单核苷酸多态性及其用途

单核苷酸多态性及其用途
1.相关申请
2.本技术要求于2019年8月7日提交的美国临时申请no.62/883,934的优先权，其全文通过引用方式并入本文。
3.序列表
4.本技术包含已以ascii格式电子提交并通过引用方式全文并入本文的序列表。所述ascii副本创建于2020年8月7日，名为a110808_1040wo_seq_listing_st25.txt，且其大小为15,054字节。
技术领域
5.本发明一般涉及炎症、癌症和分子生物学领域。本发明提供了检测单核苷酸多态性(snp)的方法，利用snp预测发生炎症性疾病、癌症的风险增加的方法，以及利用snp确定患者(癌症或其他)对治疗的反应性的方法。


背景技术：

6.炎症性疾病包括一系列以炎症为特征的障碍和病症，其包括急性呼吸窘迫综合征(ards)、放射诱导的肺损伤(rili)、肺动脉高血压或肺纤维化。本领域需要诊断和治疗此类病症的改进的方法。
7.而且，在大多数发达国家，癌症是发病和死亡的主要原因。但是，几乎没有任何预测癌症风险、预测受试者对特定治疗方案的反应性和癌症诊断后的有效治疗选择的方法是已知的，因此，许多工作已集中于改进解决上述因素的方法上。
8.前列腺癌(pca)尤其代表一种对阻止pca进展和复发的疗法的未满足的需求。pca通常是在最初一线雄激素剥夺治疗(adt)后的一种惰性肿瘤，但经常在adt治疗后的5-10年显示出广泛复发(85％)。靶向于从器官局限性pca(95％存活率)向侵袭性和转移性癌症(30％存活率)的转变对于影响pca致死率至关重要。用于雄激素非依赖性原发肿瘤的细胞毒性癌症疗法在根除转移性病变中是无效的。目前关于pca从惰性疾病转变为从包膜逃逸并转移的侵袭性癌症表型的基础的概念中包括对炎症信号通路的重要作用。


技术实现要素：

9.降低pca的发病率和死亡率包括：影响pca腺体逃逸和转移进展的种族特异性风险因素的确定；预示这一进展的种族特异性生物标志物的确定；和减缓这种进展的新型的、有效的、个性化的方法的开发。新的种族特异性生物标志物的缺失、关于种族特异性pca风险因素的信息缺乏以及有效的个性化治疗的缺乏是对抗pca进展和致命疾病发展的亟待满足的需求。
10.先天免疫的调节和减少与肿瘤相关的炎性损伤(特别是调节nfkb依赖性的炎性级联)可能在前列腺癌的发生和治疗抗性中都很重要。
11.为了改善pca的治疗和存活率，特别是抑制pca进展，需要能够预测患者对特定疗
法的反应性的生物标志物。此类标志物的非限制性示例包括调节细胞因子(例如烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)，也被称为内脂素)的基因中的单核苷酸多态性(snp)。本发明的至少一些实施方案鉴定了与前列腺癌从惰性向侵袭性的转变相关的nampt启动子内的snp。本发明的至少一些实施方案提供了鉴定可能处于pca疾病进展风险中的患者的方式。也提供了在受试者中诊断和治疗前列腺癌的方法。
12.在一些实施方案中，本文提供了鉴定受试者发生侵袭性前列腺癌风险的方法，其包括以下步骤：(a)从患有惰性前列腺癌的受试者获得样品；(b)检测样品中与人类烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)相关的至少一种单核苷酸多态性(snp)的存在。所述至少一种snp选自由rs7789066、rs61330082、rs9770242、rs59744560、rs116647506、rs1319501、rs114382471和rs190893183组成的组。
13.在一些实施方案中，受试者患有遗传的惰性前列腺癌。
14.在一些实施方案中，受试者具有选自由rs7789066、rs61330082、rs9770242、rs59744560、rs116647506、rs1319501、rs114382471和rs190893183组成的组的至少2种snp、至少3种snp、至少4种snp、至少5种snp、至少6种snp、至少7种snp或至少8种snp。在一个具体的实施方案中，所述方法包括检测选自由rs7789066、rs61330082、rs9770242和rs59744560、rs116647506、rs1319501、rs114382471和rs190893183组成的组的至少2种snp。
15.在一些实施方案中，所述方法包括检测选自由rs7789066、rs61330082、rs9770242和rs59744560组成的组的至少1种snp。
16.在一些实施方案中，所述方法包括检测选自由rs116647506、rs61330082、rs114382471和rs190893183组成的组的至少1种snp。
17.在鉴定受试者处于发生侵袭性前列腺癌风险的方法的一些实施方案中，所述受试者是非洲裔。
18.在鉴定受试者处于发生侵袭性前列腺癌风险的方法的一些实施方案中，检测包括使用聚合酶链式反应(pcr)、snp微阵列、snp-限制性片段长度多态性(snp-rflp)、动态等位基因特异性杂交(dash)、引物延伸(maldi-tof)质谱、单链构象多态性和/或新一代测序(ngs)。
19.在鉴定受试者处于发生侵袭性前列腺癌风险的方法的一些实施方案中，检测包括使样品与寡核苷酸探针接触，所述寡核苷酸探针与包含snp的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列选择性杂交，和检测寡核苷酸探针的选择性杂交。在某些实施方案中，与包含snp的核苷酸序列选择性杂交的寡核苷酸探针在围绕该snp的每一侧上包含200个碱基对。在某些实施方案中，包含如seq id no：18所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs7789066的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：19所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs61330082的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：20所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs9770242的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：21所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs59744560的核苷酸序列选择性杂交；和/或包含如seq id no：22所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs1319501的核苷酸序列选择性杂交。
20.在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含可检测的标记，且其中检测探针的选择性杂交包括检测可检测的标记。在一些具体的实施方案中，可检测的标记包括荧光标记、发光
标记、放射性核素或化学发光标记。在其他的实施方案中，寡核苷酸探针包括双标记的寡核苷酸探针，其包含荧光部分和荧光猝灭剂。
21.在一些实施方案中，鉴定受试者处于发生侵袭性前列腺癌风险的方法进一步包括检测一种或多种与高于基线nampt启动子活性水平的nampt启动子活性水平相关的其他snp。
22.在鉴定受试者处于发生侵袭性前列腺癌风险的前述方法的一些实施方案中，样品为血浆样品。
23.一些实施方案提供了一种治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法，其包括以下几个步骤：(a)从患有惰性前列腺癌的受试者获得样品；(b)检测样品中至少一种snp的存在或不存在，其中所述snp选自由rs7789066、rs61330082、rs9770242、rs59744560、rs116647506、rs1319501、rs114382471和rs190893183组成的组，和(c)向具有发生侵袭性前列腺癌风险的所述受试者施用(i)有效量的enampt抑制剂和/或(ii)一种或多种放射疗法(例如，外照射疗法；和/或近距放射疗法)；激素疗法，例如促黄体激素释放激素(lh-rh)激动剂(例如，亮丙瑞林；戈舍瑞林；曲普瑞林；和/或组氨瑞林)或阻止身体产生睾酮的其他药物(例如，酮康唑；和/或阿比特龙)；抗雄激素(例如，比卡鲁胺；尼鲁米特；氟他胺；和/或恩杂鲁胺)；化疗；和生物疗法(例如，sipuleucel-t)，从而治疗患有惰性前列腺癌的受试者。该至少一种snp的存在指示所述受试者具有发生侵袭性前列腺癌的风险。
24.在治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法的一些实施方案中，样品为血浆样品。
25.在治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法的一些实施方案中，所述方法包括检测自由rs7789066、rs61330082、rs9770242、rs59744560、rs116647506、rs1319501、rs114382471和rs190893183组成的组的至少2种snp、至少3种snp、至少4种snp、至少5种snp、至少6种snp、至少7种snp或8种snp。在一些实施方案中，snp选自由rs7789066、rs61330082、rs9770242和rs59744560组成的组。在其他实施方案中，snp选自由rs116647506、rs61330082、rs114382471和rs190893183组成的组。
26.在治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法的一些实施方案中，受试者为非洲裔。
27.在治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法的一些实施方案中，所述检测包括使用聚合酶链式反应(pcr)、snp微阵列、snp-限制性片段长度多态性(snp-rflp)、动态等位基因特异性杂交(dash)、引物延伸(maldi-tof)质谱、单链构象多态性和/或新一代测序(ngs)。在一些实施方案中，snp的存在是通过使样品与寡核苷酸探针接触来检测，所述寡核苷酸探针与包含snp的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列选择性杂交，和检测所述寡核苷酸探针的选择性杂交。在某些实施方案中，与包含snp的核苷酸序列选择性杂交的寡核苷酸探针在围绕snp的每一侧上包含200个碱基对。在特定的实施方案中，包含如seq id no：18所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs7789066的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：19所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs61330082的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：20所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs9770242的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：21所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs59744560的核苷酸序列选择性杂交；和/或包含如seq id no：22所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs1319501的核苷酸序列选择性杂交。
28.在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含可检测的标记，且其中检测探针的选择性
杂交包括检测可检测的标记。在一个具体实施方案中，可检测的标记包括荧光标记、发光标记、放射性核素或化学发光标记。在进一步的实施方案中，寡核苷酸探针包括双标记的寡核苷酸探针，其包含荧光部分和荧光猝灭剂。
29.在治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括检测一种或多种与高于基线nampt启动子活性水平的nampt启动子活性水平相关的其他snp。在具体实施方案中，基线nampt启动子活性水平是与惰性前列腺癌相关的水平。
30.在治疗患有惰性前列腺癌的受试者的方法的一些实施方案中，所述方法包括施用enampt抑制剂，其中所述enampt抑制剂为抗enampt的抗体。在具体实施方案中，抗enampt抗体包含：包含含有分别如seq id no：4、5和6的氨基酸序列所示的cdr1、cdr2和cdr3结构域的可变区的重链；和包含含有分别如seq id no：7、8和9的氨基酸序列所示的cdr1、cdr2和cdr3结构域的可变区的轻链。在另一个具体的实施方案中，重链可变区包含如seq id no：2所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含如seq id no：3所示的氨基酸序列。在一个不同的实施方案中，抗enampt抗体包含：包含含有分别如seq id no：12、13和14的氨基酸序列所示的cdr1、cdr2和cdr3结构域的可变区的重链；和包含含有分别如seq id no：15、16和17的氨基酸序列所示的cdr1、cdr2和cdr3结构域的可变区的轻链。在又一个实施方案中，重链可变区包含如seq id no：10所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含如seq id no：11所示的氨基酸序列。
附图说明
31.图1a-1d描述在最低侵袭性前列腺癌(pca)、高侵袭性pca或正常前列腺组织中nampt的免疫组织化学(ihc)染色结果。图1a是表示正常前列腺组织中nampt表达极低的代表性显微照片。图1b是表示器官局限性前列腺腺癌中显著增加但中等的nampt表达的代表性显微照片。图1c提供了表示具有平滑肌包膜渗透和前列腺外空间中侵入的两种不同的前列腺腺癌中肿瘤细胞内的强nampt表达的代表性显微照片。图1d是表示正常(良性)前列腺组织或患有器官局限性和包膜侵入性疾病的pca患者中nampt表达的累积分析的图表。*表示p《0.05；；**表示p《0.005。
32.图2a-2b是健康对照、pca患者或高风险受试者中血浆nampt水平的图形化表示。图2a是描绘pca患者(95％置信区间(ci)：22.4-41)、高风险受试者(95％ci：15.9-19.5)或健康对照(95％ci：12.3-17.5)中的血浆nampt水平的图表。图2b是显示患有器官局限性pca(95％ci：17.6-21.8)或前列腺外pca(95％ci：23.1-52.1)患者中的血浆nampt水平的图表。*表示p《0.05；***表示p《0.001。
33.图3a-3e描绘了人源化抗nampt单克隆抗体(mab)对人pca细胞侵袭性的影响，如在严重联合免疫缺陷(scid)小鼠中评估的。图3a是代表性的显微照片，其表示在注射pc3(一种高度转移性的人pca细胞)后，在scid小鼠中，癌细胞通过平滑肌层侵入(侵入部位：26；侵入深度：100μm)的严重腹膜嵌入(studding)。侵入细胞中nampt表达显著增加。图3b提供了利用与图3a所述相同的scid小鼠模型但来自不同实验的癌细胞侵入位点的放大图像。图3c是表示接受每周腹膜内(i.p.)注射人源化抗nampt mab的pc3攻击的scid小鼠中pc3细胞侵入的抑制的代表性显微照片。图3d是显示注射人源化抗nampt mab或载体对照的pc3攻击的scid小鼠中肿瘤侵入百分比的图表。图3e是显示注射人源化抗nampt mab或载体对照的pc3
攻击的scid小鼠中的肿瘤侵入深度(以μm计)的图表。*表示p《0.05。
34.图4a-4b图形表示在急性呼吸窘迫综合征(ards)和其他急性炎症性病症中nampt和其他炎性细胞因子(例如il-6、il-8和巨噬细胞迁移抑制因子(mif))的血浆水平。图4a是描绘患有covid-19感染、ards或创伤的患者或健康对照(“ctl”)中的血浆nampt水平的图表。图4b是描绘活着的和死亡的ards患者中nampt、il-6、il-8和mif的血浆水平的图表，因此这些炎性细胞因子的血浆水平与ards死亡率相关。***表示p《0.001。
35.图5a-5b是健康对照或胰腺炎患者中血浆nampt水平的图形化表示。图5a是描绘健康对照或胰腺炎患者中血浆nampt水平的图表。图5b是显示患有轻度、中度或重度胰腺炎的患者中血浆nampt水平的图表。
36.图6a-6b是健康对照或脓毒症患者中血浆nampt水平的图形化表示。图6a是描绘健康对照或脓毒症患者中血浆nampt水平的图表。图6b是显示具有或不具有脓毒性休克的脓毒症患者的血浆nampt水平的图表。***表示p《0.001。
37.图7是描绘ards死亡率指数与血浆nampt水平、nampt snp及临床协变量基因型的相关性的图表。
38.图8图形表示nampt snp与ards风险和ards死亡率的相关性，如针对对照标准化的。图8的左图提供了描绘单个nampt snp(比值比：3.1)和两个nampt snp单倍型(比值比：7.7)与ards风险的相关性的图表。图8的中间图提供了描绘单个nampt snp(比值比：1.3)和两个nampt snp单倍型(比值比：1.6)与ards死亡率的相关性的图表。图8的右图提供了描绘单个nampt snp(比值比：4.3)与ards死亡率的相关性的图表。*表示p《0.05。
39.图9a-9b描绘了辐射对nampt表达的影响，如在辐射诱导的肺损伤(rili)的小鼠模型中所评估的。图9a提供了显示未辐照对照小鼠(图9a，左图)或20gy辐射暴露后1周(图9a，中间图)或4周(图9a，右图)的辐照rili小鼠的肺组织中nampt的ihc染色的代表性显微照片。图9b是辐射暴露后1周或4周的辐照小鼠的肺组织中nampt表达(％面积)的图形化描绘。图表中还描绘为阴性对照的是未辐照小鼠肺组织中的nampt表达。
40.图10a-10c描绘了辐射对人体组织和血液中nampt表达的影响。图10a提供了表示未辐照(图10a，左图)或暴露于8gy电离辐射(ir)24小时(图10a，右图)的人扁桃体上皮组织中nampt的ihc染色的代表性显微照片。图10b是描绘对照受试者或接受乳腺癌或肺癌放疗的受试者中nampt的血浆水平的图表。图10c是描绘对照受试者或放射性肺炎患者中nampt的血浆水平的图表。*表示p《0.05。
41.图11a-11e描绘了rili小鼠模型中的肺部炎症(通过苏木精和伊红(h&e)染色评估)、支气管肺泡灌洗(bal)蛋白的量和bal表达细胞的计数。图11a提供了显示未辐照对照小鼠(图11a的插图，左图)或辐射暴露后1周(图11a，左图)或4周(图11a，右图)的辐照rili小鼠的肺组织中h&e染色的代表性显微照片。图11b是未辐照对照小鼠或辐射暴露后1周或4周的辐照rili小鼠的肺组织中h&e染色(％面积)的图形化描绘。图11c是未辐照对照小鼠或辐射暴露后1周或4周的辐照rili小鼠的肺组织中bal蛋白水平(μg/ml)的图形化表示。图11d是未辐照对照小鼠或辐射暴露后1周或4周的辐照rili小鼠的肺组织中bal表达细胞的图形化表示。图11e是未辐照对照小鼠或辐射暴露后1周或4周的辐照rili小鼠的rili严重程度评分的图形化表示。*表示p《0.05。
42.图12a-12e描绘了使用野生型(wt)和nampt杂合(nampt
/-)小鼠的rili小鼠模型中
的肺部炎症(通过h&e染色评估)、bal蛋白的量和bal表达细胞的计数。图12a提供了显示未辐照(对照)wt小鼠(图12a的插图，左图)、辐照(rili)wt小鼠(图12a，左图)或辐照(rili)nampt
/-小鼠(图12a，右图)的肺组织中的h&e染色的代表性显微照片。图12b是未辐照(对照)wt小鼠、未辐照(对照)nampt
/-小鼠、辐照(rili)wt小鼠或辐照(rili)nampt
/-小鼠的肺组织中h&e染色(％面积)的图形化描绘。图12c是未辐照(对照)wt小鼠、未辐照(对照)nampt
/-小鼠、辐照(rili)wt小鼠或辐照(rili)nampt
/-小鼠的肺组织中bal蛋白水平(μg/ml)的图形化表示。图12d是未辐照(对照)wt小鼠、未辐照(对照)nampt
/-小鼠、辐照(rili)wt小鼠或辐照(rili)nampt
/-小鼠的肺组织中bal表达细胞的图形化表示。图12e是未辐照(对照)wt小鼠、未辐照(对照)nampt
/-小鼠、辐照(rili)wt小鼠或辐照(rili)nampt
/-小鼠的急性肺损伤(ali)严重程度评分的图形化表示。
43.图13a-13e描绘了nampt中和抗体对肺部炎症(通过h&e染色评估)、bal蛋白的量和bal表达细胞的计数的影响，如rili的鼠模型中所评估的。图13a提供了显示未辐照对照小鼠(图13a的插图，左图)或辐射暴露后的注射载体对照(图13a，左图)、抗nampt多克隆抗体(pab)(图13a，中图)或抗nampt单克隆抗体(mab)(图13a，右图)的辐照rili小鼠的肺组织中h&e染色的代表性显微照片。图13b是未辐照对照小鼠或注射载体对照、抗nampt pab或抗nampt mab的辐照rili小鼠肺组织中h&e染色(％面积)的图形化描绘。图13c是未辐照对照小鼠或注射了载体对照、抗nampt pab或抗nampt mab的辐照rili小鼠的肺组织中bal蛋白水平(μg/ml)的图形化表示。图13d是未辐照对照小鼠或注射载体对照、抗nampt pab或抗nampt mab的辐照rili小鼠的肺组织中bal表达细胞的数量的图形化表示。图13e是未辐照对照小鼠或注射载体对照、抗nampt pab或抗nampt mab的辐照rili小鼠的ali严重程度评分的图形化表示。*表示p《0.05。
44.图14a-14d描绘了通过
99m
tc标记的抗nampt mab探针检测nampt表达。图14a提供了描绘在未辐照对照小鼠(图14a，左图)或暴露于8gy部分身体辐照(pbi)的辐照(rili)小鼠(图14a，右图)中通过
99m
tc标记抗nampt mab探针对nampt表达检验的代表性放射自显影图像。图14b提供了描绘在未辐照对照小鼠(图14b，上图)或辐照(rili)小鼠(图14b，下图)中通过
99m
tc标记抗nampt mab探针对nampt表达检测的代表性放射自显影图像。图14c是未辐照对照小鼠或辐照(rili)小鼠左肺和右肺的肺活动与组织背景的比率的图形化表示。图14d是未辐照对照小鼠或辐照(rili)小鼠肺组织中放射性(％id/g)的图形化表示。*表示p《0.05。
45.图15a-15c描绘了人源化抗nampt mab对bal细胞计数、胶原沉积和肺组织平滑肌肌动蛋白(sma)表达的影响，如在20gy辐射暴露后18周rili的鼠模型中所评估的。图15a是描绘腹腔内注射抗nampt mab或载体对照的辐照rili小鼠的肺组织中bal表达细胞数量的图表。图15b提供了来自蛋白质印迹分析的代表性图像，其表示腹腔内注射抗nampt mab或载体对照的辐照rili小鼠的肺组织匀浆中sma的表达。图15c提供了显示腹腔内注射抗nampt mab或载体对照的辐照rili小鼠的肺组织中通过三色染色检测的胶原沉积的代表性显微照片。*表示p《0.05。
46.图16a-16c描绘了人源化抗nampt mab对炎症细胞浸润、水肿和肺损伤评分的影响，如在创伤(爆炸)/通气诱导的肺损伤(vili)的大鼠模型中所评估的。图16a提供了显示注射载体对照的创伤/vili攻击大鼠的肺或肺组织切片的代表性图像和显微照片。图16a的
左图提供了注射载体对照的创伤/vili攻击大鼠的肺的代表性图像。图16a的中间图和右图提供了显示在注射载体对照的创伤/vili攻击的大鼠中通过h&e染色评估的炎性细胞浸润和水肿的代表性显微照片。图16a的最右侧图的插图提供了显示未受到创伤/vili攻击的大鼠肺组织中h&e染色的代表性显微照片。图16b提供了显示注射抗nampt mab的创伤/vili攻击大鼠的肺或肺组织切片的代表性图像和显微照片。图16b的左图提供注射抗nampt mab的创伤/vili攻击大鼠的肺的代表性图像。图16b的中间图和右图提供了显示在注射抗nampt mab的创伤/vili攻击的大鼠中通过h&e染色评估的炎性细胞浸润和水肿的代表性显微照片。图16c是描绘注射抗nampt mab或载体对照的创伤/vili攻击大鼠的肺损伤评分的图表。
47.图17a-17c描绘了nampt中和抗体对炎性细胞浸润、水肿和肺损伤评分的影响，如在鼠lps/vili肺损伤模型中所评估的。图17a提供了显示在注射载体对照的lps/vili攻击的小鼠中通过h&e染色评估的炎性细胞浸润和水肿的代表性显微照片。图17a的插图提供了显示来自未用lps/vili攻击的小鼠的肺组织中h&e染色的代表性显微照片。图17b提供了显示在注射抗nampt mab的lps/vili攻击的小鼠中通过h&e染色评估的炎性细胞浸润和水肿的代表性显微照片。图17c是描绘在注射抗nampt mab、抗nampt pab或载体对照(pbs)的lps/vili攻击的小鼠中所评估的ali严重程度评分的图表。图17c中的图表也描绘了未用lps/vili攻击的对照小鼠的ali严重程度评分。*表示p《0.05；***表示p《0.001。
48.图18a-18d描绘了通过
99m
tc标记的抗nampt mab探针检测nampt表达。图18a提供了描绘通过
99m
tc标记的抗nampt mab探针(pronamptor)(图18a，右图)或放射性标记的igg对照ab(图18a，左图)检测暴露于20gy全肺辐照(wtli)的小鼠中nampt表达的代表性放射自显影图像。图18b提供了描绘通过
99m
tc标记的抗nampt mab探针在lps攻击后3小时的lps攻击的小鼠(图18b，右图)或未攻击的对照小鼠(图18b，左图)中检测nampt表达的代表性放射自显影图像。图18c提供了描绘通过
99m
tc标记的抗nampt mab探针检测在lps攻击后3小时的lps攻击的小鼠的肺中(图18c，下图)或未攻击的对照小鼠的肺中(图18c，上图)的nampt表达的代表性放射自显影图像。图18d是如通过放射性(％id/g)所评估的在lps攻击后3小时和18小时的lps攻击的小鼠的肺组织或未攻击的对照小鼠的肺组织中的放射性标记的抗nampt mab探针的摄取的图形化表示。*表示p《0.05。
49.图19提供了显示特发性肺纤维化(ipf)患者的肺组织中nampt的ihc染色的代表性显微照片。箭头表示ipf肺组织纤维化区域内的成纤维细胞中的nampt表达。顶部图提供4x放大倍率的显微照片，和底部图提供40x放大倍率的显微照片。
50.图20a-20c描绘了ipf患者的血浆和肺组织中的nampt表达。图20a是来自ipf患者或健康对照的血浆样品中nampt水平的图形化表示。图20b是来自死亡ipf患者、活着的ipf患者、治疗的ipf患者或未治疗的ipf患者的血浆样品中nampt水平的图形化表示。图20c是分离自晚期ipf患者或早期ipf患者的成纤维细胞中nampt mrna水平的图形化表示。*表示p《0.05。
51.图21是博来霉素攻击的wt小鼠或博来霉素攻击的nampt
/-小鼠的全肺中的可溶性胶原蛋白(μg/肺)的图形化表示，所述可溶性胶原蛋白是纤维化的指示。该图表还显示了未用博来霉素攻击的对照wt小鼠或对照nampt
/-小鼠的全肺可溶性胶原。*表示p《0.05。
52.图22a-22d描绘了肺动脉高压(pah)患者中的nampt表达和nampt snp。图22a提供了显示来自特发性肺动脉高压(ipah)患者的肺组织中nampt的ihc染色的代表性显微照片。
图22a的插图提供了显示来自健康对照的肺组织中nampt的ihc染色的代表性显微照片。图22b是获自患有pah患者、患有非pah肺病的患者或健康对照受试者的血浆样品中nampt水平的图形化表示。图22c提供了来自蛋白质印迹分析的代表性图像，其显示来自ipah患者或健康对照受试者(“nor”)的肺组织中nampt的表达。图22d是nampt启动子snp与右心室(rv)指数的相关性的图形化表示。
53.图23a-23b描绘了人源化抗nampt mab对右心室收缩压(rvsp)和肺动脉厚度的影响，如在pah的大鼠野百合碱(mct)模型中所评估的。图23a是注射抗nampt mab或载体对照(对照mct小鼠)的mct攻击的大鼠中rvsp的图形化表示。图23b提供了显示在注射抗nampt mab(图23b，右图)或载体对照(图23b，左图)的mct攻击的大鼠中如通过h&e染色评估的的肺动脉厚度的代表性显微照片。*表示p《0.05。
具体实施方式
54.定义
55.为了便于理解本发明，首先定义某些术语。此外，应当注意，当引用参数的值或值的范围时，其旨在所述值的中间值和范围也是本发明的一部分。还应注意，如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。
56.术语“单核苷酸多态性”或“snp”在本文中可互换使用，其是指当基因组中的单个核苷酸(或其他共有序列)在物种成员之间(或个体中成对染色体之间)不同时发生的dna序列变异。snp可以发生在生物体基因组的编码区或非编码区。
57.术语“nampt”或“enampt”在本文中可互换使用，其是指烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)的分泌形式，除非特别提及涉及非分泌形式(例如，细胞内nampt或nampt核酸)。以下seq id no：1提供分泌的人nampt(也称为人enampt)的氨基酸序列(也参见ncbi基因参考号nc_000007.14和蛋白质参考号np_005737.1)。
[0058][0059]
nampt也称为前b细胞集落促进因子(pbef)或内脂素。
[0060]
如本文所用，术语“基线”是指参考或对照测量值，例如来自健康受试者(即未患前列腺癌的受试者)或患有惰性前列腺癌的受试者的nampt表达的对照水平。
[0061]
如本文所用，“nampt抑制剂”或“nampt的抑制剂”是指降低或阻止nampt活性的试
剂。在一些实施方案中，nampt抑制剂与nampt结合导致nampt的生物活性的抑制。
[0062]
如本文所用，术语“nampt抗体”或“抗nampt抗体”或“抗enampt抗体”在本文中可互换使用，其是指特异性结合至nampt的分泌形式(本文也称为enampt)的抗体。在一个优选的实施方案中，抗体特异性结合人nampt(hnampt)。优选地，nampt抗体抑制nampt的生物活性。应当理解，可以使用本领域的公知技术直接测量或者可以通过对改变的下游活性的影响来测量改变的nampt活性。
[0063]
如本文所用，术语“侵袭性前列腺癌”是指被定义为具有7至10分的gleason严重程度评分的前列腺癌或转移性前列腺癌。
[0064]
如本文所用，术语“惰性前列腺癌”是指具有6分或更低的gleason严重程度评分的低级前列腺癌。
[0065]
如本文所用，术语“水平”或“量”是指生物标志物的可测量量，例如nampt表达的水平。该量可以是(a)以每单位体积的分子、摩尔或重量或细胞测量的绝对量，或(b)例如通过光密度分析测量的相对量。
[0066]
如本文所用，术语“样品”是指获自受试者的材料(例如，相似细胞或组织的集合)。样品可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或抽出物的实体组织；血液或任何血液成分；或体液，例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、汗液或滑液。在一些实施方案中，滑膜炎生物标志物获自血清样品。在一些实施方案中，软骨降解生物标志物获自尿液样品。
[0067]
术语“患者”、“个体”或“受试者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，特别是人类。患者可能未患有疾病、或者患有轻度、中度或重度疾病。患者可能是未接受过治疗的，对任何形式的治疗有反应，或者是难治疗的。患者可以是需要治疗或需要基于特定症状或家族史进行诊断的个体。在一些实施方案中，受试者是已被诊断患有非侵袭性或惰性前列腺癌、先前接受过非侵袭性或惰性前列腺癌治疗或具有非侵袭性或惰性前列腺癌症状的人类受试者。在其他实施方案中，受试者是尚未被诊断患有前列腺癌、先前未接受过前列腺癌治疗或不具有前列腺癌症状的健康人类受试者。在又一实施方案中，受试者是已被诊断患有侵袭性前列腺癌、先前治疗过侵袭性前列腺癌或具有侵袭性前列腺癌症状的人类受试者。
[0068]
例如“治疗(treating)”或“疗法(treatment)”或“处理(to treat)”或“减轻(alleviating)”或“缓解(to alleviate)”的术语是指治愈、减缓、减轻现有诊断的病理病症或障碍的症状，和/或停止或减缓现有诊断的病理病症或障碍的进展。
[0069]
例如“预防”的术语是指防止目标病理病症或障碍发生的预防或防止性措施。
[0070]
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，其是指有效实现特定生物学结果的药剂的量。这样的结果可以包括但不限于，通过本领域任何合适的方式所确定的，抑制nampt表达或活性，或nampt下游的信号传导分子的表达或活性。
[0071]
疾病/病症
[0072]
提供了确定发生与nampt表达相关的病症的风险的方法。还提供了诊断和/或治疗此类病症的方法。在一些实施方案中，nampt相关病症是炎性病症，例如急性呼吸窘迫综合征(ards)、放射诱导的肺损伤(rili)、肺动脉高压或肺纤维化。在一些实施方案中，nampt相关病症是前列腺癌。
[0073]
ards是一种以肺部广泛的炎症为特征的呼吸系统障碍。症状包括呼吸短促、呼吸急促、肤色偏蓝、低血压、精神错乱和极度疲倦中的一种或多种。不受理论的束缚，据信ards是由液体从肺部血管渗漏入气囊引发，气囊中的血液含氧(通常，保护膜将这种液体保持在血管中)。进一步据信这种渗漏可能是由脓毒症；吸入有害物质(例如烟雾、化学烟雾、溺水、呕吐物吸入)；重症肺炎；头部、胸部或其他重大损伤(例如损害肺部的跌倒或车祸)；新型冠状病毒肺炎(covid-19)；胰腺炎；输血；和烧伤中的一种或多种引发。与ards相关的不良后果包括血栓；肺塌陷(气胸)；感染；疤痕(肺纤维化)；长期呼吸问题(即持续超过2个月、超过两年或终身)；抑郁；记忆力或清晰思维的问题；疲倦；和肌肉无力。matthay等，“acute respiratory distress syndrome,”nature reviews disease primers,5(18):1-22(2019)中更详细地讨论了ards，其通过引用方式全文并入本文。
[0074]
rili的特征是暴露于电离辐射导致的肺部受损。症状包括呼吸困难、咳嗽、发烧和胸痛中的一种或多种。不受理论束缚，据信rili是由两种主要机制之一引发：直接的dna损伤或活性氧物质的产生。与rili相关的不良后果包括肺炎、组织纤维化、坏死、萎缩和血管损伤。giuranno等，“radiation-induced lung injury(rili),”frontiers in oncology,9(article 877):1-16(2019)中更详细地讨论了rili，其通过引用方式全文并入本文。
[0075]
肺动脉高压是一种影响肺部和/或心脏右侧动脉的高血压类型。在肺动脉高压的一种形式——肺动脉高血压中——肺中的血管变窄、阻塞或破坏。肺动脉高压的症状包括呼吸短促(呼吸困难)；疲劳；头晕或昏厥(晕厥)；胸部压力或疼痛；脚踝、腿部和/或腹部肿胀(水肿)(腹水)；嘴唇和/或皮肤呈蓝色(紫绀)；和/或心跳加速或心悸。不受理论束缚，据信肺动脉高压是由基因突变；使用减肥药或如甲基苯丙胺的非法药物；心脏问题(例如，先天性心脏病)；结缔组织疾病(例如硬皮病、狼疮等)；hiv感染；慢性肝病(肝硬化)；左侧心脏瓣膜疾病；左下心室衰竭；慢性阻塞性肺疾病；肺纤维化；阻塞性睡眠呼吸暂停；长期暴露于高海拔地区；血液疾病(例如，红细胞增多症；原发性血小板增多症)；炎性障碍(例如，结节病；血管炎)；代谢综合症(例如，糖元储积症)；肾脏疾病；和压迫肺动脉的肿瘤引发的。与肺动脉高压相关的不良后果包括心脏增大；心力衰竭；血栓；心律失常；肺部出血；和妊娠并发症。hambly等“pulmonary hypertension:diagnostic approach and optimal management,”cmaj,188(11):804-812(2016)中更详细地讨论了肺高压，其通过引用方式全文并入本文。
[0076]
肺纤维化是一种在肺组织受损和结疤时发生的肺部疾病。肺纤维化的特征是肺的肺泡周围和之间的组织增厚，使其难以让氧气通过进入血液中。肺纤维化的症状包括呼吸困难、干咳、疲劳、不明原因的体重减轻、肌肉和关节疼痛以及手指尖或脚趾尖变宽和变圆(杵状指)。不受理论束缚，据信肺纤维化是由职业和环境因素(例如，暴露于二氧化硅粉尘、石棉纤维、硬金属粉尘、煤粉尘、谷物粉尘或鸟/动物粪便)；放射治疗(例如肺癌或乳腺癌的放射治疗)；药物(例如化疗药物，如甲氨蝶呤或环磷酰胺；心脏药物，例如胺碘酮；和/或抗生素，例如呋喃妥因或乙胺丁醇)；抗炎药物(例如利妥昔单抗或柳氮磺胺吡啶)；和/或医疗状况(例如，皮肌炎；多肌炎；混合性结缔组织病；系统性红斑狼疮；类风湿性关节炎；结节病；硬皮病；和/或肺炎)引起的。与肺纤维化相关的不良后果包括肺动脉高压；肺心病；呼吸衰竭；肺癌；肺部血栓；肺部感染；和肺塌陷。baratt等，“idiopathic pulmonary fibrosis(ipf):an overview,”j.clin.med.,7(8):1-21(2018)中更详细地讨论了肺纤维化，其通过
引用方式全文并入本文。
[0077]
新型冠状病毒肺炎(covid-19)是由冠状病毒2型(sars-cov-2)引起的严重急性呼吸系统综合征。sars-cov-2的直径为60nm至140nm，具有9nm至12nm范围的独特的刺突，使病毒粒子具有日冕的外观。通过基因重组和变异，冠状病毒可以适应和感染新宿主。sars-cov-2感染可以是无症状的，或者它也可能引起广谱的症状。示例性的症状包括发烧、咳嗽、呼吸短促、虚弱、疲劳、恶心、呕吐以及味觉和嗅觉改变。不良后果包括弥漫性血管内凝血；发炎的肺组织和肺内皮细胞；深静脉血栓形成；肺栓塞；血栓性动脉并发症(例如，肢体缺血；缺血性中风；心肌梗塞)；脓毒症；和多器官衰竭。wiersinga等，“pathophysiology,transmission,diagnosis,and treatment of coronavirus disease 2019(covid-2019):a review,”jama,doi:10.1001/jama.2020.12839(在线公布july 10,2020)中更详细地讨论了sars-cov-2感染，其通过引用方式全文并入本文。
[0078]
前列腺癌是一种发生在前列腺中的癌症。前列腺癌的症状包括排尿困难、尿流力量减弱、精液带血、骨盆区域不适、骨疼痛和勃起功能障碍。不受理论的束缚，据信前列腺癌是由异常细胞dna中的突变引起的，这种突变导致细胞比正常细胞的生长和分裂更快，同时异常细胞积聚并形成可以侵入附近组织和/或转移至身体其他部位的肿瘤。前列腺癌的不良后果包括转移至其他器官或骨骼(例如，通过血流或淋巴系统)；尿失禁；和勃起功能障碍。litwin等，“the diagnosis and treatment of prostate cancer:a review,”jama,317(24):2532-2542(2017)中更详细地讨论了前列腺癌，其通过引用方式全文并入本文。
[0079]
生物标志物、单核苷酸多态性及其用途
[0080]
提供了确定发生与nampt表达相关的病症的风险的方法。还提供了诊断这种病症的方法。一些实施方案包括确定nampt相关病症的进展。一些实施方案包括确定nampt相关病症的治疗功效。
[0081]
在一些实施方案中，nampt相关病症是炎症性病症，例如急性呼吸窘迫综合征(ards)、放射诱导的肺损伤(rili)、肺动脉高压或肺纤维化。在一些实施方案中，nampt相关病症是前列腺癌。在一些实施方案中，受试者患有惰性前列腺癌并且可能具有发生前列腺癌的更具侵袭性形式的风险。
[0082]
一些实施方案包括检测样品中nampt的存在或不存在。一些实施方案包括检测样品中的nampt水平。在一些实施方案中，基于样品中nampt的存在或水平(例如升高的水平)确定受试者患有病症或具有发生病症的风险。在一些实施方案中，基于样品中nampt的不存在或者低或降低的水平，确定受试者不患有病症或不具有发生病症的风险。
[0083]
一些实施方案包括检测一种或多种其他生物标志物的存在、不存在或水平，例如细胞因子趋化因子(例如，il-6、il-8、il-1b和/或il-ra)；双功能酶(例如巨噬细胞迁移抑制因子)；血管损伤标志物(例如，vegra、s1pr3和/或血管生成素2)；和/或高级糖基化终末产物通路标志物(例如，hmgb1和/或可溶性rage)。一些实施方案包括基于前述标志物的一种或多种的水平(例如，升高的水平或降低的水平)(例如，与nampt的存在、不存在或水平结合)来确定受试者具有或将发生某病症的升高或降低的风险。
[0084]
单核苷酸多态性(snp)位于基因启动子、外显子、内含子以及5
’‑
和3
’‑
非翻译区(utr)中并通过不同的机制影响基因表达。提供了位于人nampt基因的启动子区域的snp。
[0085]
在一些实施方案中，以下snp的一种或多种与炎症性病症或前列腺癌(例如侵袭性
前列腺癌)相关：rs7789066(位置：chr7:106287306(grch38.p12))；rs116647506(位置：chr7:106287180(grch38.p12))；rs61330082(位置：chr7:106286419(grch38.p12))；rs114382471(位置：chr7:106286288(grch38.p12))；rs9770242(位置：chr7:106285885(grch38.p12))；rs59744560(位置：chr7:106285832(grch38.p12))；rs190893183(位置：chr7:106285663(grch38.p12))；和rs1319501(位置：chr7:106285307(grch38.p12))。这些snp及其在患有各种疾病的受试者中的存在情况如表1所示。
[0086]
表1：对于ards和前列腺癌风险鉴定的nampt启动子snp
[0087][0088]
*表示在非洲裔个体中过多或过少表现的snp
[0089]
一些实施方案包括检测选自由rs7789066；rs116647506；rs61330082；rs114382471；rs9770242；rs59744560；rs190893183；和rs1319501组成的组的2、3、4、5、6、7或8种snp。
[0090]
在一些实施方案中，本文所述方法中使用的snp是rs7789066、rs61330082、rs9770242和/或rs59744560。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的snp是rs116647506、rs114382471、rs190893183和/或rs1319501。
[0091]
不受理论的束缚，据信本文所述的snp可能导致包括炎症信号传导通路(例如，nfkb依赖性炎症级联)失调的细胞过程的失调，并导致细胞的进展或转移，从而导致炎症性病症和/或癌症(例如，前列腺癌)。预期出现在人nampt启动子区域内的snp导致nampt启动子活性增加。活性增加导致nampt的表达增加，并随后导致nampt的血浆水平升高。nampt水平的可能升高通过toll样受体4(tlr4)激活进化保守的nfkb依赖性炎症级联。细胞因子产生的增加反过来增强向炎症表型或侵袭性前列腺癌表型的转变，因此增加受试者发生炎症性病症或前列腺癌的风险。nampt还参与肿瘤/宿主串扰以影响微环境和前列腺癌的侵入和转移。
[0092]
提供了用于鉴定具有发生炎症性病症(例如，ards、rili、肺动脉高压或肺纤维化)或侵袭性前列腺癌的风险的受试者的方法。在一些实施方案中，此类受试者的鉴定包括从可能具有发生炎症性病症或侵袭性前列腺癌的风险的受试者获得样品，并随后测试样品中存在或不存在上述snp的至少一种。在一些实施方案中，样品中至少一种snp的存在表明受试者具有发生炎症性病症的风险。在一些实施方案中，样品中至少一种snp的存在表明受试者具有发生侵袭性前列腺癌的风险。
[0093]
可能具有发生侵袭性前列腺癌的风险的受试者的一个示例是患有惰性前列腺癌
的受试者。因此，在患有惰性前列腺癌的患者中本文所述snp的鉴定可用于预测该患者是否易感或具有发生侵袭性前列腺癌的风险。在一些实施方案中，选自由rs7789066；rs116647506；rs61330082；rs114382471；rs9770242；rs59744560；rs190893183；和rs1319501组成的组的2、3、4、5、6、7或8种snp的存在表明受试者患有或具有发生前列腺癌的风险。一些实施方案包括基于一种或多种snp的存在诊断受试者患有前列腺癌。
[0094]
在一些实施方案中，惰性前列腺癌是散发的或遗传的。在遗传的前列腺癌形式中，非洲或欧洲血统的受试者发生前列腺癌的风险增加。
[0095]
在一些实施方案中，样品的nampt的启动子元件中的至少一种snp的检测可以通过snp基因分型实现。通常，snp基因分型包括以下步骤，例如从测试受试者收集生物样品(例如活检组织、细胞、体液、分泌物等的样品)，从样品的细胞中分离核酸(例如基因组dna、mrna或两者)，在靶核酸区域发生杂交和扩增的条件下使核酸与与包含靶snp的分离核酸的区域特异性杂交的一种或多种引物接触，以及测定存在于目标snp位置的核苷酸，或者，在某些测定中，检测扩增产物的存在或不存在(可以设计测定以使杂交和/或扩增仅在特定snp等位基因存在或不存在时发生)。snp基因分型可以鉴定纯合或杂合的snp。在本文所述的方法的一些实施方案中，至少一种snp是纯合的。在其他实施方案中，至少一种snp是杂合的。
[0096]
检测snp的其他方法是本领域已知的且可以应用于本方法。例如，可商购且可用于鉴定一种或多种snp的核苷酸出现的测定系统是snp-it
tm
测定系统(orchid biosciences,inc.；princeton n.j.)。通常，snp-it
tm
方法是一个三步引物延伸反应。在第一步中，通过与捕获引物杂交从样品中分离靶核酸分子，其提供第一特异性水平。在第二步中，捕获引物从目标snp位点处的终止核苷三磷酸延伸，其提供了第二特异性水平。在第三步中，可以使用多种已知形式检测延伸的核苷三磷酸，包括例如通过直接荧光、间接荧光、间接比色测定、质谱或荧光偏振。使用snpstream
tm
仪器(orchid biosciences,inc.)可以方便地以自动化形式在384孔格式中处理反应。
[0097]
通过本领域内技术人员已知的方法对获自受试者的样品的核酸样品进行基因分型以确定目标snp的存在和身份。相邻序列可用于设计snp检测试剂，例如寡核苷酸探针，其可任选地以试剂盒形式实施。示例性的snp基因分型方法描述于chen等，“single nucleotide polymorphism genotyping:biochemistry,protocol,cost and throughput”,pharmacogenomics j.2003；3(2):77-96；kwok等，“detection of single nucleotide polymorphisms”,curr issues mol.biol.2003april；5(2):43-60；shi,“technologies for individual genotyping:detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes”,am j pharmacogenomics.2002；2(3):197-205和kwok,“methods for genotyping single nucleotide polymorphisms”,annu rev genomics hum genet 2001；2:235-58。用于高通量snp基因分型的示例性技术被描述于marnellos,“high-throughput snp analysis for genetic association studies”,curr opin drug discov devel.2003may；6(3):317-21。常见的snp基因分型方法包括但不限于taqman测定、分子信标测定、核酸阵列、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性pcr、阵列引物延伸、同源引物延伸测定、通过质谱检测引物延伸、焦磷酸测序、基因阵列上分类的多重引物延伸、滚环扩增连接、均相连接、ola(美国专利no.4,988,167)、基因阵列上分类的
多重连接反应、限制性片段长度多态性、单碱基延伸标签测定和invader测定。这类方法可以与检测机制(例如发光或化学发光检测、荧光检测、时间解析荧光检测、荧光共振能量转移、荧光偏振、质谱和电检测)组合使用。用于检测多态性的各种方法包括但不限于使用裂解剂的保护检测rna/rna或rna/dna双链体中的错配碱基的方法(myers等，science 230:1242(1985)；cotton等，pnas 85:4397(1988)和saleeba等，meth.enzymol.217:286-295(1992))、变体和野生型核酸分子电泳迁移率的比较(orita等，pnas 86:2766(1989)；cotton等，mutat.res.285:125-144(1993)和hayashi等，genet.anal.tech.appl.9:73-79(1992))和使用变性梯度凝胶电泳(dgge)测定含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中多态性或野生型片段的移动(myers等，nature 313:495(1985))。特定位置的序列变异也可以通过核酸酶保护分析(例如rnase和si保护)或化学切割方法来评估。
[0098]
在一些实施方案中，检测nampt启动子序列中的snp包括：使来自受试者的样品与寡核苷酸探针接触，所述寡核苷酸探针与包含snp的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列选择性杂交，和检测寡核苷酸探针的选择性杂交。在某些实施方案中，与包含snp的核苷酸序列选择性杂交的寡核苷酸探针在围绕snp的每一侧上包含100-500个(例如，100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个)碱基对。例如，与包含snp的核苷酸序列选择性杂交的寡核苷酸探针在围绕snp的每一侧上包含200个碱基对。在特定的实施方案中，包含如seq id no：18所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs7789066的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：19所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs61330082的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：20所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs9770242的核苷酸序列选择性杂交；包含如seq id no：21所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs59744560的核苷酸序列选择性杂交；和/或包含如seq id no：22所示的核苷酸序列的寡核苷酸探针与包含rs1319501的核苷酸序列选择性杂交。可以与包含snp的核苷酸序列选择性杂交的示例性寡核苷酸探针提供于下表2中：
[0099]
表2：用于检测snp的示例性寡核苷酸探针
[0100]
[0101][0102][0103]
在一些实施方案中，使用taqman测定进行snp基因分型，该测定法也称为5’核酸酶
测定(美国专利no.5,210,015和5,538,848)。taqman测定检测pcr期间特定扩增产物的积累。taqman测定使用一种用荧光报道染料和猝灭染料标记的寡核苷酸探针。报道染料被适当波长的辐射激发，它通过称为荧光共振能量转移(fret)的过程将能量转移至同一探针中的猝灭染料。当附接至探针时，被激发的报道染料不发出信号。完整探针中的猝灭染料与报道染料的靠近使报道体保持降低的荧光。报道染料和猝灭染料可分别位于5’最末端和3’最末端，反之亦然。或者，报道染料可能位于5’或3’最末端，而猝灭染料附接至内部核苷酸，反之亦然。在另一个实施方案中，报告体和猝灭剂可彼此相距一定距离附接至内部核苷酸，从而降低报告体的荧光。在pcr过程中，dna聚合酶的5’核酸酶活性切割探针，从而分离报告染料和猝灭染料并导致报告体的荧光增强。通过监测报道染料的荧光的增加直接检测pcr产物的积累。只有当探针与在pcr过程中扩增的包含靶snp的模板杂交时，dna聚合酶才切割报告染料和猝灭染料之间的探针，并且该探针被设计为仅在特定snp等位基因存在时与靶snp位点杂交。在该方法的一些实施方案中，寡核苷酸包含双标记的寡核苷酸探针，其包含荧光部分和荧光猝灭剂。
[0104]
优选的taqman引物和探针序列可以使用本文提供的snp和相关核酸序列信息容易地确定。许多计算机程序(例如primer express(applied biosystems,foster city,calif.))可用于快速获得最佳引物/探针组。对本领域内技术人员显而易见的是用于检测本发明的snp的此类引物和探针可用于多种病症(其中包括癌症，特别是前列腺癌)的预后分析，并且可以简便地并入试剂盒形式。本发明还包括对本领域熟知的taqman测定的修改，例如分子信标探针的使用(美国专利no.5,118,801和5,312,728)及其他变体形式(美国专利no.5,866,336和6,117,635)。
[0105]
也可以使用错配检测技术来检测snp，包括但不限于使用核糖核酸探针的rnase保护方法(winter等，proc.natl.acad sci.usa82:7575,1985；meyers等，science 230:1242,1985)以及识别核苷酸错配的蛋白质，例如大肠杆菌muts蛋白质(modrich,p.ann.rev.genet.25:229-253,1991)。或者，可以通过单链构象多态性(sscp)分析来鉴定snp(orita等，genomics 5:874-879,1989；humphries等，molecular diagnosis of genetic diseases,r.elles,ed.,pp.321-340,1996)，或变性梯度凝胶电泳(dgge)(wartell等，nucl.acids res.18:2699-2706,1990；sheffield等，proc.nat.acad.sci.usa 86:232-236,1989)。
[0106]
在一些实施方案中，本文所述snp可以使用基于质谱的方法来检测。质谱法利用了dna的四种核苷酸中每一种的独特质量。可以利用质谱法通过测量含有snp的核酸的质量与来自缺乏snp的对照受试者的样品间的差异明确地检测snp。maldi-tof(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱技术对于分子质量(例如snp)的极其精确的测定是优选的。基于质谱法已经开发了许多snp分析的方法。优选的基于质谱的snp基因分型方法包括引物延伸测定，其也可以与其他方法(例如传统的基于凝胶的形式和微阵列)组合使用。
[0107]
snp基因分型可用于许多应用，其包括但不限于snp-疾病相关性分析、疾病易感性筛查、疾病诊断、疾病预后、疾病进展监测、基于个体基因型确定治疗策略、基于与疾病相关或对药物产生反应的可能性的snp基因型开发有效的治疗剂(例如，抗enampt抗体)和对进行治疗方案的临床试验的患者群体进行分层。
[0108]
治疗方法
[0109]
还提供了治疗患有或具有有发生与nampt表达相关病症风险的受试者的方法。一些实施方案包括鉴定患有或具有发生与nampt表达相关病症的风险的受试者，并治疗该受试者以预防或减少该病症的发生或进展。在一些实施方案中，nampt相关病症是炎症性病症，例如急性呼吸窘迫综合征(ards)、放射诱导的肺损伤(rili)、肺动脉高压或肺纤维化。在一些实施方案中，nampt相关病症是前列腺癌。
[0110]
在一些实施方案中，通过向受试者施用nampt抑制剂(例如，以降低nampt的水平和/或降低nampt活性)来治疗受试者。在一些实施方案中，nampt抑制剂是抗nampt抗体。示例性抗nampt抗体包含ab1和ab2，或其抗原结合部分，如下表3所述。
[0111]
表3：示例性抗nampt抗体vh/vl和cdr序列
[0112]
[0113][0114]
在一些实施方案中，ards治疗包括施用肺保护性通气；呼吸支持(例如，氧气补充；正压通气)；液体；营养补充剂；抗菌剂；类固醇(例如，糖皮质激素，如甲基强的松龙)；肺血管扩张剂(例如，一氧化氮；前列腺素)；β
2-肾上腺素能激动剂；前列腺素e1；活化蛋白c；抗氧化剂；omega-3脂肪酸；酮康唑；利索茶碱；重组人因子viia；ifnβ1α；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；和他汀类药物中的一种或多种。在一些实施方案中，上述疗法的一种或多种与一种或多种enampt抑制剂(例如抗体)组合施用。
[0115]
rili的治疗包括辐射防护剂(例如，氨磷汀；工程纳米颗粒，例如锰超氧化物歧化酶-质粒脂质体；染料木素；黄连素；和/或己酮可可碱)；放射缓解剂(例如，甲基强的松；ace(血管紧张素转换酶)抑制剂；血管紧张素-2拮抗剂；姜黄素；和/或生长因子(例如角质细胞生长因子)；和基于细胞的疗法(例如，骨髓来源的间充质干细胞；和/或诱导多能干细胞)中的一种或多种的施用。在一些实施方案中，上述疗法的一种或多种与一种或多种enampt抑制剂(例如抗体)组合施用。
[0116]
肺动脉高压的治疗包括施用一种或多种血管扩张剂；抗凝剂(例如华法林)；利尿剂；氧；地高辛；内皮受体拮抗剂(例如，波生坦；安贝生坦；和/或马西替坦)；磷酸二酯酶5抑制剂(例如，西地那非；和/或他达拉非)；前列腺素(例如，依前列醇；伊洛前列素；和/或曲前列环素)；可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂(例如，riociguat)；和钙通道阻滞剂(例如，硝苯地平；地尔硫卓；尼卡地平；和/或氨氯地平)。在一些实施方案中，上述疗法的一种或多种与一种或多种enampt抑制剂(例如抗体)组合施用。
[0117]
肺纤维化的治疗包括施用免疫抑制剂(例如泼尼松龙；和/或咪唑硫嘌呤)；抗氧化剂(例如，n-乙酰半胱氨酸)；抗纤维化剂(例如，吡非尼酮；和/或尼达尼布)；抗酸药物；氧；结缔组织生长因子(ctfg)抑制剂；αvβ6整联蛋白抑制剂；自毒素抑制剂；il-13抑制剂；和半乳糖凝集素3抑制剂中的一种或多种。在一些实施方案中，上述疗法的一种或多种与一种或多种enampt抑制剂(例如抗体)组合施用。
[0118]
covid-19的治疗包括施用ace抑制剂；血管紧张素受体阻滞剂；瑞德西韦；氧；pikfyve激酶抑制剂(例如，阿匹莫德)；和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，mdl-28170；z lvg chn2；vby-825；和/或ono 5334)中的一种或多种。在一些实施方案中，上述疗法的一种或多
种与一种或多种enampt抑制剂(例如抗体)组合施用。
[0119]
前列腺癌的治疗包括手术(例如切除前列腺或睾丸，或冷冻手术以杀死癌细胞)和/或施用放射疗法(例如，外照射疗法；和/或近距放射疗法)；激素疗法，例如促黄体激素释放激素(lh-rh)激动剂(例如，亮丙瑞林；戈舍瑞林；曲普瑞林；和/或组氨瑞林)或阻止身体产生睾酮的其他药物(例如，酮康唑；和/或阿比特龙)；抗雄激素(例如，比卡鲁胺；尼鲁米特；氟他胺；和/或恩杂鲁胺)；化疗；和生物疗法(例如，sipuleucel-t)中的一种或多种。在一些实施方案中，上述疗法的一种或多种与一种或多种enampt抑制剂(例如抗体)组合施用。
[0120]
以下实施例进一步描述和证明本公开的组合物和方法。实施例不旨在以任何方式限制本公开。其他方面对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，在本文的每种情况中，任何术语“包括”、“基本上由
…
组成”和“由
…
组成”都可以用其他两个术语中的任一个来替换；而且，任何术语都可以参考本文公开的特征来使用。
[0121]
实施例
[0122]
实施例1.与前列腺癌相关的snp的鉴定
[0123]
nampt启动子snp已被确定为可被用于鉴定具有前列腺癌风险和/或严重程度增加的患者的指标。
[0124]
12个nampt snp针对评估前列腺癌进展的风险进行审查和优化，其中一些在非洲裔个体中明显过度呈现。还确定了导致ards易感性和死亡的nampt snp。snp为rs7789066(位置：chr7:106287306(grch38.p12))、rs116647506(位置：chr7:106287180(grch38.p12))、rs61330082(位置：chr7:106286419(grch38.p12))、rs114382471(位置：chr7:106286288(grch38.p12))、rs9770242(位置：chr7:106285885(grch38.p12))、rs59744560(位置：chr7:106285832(grch38.p12))、rs190893183(位置：chr7:106285663(grch38.p12))和rs1319501(位置：chr7:106285307(grch38.p12))。
[0125]
这些nampt snp有助于ards易感性，随后响应于机械应力和缺氧及由缺氧诱导的转录因子hif2α的关键参与而复制并改变nampt启动子活性，并受到ards中的保护性snp，即nampt启动子snp-948t、-1001g和-2422g，而非-1535g的显著影响。评估了正常前列腺细胞(rwpe-1)和pca细胞(pc3、du-145)中基础和辐射诱导的nampt启动子活性。前列腺癌细胞中的基础nampt启动子活性明显高于正常前列腺细胞，并且通过辐射(8gy，4小时)进一步增加，这表明nampt表达可以通过其响应于活性氧物质被刺激的潜在机制，以促进前列腺癌进展。
[0126]
实施例2.nampt基因分型和血浆enampt分析以鉴定侵袭性前列腺癌的风险
[0127]
本实施例说明了作为侵袭性前列腺癌生物标志物的nampt启动子snp和/或升高的enampt血浆水平。为了证实enampt水平升高和/或nampt snp的存在与前列腺癌的死亡率升高和疾病进展相关，评估来自先前参加前列腺癌临床试验的受试者的生物库标本中的nampt基因分型分析板和基于血浆的enampt elisa值，其中包含表型信息，包括前列腺活检结果、psa水平、骨扫描和mri前列腺成像。受试者参加了ii/iii期pca研究，并包括166名前列腺癌活检最初呈阴性的个体和3-5年期间内获得的约20份血浆样品。该群组中超过一半(55％)最终发生经活检证实的前列腺癌，且因此提供了一组用于测定nampt snp和enampt水平是否预测pca的风险和进展的宝贵的样本集。还将评估获自非裔美国人受试者的第二
组配对的dna和多个血浆样品以确定导致前列腺癌进展和致死率的疾病预测因素。
[0128]
实施例3.人类侵袭性pca中的nampt表达
[0129]
为了评估nampt在pca侵袭性和进展中的作用，在pca组织中研究了nampt表达。在正常前列腺组织、局限于前列腺且无包膜侵入的前列腺腺癌(即，器官局限性pca)和向前列腺外脂肪组织包膜侵入的前列腺腺癌(即，侵袭性pca)中通过免疫组织化学(ihc)染色评估nampt的表达。图1a-1c中提供了代表性显微照片。图1d总结了从图1a-1c的显微照片评估的nampt染色。
[0130]
正常和pca组织的ihc分析显示正常前列腺组织中几乎没有nampt表达(图1a和1d)，而在局限于前列腺且无包膜侵入的前列腺腺癌中nampt有相当多的表达(图1b和1d；p《0.05)。相比之下，具有向前列腺外脂肪组织中的包膜侵入的前列腺腺癌显示出显著强健的nampt染色(图1c和1d；p《0.005)。
[0131]
为了进一步评估nampt在pca侵袭性和进展中的作用，通过获自健康对照、pca患者和表现出升高的psa水平但前列腺活检呈阴性的高风险受试者的血浆样品的elisa评估细胞外的nampt表达。分析的结果提供于图2a中。如图2a所示，相比于高风险受试者，pca患者的nampt血浆水平更高(p《0.05)。此外，当与健康对照组相比，发现pca患者和高风险患者的nampt血浆水平更高(p《0.05)。另外，比较了器官局限性pca(或非侵袭性pca)患者和前列腺外pca(或侵袭性pca)患者的nampt血浆水平。比较分析提供于图2b中，其显示与器官局限性或非侵袭性pca患者相比，前列腺外或侵袭性pca患者的nampt血浆水平明显更高(p《0.05)。
[0132]
因此，图1a-1d、2a和2b中概述的结果显示侵袭性pca中nampt表达的增加，强调了nampt在pca侵袭性中的关键作用。
[0133]
实施例4.人源化抗nampt抗体对pca细胞侵入的影响
[0134]
上述实施例中概述的结果表明nampt在pca侵袭性中的作用，并强调了nampt作为侵袭性pca中的潜在治疗靶标。为了进一步验证nampt作为侵袭性pca治疗靶点的作用，评估了人源化抗nampt单克隆抗体(mab)对pca细胞侵入的影响。为此，在严重联合免疫缺陷(scid)小鼠中评估了人类pca细胞的腹膜侵入。
[0135]
首先，将转移性人类pca细胞(即pc3)腹膜内(i.p.)注射至scid小鼠中。在具体的实验中，小鼠还一周注射两次2μg的人源化抗nampt mab或单独的载体。pc3细胞注射后6周评估pc3细胞的腹膜侵入。图3a-3c中提供了代表性显微照片，图3d和3e中提供了结果的图形化汇总。
[0136]
如图3a-3c所描绘，人类pca细胞系的注射导致与侵入癌细胞内突出的nampt染色相关的大量腹膜肌肉侵入(图3a和3b)，而接受人源化抗nampt mab的pc3攻击scid小鼠则表现出平滑肌腹膜的pc3侵入的显著减少(图3c)。如图3d和3e所总结的，接受人源化抗nampt mab的pc3攻击scid小鼠显示出显著降低的肿瘤侵入百分比(图3d，p《0.05)和肿瘤侵入深度(图3e，p《0.05)。
[0137]
因此，本研究的观察结果强烈暗示nampt在pca细胞侵袭性中的作用和人源化抗nampt抗体延缓这种侵袭性行为的关键潜力。
[0138]
实施例5.血浆nampt水平作为人类ards的诊断/预后生物标志物
[0139]
血浆样品获自covid-19感染、ards或创伤患者或者健康对照(“ctl”)，并通过elisa评估血浆样品中的nampt水平。结果如图4a所示，其中相比于获自健康对照组的血浆
nampt水平，患有急性炎症性病症(例如covid-19感染、ards或创伤)的患者中血浆nampt水平明显更高(p《0.001)。接下来，评估活着的和死亡的ards患者中nampt和其他促炎性细胞因子(例如il-6、il-8和巨噬细胞迁移抑制因子(mif))的血浆水平，以评估这些促炎性细胞因子的血浆水平与ards死亡率之间的相关性。结果如图4b所示，其描绘了死亡的ards患者中nampt和其他促炎性细胞因子(例如il-6、il-8和mif)的血浆水平较高，这表明这些细胞因子的较高的血浆水平与ards死亡率相关。
[0140]
因此，结果显示在ards和其他急性炎性病症中nampt表达的失调，并表明nampt作为ards的诊断/预后生物标志物的潜力。
[0141]
实施例6.血浆nampt水平作为胰腺炎的诊断/预后生物标志物
[0142]
实施例5证实了nampt作为ards和其他炎症性病症的诊断/预后生物标志物。考虑到胰腺炎(一种以胰腺的实质炎症为特征的病症)通常与ards相关的事实，我们接下来评估了nampt作为胰腺炎的诊断/预后生物标志物的潜力。
[0143]
为此，首先，通过elisa评估获自胰腺炎患者和健康对照的样品中的nampt血浆水平。结果如图5a所示，其表明与健康对照相比，胰腺炎患者中nampt血浆水平明显更高(p《0.0001)，这表明胰腺炎中nampt表达的失调。接下来，通过elisa评估获自轻度、中度或重度胰腺炎患者的样品中的血浆nampt水平。如图5b所示，相比于轻度胰腺炎患者，中度胰腺炎患者的血浆nampt水平明显更高，而重度胰腺炎患者的血浆nampt水平则更高。因此，图5b显示血浆nampt随着胰腺炎严重程度的增加而升高。
[0144]
因此，图5a和5b中概述的结果证实了nampt在胰腺炎发病机制和进展中的作用，并强调了nampt作为胰腺炎和胰腺炎相关ards的诊断/预后生物标志物的潜力。
[0145]
实施例7.血浆nampt水平作为脓毒症的诊断/预后生物标志物
[0146]
实施例5证实了nampt作为ards的诊断/预后生物标志物。考虑到严重脓毒症是ards最常见的病因的事实，我们接下来评估了nampt作为脓毒症的诊断/预后生物标志物的潜力。
[0147]
通过elisa评估获自健康对照或脓毒症患者的样品中的nampt血浆水平。如图6a所示，相比于健康对照组，脓毒症患者中血浆nampt水平明显更高(p《0.001)，这表明脓毒症中nampt表达的失调。接下来，通过elisa评估获自具有或不具有脓毒性休克的脓毒症患者的样品中的nampt血浆水平。如图6b所示，与不具有脓毒性休克的脓毒症患者相比，具有脓毒性休克的脓毒症患者的血浆nampt水平明显更高。这些结果显示了血浆nampt水平随着脓毒症严重程度的增加而升高。因此，该数据证明了nampt在脓毒症的发病机制和进展中的作用，并强调了nampt作为脓毒症和脓毒症诱导的ards的诊断/预后生物标志物的潜力。
[0148]
实施例8.nampt基因变体预测ards严重程度
[0149]
基因中的单核苷酸多态性(snp)调节细胞因子，例如nampt。某些snp的存在是细胞外nampt的存在的指示。因为上述实施例确认血浆nampt作为ards的诊断/预后生物标志物，我们接下来评估基因中某些(snp)的检测和测量可否用于检测nampt以及是否与ards的风险相关。为此，评估了来自ards患者或健康对照的dna样品中与nampt启动子相关的某些snp。
[0150]
如图7所示，发现nampt snp，rs61330082和rs9770242与较高的血浆nampt水平和较高的ards死亡率相关。此外，发现ards死亡率指数整合了血浆nampt水平、nampt snp和临
床协变量基因型。因此，图7中描述的结果证明nampt基因型可以有效地预测较高的血浆nampt水平和较高的ards死亡率。
[0151]
此外，nampt测序鉴定出会增加发生ards的风险的5个snp，包括在非洲裔受试者中过度呈现的snp。为了确定nampt snp与ards风险和ards死亡率的相关性，将具有单个nampt snp和两个nampt snp的ards患者与没有nampt snp的对照ards患者(“对照”)(即具有野生型nampt等位基因的ards患者)进行比较。结果如图8所描述。如图8所示，nampt snp展现出与ards的风险和ards死亡率相对于对照的显著相关性(p《0.05)。此外，与具有单一nampt snp的单倍型相比，具有两个nampt snp的单倍型显示出与ards的风险(图8，左图)和ards死亡率(图8，中图)的更高相关性。因此，图8所描述的结果证实“高风险”nampt基因型(snp)可以有效地预测ards的风险以及ards严重程度和死亡率。
[0152]
因此，nampt基因变体(snp)可有效地预测nampt血浆水平，并最终预测ards的风险和ards死亡死亡率。
[0153]
实施例9.使用放射性肺炎的体内模型评估辐射对nampt表达的影响
[0154]
为了评估nampt在rili中的作用，研究了辐射对nampt表达的影响。为此，将wtc57/b6小鼠暴露于20gy全胸肺照射(wtli)并在4周时间段的特定时间点进行评估。结果描述在图9a-b中。
[0155]
如图9a所示，相比于对照小鼠(未照射的小鼠；如图9a，左图所示)，wtli暴露的wt小鼠在20gy wtli后1周(图9a，中图)和4周(图图9a，右图)表现出增加的nampt表达，尤其是在肺泡巨噬细胞和上皮细胞中，和炎症、血管渗漏和炎症性肺损伤的增加。图9b总结了ir暴露后1周和4周的wtli暴露的小鼠的肺组织、或对照小鼠(未照射的小鼠)的肺组织中的nampt染色。
[0156]
因此，结果显示了辐射诱导的nampt表达的增加，这表明nampt在rili发病机制中的作用以及使用nampt作为rili生物标志物的潜力。
[0157]
实施例10.辐射对人体组织和血液中nampt表达的影响
[0158]
为了进一步探究nampt在rili中的作用，探究了辐射对人体组织和血液中nampt表达的影响。结果描述于图10a-c中。
[0159]
为了评估辐射对nampt表达的影响，将人扁桃体上皮组织暴露于8gy电离辐射(ir)24小时。如图10a所示，人扁桃体组织中的nampt表达在8gy ir暴露后迅速且显著上调。通过研究经历放射疗法的癌症患者体内的nampt表达进一步评估辐射对nampt表达的影响。如图10b所示，相比于对照受试者，经历乳腺癌或肺癌放射疗法的受试者展现出nampt的血浆水平的显著升高(p《0.05)。还通过研究放射性肺炎患者的nampt表达来评估辐射对nampt表达的影响。如图10c所描述，放射性肺炎患者表现出比对照受试者高4-5倍的nampt血浆水平(p《0.05)。
[0160]
因此，结果表明人rili中nampt表达和分泌的失调。
[0161]
实施例11.探究nampt在rili中的作用
[0162]
使用c57/b6小鼠体内实验进一步评估了nampt在rili中的作用。第一组小鼠由接受20gy胸部照射的野生型(wt)小鼠组成。未辐照的小鼠作为阴性对照(“对照”或“ctrl”)。在4周时间内的特定时间从小鼠收集肺组织。测量支气管肺泡灌洗(bal)蛋白的量并获得bal表达细胞的计数。肺组织也进行苏木精和伊红(h&e)染色以评估肺部炎症。而且，基于
bal指数和h&e染色评估rili严重程度评分。相应分析的结果提供于图11a-e中。
[0163]
如图11a所示，通过辐射暴露后1周(图11a，左图)和4周(图11a，右图)显示出急性弥漫性肺泡损伤的肺组织的h&e染色与未辐照对照的肺组织(图11a的插图，左图)相比来证实小鼠中rili的发生。图11b总结了相比于未辐照对照小鼠肺组织中的h&e染色，ir暴露后1周和4周辐照小鼠肺组织中的h&e染色。如图11b所示，ir暴露后4周，辐照小鼠的肺组织中观察到h&e染色面积明显增加(p《0.001)，其表明rili的有效发生。图11c显示了ir暴露后1周和4周的辐照小鼠肺组织中的bal蛋白水平与未辐照对照小鼠的肺组织中的bal蛋白水平相比。如图11c所示，与对照小鼠相比，暴露于辐射的小鼠从辐射暴露后第1周开始表现出升高的bal蛋白水平，且在辐照后4周观察到显著升高的bal蛋白水平(p《0.05)。相似地，如图11d所示，暴露于辐照的小鼠中bal表达的细胞(bal细胞)的计数增加，且辐射暴露后4周观察到bal细胞计数显著增加(p《0.05)。而且，如图11e所示，相比于对照小鼠，暴露于辐射的小鼠从辐射暴露后第1周开始表现出升高的rili严重性评分，且在辐照后4周观察到rili严重性评分的显著增高(p《0.05)。
[0164]
第二组小鼠由接受20gy胸部照射并被观察4周的nampt杂合(nampt
/-；“nampt het”)小鼠组成。未照射的wt和nampt杂合小鼠以及照射的wt小鼠被用作对照。测量bal蛋白的量并获得bal表达细胞的计数。肺组织也进行了h&e染色以评估肺部炎症。而且，基于bal指数和h&e染色评估急性肺损伤(ali)严重程度评分。相应分析的结果提供于图12a-e中。
[0165]
如图12a所示，与来自未辐照wt小鼠的肺组织(图12a的插图，左图)相比，wt辐照小鼠(图12a，左图)肺组织的h&e染色在辐射暴露后4周表现出弥漫性肺泡损伤。相比之下，nampt
/-小鼠的肺组织(图12a，右图)显示出减少的h&e染色，这表明辐射暴露后nampt
/-小鼠中的肺泡损伤较少。图12b总结了辐照或未辐照的wt和nampt
/-小鼠的肺组织中的h&e染色。如图12b所示，与辐照的wt小鼠相比，辐照的nampt
/-小鼠的肺组织中观察到减少的h&e染色区域，由此表明nampt在rili发病机制中的作用。图12c显示了辐照或未辐照的wt和nampt
/-小鼠肺组织中的bal蛋白水平。如图12c所示，相比于未辐照的对照小鼠，暴露于辐射的小鼠表现出升高的bal蛋白水平。但是，相比于辐照的wt对照，辐照的nampt
/-小鼠表现出降低的bal蛋白水平。类似地，暴露于辐照的小鼠中bal细胞计数升高，尽管相比于辐照的wt对照，辐照的nampt
/-小鼠表现出显著降低的bal细胞计数。而且，如图12e所描述，相比于对照小鼠，暴露于辐射的小鼠表现出升高的ali严重程度评分；但是，与辐照的wt对照相比，辐照的nampt
/-小鼠展现出降低的ali严重程度评分。因此，结果显示nampt
/-小鼠中rili的表现减少，这表明nampt在rili的发生和进展中的作用。
[0166]
第三组小鼠由接受20gy胸部照射且腹膜内注射多克隆nampt中和抗体(pab)或单克隆抗nampt抗体(mab)的辐射小鼠组成。未辐照的小鼠和仅注射载体的辐照小鼠被用作对照(“ctrl”)。测量bal蛋白的量并获得bal表达细胞的计数。肺组织也进行了h&e染色以评估肺部炎症。而且，基于bal指数和h&e染色评估急性肺损伤(ali)严重程度评分。相应分析的结果提供于图13a-e中。
[0167]
如图13a所描述，与未辐照对照小鼠的肺组织(图13a的插图，左图)相比，来自辐照对照小鼠(仅注射载体)的肺组织的h&e染色在辐射暴露后4周表现出弥漫性肺泡损伤(图13a，左图)。相比之下，注射抗nampt pab(图13a，中图)或抗nampt mab(图13a，右图)的小鼠肺组织显示出减少的h&e染色，这表明辐射暴露后抗nampt ab治疗的小鼠中的肺泡损伤较
少。图13b总结了未辐照对照小鼠、辐照对照小鼠和注射抗nampt pab或mab的辐照小鼠肺组织中的h&e染色。如图13b所示，相比于未辐照对照小鼠，辐照对照小鼠肺组织中的h&e染色区域增加。但是，相比于辐照对照小鼠，在注射抗nampt pab或mab的小鼠肺组织中观察到h&e染色区域明显减少(p《0.05)，这表明nampt在rili发生中的作用。图13c显示了未辐照对照小鼠、辐照对照小鼠和注射抗nampt pab或mab的辐照小鼠的肺组织中的bal蛋白水平。如图13c所示，与未辐照对照小鼠相比，暴露于辐射的小鼠表现出升高的bal蛋白水平。但是，相比于辐照对照小鼠，注射抗nampt pab或mab的辐照小鼠表现出显著降低的bal蛋白水平(p《0.05)，且在用抗nampt mab治疗的辐照小鼠中观察到更明显的降低。类似地，暴露于辐照的小鼠中bal细胞计数增加，尽管与辐照对照小鼠相比，注射抗nampt pab或mab的辐照小鼠表现出明显减少的bal细胞计数(p《0.05)，且在用抗nampt mab治疗的辐射小鼠中观察到更明显的减少。而且，如图13e所示，与对照小鼠相比，暴露于辐射的小鼠表现出升高的ali严重程度评分；但是，与辐照对照小鼠相比，注射抗nampt pab或mab的辐照小鼠展现出显著降低的ali严重程度评分，且在用抗nampt mab治疗的辐照小鼠中观察到更明显的降低。因此，图13a-e中描述的结果显示了用抗nampt ab治疗后rili的减轻，强调了nampt作为rili的潜在治疗靶标。
[0168]
因此，结果证实了rili中nampt表达和分泌的失调，并表明nampt是rili的新的生物标志物和治疗靶标，其造成肺组织辐射损伤的病理生物学。
[0169]
实施例12.放射性标记的抗nampt抗体确定发炎的肺组织中增加的nampt表达
[0170]
开发放射性标记的抗nampt抗体的目的在于非侵入性检测nampt信号传导通路和体内不同组织中的nampt表达。使用放射性标记的抗nampt mab的rili小鼠模型成像能够确定使用抗nampt mab作为治疗干预的最佳时间，并在全身辐照(tbi)或部分身体辐照(pbi)之后(例如在核事故中)使用其他特定的放射性标记检查主要器官的炎症和细胞凋亡。为了测试通过放射性标记的抗nampt抗体对nampt表达的检测，
99m
tc标记的抗nampt mab探针被注射入对照小鼠和暴露于8gy pbi的小鼠中，并进行快速放射自显影成像。分析结果如图14a-d所描述。
[0171]
如图14a-b所示，相比于未辐照对照小鼠，辐照小鼠的肺中观察到更高的放射性摄取，这表明由rili诱导的更高的nampt表达。而且，放射性标记的抗nampt抗体的摄取被用作辐照小鼠或未辐照对照小鼠中肺活动的量度。如图14c所示，与未辐照对照小鼠相比，辐照小鼠的右肺和左肺中均观察到相对于组织背景的肺活动的显著增加(p《0.05)。而且，测定辐照小鼠或未辐照对照小鼠中的放射性水平以评估放射性标记的抗nampt mab的摄取。如图14d所示，与未辐照对照小鼠相比，在辐照小鼠中观察到放射性的显著增加(p《0.05)，从而证实辐照小鼠中放射性标记的抗nampt mab的摄取增加。
[0172]
因此，放射性标记的抗nampt抗体在检测发炎的肺组织中增加的nampt表达中是有效的。这强调了利用放射性标记的抗nampt抗体作为nampt的检测工具的潜力，其在使用nampt作为rili的生物标志物中是关键的。
[0173]
实施例13.使用辐射诱导肺纤维化的体内模型验证nampt作为rili的治疗靶点
[0174]
为了进一步验证nampt作为rili的治疗靶点，将wt c57/b6小鼠暴露于20gy wtli。向辐照小鼠腹腔内注射10μg的抗nampt mab或载体对照。辐射暴露后18周，通过评估bal细胞计数、胶原沉积和肺组织平滑肌肌动蛋白(sma)表达来评估小鼠的辐射诱导肺纤维化
(rilf)，这是肌成纤维细胞转变和纤维化的反映。结果如图15a-c所示。
[0175]
如图15a-c所示，抗nampt mab显著降低ir诱导的rili，这通过相比于载体治疗的对照小鼠，ab治疗的小鼠中的bal细胞计数减少(图15a)、肺组织sma的表达减少(通过蛋白质印迹分析检测，如图15b所示)和胶原沉积减少(通过肺组织的三色染色检测，如图15c所示)反映。
[0176]
因此，结果强调了抗nampt ab在减弱rilf中的作用，进一步验证了nampt作为rili的治疗靶点。
[0177]
实施例14.评估抗nampt mab在肺损伤的临床前模型中的功效
[0178]
在创伤(爆炸)/呼吸机诱导的肺损伤(vili)的大鼠模型中验证抗nampt mab的功效。sprague dawley大鼠受到创伤(爆炸)/vili的攻击，并在爆炸后30分钟静脉内(iv)注射100μg的抗nampt mab(alt-100)。暴露于创伤(爆炸)/vili并注射载体的大鼠作为对照。然后，在机械通气4小时后评估大鼠肺的损伤。此外，通过苏木精和伊红(h&e)染色评估肺组织中的水肿和炎性细胞浸润，作为肺损伤的读数。该创伤(爆炸)/vili肺损伤模型的结果提供于图16a-c中。
[0179]
如图16a所示，与未攻击的大鼠(图16a，最右侧框中的插图)相比，注射载体的对照创伤/vili大鼠的肺组织表现出炎性细胞浸润和水肿，其代表创伤/vili诱导的肺损伤。相反，如图16b所示，抗nampt mab治疗的创伤/vili大鼠的肺组织表现出炎性细胞浸润和水肿的明显减少，因此表明抗nampt mab对创伤/vili诱导的肺损伤的减轻。图16c中总结了抗nampt mab对创伤/vili诱导的肺损伤的影响，其显示了通过h&e染色指数评估的大鼠肺损伤评分。如图16c所示，相比于注射载体的对照大鼠，用抗nampt mab治疗的大鼠的肺损伤评分显著降低(p《0.05)。因此，图16a-c中概述的结果表明了nampt中和mab在减轻创伤/vili诱导的肺损伤中的功效。
[0180]
接下来，在lps/vili的小鼠模型中验证了抗nampt mab的功效。用lps攻击小鼠18小时，然后机械通气4小时。在lps攻击后1小时，向小鼠注射10μg(iv)的抗nampt mab(alt-100)、抗nampt多克隆抗体(pab，iv)或载体对照(pbs)。未暴露于lps/vili的小鼠作为对照。然后通过h&e染色评估小鼠肺组织中的水肿和炎性细胞浸润，作为肺损伤的读数。该lps/vili肺损伤模型的结果提供于图17a-c中。
[0181]
如图17a所示，与未攻击的小鼠(图17a，插图)相比，注射载体的对照小鼠的肺组织表现出炎性细胞浸润和水肿，其指示lps/vili诱导的肺损伤。相反，如图17b所示，抗nampt mab治疗的小鼠的肺组织表现出炎性细胞浸润和水肿的显著减少，因此表明抗nampt mab对lps/vili诱导的肺损伤的减轻。图17c中总结了抗nampt mab对创伤/vili诱导的肺损伤的影响，其显示了通过h&e染色指数评估的小鼠急性肺损伤(ali)的严重程度评分。如图17c所示，与注射载体的小鼠相比，用抗nampt pab或mab治疗的小鼠ali显著降低，其中在用抗nampt mab治疗的小鼠中观察的ali严重程度评分的降低最为明显(p《0.001)。因此，图17a-c中概述的结果表明了nampt中和mab在减轻创伤/vili诱导的肺损伤中的功效。
[0182]
因此，结果证明了抗nampt mab在临床前体内肺损伤模型中减轻肺损伤的效力。
[0183]
实施例15.放射性标记的抗nampt抗体鉴定发炎的肺组织中增加的nampt表达
[0184]
对人源化抗nampt mab进行放射性标记以开发一种能够无创检测体内不同组织中的nampt信号传导通路和nampt表达的成像探针。考虑到nampt作为急性炎症性病症(例如
covid-19、ards和肺损伤)中诊断和/或预后生物标志物的潜力，放射性标记的抗nampt mab可用作具有发生此类病症风险的受试者的诊断工具，或用于选择可能对用抗nampt mab治疗此类炎症性病症(包括慢性病症，例如肺纤维化、放射损伤和心脏纤维化)产生反应的受试者。本实施例描述了使用放射性标记的抗nampt mab检测发炎的组织(例如lps攻击的和电离辐射暴露的肺)中的nampt表达。
[0185]
首先，为了测试通过放射性标记的抗nampt抗体对nampt表达的检测，
99m
tc标记的抗nampt mab探针或放射性标记的igg对照ab被注射入暴露于20gy全肺辐照(wtli)的小鼠中，并进行快速放射自显影成像。
[0186]
如图18a所示，相比于注射放射性标记的igg对照的辐照小鼠(图18a，左图)，在注射放射性标记的抗nampt mab pronamptor的辐照小鼠(图18a，右图)中观察到明显更高的放射性摄取。因此，图18a中所示的结果证实了放射性标记的抗nampt成像探针在检测辐射诱导的nampt表达中的能力。
[0187]
为了进一步评估通过放射性标记的抗nampt成像探针对nampt表达的检测，
99m
tc标记的抗nampt mab被注射入载体攻击的对照小鼠或在lps攻击后3小时或18小时注射入lps攻击的小鼠，并进行快速放射自显影成像。分析结果如图18b-d所示。
[0188]
如图18b所示，相比于对照小鼠(图18b，左图)，lps攻击的小鼠在lps攻击后3小时表现出对放射性标记的抗nampt成像探针的明显更高的摄取(图18b，右图)。lps攻击的小鼠或对照小鼠的肺的放射自显影成像进一步证实了这一观察结果；与对照小鼠(图18c，左图)相比，lps攻击的小鼠的肺在lps攻击后3小时表现出放射性标记的抗nampt成像探针的明显更高的摄取(图18c，右图)。而且，如图18d所示，相比于对照小鼠，lps攻击的小鼠在lps攻击后3小时和18小时显示出显著更高的放射性(p《0.05)，这表明放射性标记的抗nampt成像探针的更高的摄取。因此，图18b-d中描述的结果证实了放射性标记的抗nampt成像探针在检测lps诱导的nampt表达中的能力。
[0189]
因此，放射性标记的抗nampt抗体在检测发炎的组织中增加的nampt表达中是有效的。这强调了利用放射性标记的抗nampt抗体作为检测nampt的工具的潜力，这在使用nampt作为急性炎症性病症诊断和/或预后的生物标志物中可能至关重要。而且，通过检测发炎的组织中nampt表达的增加，这种放射性标记的抗nampt成像探针可用于选择可能对用中和抗nampt mab治疗急性炎症性病症有反应的受试者。
[0190]
实施例16.在人ipf中的nampt表达
[0191]
为了评估nampt在肺纤维化中的作用，评估了在特发性肺纤维化(ipf)患者的肺组织和血浆中的nampt表达。结果如图19和20a-c所示。为此，从确诊为ipf的患者中分离肺组织并通过免疫组织化学(ihc)染色评估nampt表达。如图19所示，通过ihc染色发现nampt在ipf肺组织纤维化区域内的成纤维细胞中特异性表达，从而表明nampt在ipf病理生理学中的作用。接下来，从ipf患者和健康对照获得血浆样品，并通过elisa评估nampt的表达。如图20a所示，与健康对照相比，来自ipf患者的血浆样品表现出明显升高的nampt水平。为了进一步评估ipf中的nampt血浆水平，评估了获自死亡ipf患者、活着的ipf患者、经治疗的ipf患者和未经治疗的ipf患者的血浆样品中的nampt表达。如图20b所示，来自死亡ipf患者、活着的ipf患者和未经治疗的ipf患者的血浆样品之间的nampt水平没有明显差异。但是，接受治疗的ipf患者具有明显降低的nampt血浆水平，从而强调了nampt在ipf发病机制中的作
用。通过评估分离自晚期vs早期ipf患者的成纤维细胞中的nampt mrna水平来进一步评估了nampt在ipf发病机制和进展中的作用。如图20c所示，与早期ipf患者相比，在晚期ipf患者的成纤维细胞中观察到明显升高的nampt mrna水平(p《0.05)，因此表明nampt表达随着ipf严重程度的升高而增加。
[0192]
因此，结果证实ipf中nampt表达和分泌的失调，这表明nampt在肺纤维化的发病机制和进展中的作用。
[0193]
实施例17.使用博来霉素诱导的鼠肺纤维化模型探究nampt在ipf中的作用
[0194]
使用博来霉素诱导的鼠肺纤维化模型进一步探究nampt在ipf中的作用。为此，用博来霉素攻击nampt杂合(nampt
/-；“nampt het”)小鼠或wt小鼠；将未用博来霉素攻击的wt和nampt
/-小鼠作为对照。通过评估全肺中的可溶性胶原蛋白来评估博来霉素攻击组和未攻击对照组中的肺纤维化。
[0195]
如图21所示，与对照wt小鼠相比，博来霉素攻击的wt小鼠表现出肺纤维化的显著增加，其通过全肺中的可溶性胶原蛋白反映(p《0.05)。但是，博来霉素攻击的nampt
/-小鼠全肺中的可溶性胶原蛋白明显低于博来霉素攻击的wt小鼠(p《0.05)，这表明保护nampt
/-小鼠免受博来霉素诱导的肺损伤和肺纤维化。
[0196]
因此，本结果证明了nampt的体内靶向导致针对肺纤维化的保护，并强调nampt作为肺纤维化的有效治疗靶点的概念验证。
[0197]
实施例18.评估pah患者中的nampt表达和nampt snp
[0198]
为了评估nampt在肺动脉高压(pah)中的作用，评估了在特发性肺动脉高压(ipah)患者的肺组织和血浆中的nampt表达。结果显示于图22a-c中。如图22a所示，与健康对照的肺组织相比，ipah患者的肺组织显示出nampt表达的显著增加(图22a，插图)。接下来，从pah患者、非pah肺病患者和健康对照受试者获取血浆样品；通过elisa评估nampt血浆水平。结果如图22b所示。尽管与健康对照相比，pah患者和非pah肺病患者均显示出升高的nampt血浆水平，pah患者中观察到nampt血浆水平的显著升高。为了进一步确定ipah患者中的nampt表达，对由ipah患者或正常健康对照的肺组织制备的裂解物进行蛋白质印迹分析。如图22c所示，与健康正常对照的肺组织相比，ipah患者的肺组织中观察到nampt表达的显著增加。因此，结果证实了pah中nampt表达和分泌的失调，这表明nampt在pah发病机制中的作用。
[0199]
接下来，分析ipah患者的dna以在全基因组关联研究(gwas)中确定nampt启动子snp与右心室(rv)指数之间的相关性。如图22d所示，nampt启动子snp rs59744560与rv指数明显相关，因此表明使用nampt启动子snp作为pah的遗传生物标志物、pah严重程度的预测因子以及鉴定可能对enampt中和mab治疗有反应的持续性pah(ppah)患者的可能机制的潜力。
[0200]
实施例19.抗nampt抗体减少大鼠模型中的pah表现
[0201]
为了探究nampt作为pah的治疗靶点的潜力，使用了pah的大鼠野百合碱(mct)模型。向sprague-dawley大鼠(190-200g)皮下注射一剂的mct(60mg/kg体重)。然后向mct攻击的大鼠注射抗nampt mab(每周，100μg/大鼠，腹膜内(i.p.))或载体对照(对照mct大鼠)。然后评估大鼠的右心室收缩压(rvsp)和肺动脉重构。结果如图23a和23b所示。
[0202]
通过使用millar压力传感器导管的右心插管测定抗nampt ab治疗的mct大鼠或对照mct大鼠中的rvsp。如图23a所示，与对照mct大鼠相比，在用抗nampt mab治疗的mct大鼠
中观察到明显降低的rvsp(p《0.05)。
[0203]
在对抗nampt mab治疗的mct大鼠或对照mct大鼠的肺进行h&e染色后，使用aperio imagescope软件评估肺动脉重构。如图23b所示，与对照mct大鼠相比，在抗nampt mab治疗的mct大鼠中观察到肺动脉厚度的显著降低。
[0204]
结果证实了通过抗nampt mab的nampt中和逆转pah大鼠模型中的血管重构和rv功能障碍，从而表明nampt作为pah治疗靶点的有效性。