司(biobasic inc)化学合成的。在6孔板中使用pei(聚乙烯亚胺)转染试剂将0.1ug和0.01ug线性化转移质粒(通过用ecor1和hindiii消化)与用sbf1消化的2.5ug hvt-gfp-a共转染到二级cef细胞中。转染后4天，观察到0.01ug转移质粒转染的4个非绿色病灶，并且观察到0.1ug转移质粒转染的3个非绿色病灶，而单独用sbf1消化的hvt-gfp-a未观察到病灶。使用96孔板通过有限稀释方法将2个非绿色病灶纯化3次。使用cef细胞将经纯化的病毒扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-ibd#6a”。
[0298]
制备经感染的细胞裂解物，并使用针对ibdv r63的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。除了含有hvt-gfp-a载体的裂解物的泳道之外，在所有泳道中均可看到约50kd的蛋白质条带。请参考图6。
[0299]
用于确认正确整合的使用2组引物的克隆的pcr分析。靶向上游整合位点的第一引物组：定位于ul35-ul36整合位点上游的上部引物5'-seq id no:56；定位于pec启动子内的下部引物seq id no:57。此组引物得到如所预期的0.911kb的pcr条带。靶向下游整合位点
的第二引物组：定位于ibdv vp2编码区内的上部引物5'-seq id no:58；定位于ul35-ul36插入位点的下游的下部引物5'-seq id no:59。获得了如所预期的1.244kb的pcr条带。请参考图7a和7b。
[0300]
hvt-ibd#9的构建
[0301]
hvt-ibd#9转移质粒(seq id no:23)是通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的。在6孔板中使用ltx转染试剂(英杰公司(invitrogen))将2.5ug质粒转染到二级cef细胞中。约4-6小时后，以0.075moi将经转染的细胞用hvt-gfp-b感染。三天后，将细胞用新鲜cef(1
×
10^7个细胞/t75)以1:10传代3次到t75。然后将细胞接种到96个孔板中的10个上，并获得90个非绿色病灶。将其中三个用抗ibdv鸡血清染色呈阳性。使用96孔板通过有限稀释方法对两个克隆进行3轮纯化。使用cef细胞将经纯化的病毒扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-ibd#9”。
[0302]
使用正好在ul55-基因3整合位点外部的引物对不同克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:60；下部引物：seq id no:61，图a)得到2.536kb的条带，而原始载体hvt-gfp-b的pcr条带为1.922kb。正确整合通过使用插入的上游接合点周围的引物(定位于ul55-基因3插入位点上游的上部引物seq id no:62；定位于ibdv vp2编码区内的下部引物seq id no:63)来进一步确认。获得了如所预期的1.482kb的pcr条带。下游位点的正确整合通过使用插入的下游接合点周围的引物(定位于ibdv vp2序列内的上部引物seq id no:64；定位于ul55-基因3插入位点的下游的下部引物seq id no:65)来进行。获得了如所预期的1.166kb的pcr条带。请参考图8a和b。
[0303]
hvt-ibd#30的构建
[0304]
hvt-ibd#30转移质粒(seq id no:24)是通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的。在6孔板中使用pei(聚乙烯亚胺)转染试剂将二级cef细胞与0.1ug质粒和2.5ug hvt共转染。三天后，将细胞以1:12传代到新鲜的cef细胞上。用针对ibdv的鸡多克隆血清通过染色未固定的培养物来使表达ibd vp2的病灶可视化，并在荧光显微镜的帮助下标记这些病灶。使用克隆圆柱体通过胰蛋白酶消化将总共16个阳性病灶传代到新鲜cef细胞上，以将病灶与非vp2表达病灶分离。将其中的四个培养物按照相同的程序克隆了三次，然后在滚瓶中的原代cef细胞上进行扩增。放置冷冻的细胞储备液并指定为“hvt-ibd#30”。
[0305]
使用ul55-基因3的整合位点的上游区的引物对4个不同克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:66；下部引物：seq id no:67，图a)得到1.673kb的条带。正确的整合通过使用插入的3'接合点周围的引物(定位于ibdv vp2编码区内的上部引物seq id no:68)；定位于ul55-基因3插入位点下游的下部引物seq id no:69，图b)来进一步确认。获得了如所预期的1.082kb的pcr条带。下游位点的正确整合通过使用表达盒外部的引物(上部引物seq id no:70；下部引物seq id no:71(图c))来进一步确认。获得了如所预期的2.558kb的pcr条带。请参考图9a-c。
[0306]
hvt-ibd#31的构建
[0307]
hvt-ibd#31转移质粒(seq id no:25)是通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的。在6孔板中使用pei(聚乙烯亚胺)转染试剂将0.01ug线性化转移质粒(通过用ecor1和hindiii消化)与用sbf1消化的2.5ug hvt-gfp-a共转染到二级cef细胞中。转染后4天，可看到1个非绿色病灶，而仅用sbf1消化的hvt-gfp-a未观察到病灶。在传代之后，使用96孔板通
过有限稀释方法将2个非绿色病灶纯化3次。使用cef细胞将经纯化的病毒扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-ibd#31”。
[0308]
制备经感染的细胞裂解物，并使用针对ibdv r63的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。在仅用抗ibdv鸡血清作为探针的所有泳道中都看到了约50kd的蛋白质条带，而对于ibdv r63，在用mab的泳道中则没有看到。请参见图10a和b。
[0309]
用于确认正确整合的使用2组引物的克隆的pcr分析。靶向上游整合位点的第一引物组：定位于ul35-ul36整合位点上游的上部引物seq id no:72；定位于鸡β肌动蛋白启动子内的下部引物seq id no:73。此组引物得到如所预期的0.835kb的pcr条带。靶向下游整合位点的第二引物组：定位于ibdv vp2编码区内的上部引物seq id no:76；定位于ul35-ul36插入位点下游的下部引物seq id no:77。获得了如所预期的1.248kb的pcr条带。请参考图11a和b。
[0310]
hvt-ibd#34的构建
[0311]
hvt-ibd#34转移质粒(seq id no:28)是通过赛默飞世尔公司的geneart化学合成的。在6孔板中使用ltx转染试剂(英杰公司(invitrogen))将2.5ug质粒转染到二级cef细胞中。约4-6小时后，以0.05moi将经转染的细胞用hvt-gfp-b感染。三天后，将细胞用新鲜cef(1
×
107个细胞/t75)以1:15传代到t75。将受感染的细胞接种在10
×
96孔板上，生长3天，然后传代到复制的96孔板中。将一个复制品固定并用抗ibdv鸡血清染色，并鉴定了含有ibdv染色阳性病灶的3个孔。使用96孔板通过3轮有限稀释克隆将来自活复制板的对应孔纯化。使用cef细胞将经纯化的病毒之一扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-ibd#34”。
[0312]
使用基因3-ul55的整合位点的上游区的引物对3个不同克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:78；定位于鸡β肌动蛋白启动子内的下部引物：seq id no:79，图a)得到如所预期的0.815kb的条带。正确整合通过使用插入的下游接合点周围的引物(定位于ibdv vp2编码区内的上部引物seq id no:80；定位于基因3-ul55插入位点下游的下部引物seq id no:81，图b)来进一步确认。获得了如所预期的1.296kb的pcr条带。正确构建体通过使用表达盒外部的引物(上部引物seq id no:82；下部引物seq id no:83(图c))来进一步确认。获得了如所预期的3.001kb的pcr条带。请参考图12a-c。
[0313]
hvt-nd#38的构建
[0314]
hvt-ibd#38转移质粒(seq id no:29)是通过生物基础公司化学合成的。在具有二级cef细胞的6孔板中，使用pei(聚乙烯亚胺，7.5ul)将hindiii和apoi消化的hvt-nd#38转移质粒与用sbf1消化的hvt-gfp-a dna共转染。转染后6天，将经转染的细胞接种到96孔板上，并且用ndv鸡血清进行活染色。通过有限稀释将含有阳性染色病灶的七个孔纯化3次。使用cef细胞将经纯化的病毒之一扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-nd#38”。
[0315]
使用ul35-ul36的整合位点的上游区的引物对5个不同克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:84；定位于ndv f编码区内的下部引物seq id no:85，图a)得到2.122kb的条带。正确整合通过使用插入的3'接合点周围的引物(定位于ndv f编码区内的上部引物seq id no:86；定位于ul35-ul36插入位点下游的下部引物seq id no:87，图b)来进一步确认。获得了如所预期的1.127kb的pcr条带。正确构建体通过使用表达盒外部的引物(上部引物seq id no:88；下部引物seq id no:89(图c))来进一步确认。获得了如所预期的3.657kb的pcr条带。请参考图15a和b。
no:104；下部引物seq id no:105)得到如所预期的3.597kb的条带。ul55-基因3的上游整合区的四组引物，其中所有上部引物定位于表达盒的上游和外部，所有下部引物定位于nd f编码区内。引物组2：上部引物：seq id no:106，下部引物：seq id no:107，其得到2.243kb的条带；引物组3：上部引物：seq id no:108，下部引物：seq id no:109，其得到2.356kb的pcr条带。引物组4：上部引物：seq id no:110，下部引物：seq id no:111，其得到2.424kb的pcr条带。引物组5：上部引物：seq id no:112，下部引物：seq id no:113，其得到2.170kb的pcr条带。正确整合通过使用插入的下游接合点周围的引物(引物组6：定位于ndv f基因编码序列内的上部引物seq id no:114；定位于ul55-基因3插入位点下游的下部引物seq id no:115，图c)来进一步确认。获得了如所预期的0.971kb的pcr条带。请参考图18。
[0326]
hvt-nd#44的构建
[0327]
hvt-ibd#44转移质粒(seq id no:36)是通过生物基础公司化学合成的。将转移质粒第44号用限制酶ecori和hindiii消化以从质粒序列中释放插入物，并且所得经消化的dna(10ng)与2.5μg hvt-gfpb dna一起使用以使用pei(聚乙烯亚胺)共转染二级细胞。转染后四天，将经转染的细胞以1:6与新鲜的二级细胞传代，并用鸡抗ndv多克隆血清进行活染色，以在传代后三到四天鉴定ndv表达病灶。使用克隆通过胰蛋白酶消化将三个阳性染色病灶采集。将所采集的细胞连续稀释并接种在新鲜的二级cef细胞上。此过程每三天到四天重复一次，直到ndv染色显示均匀，并且然后进行四次后续克隆。然后将克隆的培养物扩增，并制备冷冻储备液。冷冻储备液被指定为“hvt-nd#44”。
[0328]
使用ul55-基因3的整合位点的上游区的引物对1个最终克隆进行pcr分析(定位于ul55上游的上部引物：seq id no:116；定位于鸡β肌动蛋白启动子内的下部引物：seq id no:117，图a)得到0.71kb的条带；类似定位的引物对：上部引物：seq id no:118，下部引物：seq id no:119(图b得到0.965kb的pcr条带)。正确整合通过使用插入的下游接合点周围的引物(定位于ndv f基因编码序列内的上部引物seq id no:120；定位于ul55-基因3插入位点下游的下部引物seq id no:121，图c)来进一步确认。获得了如所预期的0.971kb的pcr条带。正确构建体通过使用表达盒外部的引物(上部引物seq id no:122；下部引物seq id no:123(图d))来进一步确认。获得了如所预期的3.438kb的pcr条带。
[0329]
hvt-nd#45的构建
[0330]
hvt-ibd#45转移质粒(seq id)是通过生物基础公司化学合成的。使用lipofectamine ltx在6孔板中将此质粒转染到用hvt-gfp-b感染的cef细胞中。转染后3天，将经转染/受感染的细胞接种到96孔板上，以用于筛选gfp阴性病灶。通过有限稀释将含有gfp阴性病灶的孔纯化3次。将经纯化的病毒用鸡ndv血清进行ifa染色以确认ndv f基因表达。使用cef细胞将经纯化的病毒之一扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-nd#45”。
[0331]
使用表达盒外部的引物对1个最终克隆进行pcr分析(引物组1：上部引物seq id no:124；下部引物seq id no:125)得到如所预期的2.830kb的条带。基因3-ul55的上游整合区的两组引物，其中两组上部引物定位于表达盒的上游和外部，两组下部引物定位于nd f编码区内。引物组2：上部引物：seq id no:126，下部引物：seq id no:127，其得到1.635kb的条带；引物组3：上部引物seq id no:128，下部引物：seq id no:129，其得到1.588kb的pcr条带。正确整合通过使用插入的下游接合点周围的2组引物来进一步确认：引物组4：定位于ndv f基因编码序列内的上部引物seq id no:130；定位于基因3-ul55插入位点下游的
下部引物seq id no:131。获得了如所预期的0.993kb的pcr条带。引物组5：上部引物：seq id no:132，下部引物：seq id no:133，获得了如所预期的1.137kb的pcr条带。请参考图19。
[0332]
hvt-nd#46的构建
[0333]
hvt-nd#46转移质粒(seq id no:38)是通过生物基础公司化学合成的。在6孔板中使用pei(聚乙烯亚胺，7.5ul)将此质粒与hvt-gfp-b病毒dna一起转染到cef细胞中。转染后4天，将经转染的细胞接种到96孔板上，以用于筛选gfp阴性病灶。通过有限稀释将含有gfp阴性病灶的孔纯化3次。将经纯化的病毒用鸡ndv血清进行ifa染色以确认ndv f基因表达。使用cef细胞将经纯化的病毒之一扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-nd#46”。
[0334]
使用表达盒外部的引物对1个最终克隆进行pcr分析(上部引物seq id no:134；下部引物seq id no:135)得到如所预期的3.597kb的条带。基因3-ul55的上游整合区的一组引物，其中上部引物定位于表达盒的上游和外部(seq id no:136)，下部引物定位于鼠类cmv启动子(上部引物seq id no:137)，其得到如所预期的1.107kb的pcr条带。正确整合通过使用插入的下游接合点周围的4组引物来进一步确认：p1：定位于ndv f基因编码序列内的上部引物seq id no:138；定位于表达盒的下游和外部的下部引物seq id no:139。获得了如所预期的1.003kb的pcr条带。p2：上部引物：seq id no:140，下部引物：seq id no:141，获得了如所预期的1.147kb的pcr条带。p3：上部引物：seq id no:142，下部引物：seq id no:143，获得了如所预期的1.019kb的pcr条带。p4：上部引物：seq id no:144，下部引物：seq id no:145，获得了如所预期的1.018kb的pcr条带。请参考图20a-c。
[0335]
hvt-nd#48的构建
[0336]
在具有二级cef细胞的6孔板中，使用pei(聚乙烯亚胺，7.5ul)将hvt-nd#48的线性化转移质粒(seq id no:39)与hvt-gfp-b dna共转染。转染后4天，将经转染的细胞接种到96孔板上，并且用ndv鸡血清进行活染色。发现四个非绿色病灶，并且2个使用ndv鸡血清染色呈阳性带有阳性。请参考图33a和b。通过有限稀释将两个克隆纯化3次。使用cef细胞将经纯化的病毒扩增并制备冷冻储备液。其被指定为“hvt-nd#48”。
[0337]
hvt-ibd#48转移质粒是通过生物基础公司化学合成的。将转移质粒用ecori和hindiii消化以从质粒序列中释放插入物，并且所得经消化的dna(10ng)与2.5μg hvt-gfp-b dna一起使用以使用pei(聚乙烯亚胺)共转染二级细胞。转染后三天，将经转染的细胞以1:6与新鲜的二级细胞传代，并用ndv鸡多克隆血清进行活染色，以在传代后四天鉴定ndv表达病灶。使用克隆圆柱体通过胰蛋白酶消化将三个阳性染色病灶采集。将所采集的细胞连续稀释并接种在新鲜的二级cef细胞上。此过程每三天到四天重复一次，直到ndv染色显示均匀，并且然后进行四次后续克隆。然后将经克隆的培养物从六孔板扩增到75cm2烧瓶，再扩增到225cm2烧瓶，然后使用原代cef细胞在850cm2滚瓶中进行最终扩增。将最终培养物采集并指定为“hvt-nd#48”。
[0338]
使用基因3-ul55的整合位点的上游区的引物对1个最终克隆进行pcr分析(上部引物：seq id no:146；定位于鸡β肌动蛋白启动子内的下部引物：seq id no:147，图a)得到如所预期的0.815kb的条带；正确整合通过使用插入的下游接合点周围的引物(定位于ndv f编码区内的上部引物seq id no:148；定位于基因3-ul55插入位点下游的下部引物seq id no:149，图b)来进一步确认。获得了如所预期的1.003kb的pcr条带。另一个类似定位的引物：上部引物：seq id no:150；下部引物：seq id no:151(图c)，其得到如所预期的1.147kb
的pcr条带。正确构建体通过使用表达盒外部的引物(上部引物seq id no:152；下部引物seq id no:153(图d))来进一步确认。获得了如所预期的3.430kb的pcr条带。
[0339]
实例3：
[0340]
sfp鸟类的hvt-ibd
[0341]
#9、#34的体内ibdv功效测试
[0342]
在spf鸟类中测试了两种hvt-ibd重组体hvt-ibd#9、#34针对毒性ibdv激发(std病毒株，由usda提供)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vaxxitek(梅里亚公司(merial))的阳性对照。在e18时卵内注射1500pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，还确定了针对每种重组体的每种疫苗病毒的回滴度。虽然100％的hvt-ibd#9表达ibdv vp2抗原，但发现仅96％的hvt-ibd#34表达抗原。根据usda指示，在第28天进行ibdv std激发。在激发后5天对所有的鸟类进行尸检。观察到hvt-ibd#9有100％的保护率，并且hvt-ibd#34有90％的保护率，而阳性对照vaxxitek得到97％的保护率。
[0343][0344]
实例4：
[0345]
sfp鸟类的hvt-ibd
[0346]
#1、#5、#6a、#9、#30、#34的体内ibdv功效测试
[0347]
在spf鸟类中测试了六种hvt-ibd重组体hvt-ibd#1、#5、#6a、#9、#30、#34针对毒性ibdv激发(std病毒株，由usda提供)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vaxxitek(梅里亚公司)的阳性对照。在e18时卵内注射1500pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，还确定了针对每种重组体的每种疫苗病毒的回滴度。发现所有重组体都对ibdv vp2抗原具有100％表达。根据usda指示，在第28天进行ibdv std激发。在激发后5天对所有的鸟类进行尸检。观察到hvt-ibd#9有100％的保护率，并且hvt-ibd#1、#30、#34有96％的保护率，并且hvt-ibd#6a有92％的保护率，而阳性对照vaxxitek得到92％的保护率。
[0348][0349]
实例5：
[0350]
商业肉用鸟类的hvt-ibd
[0351]
#1、#5、#9、#15的ibdv血清学应答
[0352]
针对ibdv抗原的血清学应答通过使用商业elisa试剂盒proflok nd plus来测量。针对1天大雏鸡，皮下(sc)注射1500pfu(0.2ml)的每种重组体(hvt-ibd#1、#5、#9、#15)。在第12天、第19天、第26天、第33天、第39天、第47天和第54天将血清样品分离，并且可以参见下表3。在时间过程期间每个构建体的阳性样品百分比如图13所示。
[0353]
表3
[0354][0355]
实例6：
[0356]
商业肉用鸟类的hvt-ibd
[0357]
#6a、#30、#31的ibdv血清学应答
[0358]
针对ibdv抗原的血清学应答通过使用商业elisa试剂盒proflok ibd plus来测量。针对1天大雏鸡，皮下(sc)注射1500pfu(0.2ml)的每种重组体(hvt-ibd#61、#30、#31)。在第12天、第19天、第26天、第33天、第39天、第47天和第54天将血清样品分离，如下表4所示。在时间过程期间每个构建体的阳性样品百分比如图14所示。
[0359]
表4
[0360][0361][0362]
实例7：
[0363]
sfp鸟类的hvt-nd
[0364]
#38、#39、#44、#48的体内功效测试
[0365]
在spf鸟类中测试了四种hvt-nd重组体hvt-ibd#38、#39、#44、#48针对毒性ndv激发(texas gb病毒株，由usda提供)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vectormune nd(ceva)的阳性对照。在e18时卵内注射1500pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，还确定了针对每种重组体的疫苗病毒的回滴度。虽然100％的hvt-nd#38和#48表达ndv f抗原，但发现仅95天-96％的hvt-ibd#39和#44表达抗原。根据usda指示，在第28天进行ndv texas gb激发。激发后观察所有鸟类2周。观察到hvt-nd#38和#48有90％的保护率，hvt-nd#39有50％的保护率，并且hvt-nd#44有60％的保护率，而阳性对照vectormune nd得到90％的保护率。请参考下表5。
[0366][0367][0368]
针对各种hvt-nd疫苗候选者的抗体应答通过使用proflok nd plus试剂盒(硕腾有限责任公司(zoetis llc))来测定。在未使用试剂盒推荐的截止值(345)的情况下包含所有滴度。具有阳性nd滴度的鸟类百分比示出于下表6中。
[0369]
表6
[0370][0371]
实例8：
[0372]
sfp鸟类中的hvt-nd
[0373]
#40、#42、#45、#46的体内ndv功效测试
[0374]
在spf鸟类中测试了四种hvt-nd重组体hvt-ibd#40、#42、#45、#46针对毒性ndv激发(texas gb病毒株，由usda提供)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vectormune nd(ceva)的阳性对照。在e18时卵内注射1500pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，确定了针对每种重组体的疫苗病毒的回滴度。虽然100％的hvt-nd#42、#45、#46表达ndv f抗原，但发现仅94％-99％的hvt-ibd#40表达抗原。根据usda指示，在第28天进行ndv texas gb激发。激发后观察所有鸟类2周。观察到hvt-nd#42和#45有95％的保护率，并且hvt-nd#46有80％的保护率，hvt-nd#40有55％的保护率，而阳性对照vectormune nd得到90％的保护率。请参见下表7。
[0375][0376]
针对各种hvt-nd疫苗候选者的抗体应答通过使用proflok nd plus试剂盒(硕腾有限责任公司)来测定。在未使用试剂盒推荐的截止值(345)的情况下包含所有滴度。具有阳性nd滴度的鸟类百分比示出于下表8中。
[0377]
表8
[0378]
[0379][0380]
实例9：
[0381]
sfp鸟类中的hvt-nd
[0382]
#38、#42、#45的体内mdv功效测试
[0383]
在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-ibd#38、#42、#45针对毒性mdv激发(ga22)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vectormune nd(ceva)的阳性对照。在e18时卵内注射1500pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，确定了针对每种重组体的疫苗病毒的回滴度。根据usda指示，在第5天进行mdv ga22激发。激发后观察所有鸟类54天。观察到hvt-nd#42和#45有69％的保护率，并且hvt-nd#38有46％的保护率，而阳性对照vectormune nd得到62％的保护率。请参见下表9。
[0384][0385]
实例10：
[0386]
肉用鸟类中的hvt-nd
[0387]
#38、#42、#45的体内nd功效测试
[0388]
在肉用鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-ibd#38、#42、#45针对毒性ndv激发(texas gb病毒株，由usda提供)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vectormune nd(ceva)的阳性对照。在e18时卵内注射4000pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，确定了针对每种重组体的疫苗病毒的回滴度。根据usda指示，在第28天进行ndv texas gb激发。激发后观察所有鸟类2周。观察到hvt-nd#42和#45有100％的保护率，并且hvt-nd#38有37％的保护率，而阳性对照vectormune nd得到50％的保护率。vectormune nd的回滴度为0。
[0389][0390]
针对各种hvt-nd疫苗候选者的抗体应答通过使用proflok nd plus试剂盒(硕腾有限责任公司)来测定。在未使用试剂盒推荐的截止值(345)的情况下包含所有滴度。
[0391]
实例11：
[0392]
spf鸟类中的hvt-nd
[0393]
#38、#42、#45在第20天激发的情况下的体内ndv功效
[0394]
在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-ibd#38、#42、#45在第20天激发的情况下针对毒性ndv激发(texas gb病毒株，由usda提供)的体内功效。在这项研究中，使用了商业疫苗vectormune nd(ceva)的阳性对照。在e18时卵内注射2000pfu的每种重组病毒。在接种疫苗之后，确定了针对每种重组体的疫苗病毒的回滴度。根据usda指示，在第20天进行ndv texas gb激发。激发后观察所有鸟类2周。观察到hvt-nd#42有87.5％的保护率，并且hvt-nd#45有70％的保护率，hvt-nd#38有65％的保护率，而阳性对照vectormune nd得到87.5％的保护率。请参见下表11。
[0395][0396]
实例12：
[0397]
在第17天、第18天和第19天激发的情况下的spf鸟类中的hvt-[0398]
nd(#42，msv 5)的体内ndv功效测试
[0399]
在第17天、第18天和第19天激发的情况下，在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-nd(#42，msv 5)针对毒性ndv激发(texas gb病毒株)的体内功效。激发后观察所有鸟类2周。对于卵内疫苗接种，分别在第17天、第18天和第19天时观察到ndv激发有100％(40/40)、88％(35/40)、98％(39/40)的保护率。在孵化当天，观察到皮下疫苗接种有75％(30/40)、88％(35/40)、93％(37/40)的保护率。请参见下表12。
[0400]
表12
[0401][0402]
实例13：
[0403]
在第16天和第19天激发的情况下的spf鸟类中的hvt-nd
[0404]
(#42，msv 5)的体内ndv功效测试
[0405]
在第16天和第19天激发的情况下，在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-nd(#42，msv 5)针对毒性ndv激发(texas gb病毒株)的体内功效。激发后观察所有鸟类2周。对于卵内疫苗接种，在ndv激发的第16天和第19天观察到85％(37/40)和93％(37/40)的保护率。在孵化当天，观察到皮下疫苗接种有70％(28/40)和95％(38/40)的保护率。请参见下表13。
[0406]
表13
[0407][0408][0409]
实例14：
[0410]
到第63天激发时spf鸟类中的hvt-nd(#42，msv 5)的免疫持续时间测试
[0411]
在第63天激发的情况下，在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-nd(#42，msv 5)针对毒性ndv激发(texas gb病毒株)的免疫持续时间。激发后观察所有鸟类2周。在孵化
当天，观察到卵内疫苗接种或皮下疫苗接种两者均有100％(30/30)的保护率。请参见下表14。
[0412]
表14
[0413][0414]
实例15：
[0415]
spf鸟类中的hvt-nd
[0416]
(#42，msv 5)的nd免疫原性测试
[0417]
在第28天，在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-nd(#42，msv 5)针对毒性ndv激发(texas gb病毒株，由usda提供)的免疫原性。激发后观察所有鸟类2周。在孵化当天，观察到卵内疫苗接种或皮下疫苗接种两者均有100％(30/30)的保护率。请参见下表15。
[0418]
表15
[0419][0420]
实例16：
[0421]
spf鸟类中的hvt-nd
[0422]
(#42，msv 5)的md免疫原性测试
[0423]
在第5天，在spf鸟类中测试了三种hvt-nd重组体hvt-nd(#42，msv 5)针对毒性mdv激发(ga22病毒株)的免疫原性。激发后观察所有鸟类54天。在孵化当天，观察到卵内疫苗接种或皮下疫苗接种两者均有100％(30/30)的保护率。请参见下表16。
[0424]
表16
[0425][0426]
实例17：
[0427]
体外生长实验
[0428]
对hvt-nd#38、#42、#45进行了体外生长实验。将490cm2的滚瓶接种有5
×
108个原代cef细胞。将hvt-nd#38、#42、#45以三种不同的moi：0.001、0.003、0.008接种到每个滚瓶中。在感染后48小时将受感染的细胞采集并将其在cef细胞上进行滴定。hvt-nd#42和#45两者生长良好，并且滴度分别为2.86
×
106和2.97
×
106pfu/ml。hvt-nd#38的滴度为1.67
×
106pfu/ml。请参见下表17。
[0429]
表17
[0430][0431]
实例18：
[0432]
hvt-ibd-nd#42-#30lp c2的构建
[0433]
转移质粒-#42的产生：
[0434]
初始转移质粒hvt-nd#42是通过生物基础公司化学合成的。克隆质粒ul55/基因3是通过dna2.0化学合成的，如上文所描述的。通过使用以下引物对hvt-nd#42转移质粒的ndv f基因表达盒进行pcr扩增：上部引物seq id no:154；下部引物seq id no:155。
[0435]
将经扩增的pcr产物克隆到ul55/基因3的asci和nhei位点中，以制备最终的转移质粒#42。此质粒用于转染/感染以制备hvt-nd#42。
[0436]
转移质粒-#30的产生：
[0437]
初始转移质粒hvt-ibd#30是通过生物基础公司化学合成的。克隆质粒是通过dna2.0化学合成的。通过使用以下引物对质粒#30质粒的ibd基因表达盒进行pcr扩增：上部引物seq id no:156，下部引物和seq id no:157。将经扩增的pcr产物克隆到ul35/36的agei和kpni位点中，以制备最终的转移质粒#30。此质粒用于转染/感染以制备hvt-ibd-nd#42-#30lp c2。
[0438]
hvt-nd#42的构建：
[0439]
共感染/共转染：在6孔板中接种cef细胞，第二天使用lipofectamine
tm
ltx试剂(赛默飞世尔公司)进行hvt工作接种感染(140ul) 质粒-#42(通过spei sbfi消化来线性化)转染。在转染后第2天将经转染的细胞采集。通过ifa用鸡抗ndv多克隆抗体(活染色，约1:250稀释度)在6孔板中筛选阳性病灶，然后通过有限稀释在96孔板中进一步纯化一次(通过活染色)以获得单克隆。将经纯化的克隆一式两份在6孔板中传代两次，并通过ifa(通过固定和染色)来确认克隆的纯度。6孔板采集用于构建hvt-ibd-nd#42-#30。
[0440]
hvt-ibd-nd#42-#30的构建：
[0441]
共感染/共转染：在6孔板中接种cef细胞，第二天使用lipofectamine
tm
ltx试剂(赛默飞世尔公司)进行hvt-nd#42感染 质粒#30(通过sbfi消化来线性化)转染。在转染后第3天将经转染的细胞采集。通过ifa用鸡抗ibd多克隆抗体(活染色，约1:250稀释度)在6孔板中筛选阳性病灶，然后通过有限稀释在96孔板中进一步纯化一次(通过活染色)以获得单克隆。挑取两个经纯化的克隆，并一式两份地在6孔板中传代，并通过ifa(通过固定和染色)来确认克隆的纯度。克隆依次在t-75烧瓶、t-150烧瓶、t-225烧瓶、850ml滚瓶中按比例放大。将重组病毒采集，并以1ml/小瓶等分，在-80℃下冷冻过夜，然后转移到ln罐中。
[0442]
实例19：
[0443]
sfp鸟类中的hvt-ibd-nd
[0444]
#42-#30、#42-#32、#104的体内ndv功效测试
[0445]
在spf鸟类中测试了七种hvt-ibd-nd重组体hvt-ibd-nd#42-#30(3个克隆)、#42-#32(2个克隆)、#104(2个克隆)针对毒性ndv激发的体内功效。在第28天进行ndv texas gb激发。在e18时卵内注射约1500pfu的每种重组病毒。激发后观察所有鸟类2周。请参见下表18。
[0446]
表18
[0447][0448]
实例20：
[0449]
sfp鸟类中的hvt-ibd-nd
[0450]
#42-#30、#42-#32、#104的体内ibd功效测试
[0451]
在第14天和第21天，在spf鸟类中分别测试了七种hvt-ibd-nd重组体hvt-ibd-nd#42-#30(3个克隆)、#42-#32(2个克隆)、#104(2个克隆)针对的毒性ibdv激发的体内功效。在e18时卵内注射约2000pfu的每种重组病毒。在激发后5天对所有的鸟类进行尸检。请参见下表19。
[0452]
表19
[0453][0454][0455]
实例21：
[0456]
sfp鸟类中的hvt-ibd-nd#42-#30(4个克隆)的体内mdv
[0457]
功效测试
[0458]
在spf鸟类中测试了三种hvt-ibd-nd重组体#42-#30(4个克隆)对毒性mdv激发(ga22)的体内功效。在e18时卵内注射约1500pfu的每种重组病毒。在第5天进行mdv ga22激发。激发后观察所有鸟类54天。请参见下表20。
[0459]
表20
[0460][0461]
实例22：
[0462]
spf鸟类中的hvt-ibd-nd
[0463]
#42-#30、#42-#32、#104的体内vvibd功效测试
[0464]
在spf鸟类中测试了三种hvt-ibd-nd重组体#42-#30(2个克隆)、#42-#32(2个克隆)、#104针对极具毒性的ibdv激发的体内功效。在e18时卵内注射约1500pfu的每种重组病毒。在第14天和第21天进行vvibdv激发。激发后观察所有鸟类10天。在研究结束时对每只鸟类进行法氏囊组织学检查。请参见下表21。
[0465]
表21
[0466][0467]
实例23：
[0468]
到第63天激发时spf鸟类中的hvt-ibd-nd
[0469]
(#42-#30，x 5)的ibd免疫持续时间测试
[0470]
在第63天激发的情况下在spf鸟类中测试了hvt-ibd-nd重组体#42-#30(msv 5)针
对毒性经典ibdv激发的免疫持续时间。激发后观察所有鸟类四天，并且随后进行尸检。请参见表22。
[0471]
表22
[0472] 疫苗途径激发后死亡率％ibd保护％t01稀释剂卵内0(0/30)na(30/30)t02安慰剂卵内7(2/30)7(2/30)t03hvt-ibd-ndsc0(0/30)100(30/30)t04hvt-ibd-nd卵内0(0/30)100(30/30)
[0473]
实例24：
[0474]
spf鸟类中的hvt-ibd-nd
[0475]
(#42-#30，msv 5)的nd免疫原性测试
[0476]
在第28天，在spf鸟类中测试了hvt-ibd-nd重组体#42-#30(msv 5)针对毒性ndv激发(texas gb病毒株)的免疫原性。激发后观察所有鸟类2周。请参见表23。
[0477]
表23
[0478][0479]
实例25：
[0480]
spf鸟类中的hvt-ibd-nd
[0481]
(#42-#30，msv 5)的ibd免疫原性测试
[0482]
在第34天，在spf鸟类中测试了hvt-ibd-nd重组体#42-#30(msv 5)针对毒性ibdv激发的免疫原性。激发后观察所有鸟类4天，并且随后对法氏囊病变进行尸检。请参见下表24。
[0483]
表24
[0484][0485]
实例26：
[0486]
spf鸟类中的hvt-ibd-nd
[0487]
(#42-#30，msv 5)的md免疫原性测试
[0488]
在第5天，在spf鸟类中测试了三种hvt-ibd-nd重组体#42-#30(msv 5)针对毒性mdv激发(ga22病毒株)的免疫原性。激发后观察所有鸟类54天。请参见下表25。
[0489]
表25
[0490][0491]
实例27：
[0492]
spf鸟类中的hvt-ibd-nd
[0493]
(#42-#30，msv 5)针对eu激发病毒株的nd免疫原性测试
[0494]
在第21天，在spf鸟类中测试了hvt-ibd-nd重组体#42-#30(msv 5)针对毒性ndv欧洲激发(herts weybridge 33/56)的免疫原性。激发后观察所有鸟类2周。请参见下表26。
[0495]
表26
[0496]
trt描述途径死亡率％保护％t01对照-100(15/15)nat03hvt-ibd-ndsc4(1/26)96t04hvt-ibd-nd卵内4(1/26)96
[0497]
实例28：
[0498]
hvt-nd与bursaplex的相容性
[0499]
ibdv功效
[0500]
bursaplex
tm
(硕腾公司，us5871748，通过引用并入本文)是一种针对传染性法氏囊病(ibd)的疫苗，所述疫苗包括由活的减毒的ibd病毒株2512和与病毒结合的中和抗体bda组成的疫苗缀合物。bursaplex对家禽，具体地鸡产生针对ibd的主动免疫。在e18时，向卵内注射对照疫苗或测试疫苗(hvt-nd与bursaplex以1:1的比率)，并将其与未注射的蛋一起转移到由生物计量学指定的分配的孵化器。在孵化当天，对t04鸟类进行皮下疫苗接种。在第5天、第12天、第19天、第26天和第33天将血液样品收集以用于ibdv血清学。在第34天，将指定的鸡用经典的毒性ibdv激发，并在第38天对存在法氏囊病变的所有鸡进行尸检。t01阴性组中的鸡没有出现可显著观察到的病变，并且t02激发对照组中100％的鸡出现可显著观察到的病变。t03(hvt-nd bursaplex，卵内)和t04(hvt-nd bursaplex，sc)均受到100％的保护。可以得出结论，当在一起施用时，poulvac procerta hvt-nd和poulvac bursaplex是相容的，并且在卵内或皮下施用时保持对ibdv激发有效。
[0501]
ndv功效
[0502]
在e18时，向卵内注射对照疫苗或测试疫苗(hvt-nd与bursaplex以1:1的比率)，并将其与未注射的蛋一起转移到由生物计量学指定的分配的孵化器。在孵化当天，对t04鸟类进行皮下疫苗接种。在第6天、第13天、第20天和第27天将血液样品收集以用于ndv血清学。
在第28天，将指定的鸟类用强毒的ndv激发，并在第42天处死所有存活的鸟类。t01阴性组中的鸡没有出现临床体征，并且t02激发对照组中的100％的鸡出现新城疫临床体征，包含死亡。t03(hvt-nd bursaplex，卵内)和t04(hvt-nd bursaplex，sc)分别受到92.5％和95％的保护。可以得出结论，当在一起施用时，poulvac procerta hvt-nd和poulvac bursaplex是相容的，并且在卵内或皮下施用时保持对ndv激发有效。
[0503]
实例29：
[0504]
hvt-nd与magniplex的相容性
[0505]
ibd功效
[0506]
magniplex
tm
(硕腾公司)是一种针对传染性法氏囊病(ibd)的疫苗，所述疫苗包括由活的减毒的ibd病毒株v877和与病毒结合的中和抗体bda组成的疫苗缀合物。bursaplex对家禽，具体地鸡产生针对ibd的主动免疫。在e18时，向卵内注射对照疫苗或测试疫苗(hvt-nd pre-license serial与magniplex以1:1的比率)，并将其与未注射的蛋一起转移到由生物计量学指定的分配的孵化器。在孵化当天，对t04鸟类进行皮下疫苗接种。在第5天、第12天、第19天、第26天和第33天将血液样品收集以用于ibdv血清学。在第34天，将指定的鸡用经典的毒性ibdv激发，并在第38天对存在法氏囊病变的所有鸡进行尸检。t01阴性组中的鸡没有出现可显著观察到的病变，并且t02激发对照组中100％的鸡出现可显著观察到的病变。t03(hvt-nd magniplex，卵内)和t04(hvt-nd bursaplex，sc)均受到100％的保护。可以得出结论，当在一起施用时，poulvac procerta hvt-nd和poulvac magniplex是相容的，并且在卵内或皮下施用时保持对ibdv激发有效。
[0507]
表27
[0508][0509]
表28
[0510][0511]
nd功效
[0512]
在e18时，向内注射对照疫苗或测试疫苗(hvt-nd与magniplex以1:1的比率)，并将其与未注射的蛋一起转移到由生物计量学指定的分配的孵化器。在孵化当天，对t04鸟类进
行皮下疫苗接种。在第6天、第13天、第20天和第27天将血液样品收集以用于ndv血清学。在第28天，将指定的鸟类用强毒的ndv激发，并在第42天处死所有存活的鸟类。t01阴性组中的鸡没有出现临床体征，并且t02激发对照组中的100％的鸡出现新城疫临床体征，包含死亡。t03(hvt-nd magniplex，卵内)和t04(hvt-nd magniplex，sc)分别受到92.5％和95％的保护。可以得出结论，当在一起施用时，poulvac procerta hvt-nd和poulvac magniplex是相容的，并且在卵内或皮下施用时保持对ndv激发有效。
[0513]
表29
[0514][0515]
表30
[0516]