嵌合CD3融合蛋白与基于anti-CD3的双特异性T细胞激活元件的联合表达的制作方法

嵌合cd3融合蛋白与基于anti-cd3的双特异性t细胞激活元件的联合表达
1.背景
技术领域
2.本公开主要涉及免疫治疗领域，具体地，本公开涉及嵌合cd3融合蛋白与基于anti-cd3的双特异性t细胞激活元件的联合表达。
3.相关技术
4.近年来，免疫细胞疗法在血液肿瘤完全缓解率方面取得了前所未有的成功。2017年，已有两个靶向cd19的car-t产品已成功上市，分别被批准用于治疗儿童及青少年急性白血病和非霍奇金淋巴瘤。
5.但利用免疫疗法治疗实体肿瘤，还存在两大难题：一方面，与car-t疗法相伴随的严重、甚至致命的临床副作用仍是car-t疗法临床应用的巨大风险，这些副作用主要包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,crs)、巨噬细胞活化综合征、神经毒性等。而另一方面，在实体肿瘤的临床治疗中，car-t疗法还未展现其显著的临床疗效。
6.wo2016070061(zhao等人)描述了表达双特异性抗体和嵌合配体工程化活化受体(chimeric ligand engineered activation receptor,clear)的工程化t细胞。然而，其所公开的内容仅限于受体/配体靶点pd1/pd-l1和cd27/cd70、以及pd1或cd27 clears的表达。
7.wo2016/054520(kim等人)描述了表达工程化细胞表面蛋白的效应细胞以及使用所述效应细胞用于治疗疾病。在其中一个实施方案中，描述了表达工程化cd3e的效应细胞和双特异性t细胞衔接器(bispecific t cell engager,bite)的联合治疗。然而，在kim的方法中，cd3e和bites并不是在一个效应细胞中共表达，并且由于bite的低pk半衰期和毒性，需要进行连续低剂量输注。独立施用这些效应细胞和bites不会在实体肿瘤微环境中产生协同作用。
8.因此本领域依然需要开发一种临床疗效好而临床副作用低的抑制实体肿瘤的治疗方案。
9.概述
10.本公开的目的包括提供一种临床疗效好而临床副作用低的抑制实体肿瘤的治疗方案。
11.本公开第一方面提供一种dna构建体，其编码嵌合cd3融合蛋白(例如嵌合cd3e融合蛋白)以及基于anti-cd3的双特异性t细胞激活元件。
12.在一个优选实施方案中，所述嵌合cd3是融合蛋白，所述融合蛋白包含能够被抗cd3抗体识别的一个或多个多肽，以及可选地包含选自下列的一个或多个：跨膜结构域(tm)、共刺激结构域和cd3信号激活结构域(如cd3ζ结构域)。
13.在一个优选实施方案中，所述基于anti-cd3的双特异性t细胞激活元件是融合蛋白，所述融合蛋白包含一个或多个肿瘤抗原识别结构域和一个或多个抗cd3抗体片段，例如靶向cd3的单域抗体序列(vhh)、单链抗体可变区序列(scfv)和/或抗原结合片段(fab)。在
protein)以顺式或融合形式表达，所述能够作为安全开关的蛋白包括诱导型caspase 9(inducible caspase 9,icasp9),cd19,cd20,egfr,her2,cd30,cd19,c-met,claudin 18.2,或其组合。
35.在另一个优选实施方案中，所述的基于anti-cd3的双特异t细胞激活元件(bita)结构如下式ii所示：
36.l
’‑
t1-b1-b2-t2
ꢀꢀꢀꢀ
(ii)
37.式中，
38.l’为无或信号肽序列；
39.t1为无或标签元件；
40.b1为肿瘤抗原识别区或cd3抗原识别区；
41.b2为结合cd3抗原的抗体片段或肿瘤抗原结合区；
42.t2为无或标签元件；
43.各
“‑”
独立地为连接肽或肽键。
44.在另一个优选实施方案中，所述的l’为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、gm-csfr、cd4、cd137、或其组合。
45.在另一个优选实施方案中，所述标签元件，包括标签蛋白、荧光素标记蛋白或酶标记蛋白。
46.在另一个优选实施方案中，所述标签蛋白包括flag蛋白(dna seq id no.:seq 13,aa seq id no.:seq 14)、his蛋白(dna seq id no.:seq 35,aa seq id no.:seq 36)。
47.在另一个优选实施方案中，所述b1为肿瘤抗原识别区，所述b2为cd3抗原识别区。
48.在另一个优选实施方案中，所述肿瘤抗原识别区包括一个或多个受体或配体结合域，抗体片段(包括单域抗体序列(vhh)，和/或单链抗体可变区序列(scfv))，和/或tcr序列。
49.在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原识别区b1包含单域抗体序列(vhh)、和/或单链抗体可变区序列(scfv)。
50.在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原选自下组：tshr,cd19,cd123,cd22,cd30,cd171,cs-1,cll-1,cd33,egfrviii,gd2,gd3,bcma,tn ag,psma,ror1,flt3,fap,tag72,cd38,cd44v6,cea,epcam,b7h3,kit,il-13ra2,间皮素(mesothelin),il-11ra,psca,prss21,vegfr2,lewisy,cd24,pdgfr-β,ssea-4,cd20,叶酸受体α,erbb2(her2/neu),muc1,egfr,ncam,prostase,pap,elf2m,肝配蛋白b2,igf-i受体,caix,lmp2,gp100,bcr-abl,酪氨酸酶,epha2,岩藻糖基gm1,sle,gm3,tgs5,hmwmaa,邻乙酰基-gd2,叶酸受体β,tem1/cd248,tem7r,cldn6,gprc5d,cxorf61,cd97,cd179a,alk,聚唾液酸,plac1,globoh,ny-br-1,upk2,havcr1,adrb3,panx3,gpr20,ly6k,or51e2,tarp,wt1,ny-eso-1,lage-1a,mage-a1,legumain,hpv e6,e7,mage a1,etv6-aml,精子蛋白17,xage1,tie 2,mad-ct-1,mad-ct-2,fos相关抗原1,p53,p53突变体,prostein,存活蛋白和端粒酶,pcta-1/galectin 8,melana/mart1,ras变体,htert,肉瘤易位断点,ml-iap,erg(tmprss2ets融合基因),na17,pax3,雄激素受体,细胞周期蛋白b1,mycn,rhoc,trp-2,cyp1b1,boris,sart3,pax5,oy-tes1,lck,akap-4,ssx2,rage-1,人端粒酶逆转录酶,ru1,ru2,肠羧基酯酶,mut hsp70-2,cd79a,cd79b,cd72,lair1,fcar,lilra2,cd300lf,clec12a,bst2,emr2,ly75,gpc3,
fcrl5,igll1,dll3，或其组合。
51.在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原识别区靶向caix和/或her2。
52.在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原识别区为靶向caix的纳米抗体(dna seq id no.:seq 17,aa seq id no.:seq 18)。
53.在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原识别区b1为靶向her2的单链抗体(dna seq id no.:seq 65,aa seq id no.:seq 66)。
54.在另一个优选实施方案中，所述结合cd3抗原的抗体片段为靶向cd3的单域抗体序列(vhh)、单链抗体可变区序列(scfv)或抗原结合片段(fab)。
55.在另一个优选实施方案中，所述的bita为分泌型bita。
56.在另一个优选实施方案中，所述的bita靶向caix(dna seq id no.:seq 21,aa seq id no.:seq 22),或靶向her2(dna seq id no.:seq 49,aa seq id no.:seq 50)。
57.在另一个优选实施方案中，所述的分泌型bita可以自分泌、和/或旁分泌。
58.在另一个优选实施方案中，所述分泌型bita的分泌细胞类型可以为：t细胞、nk细胞、巨噬细胞、b细胞、红细胞、或其组合。
59.在另一个优选实施方案中，所述分泌型bita的分泌细胞类型为t细胞。
60.在另一个优选实施方案中，所述的bita可与嵌合cd3e结合。
61.在另一个优选实施方案中，所述的bita可与t细胞受体(tcr)复合物结合。
62.在另一个优选实施方案中，所述的tcr来自于如第五方面所述的t细胞、和/或未经工程化编辑的t细胞。
63.在另一个优选实施方案中，编码所述嵌合cd3融合蛋白的核酸分子以及编码所述双特异性t细胞激活元件的核酸分子分开提供。有利的是，编码嵌合cd3融合蛋白的核酸分子和编码双特异性t细胞激活元件的核酸分子在同一免疫细胞中共表达。
64.本发明第二方面提供一种载体，其特征在于，所述的载体含有所述核酸分子。
65.在另一个优选实施方案中，所述载体选自由以下组成的组：慢病毒、腺病毒、逆转录病毒载体。
66.本发明第三方面提供一种基因工程化的免疫细胞(如t细胞),其特征在于,所述的免疫细胞表达如上所述的核酸分子。在一个任选的实施方案中，所述免疫细胞经工程化以表达所述嵌合cd3融合蛋白和双特异性t细胞激活元件，其中，编码所述嵌合cd3融合蛋白的核酸分子以及编码所述双特异性t细胞激活元件的核酸分子不提供在同一个dna构建体上。
67.在另一个优选实施方案中，所述t细胞来自人或非人哺乳动物。
68.在另一个优选实施方案中，所述t细胞还包含另外的嵌合抗原。
69.本公开第四方面提供一种组合物，其特征在于，所述组合物包含所述融合蛋白和bita。
70.在另一个优选实施方案中，所述的组合物中的融合蛋白位于t细胞细胞膜胞外区。
71.在另一个优选实施方案中，所述的组合物中的bita为自分泌、旁分泌或外源性的bita。
72.在另一个优选实施方案中，所述组合物的表达形式为结构式i和结构式ii融合蛋白与2a蛋白的融合表达，其结构式为：i-2a-ii或ii-2a-i，所述2a序列包括t2a(dna seq id no.:seq 23,aa seq id no.:seq 24)，p2a，f2a或e2a中的一种或其组合形式。
73.在另一个优选实施方案中，所述i-2a-ii结构为靶向caix的多肽(dna seq id no.:seq 25,aa seq id no.:seq 26)或her2的多肽(dna seq id no.:seq 49,aa seq id no.:seq 50)。
74.在另一个优选实施方案中，所述ii-2a-i结构为靶向caix或her2的多肽(dna seq id no.:seq 67,aa seq id no.:seq 68)。
75.在另一个优选实施方案中，所述i-2a-ii或ii-2a-i结构与安全开关蛋白(safety switch protein)以顺式或融合形式表达，所述能够作为安全开关的蛋白包括诱导型caspase 9(inducible caspase 9,icasp9),cd19,cd20,egfr,her2,cd30,cd19,c-met,claudin 18.2,或其组合。
76.在另一个优选实施方案中，所述组合物的表达形式为结构式i和结构式ii融合蛋白与ires序列的组合，其结构式为：i-ires-ii或ii-ires-i，所述ires为核糖体进入位点核苷酸序列。
77.在另一个优选实施方案中，所述ires作用为启动下游基因的氨基酸翻译。
78.在另一个优选实施方案中，所述i-ires-ii或ii-ires-i结构与安全开关蛋白(safety switch protein)以顺式或融合形式表达，所述能够作为安全开关的蛋白包括诱导型caspase 9(inducible caspase 9,icasp9),cd19,cd20,egfr,her2,cd30,cd19,c-met,claudin 18.2,或其组合。
79.本公开第五方面提供一种非天然存在的t细胞群。如上所述的t细胞在所述的t细胞群中的比例c1≥10％，按所述t细胞群中的t细胞总数计。
80.在另一个优选实施方案中，所述的c1≥10％，优选c1≥20％，优选c1≥30％。
81.在另一个优选实施方案中，所述的t细胞群中还存在bita、和/或分泌bita的t细胞c2。
82.本公开第六方面提供一种组合物，其含有(a)如上所述的基因工程化t细胞和/或如上所述的t细胞群，以及(b)药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
83.本公开第七方面提供如上所述的基因工程化t细胞、t细胞群和/或组合物在制备用于预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物中的用途，或者用于下述方法中的用途。
84.本公开第八方面提供用于预防或治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用适量的如上所述的基因工程化t细胞、t细胞群和/或组合物。
85.在另一个优选实施方案中，所述疾病是癌症或者肿瘤。
86.在另一个优选实施方案中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
87.在另一个优选实施方案中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。
88.在另一个优选实施方案中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、神经胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、尿路肿瘤(urinary tract tumor)、甲状腺癌、或其组合。
89.在另一个优选实施方案中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、或其组合。在另一个优选实施方案中，所述方法还包括施用适量
的刺激细胞分泌的细胞因子或药物化合物及其组合物，以增强免疫细胞响应能力。
90.在另一个优选实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用达沙替尼(dasatinib)的步骤。
91.在另一个优选实施方案中，所述免疫细胞包括如上所述的t细胞、t细胞群和/或组合物，以及内源性的t细胞、nk细胞、巨噬细胞、b细胞。
92.本公开第九方面提供了一种减少由嵌合cd3e融合蛋白和双特异性t细胞激活元件工程化的免疫细胞的毒性的方法，其包括施用达沙替尼；也提供了达沙替尼在制备用于降低由嵌合cd3e融合蛋白和双特异性t细胞活化元件工程化的免疫细胞的毒性的药物中的用途。
93.应理解，在本公开范围内中，本公开的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
94.图1显示了第一组实验cab-t及其对照组的结构。
95.图2显示了第二组实验cab-t及其对照组的结构。
96.图3显示了第三组实验cab-t及其对照组的结构。
97.图4显示了由第一组结构编辑的t细胞的转导率检测结果。
98.图5显示了由第二组结构编辑的t细胞的转导率检测结果。
99.图6显示了由第三组结构编辑的t细胞的转导率检测结果。
100.图7显示了caix-cab-t的细胞因子释放检测(第一组实验构建体)。
101.图8显示了caix-cab-t的细胞因子释放检测(第二组实验构建体)。
102.图9显示了caix-cab-t的细胞活化水平检测(第一组实验构建体)。
103.图10显示了caix-cab-t的细胞活化水平检测(第二组实验构建体)。
104.图11显示了her2-cab-t的细胞活化水平检测(第三组实验构建体)。
105.图12显示了caix-cab-t旁分泌活化t细胞水平检测(第二组构建体)。
106.图13显示了her2-cab-t旁分泌活化t细胞水平检测(第三组构建体)。
107.图14显示了caix-cab-t及其对照的细胞免疫检查点表达水平和细胞分化表型分析(第二组构建体)。
108.图15显示了her2-cab-t及其对照的细胞免疫检查点表达水平和细胞分化表型分析(第三组实验构建体)。
109.图16显示了caix-cab-t及其对照组的细胞介导的肿瘤杀伤能力检测(第一组实验构建体)。
110.图17显示了caix-cab-t及其对照组的细胞介导的肿瘤杀伤能力检测(第二组实验构建体)。
111.图18显示了her2-cab-t及其对照组的细胞介导的肿瘤杀伤能力检测(第三组实验构建体)。
112.图19显示了第四组实验cab-t及其对照组的结构。
113.图20显示了由第四组结构编辑的t细胞的转导率检测结果。
114.图21显示了her2-cab-t的细胞活化水平检测(第四组实验构建体)。
115.图22显示了her2-cab-t及其对照组的细胞介导的肿瘤杀伤能力检测(第四组实验构建体)。
116.图23a显示了不同剂量的caix-cab-t及其对照组细胞在ncg人源化小鼠中的caix

mda-mb231肿瘤生长抑制实验。
117.图23b显示了图23a所示的实验中小鼠的体重变化。
118.图23c显示了图23a所示的实验中小鼠肿瘤的图像。
119.图23d显示了图23a所示的实验中小鼠的肿瘤重量。
120.图24a显示了m-nsg人源化小鼠经her2-cab-t及其对照t细胞处理后的nci-n87肿瘤生长抑制情况。
121.图24b显示了图24a所示的实验中小鼠肿瘤的图像。
122.图24c显示了图24a所示的实验中小鼠的肿瘤重量统计。
123.图25a显示了低浓度达沙替尼抑制活化的caix cab-t的il-2分泌。
124.图25b显示了低浓度达沙替尼抑制活化的caix cab-t的ifn-γ分泌。
125.图25c显示了低浓度达沙替尼在低浓度时抑制caix cab-t的杀伤活性。
126.图26a显示了低浓度达沙替尼抑制活化的her2 cab-t的il-2分泌。
127.图26b显示了低浓度达沙替尼抑制活化的her2 cab-t的ifn-γ分泌。
128.图26c显示了低浓度达沙替尼抑制her2 cab-t的杀伤活性。
129.图27为cab-t作用机理示意图。
130.详述
131.本公开涉及抑制肿瘤尤其是实体肿瘤的免疫治疗方案，其包括将表达嵌合cd3融合蛋白(优选嵌合cd3e融合蛋白)的t细胞与类似双特异性t细胞激活器(bite)的基于anti-cd3的双特异性t细胞激活元件(bita)联用。所述嵌合cd3e融合蛋白与含有cd3抗原识别位点的bita相互结合，发挥活化t细胞和靶向表达肿瘤相关抗原(taa)的肿瘤细胞的功能。本公开还提供了一种cab结构和cab编辑t细胞(cab-t)，在所述的编辑t细胞表达嵌合cd3e和基于cd3抗体的双特异性t细胞激活元件。cab-t细胞分泌的bita在肿瘤组织中可以同时激活cab-t细胞和非编辑t细胞和编辑t细胞的内源tcr复合物，并发挥cab-t自身抗肿瘤以及调动未编辑t细胞的抗肿瘤作用，这保证了cab-t临床应用的有效性。cab-t表达的嵌合cd3构建体与bita相互协同发挥抗肿瘤效应：嵌合cd3元件的活化依赖于cab-t分泌的bita，而bita的分泌会进一步通过激活嵌合cd3元件而刺激cab-t释放更多的bita；从而使得免疫细胞活化及抗肿瘤效应定位至肿瘤微环境，保证了cab-t临床应用的安全性优势。
132.术语说明
133.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
134.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
135.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
136.术语“施用(administering)”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系
统中的任一种将本公开的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
137.术语“抗体”(ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，或其抗原结合部分。每条h链包含重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域cl。vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl包含三个cdr和四个fr，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
138.应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：ala(a)、arg(r)、asn(n)、asp(d)、cys(c)、gln(q)、glu(e)、gly(g)、his(h)、i1e(i)、leu(l)、lys(k)、met(m)、phe(f)、pro(p)、ser(s)、thr(t)、trp(w)、tyr(y)、val(v)。
139.嵌合抗原受体(car)
140.嵌合抗原受体(car)的结构是以tcr复合体cd3ζ胞内段基域和来自共刺激信号cd28或4-1bb的胞内活化基域为基础的融合蛋白。有利的是，经修饰表达car的t细胞能够以非mhc依赖性方式结合靶抗原，从而t细胞的激活不再依赖于mhc对抗原的提呈。这类cdr被称为二代car结构，两个于2017年被批准的car-t药物均是属于此类结构。
141.t细胞受体(tcr)
142.t细胞受体(tcr)是人体中最复杂的受体，六个不同受体亚基的相互作用共同决定了其在t细胞内传导的广泛信号。tcrα和tcrβ两条链共同识别多肽-组织相容性复合体组成的复合物，传递tcr信号的亚基统称为cd3，包括：1个由cd3ε和cd3γ形成的异源二聚体，1个由cd3ε和cd3δ形成的异源二聚体，以及一个cdζ同源二聚体。tcr所有的亚基都是i型跨膜蛋白，并且除cd3ζ之外都具有免疫球蛋白基域。tcr受体中四种不同的cd3亚基一共具有10个免疫受体酪氨酸激活基序(immune receptor tyrosine-based activation motifs，itam),在tcr受体活化时总共可以接受20个酪氨酸磷酸基。在转基因小鼠实验中显示，cd3ε胞内段脯氨酸富集区域或cd3ε的构想改变对于传递完整的tcr起到至关重要的调节作用。已经证明，tcr活性可以通过以下方式调节：配体与tcrαβ的结合并稳定cd3亚基的排列分布、配体非依赖的tcr寡聚化，以及与胆固醇的结合。
143.truc结构
144.tcr2自主开发的新型t细胞治疗平台-truc
tm
，由以抗体为基础的靶抗原识别序列与tcr受体亚基组成的嵌合抗原受体，truc结构可以重编程一个识别肿瘤抗原的完整的tcr复合体。与car结构不同，truc结构可以整合在tcr复合体中发挥作用。truc-t具有二代car-t同样的肿瘤杀伤活性；同时，由于不带有额外共刺激信号基域(cd28或4-1bb)，truc-t细胞释放的细胞因子水平显著低于car-t细胞。truc-t在血液肿瘤和实体瘤移植模型中均显示了抗肿瘤活性。同时，在多个肿瘤模型中，truc-t均显示了相比于car-t更有效的抗肿瘤活性。
145.t细胞抗原耦连器(tac)
146.triumvira的tac(t细胞抗原耦连器)技术平台，通过调节t细胞内源tcr，可以诱导比car-t更高效抗肿瘤反应，并且更低的毒性。tac结构由三部分组成：1.胞外抗原结合区；2.cd3单链抗体的tcr-募集区；3.cd4/cd8共受体结合区。临床前实验表明，tac-t技术能够特异性的结合肿瘤细胞并产生细胞毒性，而且tac-t细胞的激活与正常t细胞的激活类似，避免了大量细胞因子的产生。在小鼠肿瘤移植模型中，不管是对实体瘤还是血液瘤，tac-t都表现出比car-t更好的活性。此外，在实体瘤中，tac-t浸润到肿瘤微环境的能力更强。
147.双特异性t细胞衔接器(bite)
148.blinatumomab，是美国安进公司开发的一种靶向cd19的双特异性t细胞衔接器(bite)药物，已在2014年被fda批准用于急性白血病的临床治疗，该抗体由识别cd19抗原的scfv和识别tcr(cd3e)的scfv两部分组成。bite抗体在识别肿瘤细胞靶抗原cd19后，可以利用cd3 scfv部分诱导t细胞内源tcr寡聚化进而激活t细胞和触发肿瘤杀伤。利用bite治疗肿瘤的方式与truc以及tac技术类似，都是引起t细胞内源tcr活化。理论上讲，三者对内源tcr信号的活化能力相当，都对调动t细胞治疗实体肿瘤具有潜在的巨大价值。但是，由于bite药物的系统给药方式导致安全性较差，并且bite药物在体内半衰期极短等原因，造成其在实体肿瘤的临床治疗中还未展现较好疗效。
149.双特异性t细胞激活器(bispecific t cell activator,bita)结构
150.本文所述“双特异性t细胞激活器结构”、“bita”、“双特异性t细胞激活元件(bispecific t cell activating element)”、“双特异性t细胞激活器(bispecific t cell activator)”、
“‑
bita”，均代指cab结构中的基于anti-cd3的双特异性t细胞激活器(bita)结构，其由两部分组成：(i)一个或多个肿瘤抗原识别区，例如识别肿瘤抗原的受体或配体结合结构域，抗体片段(如单域抗体序列(vhh)、单链抗体可变区序列(scfv)或抗原结合片段(fab)，和/或t细胞受体(tcr)序列；以及(ii)一个或多个cd3抗原识别区，例如靶向cd3的抗体片段，包括单域抗体序列(vhh)、单链抗体可变区序列(scfv)或抗原结合片段(fab)。
151.在一个优选实施方案中，所述基于cd3抗体的双特异性t细胞激活元件具有下式ii所示的结构：
152.l
’‑
t1-b1-b2-t2
ꢀꢀꢀꢀ
(ii)
153.式中，
154.l’为无或为源自选自下组的蛋白的信号肽序列：cd8、gm-csfr、cd4、cd137、或其组合。
155.t1为无或标签元件，可选地包含标签蛋白、荧光素标记蛋白或酶标记蛋白。优选地，所述标签蛋白包括flag蛋白(dna seq id no.:seq 13,aa seq id no.:seq 14)、his蛋白(dna seq id no.:seq 35,aa seq id no.:seq 36)。
156.b1为肿瘤抗原识别区，可选地包含能够识别选自下组的肿瘤抗原的受体或配体结合结构域、单域抗体序列(vhh)、和/或单链抗体可变区序列(scfv)、和/或fab、和/或t细胞受体(tcr)序列：tshr,cd19,cd123,cd22,cd30,cd171,cs-1,cll-1,cd33,egfrviii,gd2,gd3,bcma,tn ag,psma,ror1,flt3,fap,tag72,cd38,cd44v6,cea,epcam,b7h3,kit,il-13ra2,间皮素(mesothelin),il-11ra,psca,prss21,vegfr2,lewisy,cd24,pdgfr-β,ssea-4,cd20,叶酸受体α,erbb2(her2/neu),muc1,egfr,ncam,prostase,pap,elf2m,肝配蛋白
b2,igf-i受体,caix,lmp2,gp100,bcr-abl,酪氨酸酶,epha2,岩藻糖基gm1,sle,gm3,tgs5,hmwmaa,邻乙酰基-gd2,叶酸受体β,tem1/cd248,tem7r,cldn6,gprc5d,cxorf61,cd97,cd179a,alk,聚唾液酸,plac1,globoh,ny-br-1,upk2,havcr1,adrb3,panx3,gpr20,ly6k,or51e2,tarp,wt1,ny-eso-1,lage-1a,mage-a1,legumain,hpv e6,e7,mage a1,etv6-aml,精子蛋白17,xage1,tie 2,mad-ct-1,mad-ct-2,fos相关抗原1,p53,p53突变体,prostein,存活蛋白和端粒酶,pcta-1/galectin 8,melana/mart1,ras变体,htert,肉瘤易位断点,ml-iap,erg(tmprss2ets融合基因),na17,pax3,雄激素受体,细胞周期蛋白b1,mycn,rhoc,trp-2,cyp1b1,boris,sart3,pax5,oy-tes1,lck,akap-4,ssx2,rage-1,人端粒酶逆转录酶,ru1,ru2,肠羧基酯酶,mut hsp70-2,cd79a,cd79b,cd72,lair1,fcar,lilra2,cd300lf,clec12a,bst2,emr2,ly75,gpc3,fcrl5,igll1,dll3，或其组合。优选地，所述肿瘤抗原识别区b1靶向肿瘤抗原caix和/或her2。
157.在另一个优选实施方案中，所述肿瘤抗原识别区b1是靶向caix的vhh抗体(dna seq id no.:seq 17,aa seq id no.:seq 18)。
158.在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原识别区b1为靶向her2的源自trastuzumab的单链抗体(dna seq id no.:seq 65,aa seq id no.:seq 66)。
159.b2为cd3抗原识别区，可选地为靶向cd3的单域抗体序列(vhh)、和/或抗原结合片段(fab)、和/或单链抗体可变区序列(scfv)。在一个优选实施方案中，所述结合cd3抗原的抗体片段源自cd3抗体克隆l2k、ucht、okt3、f6a、sp34等。
160.可选地，b1和b2的位置可以调换。
161.t2为无或标签元件，可选地包含标签蛋白、荧光素标记蛋白或酶标记蛋白。优选地，所述标签蛋白包括flag蛋白(dna seq id no.:seq 13,aa seq id no.:seq 14)、his蛋白(dna seq id no.:seq 35,aa seq id no.:seq 36)。
162.各
“‑”
独立地为连接肽或肽键。
163.cd3e蛋白
164.本文所述的“cd3e蛋白”、“cd3e”均指代人源的cd3e蛋白。
165.本文所述的“cd3e蛋白胞外区”指cd3e蛋白序列的第1-104位氨基酸，如seq id no.no.:4所示。
166.所述蛋白序列包含与所述氨基酸序列的同源性不小于60％的氨基酸序列，例如，至少为65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
167.嵌合cd3e融合蛋白
168.本文所述的“嵌合cd3e融合蛋白”、“cd3e融合蛋白”、“嵌合cd3e蛋白”、均代指在t细胞中表达的融合蛋白，其结构如下式i所示：
169.l-ec-h-tm-c-cd3ζ
ꢀꢀꢀꢀ(i)170.式中，
171.各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
172.l为任选的信号肽序列；
173.ec为多肽结合域，其来自或源自cd3e蛋白，所述多肽结合域可被cd3抗体识别并与cd3抗体结合；
174.所述的多肽结合域也是指cd3抗体的识别结合域；
175.所述的多肽结合域也是指cd3抗体的识别结合域的亚单位；
176.h为任选的连接子或铰链区；
177.tm为跨膜结构域；
178.c为无或共刺激信号分子；
179.cd3ζ为无或源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
180.在另一个优选实施方案中，所述多肽结合域是seq id no.no.:4所示的cd3e胞外区，或其能够被cd3抗体识别的部分。
181.在另一个优选实施方案中，所述的cd3抗体选自下组：scfv(单链抗体)、单域抗体(也成为纳米抗体)、双抗体(diabody)、fab、或其变体、或其组合。
182.在另一个优选实施方案中，所述多肽结合域特异性识别和结合cd3抗体，所述cd3抗体可以是双特异性抗体的一部分。
183.在另一个优选实施方案中，所述铰链区为cd8 hinge，其氨基酸序列为seq id no.:3。
184.在另一个优选实施方案中，所述跨膜区为cd8 tm，其氨基酸序列为seq id no.:8。
185.嵌合cd3e和基于cd3抗体的双特异性t细胞激活器编辑t细胞(chimeric cd3e and anti-cd3 based bispecific t cell activator engineered t cells,cab-t)
186.本文所述的“嵌合cd3e和基于cd3抗体的双特异性t细胞激活器编辑t细胞”、“cab-t细胞”、“cab-t技术”、“cab结构”、“cab-t”、
“‑
cab-t”、
“‑
cab”均代指共表达嵌合cd3融合蛋白和基于cd3抗体的双特异性t细胞激活器的编辑t细胞。优选地，所述编辑t细胞包含以下结构：(i)cab结构中的嵌合cd3e至少包含下述4各组件：cd3e胞外区、cd8铰链区和跨膜去、4-1bb胞内区和cd3胞内区；(ii)基于anti-cd3的双特异性t细胞激活器(bita)结构至少包含两个部分：识别/结合肿瘤抗原的单域抗体序列(vhh)、fab片段、或单链抗体可变区序列(scfv)或t细胞受体(tcr)序列，以及tcr复合物中识别cd3抗原的可变区序列。
187.如上所述的，所述cd3e胞外区的氨基酸序列如seq id no.:seq 4所示，所述4-1bb的氨基酸序列如seq id no.:seq 10所示，所述cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.:seq 12所示。
188.其他优选的合成基因序列见表1:
189.表1.合成基因名称及其核苷酸和氨基酸序列
190.[0191][0192][0193]
caix
[0194]
caix是一种表达在多种实体肿瘤细胞中的跨膜蛋白。caix的主要功能是在实体肿瘤常见的低氧条件下维持胞内ph的稳态。caix在肿瘤细胞中的表达被认为是肿瘤环境的低氧和患者较差的预后的标志蛋白。常见的表达caix的肿瘤类型包括子宫颈癌、肾癌、脑癌、头颈癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌等。正常组织中，caix主要表达在胆管和小肠的上皮细胞，以及胃上皮细胞等，但是与肿瘤细胞不同，正常组织中表达的caix主要定位在胞质中。因此，caix是包括细胞治疗在内靶向治疗非常理想的治疗靶点。
[0195]
her2
[0196]
her2是在肿瘤免疫治疗研究最多的靶点之一，常见在乳腺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌、卵巢癌、肺癌等组织中表达。尽管靶向her2的单克隆抗体药物曲托株单抗已经大幅提高了her2阳性乳腺癌患者的生存质量和生存期，但仍有大量的her2阳性肿瘤患者对曲托株单抗无反应或产生抗药性。因此，开发靶向her2的新的治疗方法仍有很大的市场需求。目前，也已有靶向her2的car-t药物的报道。其中，steven a rosenberg报道了靶向her2三代car-t药物的临床实验中出现了严重的毒副作用，并由于造成患者呼吸窘迫和严重的肺部免疫细胞浸润导致患者死亡。所以，开发靶向her2细胞药物的过程中，一定要在设计上凸显药物的安全性。
[0197]
组合物
[0198]
本公开提供了一种含有共表达嵌合cd3融合蛋白和基于cd3抗体的双特异性t细胞激活器(即，cab-t细胞)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物(composition)或制剂(formulation)。在一个实施方式中，所述组合物为液态制剂。优选地，所述组合物为注射剂。优选地，所述组合物中所述cab-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，更优地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0199]
在一个实施方式中，所述组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0200]
治疗性应用
[0201]
本公开包括共表达嵌合cd3融合蛋白和基于cd3抗体的双特异性t细胞激活器(即，cab-t细胞)的治疗性应用。经包含本公开的核酸构建体的载体转导的t细胞可靶向肿瘤细胞的标志物，同时自分泌、旁分泌的bita(由所述编辑t细胞分泌)能够协同激活t细胞，引起t细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
[0202]
因此，本公开也提供了在哺乳动物中刺激靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括施用所述cab-t细胞的步骤。
[0203]
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。可用本公开的核酸构建体和编辑t细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌(carcinoma)、胚细胞瘤(blastoma)和肉瘤(sarcoma)，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0204]
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细
胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0205]
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌。
[0206]
本发明的cab-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0207]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码cab的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
[0208]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的cab的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。cab-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和cab-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0209]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本公开也提供了用于体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0210]
本公开提供了治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本公开的cab-修饰的t细胞。
[0211]
本公开的cab-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群联合施用。简单地说，本公开的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本公开的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0212]
本公开的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管合适的剂量可由临床试验确定。
[0213]
当指出“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本公开组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员容易地通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗而确定。
[0214]
可以以任何方便的方式向受试者施用所述组合物，包括通过喷雾法、注射、口服、
输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内(intranodally)、脊髓内(intraspinally)、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本公开的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本公开的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0215]
在本公开的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩增至治疗性水平的方法活化和扩增的细胞，与任何数量的相关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于：使用抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)的治疗或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本公开的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本公开的细胞组合物与骨髓移植、化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)或环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本公开的扩增的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩增的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0216]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本公开的经修饰的t细胞通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
[0217]
本公开的技术方案具有如下有益效果：
[0218]
1.本公开提供一种抑制肿瘤尤其是实体肿瘤的免疫治疗方案——将表达嵌合cd3融合蛋白的t细胞与bita联用。所述嵌合cd3融合蛋白与bita相互结合，发挥活化t细胞和靶向肿瘤细胞的功能。
[0219]
2.本公开还提供的一种cab技术，通过在t细胞中嵌合表达cd3和bita从而使得cab-t细胞靶向肿瘤组织，其分泌的bita在肿瘤组织中可以同时实现cab-t细胞激活和非编辑t细胞内源tcr复合物的活化，并发挥cab-t自身抗肿瘤以及调动未编辑t细胞的抗肿瘤作用，这保证了cab-t临床应用的有效性。
[0220]
3.由于嵌合cd3的活化依赖于cab-t分泌的bita，肿瘤组织中cab-t释放的少量bita可以刺激局部肿瘤微环境中cab-t释放更多的bita，这保证了cab-t临床应用的安全性优势。
[0221]
4.cab-t可以在实体肿瘤组织中可以实现更好地活化，实现在肿瘤部位发挥最大的抗肿瘤效果，达到近似肿瘤局部给药的安全性和有效性，与第二代car-t相比，在实体肿瘤的临床治疗中具有巨大的优势和潜力。
[0222]
下面结合具体实施，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0223]
实施例1 cab及对照结构的设计
[0224]
1.1对照组cd3e-bbζ、1
st-caix-bita、1
st-caix-cab和caix-truc的结构设计
[0225]
为验证cab-t的抗肿瘤活性，在一组实验中我们利用靶向caix的纳米抗体(vhh)首先设计了第一组共四种结构：cd3e-bbζ(dna seq id no.:seq 15,aa seq id no.:seq 16),caix-bita(dna seq id no.:seq 21,aa seq id no.:seq 22),caix-cab(dna seq id no.:seq 25,aa seq id no.:seq 26)and caix-truc(dna seq id no.:seq 31,aa seq id no.:seq 32)。为了与后述第二组caix-cab结构相区分，我们将此组的caix-bita和caix-cab分别命名为1
st-caix-bita和1
st-caix-cab。其中，1
st-caix-bita为不带标签的bita，1
st-caix-cab包括cd3e-bbζ和不带标签bita的cab结构，caix-truc为利用tcr2公司的平台技术的对照结构。上述结构具体结构图如图1所示。
[0226]
1.2靶向caix的纳米抗体(vhh)试验组terbb2、cd3e-bbζ、caix-bita、caix-cab、caix-ζ、caix-bbζ和caix-28ζ的结构设计
[0227]
在另一组实验中,我们利用靶向caix的vhh设计了第二组结构，包括：截短erbb2(terbb2，作为阴性对照，包括erbb2胞外第四个基域、跨膜区和flag标签)(dna seq id no.:seq 33,aa seq id no.:seq 34),cd3e-bbζ(dna seq id no.:seq 15,aa seq id no.:seq 16),caix-bita(dna seq id no.:seq 37,aa seq id no.:seq 38),caix-cab(dna seq id no.:seq39,aa seq id no.:seq 40),caix-ζ(靶向caix的一代car结构)(dna seq id no.:seq 41,aa seq id no.:seq 42),caix-bbζ(含4-1bb共刺激基域的二代car结构)(dna seq id no.:seq 45,aa seq id no.:seq 46)and caix-28ζ(含cd28共刺激基域的二代car结构)(dna seq id no.:seq 47,aa seq id no.:seq 48)。在此组结构中，所有结构都带有flag标签，并且所分泌的bita抗体都带有his标签。加入his标签有利于后续检测bita分泌水平。具体结构如图2所示。
[0228]
1.3靶向her2的单链抗体试验组terbb2、cd3e-bbζ、her2-bita、her2-cab、her2-ζ、her2-bbζ和her2-28ζ的结构设计
[0229]
第三组实验中，我们利用靶向her2的单链抗体(scfv)测试了cab平台的抗肿瘤活性。该单链抗体可变区序列来源于抗体药herceptin(trastuzumab)。在该实施例中，我们设计的第三组结构，包括：截短erbb2,cd3e-bbζ,her2-cab(dna seq id no.:seq 49,aa seq id no.:seq 50),her2-ζ(dna seq id no.:seq 51,aa seq id no.:seq 52),her2-bbζ(dna seq id no.:seq 53,aa seq id no.:seq 54)and her2-28ζ二代car结构(dna seq id no.:seq 55,aa seq id no.:seq 56),共计7种结构。在此组结构中，除her2-ζ之外的所有结构都带有flag标签，所有分泌的bita抗体也都带有his标签。具体如图3所示。
[0230]
实施例2 cab及其对照结构慢病毒载体的包装
[0231]
本公开中，我们利用慢病毒作为载体制备cab-t细胞。首先，我们制备了携带cab及其对照结构编码基因的慢病毒载体。慢病毒包装具体流程如下：
[0232]
1)在10cm培养板中铺1
×
107hek 293t细胞，加10ml的含10％fbs(gibco，10099-141c)的dmem(hyclone，sh30243.01)培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜；
[0233]
2)第2天，待hek 293t(atcc,crl-3216)细胞融合度达到90％左右更换无血清dmem；
[0234]
3)准备质粒复合物，各质粒的量分别为：8μg plasmid dna,4μg pspax2和2μg pmd2g，溶于1ml opti-mem(gibco，31985-070)中并加42μl pei(polysciences,24765-2)；
涡旋震荡20s。室温静置15分钟后轻柔地将混合物沿着边加入到hek293t培养基中，37度继续培养；
[0235]
4)培养4h后，去除培养基，pbs(hyclone，sh30256.01)洗一遍，重新加入预热的包含2％fbs的新鲜dmem培养基；
[0236]
5)转染48h和72h后分别收集上清，2000g离心5分钟后弃去沉淀，上清用0.25μm滤器(sartorius，16541-k)过滤后加终浓度5％peg8000(sigma,89510-1kg-f)和终浓度0.15m的nacl(sigma，s5150-1l)剧烈混匀后于4℃过夜；
[0237]
6)将病毒上清在2000g，4℃离心20分钟，去上清并将病毒沉淀溶于50-100μl pbs中，-80℃冻存。
[0238]
实施例3 cab及其对照结构工程化t细胞的制备
[0239]
携带cab结构的慢病毒载体制备完成后，即可利用此慢病毒载体感染免疫细胞，以完成cab-t细胞的制备。cab-t细胞的制备具体流程如下：
[0240]
1)将商品化pbmc(赛笠生物，slb-hp050b)细胞用含有5％人血白蛋白(grifols，人血白蛋白20％)的x-vivo 15(lonza，04-418q)培养，起始细胞密度为1
×
106/ml；
[0241]
2)按细胞:beads＝3:1的比例加入anti-cd3/cd28 beads(miltenyi biotec，130-091-441)，并加入1000iu/ml的il-2(四环生物，国药准字s10970016)以激活t细胞扩增；
[0242]
3)细胞激活48小时后加入适量病毒和12μg/ml鱼精蛋白(sigma，p4005)感染t细胞；
[0243]
4)慢病毒感染24h后，将细胞悬液吸出，并按1
×
106细胞/ml的浓度补加完全新鲜x-vivo 15培养基；
[0244]
5)每天观察细胞的密度，适时补加含il-2 1000iu/ml的t细胞培养液，使t细胞的密度维持在1
×
106cell/ml左右，继续扩增5-10天，完成car-t细胞的制备。
[0245]
实施例4 cab-t细胞阳性率检测
[0246]
cab-t及其对照组细胞制备完成后，需要确定感染率以作为后续活性分析的依据。具体地，使用flag抗体检测cab-t阳性率的方法如下：
[0247]
1)取3-5
×
105细胞，每个流式管中加入200μl facs buffer(含1％fbs的pbs)，300g，5min离心；caix-truc样本加入终浓度100nm的biotin-caix(sino biological，10107-h02h),4℃孵育20min；her2-truc样本加入终浓度100nm的biotin-her-2(acro,he2-h82e2),4℃孵育20min；弃掉上清，加入200μl fixation/permeabilization溶液(bd bioscience，554715)，4℃孵育20min；
[0248]
2)300g，离心5min；倒掉离心后的上清液，加200μl 1
×
perm/wash buffer(bd bioscience，554715)重悬，400g，离心5min；洗两遍；
[0249]
3)倒掉离心后的上清液，每个样本中加入100μl按1:1000比例经facs buffer稀释后的anti-flag抗体，混匀细胞，4℃孵育30min；
[0250]
4)孵育后，向每个流式管中加入1ml facs buffer，400g，5min离心；
[0251]
5)倒掉离心后的上清液，加1ml facs buffer重悬，400g，5min离心；
[0252]
6)倒掉离心后的上清液，每个样本中加入100μl按1:250比例经facs buffer稀释后的sa-pe(invitrogen，s866)，混匀细胞，4℃避光孵育30min；孵育后，向每个流式管中加入1ml facs buffer，300g，5min离心；倒掉离心后的上清液，重复洗两遍；
[0253]
7)将样品置于流式细胞仪检测。
[0254]
结果：
[0255]
在第一组实验中，由于cd3e-bbζ结构和1
st-caix-cab结构中带有flag标签，可以利用flag抗体来检测相应结构编辑t细胞的阳性率，而caix-truc编辑t细胞可以利用生物素标记的caix蛋白检测t细胞转染的阳性率。但是，由于1
st-caix-bita结构没有合适的标签，因此无法检测其编辑t细胞的阳性率。但根据后续结果判断，1
st-caix-bita编辑t细胞的阳性率水平可以满足实验分析的需求。检测结果如图4所示。
[0256]
在第二组和第三组实验中，我们在每个结构中都设计了flag标签，相应编辑t细胞的阳性率检测可利用flag抗体标记并完成检测(her2-ζ一代结构不带有flag标签，使用生物素化的her2进行转导效率检测)。nt为non-transduced t cells(nt)，为阴性对照组。检测结果如图5和图6所示，不同样品间的感染率差异在可接受范围内。
[0257]
由上可知，使用本公开及现有技术公开的结构,设计得到的各组编辑t细胞转染的阳性率均满足实验分析的需求。
[0258]
实施例5 cab-t抗原依赖的细胞因子释放水平的检测
[0259]
cab-t细胞与肿瘤细胞共培养时，cab-t能够识别肿瘤细胞表面的靶抗原并发生活化，释放大量炎性细胞因子。基于此，本实施例中利用酶连免疫吸附实验(elisa)检测活化cab-t细胞释放细胞因子的水平。
[0260]
elisa检测流程如下：
[0261]
1)效应细胞和靶细胞各1
×
105，200μl/孔。将共培养过夜的96孔细胞培养板，300g，5min离心，用多道移液器吸取150μl上清液/孔转移到新的96孔细胞培养板，细胞因子检测分别使用ifn-γ(invitrogen,88-7316-88)/il-2(invitrogen,88-7025-88)/tnf-α(invitrogen,88-7346-88)检测试剂盒检测；
[0262]
2)提前一天用human anti-ifn-γ/il-2/tnf-α抗体包被酶标板。将human anti-ifn-γ/il-2/tnf-α抗体用pbs稀释(1:250)，每孔加入100μl抗体，用封板膜将酶标板密封，4℃过夜；
[0263]
3)洗板：迅速倒掉板内液体，用多道移液器加入wash buffer，每孔200μl，重复洗板五次；
[0264]
4)每孔加入200μl 1
×
elisa/elisaspot diluent，盖上封板膜，室温封闭60分钟；
[0265]
5)洗板：迅速倒掉板内液体，用多道移液器加入wash buffer，每孔200μl，重复洗板五次；
[0266]
6)准备human ifn-γelisa standard，设置8个梯度(单位pg/ml)：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8125；
[0267]
7)将标准品和样品加入酶标板，100μl/孔，样品和标准品均用1
×
elisa/elisaspot diluent稀释到所需浓度，盖上封板膜，室温孵育2h；
[0268]
8)洗板：迅速倒掉板内液体，用多道移液器加入wash buffer，每孔200μl，重复洗板四次；
[0269]
9)将human ifn-γ/il-2/tnf-α检测抗体用pbs稀释(1:250)，每孔加入100μl抗体，用封板膜将酶标板密封室温孵育1h；
[0270]
10)准备hrp-conjugated streptavidin，用pbs稀释(1:250)，每孔加入100μl到酶
标板。盖上封板膜，室温孵育30分钟；
[0271]
11)洗板：迅速倒掉板内液体，用多道移液器加入wash buffer，每孔200μl，重复洗板五次；
[0272]
12)提前30min恢复tmb substrate至室温，每孔加入100μl到酶标板。室温反应5-10分钟后，加入50μl/孔stop solution；
[0273]
13)酶标仪在检测波长od＝450nm处读取吸光度；
[0274]
14)根据标准品的浓度和od值计算标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。graphpad prism作图软件作图。
[0275]
结果：
[0276]
在第一组实验中，当caix-cab-t细胞或其对照组细胞分别与caix hek 293t细胞或caix-hek293t共培养后检测上清液中炎性细胞因子il-2、ifn-γ的释放水平。结果如图7所示，当caix-cab-t及其对照分别与caix-hek 293t细胞共培养时，所有免疫细胞均没有明显细胞因子释放。而当caix-cab-t及其对照与caix hek 293t细胞共培养时，1st-caix-bita、1st-caix-cab和caix-truc编辑的t细胞都会呈现共培养时间依赖性的细胞因子释放水平，共培养48h累积的细胞因子明显高于共培养24h累积的细胞因子水平。而当未编辑t细胞和cd3e-bbζ编辑t细胞分别与caix hek 293t细胞共培养时，均未检测到il-2和ifn-γ两种细胞因子的明显释放。同时，意外地发现共培养48h后，1st-caix-cab-t细胞释放的细胞因子水平明显多于1st-caix-bita-t细胞的释放水平；当cd3e-bbζ和1st-caix-bita编辑的t细胞按1：1比例混合后再与caix hek 293t细胞共培养后，发现其释放的细胞因子水平与1st-caix-cab-t细胞的释放水平相当。以上结果表明，caix-cab-t细胞活化对caix抗原的依赖性，以及bita和cd3e-bbζ在促进t细胞活化方面的协同性；也证明了cab-t细胞与对照组truc-t细胞具有相当的体外活化能力。
[0277]
在第二组实验中，检测caix-cab-t及其对照组细胞分别与caix mb-231或caix-mb-231细胞(caix表达水平如图8.a所示)共培养后检测上清中炎性细胞因子il-2、ifn-γ、tnf-α的释放水平。结果如图8所示，当caix-cab-t细胞及其对照分别与caix-mb-231细胞共培养时，所有细胞均没有明显细胞因子释放。而当caix-cab-t及其对照分别与caix mb-231细胞共培养48h后，caix-bita、caix-cab、caix-bbζ、caix-28ζ及caix-ζ编辑的t细胞均会有不同程度的活化水平。从数据可以发现，caix-cab-t与caix-bita、一代和二代car结构修饰t细胞在ifn-γ和tnf-α的释放能力基本相当；而在il-2释放方面，caix-cab-t显著弱于二代car细胞，但略高于caix-bita及一代car修饰t细胞。第二组实验结果表明，caix-cab-t细胞活化对caix抗原的依赖性，以及在细胞因子释放方面与二代car相比的差异性，即caix-bita-t和caix-cab-t释放的ifn-γ和tnf-α与二代car基本相当，而在il-2释放方面明显弱于二代car。
[0278]
实施例6 cab-t的抗原依赖性t细胞活化标志物表达上调
[0279]
cab-t细胞与肿瘤细胞共培养时，cab-t能够识别肿瘤细胞表面的靶抗原并发生活化，t细胞活化标志蛋白包括cd137、cd25、cd27等的膜表面表达水平会显著上调，以ki67表达水平为代表的细胞增殖能力会增加，以cd107a为代表的t细胞的杀伤能力也会增强。基于此，本实施例中利用上述染色方法和流式细胞技术检测活化cab-t细胞中上述膜表面蛋白表达水平的变化。
[0280]
具体的细胞染色流程如下：
[0281]
1)效应细胞和靶细胞各1
×
105，200μl/孔。将共培养过夜的96孔细胞培养板，300g，5min离心，每孔加200μl facs buffer，300g，5min离心；
[0282]
2)倒掉离心后的上清液，加200μl facs buffer重悬细胞，300g，5min离心；
[0283]
3)用facs buffer稀释抗体(100μl/孔)
[0284]
bv421 mouse anti-human cd3(bd bioscience，562426)1:500稀释
[0285]
pe mouse anti-human cd137(bd bioscience，555956)1:200稀释
[0286]
apc mouse anti-human cd27(bd bioscience，561786)1:200稀释
[0287]
pe-cy7 mouse anti-human cd25(bd bioscience，557741)1:200稀释
[0288]
4)倒掉离心后的上清液，每孔加入100μl抗体并混合，4℃避光孵育30min；
[0289]
5)每孔加入200μl facs buffer，300g，5min离心，倒掉上清；
[0290]
6)倒掉离心后的上清液，重复步骤2.5；
[0291]
7)弃掉上清，加入200μl fixation/permeabilization溶液(bd bioscience，554715)，4℃孵育20min.；
[0292]
8)300g，离心5min；倒掉离心后的上清液，加200μl 1
×
perm/wash buffer(bd bioscience，554715)重悬，400g，离心5min；
[0293]
9)洗两遍，用facs buffer按1:1000的比例稀释抗体fitc mouse anti-flag(biolegend,637318)；
[0294]
10)400g，离心5min；倒掉离心后的上清液,洗两遍；
[0295]
11)流式细胞仪检测，以fsc,ssc画门，得到需要的淋巴细胞群(pbmcs)，从中选取cd3 bv421 ，flag fitc 细胞群即得到活的car-t细胞，再从中以未转染病毒的pbmcs为标准画门得到car-t细胞cd137 pe 细胞的百分比。
[0296]
结果：
[0297]
在第一组实验中，当caix-cab-t细胞或其对照组细胞分别与caix hek 293t细胞或caix-hek293t共培养后检测t细胞膜表面cd137和cd107a的表达水平变化。结果如图9所示，当caix-cab-t及其对照分别与caix-hek 293t细胞共培养时，cab-t及其对照组免疫细胞的cd137和cd107a表达水平均没有明显变化。而当caix-cab-t及其对照与caix hek 293t细胞共培养24后，1st-caix-bita、1st-caix-cab和caix-truc编辑的t细胞的cd137和cd107a表达水平均显著上调，且1st-caix-cab-t强于1st-caix-bita的上调水平。而当未编辑t细胞和cd3e-bbζ编辑t细胞分别与caix hek 293t细胞共培养时，均未检测到cd137和cd107a的明显上调。当cd3e-bbζ和1st-caix-bita编辑的t细胞按1：1比例混合后再与caix hek 293t细胞共培养24h后，发现其cd137和cd107a的表达水平显著高于cd3e-bbζ-t和1st-caix-bita-t单独与caix hek 293t共培养的组别。以上结果表明，caix-cab-t细胞活化对caix抗原的依赖性，以及bita和cd3e-bbζ在促进t细胞活化方面的协同性；也证明了cab-t细胞与对照组truc-t细胞具有相当的体外活化能力。
[0298]
在第二组实验中，当caix-cab-t细胞及其对照组细胞分别与caix mb-231细胞或caix-mb-231共培养48h后检测t细胞膜表面cd137、cd25、cd27和ki67的表达水平变化。结果如图10所示，当caix-cab-t及其对照分别与caix-mb-231细胞共培养时，caix-cab-t及其对照组免疫细胞的cd137、cd25、cd27和ki67表达水平均没有明显变化。而当caix-cab-t及其
对照与caix mb-231细胞共培养后，caix-bita、caix-cab和一代car及二代car编辑的t细胞的cd137、cd25、cd27和ki67表达水平均显著上调。而当terbb2和cd3e-bbζ编辑t细胞分别与caix mb-231细胞共培养时，均未检测到cd137、cd25、cd27和ki67的明显上调。以上结果表明，caix-cab-t细胞活化对caix抗原的依赖性，也证明了cab-t细胞与对照组bita-t，一代car及二代car细胞具有相当的体外活化能力。
[0299]
在第三组实验中，我们检测了利用trastuzumab来源scfv序列构建的her2-cab结构的体外活化能力。结果如图11所示，当her2-cab-t细胞及其对照组细胞分别与her2阳性的skbr3细胞株或her2阴性的raji细胞株共培养48h后检测t细胞膜表面cd137、cd25、cd27和ki67的表达水平变化。结果如图12所示，当her2-cab-t及其对照分别与raji细胞共培养时，her2-cab-t及其对照组免疫细胞的cd137、cd25、cd27和ki67表达水平均没有明显变化。而当her2-cab-t及其对照与her2阳性的skbr3细胞共培养后，her2-cab、一代car及二代car编辑的t细胞的cd137、cd25、cd27和ki67表达水平均显著上调。而当terbb2和cd3e-bbζ编辑t细胞分别与skbr3细胞共培养时，均未检测到cd137、cd25、cd27和ki67的明显上调。以上结果表明，her2-cab-t细胞活化对her2抗原的依赖性，也证明了cab-t细胞与对照组bita-t，一代car及二代car细胞具有相当的体外活化能力。
[0300]
实施例7 通过旁分泌cab-t激活未编辑t细胞的分析
[0301]
cab结构的设计初衷，是为了实现在cab-t碰到肿瘤细胞时不仅可以激活自身的抗肿瘤活性，而且其分泌的bita药物还可以活化cab-t周围未编辑的t细胞，实现旁分泌的活化作用。为检测cab-t的旁分泌活化t细胞功能，我们利用transwell实验做了验证。实验具体来讲是通过0.4μm的transwell系统，利用物理屏障将cab-t和未编辑t细胞分隔开，cab-t细胞置于上室，未编辑t细胞和肿瘤细胞置于下室。cab-t分泌的可溶性bita可以自由穿过0.4μm的格网进入下室，来激活下层的未编辑t细胞通过识别肿瘤细胞来活化的能力。
[0302]
具体实验流程如下：
[0303]
1)将bita-t及cab-t各1
×
106细胞数分别重悬于200μl x-vivo 15培养基中，随后加入到0.4-μm transwell(coning,3413)的上室；
[0304]
2)未编辑t细胞和靶细胞各1
×
106重悬于500μl的x-vivo-15培养基加入到transwell下室；
[0305]
3)将上室小心放入下室，于培养箱中培养48小时；
[0306]
4)取出共培养过夜的培养板，取出500μl下室细胞上清。300g，5min离心，用多道移液器吸取150μl上清液/孔转移到新的96孔细胞培养板，用于ifn-γ/il-2/tnf-α的elisa检测。
[0307]
结果：
[0308]
在第二组实验中(图12)，caix-bita-t和caix-cab-t分泌的bita均可以通过transwell小孔激活下层未编辑t细胞识别caix阳性mb-231肿瘤细胞的能力，表现为ifn-γ和tnf-α的高水平释放。同时，我们发现il-2释放水平未见明显变化，这与实施例9中的研究结果相一致。
[0309]
由第三组实验(图13)所显示结果来看，her2-cab-t也显示了同样的旁分泌活化未编辑t细胞识别肿瘤抗原的能力。her2-cab-t细胞，而非对照的terbb2-t细胞，可以活化transwell下层未编辑t细胞识别her2阳性skbr3肿瘤细胞。而her2-cab-t对未编辑t细胞识
别her2阴性的raji细胞没有帮助。
[0310]
第二组和第三组实验均表明，cab-t结构可以通过旁分泌bita活化未编辑t细胞识别肿瘤细胞的能力。
[0311]
实施例8 cab-t细胞免疫检查点表达水平及细胞分化表型的分析
[0312]
由于免疫细胞上免疫检查点蛋白的表达水平及免疫细胞的分化表型对过继t细胞临床治疗的疗效有很大关系。较低的免疫检查点表达水平和记忆t细胞较高的比例均预示较好的临床反应率。我们利用流式细胞术检测了cab结构对其编辑t细胞的免疫检查点表达水平和细胞表型的影响。
[0313]
具体分析流程如下：
[0314]
1)将共培养过夜的96孔细胞培养板，300g，5min离心，每孔加200μl facs buffer，300g，5min离心；
[0315]
2)倒掉离心后的上清液，加200μl facs buffer重悬细胞，300g，5min离心；
[0316]
3)用facs buffer稀释抗体，配制抗体mix(100μl/孔)
[0317][0318]
4)倒掉离心后的上清液，每孔加入100μl抗体mix，4℃避光孵育30min；
[0319]
5)每孔加入200μl facs buffer，300g，5min离心，倒掉上清；
[0320]
6)倒掉离心后的上清液，重复步骤2.5；
[0321]
7)加入200μl fixation/permeabilization溶液(bd bioscience，554715)，4℃孵育20min；
[0322]
8)300g，离心5min；倒掉离心后的上清液，加200μl 1
×
perm/wash buffer(bd bioscience，554715)重悬，400g，离心5min；洗两遍；
[0323]
9)用facs buffer按1:1000的比例稀释抗体fitc mouse anti-flag(biolegend,637318)；
[0324]
10)400g，离心5min；倒掉离心后的上清液,洗两遍；
[0325]
11)流式细胞仪检测，以fsc，ssc画门，得到需要的淋巴细胞群，从中选取cd3 bv421 ，flag fitc 细胞群即得到活的car-t细胞，
[0326]
结果：
[0327]
由第二组实验结果可以看出(图14)，在与caix阳性mb-231细胞共培养后，caix-cab-t细胞表面免疫检查点蛋白表达水平，包括lag-3、pd-1和tim-3，相比于caix-28ζ二代car-t都处于较低的水平；cab-t细胞上pd-1和tim-3的表达水平与caix-bbζ编辑的二代
car-t基本相当，cab-t细胞中lag-3的表达水平还表现出少许低于caix-bbζ编辑的二代car-t。较低的免疫检查点表达水平，显示出cab-t细胞相比于二代car-t的临床应用优势。
[0328]
此外，在第二组实验中我们还用cd45ra和ccr7来进行免疫细胞分化表型分析，其分化标志蛋白分别为：初始t细胞(cd45ra

,ccr7

),中央记忆t细胞(cd45ra-,ccr7

),效应记忆t细胞(cd45ra-,ccr7-),以及终末分化效应t细胞(cd45ra

,ccr7-)。由图14.d所示结果我们可以看出，相比于二代car-t，caix-cab-t的初始分化t细胞表型和中央记忆t细胞表型的细胞比例明显高于二代car-t细胞，而二代car-t细胞效应记忆t细胞的比例明显多于cab-t细胞。而较多中央记忆t细胞表型预示着更好的临床疗效，显示出cab-t在分化状态中相较于二代car-t的优势。
[0329]
由第三组实验(图15)所显示结果来看，her2-cab-t的免疫检查点表达状态及细胞表型的分化结果与caix-cab-t的分析结果基本一致。即：her2-cab-t的免疫检查点表达水平相比于caix-28ζ二代car-t都处于较低的水平，表达水平与caix-bbζ编辑的二代car-t相比基本相当或稍低。her2-cab-t的分化状态与二代car-t相比，也有更高比例的中央记忆t细胞表型。
[0330]
实施例9 cab-t细胞的抗原依赖性杀伤活性
[0331]
cab-t细胞是否具有体外杀伤活性是判断cab-t潜在临床疗效的关键依据。为验证cab-t的肿瘤杀伤活性，我们利用ldh方法进行检测。
[0332]
具体实验流程如下：
[0333]
1)分别设置实验孔，效应细胞对照孔，靶细胞对照孔，靶细胞最大释放孔，培养基对照孔，体积对照孔；实验步骤按照cytotoxnon-radioactive cytotoxicity assay kit(promega，g1781)标准流程；
[0334]
2)设置不同效靶比，即效应细胞数量：靶细胞数量＝0：1，1：1，5：1，10：1，20：1
[0335]
3)细胞数量：靶细胞1
×
104，50μl/孔；
[0336]
4)实验孔，加不同效应细胞:靶细胞稀释比例的细胞共100ul(效应细胞50μl 靶细胞50μl)到细胞培养板，其中，效应细胞:靶细胞＝0：1，1：1，5：1，10：1或20：1，设置3个重复；
[0337]
5)效应细胞对照孔，即效应细胞：靶细胞＝0：0，1：0，5：0，10：0，20：0，设置2个重复；
[0338]
6)靶细胞对照孔，加入50μl靶细胞1
×
104/孔，以及50μl培养基；
[0339]
7)靶细胞最大释放孔，即加入50μl靶细胞1
×
104，以及50μl培养基，在收样前1h加入10μl裂解液；
[0340]
8)培养基对照孔，即加入100μl培养基；
[0341]
9)体积对照孔，即加入100μl培养基，在收样前1h向靶细胞最大释放孔中加入10ul裂解液的同时，加入10μl裂解液，37℃孵育。
[0342]
10)根据设计好的版布局，加样，铺板放置37℃，5％co2孵育24h，或36h，或48h；
[0343]
11)从-20℃冰箱中取出检测缓冲液(assay buffer)置于4℃冰箱溶解，注意避光。使用时加12ml检测缓冲液(assay buffer)到一瓶底物混合物(substrate mix)中混匀。
[0344]
12)将培养板置于250g，4min离心，转移50μl/孔细胞上清到新的酶标版；
[0345]
13)向新的酶标版中加入50μl/孔底物混合物(避光，12ml assay buffer加到一瓶substrate mix中混匀)；
[0346]
14)室温避光孵育30min，加入50μl/孔终止液；
[0347]
15)酶标仪在检测波长od＝490nm处读取吸光度，1h内完成。
[0348]
16)根据od值，计算细胞杀伤比例(百分比％)
[0349]
实验孔＝效靶比-培养基对照(均值)
[0350]
靶细胞自发释放＝靶细胞对照-培养基对照(均值)
[0351]
效应细胞自发释放＝效应细胞对照-培养基对照(均值)
[0352]
靶细胞最大释放＝靶细胞最大释放(均值)-体积对照(均值)
[0353]
细胞杀伤比例(％)＝(实验-靶细胞自发释放-效应细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)
[0354]
结果：
[0355]
cab-t分泌的bita可以实现靶抗原依赖性的cab-t细胞自身及其周围未编辑t细胞的活化，并杀伤靶抗原阳性肿瘤细胞；同时，由于cab-t细胞表达cd3e-bbζ，造成cab-t不仅可以依赖内源tcr活化，cd3e-bbζ也可以增强cab-t细胞的活化水平，进而促进cab-t释放更多的bita，彼此再互相增强。因此，理论上cab-t相较于bita-t应该对肿瘤细胞有更强的杀伤效果。
[0356]
在第一组实验中，为检测caix-cab-t细胞对caix hek 293t靶细胞的杀伤作用，我们选择以caix-cab-t细胞为实验组效应细胞进行了杀伤作用检测。按0:1、1:1、5:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞分别与靶细胞共培养24和48小时，取上清测定在不同效靶比下的t细胞对靶细胞的杀伤能力。从图16的结果我们可以看出，1st-caix-cab-t细胞及其对照组t细胞对caix-hek293t均不具有杀伤作用；而1st-bita-t细胞、1st-caix-cab-t、caix-truc-t、以及cd3e-bbζ-t和1st-bita-t的混合t细胞对caix hek 293t细胞均展现了不同程度的杀伤能力，这种杀伤能力随着效靶比的升高而增强。并且，caix-cab-t及其对照组t细胞对靶细胞的杀伤随着共培养时间的延长变得更加显著，共培养48h的杀伤效果明显强于共培养24h的杀伤效果。而cd3e-bbζ-t和未编辑t细胞对照组对caix hek 293t细胞未显示杀伤作用。此外，1st-caix-cab-t、caix-truc-t、以及cd3e-bbζ-t和1st-bita-t的混合t细胞对caix hek 293t细胞的杀伤能力相当，且优于1st-bita-t的杀伤能力。由此，我们可以确定，caix-cab-t对肿瘤细胞的杀伤能力依赖于其靶抗原的表达，且其杀伤能力与对照组caxi-truc-t细胞的杀伤能力相当。此外，bita-t与cd3e-bbζ-t也显示出对靶细胞的杀伤具有协同效应。
[0357]
第二组实验与第一组实验方法相同，我们检测了caix-cab-t及其对照细胞对caix

mb-231或caix-mb-231肿瘤细胞的杀伤能力。按0:1、1:1、5:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞分别与靶细胞共培养36h，取上清测定在不同效靶比下的t细胞对靶细胞的杀伤能力。从图17所示结果我们可以发现，caix-cab-t及其对照细胞对caix-mb-231对照肿瘤细胞均不具有杀伤作用；而caix-cab-t与靶向caix的一代和二代car-t细胞表现出对caix

mb-231细胞相当的杀伤能力。同时，terbb2-t和cd3e-bbζ-t对照组细胞对caix

mb-231细胞不具有杀伤力。caix-cab-t显示出与一代和二代car-t相当的对肿瘤细胞的杀伤力，且该杀伤能力具有靶抗原依赖性。需要注意的是，由于较高的转导率或供体细胞来源不同等原因，caix-cab-t和caix-bita-t在此组实验中未显示出对靶细胞杀伤能力的差异。
[0358]
第三组实验与第一组和第二组实验相同，我们检测了her2-cab-t及其对照细胞对
her2阳性肿瘤细胞skbr3或her2阴性肿瘤细胞raji杀伤能力。按0:1、1:1、5:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞分别与靶细胞共培养36h，取上清测定在不同效靶比下的t细胞对靶细胞的杀伤能力。从图18所示结果我们可以看出，her2-cab-t及其对照细胞对her2阴性的raji细胞均不具有杀伤作用；而her2-cab-t与靶向her2的一代和二代car-t细胞表现出对skbr3相当的杀伤能力。同时，terbb2-t和cd3e-bbζ-t对照组细胞对skbr3细胞不具有杀伤力。her2-cab-t显示出与一代和二代car-t相当的对肿瘤细胞的杀伤力，且该杀伤能力具有靶抗原依赖性。
[0359]
实施例10 不同cab结构与bita以及二代car的体外活性比较
[0360]
由于细胞中cd3e-bbζ和bita的表达水平不同，我们试图分析不同结构的cab和bita以及第二代car的差异。我们首先设计了一组cab及其对照结构，如图19所示，包括:terbb2,her2-bita,her2-cab,her2-cabr(dna seq id no.:seq 67,aa seq id no.:seq 68)和her2-bbζ。使用携带上述结构的载体，按照实施例2所述的方法包装慢病毒，并按照实施例3所述的方法感染t细胞。按照实施例4所述方法检测感染细胞的阳性率，检测结果如图20所示。这些编辑t细胞的阳性率基本一致。
[0361]
为了鉴定编辑t细胞的体外活化能力，参照实施例5的方法，将编辑t细胞分别与her2阴性的raji细胞和her2阳性的skbr3细胞共培养后，检测细胞因子il-2和ifnγ的释放水平。结果如图21所示。her2-cab-t和her2-cab
r-t细胞激活后细胞因子的释放水平基本相同。
[0362]
为了鉴定编辑t细胞体外杀伤能力的差异，我们按照实施例9中描述的方法检测了每种编辑t细胞对raji和skbr3细胞的体外杀伤能力。与her2-cab结构相比，由于her2-cabr结构前面有bita，后面有cd3e-bbζ结构，理论上，her2-cab
r-t可以分泌更高水平的bita。我们推测her2-cab
r-t细胞的体外杀伤能力优于her2-cab-t细胞。如图22所示，结果与我们的假设一致，即her2-cab
r-t的体外杀伤能力优于her2-cab-t细胞。
[0363]
实施例11 caix cab-t的体内疗效
[0364]
cab-t在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性是判断cab-t潜在临床疗效的关键依据。为鉴定cab-t在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性，我们进行了以下验证实验。
[0365]
具体实验流程如下：
[0366]
caix

mda-mb-231细胞扩增培养及接种
[0367]
1)体外培养和扩增足够的caix

mda-mb-231细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，使用pbs洗涤三次并计数，用含20％matrigel的80％rpmi-1640基础培养基调整细胞密度至15 x106/ml。这些细胞被置于一个50ml离心管，用密封膜将离心管的开口盖紧密封，通过转移窗将离心管送入spf级动物室。
[0368]
2)将已购买的8周龄ncg严重免疫缺陷雌性小鼠68只适应性喂养1周后，用剃须刀刮除小鼠右腹部毛发。使用1ml移液管将密度为15 x106/毫升的caix

mda-mb-231细胞分离并充分混合，使用1毫升注射器将0.2毫升细胞皮下接种至每个ncg小鼠的右腹部，即每个ncg小鼠接种3x106caix

mda-mb-231细胞，每天观察ncg小鼠皮下肿瘤形成情况，接种后6天用带数字的耳标给每只小鼠编号；
[0369]
caix

mda-mb-231荷瘤小鼠分组、给药和测量
[0370]
3)接种10天后，用游标卡尺测量每只ncg小鼠右腹部皮下肿瘤的最大宽轴w和最大
长轴l，用电子秤称体重。按肿瘤体积t＝1/2xwxwxl计算每只ncg小鼠右腹部皮下肿瘤体积。排除肿瘤过大和过小的小鼠，按肿瘤平均体积将ncg小鼠平均分为11组，每组6只；
[0371]
4)各组按以下给药方案分组，注射相应的试剂或细胞。在用于编辑t细胞的hcaix-bita(dna seq id no.:seq 71,aa seq id no.:seq 72),hcaix-cab(dna seq id no.:seq 73,aa seq id no.:seq 74),以及hcaix-bbζ(dna seq id no.:seq 75,aa seq id no.:seq 76)结构中，用于识别caix的抗体序列均来源于vhh氨基酸序列seq id no.18的人源化序列。
[0372]
各组给药方案：
[0373][0374][0375]
5)每周测量2次小鼠的肿瘤体积和体重。接种肿瘤细胞后第37天，最后一次测定小鼠的体重和肿瘤体积。小鼠安乐死后，解剖每只小鼠的肿瘤，称肿瘤重量，并拍照。
[0376]
结果和讨论
[0377]
各组小鼠的肿瘤生长曲线、肿瘤照片以及肿瘤重量如图中所示，pbs组和nt组小鼠的肿瘤随着接种时间的延长迅速增加，表明本实验中cdx移植模型成功建立；与pbs组和nt
组相比，hcaix-bita-t细胞组和hcaix-bbζ-t细胞组仅在2.5x106/小鼠剂量下显示出对肿瘤生长的抑制，然而，hcaix-cab-t细胞组在三个剂量组中都有一定效果，并且该效果是剂量依赖的，其中，2.5x106/小鼠组中的所有肿瘤均退化，0.75x106/小鼠组中的5只显示肿瘤退化；在相同剂量时，hcaix-cab-t细胞组明显优于hcaix-bita-t细胞组和hcaix-bbζ-t细胞组。各组小鼠的肿瘤生长曲线、肿瘤图像、肿瘤重量结果趋势一致(图23a、c、d)。在整个实验期间，各组小鼠的体重均未见明显下降(图23b)，说明各检测样本的安全性。
[0378]
实施例12 her2 cab-t的体内疗效
[0379]
通过以下实验在m-nsg免疫缺陷小鼠肿瘤模型中鉴定her2 cab-t的抗肿瘤活性。
[0380]
nci-n87细胞扩增培养及接种
[0381]
1)在体外培养和扩增nci-n87细胞，胰酶消化后收集细胞，pbs洗涤3次，计数，用含20％matrigel的80％rpmi-1640基础培养基调整细胞密度至10x106细胞/ml，置于50ml离心管中，用密封膜将离心管的开口盖紧密封，通过转移窗将离心管送入spf级动物室。
[0382]
2)适应性喂养8周龄nsg严重免疫缺陷雌性小鼠32只，用剃须刀刮除小鼠右腹部毛发。用1ml移液管将密度为10x106细胞/ml的nci-n87细胞分离并充分混合，用1ml注射器皮下接种0.2ml细胞至每只nsg小鼠右腹部，即每只nsg小鼠接种3x10
6 nci-n87细胞，每天观察nsg小鼠皮下肿瘤形成情况，每只nsg小鼠接种后6天用带有数字的耳标进行编号。
[0383]
nci-n87荷瘤小鼠分组、给药和测量
[0384]
3)接种6天后，用游标卡尺测量每只nsg小鼠右腹部皮下肿瘤的最大宽轴w和最大长轴l，用电子秤称体重。按肿瘤体积t＝1/2xwxwxl计算每只ncg小鼠右腹部皮下肿瘤体积。排除肿瘤过大和过小的小鼠，根据肿瘤的平均体积将nsg小鼠平均分为4组，每组6只；
[0385]
4)各组按以下给药方案进行，注射相应的试剂或细胞。在用于编辑t细胞的nt(dna seq id no.:seq 33,aa seq id no.:seq 34),her2 cabr-t(dna seq id no.:seq 67,aa seq id no.:seq 68),her2 cab-t(dna seq id no.:seq 49,aa seq id no.:seq 50)和her2 car-t结构中，识别her2的scfv抗体序列都来自于曲妥珠单抗氨基酸序列seq id no.66。
[0386]
各组给药方案
[0387]
组别第0天给药剂量第2天给药剂量给药方式nt细胞5.0x106/小鼠3.0x106/小鼠尾静脉注射her2 cab
r-t5.0x106/小鼠3.0x106/小鼠尾静脉注射her2 cab-t5.0x106/小鼠3.0x106/小鼠尾静脉注射her2 car-t5.0x106/小鼠3.0x106/小鼠尾静脉注射
[0388]
5)每周测量2次小鼠的肿瘤体积和体重。接种肿瘤细胞后第48天，最后一次测定小鼠的体重和肿瘤体积。小鼠安乐死后，解剖每只小鼠的肿瘤，称肿瘤重量，并拍照。
[0389]
结果和讨论
[0390]
各组小鼠的肿瘤生长曲线和肿瘤图片如图中所示，nt组小鼠的肿瘤随着接种时间的延长迅速增加，说明本实验成功建立了cdx移植模型；与nt组相比，其他3个编辑t细胞处理组均表现出一定的肿瘤生长抑制。与her2 car-t治疗组的轻度肿瘤生长抑制和2只无肿瘤小鼠相比，her2-cab
r-t和her2-cab-t的肿瘤生长抑制效果都好得多，分别包括5只无肿瘤小鼠和2只无肿瘤小鼠。
[0391]
各组小鼠的肿瘤生长曲线、肿瘤图像、肿瘤重量结果趋势一致(图24a、c、d)。在整个实验期间，各组小鼠的体重均无明显下降，说明各测试样本具有良好的安全性。
[0392]
实施例13 达沙替尼作为安全开关并抑制cab-t的细胞因子释放
[0393]
作为一种活细胞治疗，cab-t可能导致细胞因子释放综合征(crs)和因非肿瘤组织中靶标的结合而产生的毒性(on-target off-tumor toxicities)等。crs的临床管理包括抗il-6r激动剂tocilizumab和类固醇治疗。在此，我们开发了使用达沙替尼管理潜在毒性的方法。
[0394]
达沙替尼已被开发为bcr-abl融合蛋白的抑制剂，并已被临床批准用于慢性粒细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病的治疗。此外，达沙替尼也被报道可以阻断淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)，从而抑制cd3ζ和zap70的磷酸化，从而消除car和tcr信号通路。以下实施例表明达沙替尼能够显著抑制cab-t细胞因子的释放。
[0395]1×
105效应细胞(caix cab-t或her2 cab-t)和1
×
105靶细胞(caix mda-mb231或skbr3)接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，达沙替尼梯度浓度为100nm,50nm,25nm,12.5nm,6.25nm,0nm，共培养过夜。将培养板在300g离心5分钟，用多通道移液管将150μl上清液/孔移至新的96孔细胞培养板，细胞因子检测如实施例5所示。
[0396]
结果和讨论
[0397]
如图25a、25b和图26a、26b所示，达沙替尼在25nm左右的低剂量时，可以有效抑制活化的caix cab-t和her2 cab-t中ifnγ和il-2的分泌。这一结果提示达沙替尼可作为一种安全开关，在临床治疗中控制潜在的crs综合征和cab-t的on-target off-tumor毒性。
[0398]
实施例14 达沙替尼作为安全开关并抑制cab-t的杀伤活性
[0399]
如实施例13所述，t细胞治疗在临床上有因非肿瘤组织中靶标的结合而产生的毒性(on-target off-tumor toxicities)的潜在问题。为了管理cab-t的潜在毒性，评估了达沙替尼对cab-t杀伤活性的抑制作用。
[0400]
采用ldh细胞毒性法检测达沙替尼的杀伤抑制能力。具体操作流程见实施例9。简单地说，将5
×
104效应细胞(caix cab-t或her2 cab-t)和5
×
104靶细胞(caix mda-mb231或skbr3)与梯度浓度的达沙替尼(100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、0nm)共培养，在12小时内，每隔2小时检测一次cab-t对其靶细胞的细胞毒性[效应细胞与靶细胞(e:t)比值，5:1]。
[0401]
结果和讨论
[0402]
如图25c和图26c所示，达沙替尼在50nm左右的低剂量下有效地抑制了caix cab-t和her2 cab-t对其靶细胞的细胞毒性。这一结果表明，达沙替尼在临床治疗中可作为一种安全的药物，用于控制cab-t潜在的on-target off-tumor毒性。
[0403]
总结和讨论：
[0404]
cab-t技术利用自身分泌的bita同时识别嵌合cd3或肿瘤抗原和t细胞内源cd3，诱导肿瘤抗原依赖的内源tcr活化和嵌合cd3活化。内源tcr复合物和嵌合cd3的活化都依赖于cab-t细胞分泌的bita的表达和分泌水平。因而，bita可通过自分泌形式诱导cab-t细胞和通过旁分泌形式诱导肿瘤微环境中的未编辑t细胞活化；同时，cab-t细胞在肿瘤组织中活化后，可以在肿瘤组织中释放更高水平的bita，进而调动更多的肿瘤组织中未编辑t细胞的活化和抗肿瘤作用。
[0405]
因此，相比于truc-t和tac-t，cab-t不仅具有活化内源tcr信号的优势，还可以调
动肿瘤组织中浸润t细胞的抗肿瘤活性，理论上具有更好的实体肿瘤治疗潜力。另外，与bite药物不同，通过cab-t细胞持续分泌的bita药物，解决了bite单药半衰期短的临床应用问题；此外，由于针对靶抗原的bita会在cab-t细胞到达的肿瘤微环境部位发挥最大作用，不会在非肿瘤组织部位高浓度富集，相比于bite单药的系统给药而言，具有更优的安全性和更大的临床应用潜力。
[0406]
cab-t的作用机制及临床应用潜力阐述如下：
[0407]
1)在肿瘤组织中，cab-t细胞中低表达的bita可以通过自分泌结合其自身内源tcr或cd3e-bbζ(图19b)，从而刺激cab-t释放更多的bita从而形成局部活化回路(图19c)，引起cab-t在肿瘤部位实现最大的活化水平，发挥最大的抗肿瘤效果，达到近似肿瘤局部给药的安全性和有效性。可以预期cd3e-bbζ将与t细胞膜上的内源性cdδ或cd3γ链形成异源二聚体，从而进一步增强基于cd3的信号传导。
[0408]
2)通过自分泌bita结合并活化cab-t中的嵌合cd3e(图19a)，赋予了cab-t相比于未编辑t细胞更敏感的增殖和活化能力，进一步增强了cab-t的抗肿瘤活性。
[0409]
3)通过自分泌和旁分泌bita分别活化cab-t(图19a，b，c)和未编辑t细胞(图19d)，解决了car-t细胞无法活化内源tcr信号的问题，赋予了cab-t细胞治疗实体瘤的潜力；
[0410]
4)cab-t可以作为bita的药物合成工厂，解决了bita体内半衰期短的问题；并且cab-t的活化依赖于bita的释放水平，二者彼此依赖，相互协同，共同决定了cab-t临床应用的安全性和有效性。
[0411]
cab-t作用机制模式图如图27所示。
[0412]
在本公开提及的所有文献都在本文中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外应理解，在阅读了本公开的上述教导之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。